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Universidad Manuela Beltrán. Gómez I. Hoyos P. Vaca A.

MEDICIÓN DE VIABLES O DILUCIONES SERIADAS


Gómez Ulloa Indira Solanyi, Hoyos Gómez Yenifer Paola, Vaca Salinas Angie Lorena
Universidad Manuela Beltrán
Faculta de ingeniería Ambiental
Septiembre 2016
OBJETIVOS
INTRODUCCIÓN
OBJETIVO GENERAL
En Colombia, la problemática actual de
los sitios contaminados con  Determinar el crecimiento de
hidrocarburos, es que hasta hace pocos microorganismos, utilizando diferentes
años, prácticamente no existía una diluciones de la cepa Pseudomona sp y
conciencia del grado de dificultad y del establecer si esta puede metabolizar
enorme costo de la remediación de suelos, gasolina.
cuerpos de agua y atmósfera
contaminados, lo que representa hoy para OBJETIVOS ESPECÍFICOS
la sociedad un gran costo económico
(KANTACHOTE, D., 2001; MITRA, J,  Realizar diluciones de 10-1 – 10-4
2011). Dicha contaminación está utilizando la cepa pseudomona sp para
ocasionando el deterioro progresivo de la observar el crecimiento de
calidad del medio ambiente y genera una microorganismos de acuerdo con su
amenaza real a la salud pública, así como concentración inicial.
la extinción de gran cantidad de especies  Determinar la capacidad de
vegetales y animales. crecimiento de la cepa pseudomona sp
utilizando diferentes medios de cultivo
Este trabajo pretende mostrar los  Medir la absorbancia de las
resultados obtenidos en la práctica diluciones por medio del
realizada sobre diluciones seriadas, las espectrofotómetro.
cuales se realizaron desde la dilución 10-1  Aplicar los conceptos
– 10-4; de las cuales posteriormente se posteriormente obtenidos en clase teórica
procedió a trasferir a los agares y laboratorio.
proporcionados (agar nutritivo y agar de  obtener habilidades para el uso de
gasolina). instrumentos de laboratorio, en el manejo
de cepas bacterianas y la evaluación en
Esta práctica de laboratorio tiene como biorremediación.
fin establecer el crecimiento de la
pseudomona sp en diferentes agares para JUSTIFICACIÓN
determinar si esta metaboliza derivados
del petróleo (gasolina) y establecer si esta Esta práctica de laboratorio se llevó a
se puede implementarse en tratamientos cabo con el fin de aplicar los conceptos
de recuperación de suelos a través de adquiridos en teoría de una manera
biorremediación. práctica, para así ver como utilizando un
tipo de cepa y las diluciones seriadas
influyen en el crecimiento de
microorganismos. De igual manera se
pudo adquirir habilidades para realizar
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diluciones y posterior a esto poder ser Biorremediación


transferidas a un medio de cultivo;
ayudando esto para la vida que nos espera Es un método utilizado para degradar,
profesionalmente como Ingenieros transformar y remover compuestos
Ambientales para identificar por medio de orgánicos tóxicos a productos menos
estas la presencia de microorganismos tóxicos, por medio de organismo vivos
que puedan llegar a estar presentes en los como: plantas hongos y bacterias, la
diferentes problemas ambientales que se biorremediación depende del catabolismo
presentan en nuestro alrededor ya se por de los organismos y de la utilización de
medio del recurso agua, suelo, etc. los contaminantes como fuente de
alimento y energía por ello las
MARCO TEÓRICO condiciones de crecimientos y
degradación deben ser óptimas, algunos
Diluciones contaminantes utilizados son el petróleo y
sus derivados EPA,(2012)
Las diluciones seriadas consisten en El funcionamiento de la biorremediación
adicionar una dilución a un diluyente que requiere una temperatura específica,
puede ser un caldo nutritivo, en donde se nutrientes y alimentos, cuando son
parte de una muestra con una gran ineficientes las absorciones de
cantidad de microrganismos y a partir de contamínate se pueden mejorar agregando
ella se realizan las diluciones seriadas en adictivos, estos pueden ser productos que
un medio líquido, el volumen de esta se encuentran en casa como la melaza y el
dilución se determina con la cantidad que aceite vegetal o aire, esto es más utilizado
contenga de esa forma se obtiene el factor para descontaminación de suelos(
de dilución que se expresa en términos EPA,2012)
UFC/ml y UFC/g, (Gómez, G; Aracíl, B
& Gil, Y. 2009). Se puede observar en la La biorremediación de suelos, consiste en
imagen 1. la recuperación de las condiciones
naturales del mismo, haciendo uso de
Ilustración 1. Diluciones seriadas a procesos biológicos, para resolver
partir de muestras sólidas y liquidas problemas específicos medioambientales,
como la contaminación. La
Biorremediación puede ser empleada para
atacar contaminantes específicos del
suelo, por ejemplo en la degradación
bacteriana de compuestos organoclorados
o de hidrocarburos. (Flavio B, Et al,
1999).

En el agua, la mancha generada por los


hidrocarburos vertidos flota por
diferencia de densidades impidiendo la
entrada de luz y el intercambio gaseoso,
dando comienzo a la solubilización de
Tomado de: Gómez, G; Aracíl, B & Gil, compuestos hidrosolubles y a la afección
Y. (2009). de diferentes poblaciones: la primera
población afectada por un derrame es el
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plancton, en segundo lugar son afectados  se trabajó con la cepa Pseudomona


los macroinvertebrados, y la última sp la muestra se encontraba en
población afectada son los Bentos o liquido por lo que tuvimos que
población de macroinvertebrados que sacarla con una asa de un medio
viven en los fondos de los ríos y solido al líquido asignado durante la
ciénagas( EPA, 2012) práctica y posteriormente se mezclo
 Se procede a realizar las diluciones
Los organismos utilizados en la con una pipeta graduada estéril de
biorremediación de suelo son plantas 2ml , tomando 1ml de la solución
(fitorremediación), hongos bacterias madre en este caso Pseudomona sp
(naturales o modificadas) e incluso a un tubo de 9ml donde se obtendrá
animales, como por ejemplo la lombriz de una dilución de 10-1
tierra la cual absorbe los contaminantes a  Luego se transfiere 1ml de la
través de sus tejidos. dilución anteriormente obtenida ol
Las bacterias son las más empleadas en el tubo 2 donde se obtiene la dilución
proceso de biorremediación, aunque 10-2
también se han empleado otros  Posteriormente se realizó el mismo
microorganismos como hongos, algas, procedimiento hasta llegar a la
cianobacterias y actinomicetos para la dilución 10-4.
degradación de compuestos tóxicos en el  se transfiere 1ml de cada una de las
suelo.( HUANG, Y. 2007) diluciones obtenidas al agar
nutritivo y el agar de gasolina,
Las bacterias del género pseudomonas distribuyendo uniformemente
poseen la habilidad para utilizar diversos  Después de esto, se llevaron las
substratos, incluyendo aquellos creados cajas de agar nutritivo y gasolina a
por el petróleo. Las pseudomonas son la incubadora durante 24 horas a
bacterias Gram negativas, que pertenecen 37°C
a la subclase gamma del Proteo bacterias.
 Luego de que se realizó las
siembras se hacen las mediciones
Las Pseudomonas son bacterias espectrofotométricas de las
productoras de biosurfactantes como los -1 -4
diluciones 10 a la 10 y el blanco,
ramnolipidos involucrados en procesos de se llevaron al espectrofotómetro
remoción de aceites y productos para hacer la medición de
relacionados, Bushnell y Hass fueron de absorbancia a 540nm
los primeros en describir bacterias
 Finalmente pasado las 24 horas se
productoras de biosurfactantes, como el
hace el recuento en placa de las
Corynebacterium simplex y cepas de
colonias de pseudomonas sp de
pseudomonas (Flavio B, Et al, 1999).
cada una se las diluciones y se
determinó si creció en el medio
METODOLOGÍA

En el laboratorio de biotecnología se
realizó la práctica correspondiente a
diluciones seriadas para cuantificar el
crecimiento de la cepa Pseudomona sp.
Se precedió a seguir los siguientes pasos
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RESULTADOS Tabla N. 2: Medición


Espectrofotométrica
Los resultados de crecimiento microbiano DILUCIÓN VALOR
de la pseudomona sp fueron evaluados ABSORBANCIA A 540
mediante diluciones seriadas desde la nm
dilución 10-1 a la 10-4; los cuales se blanco 0,001
cultivaron en agar nutritivo y agar de 10-1 0,088
derivados de petróleo (gasolina). 10 -2
0,010
10-3 0,008
-4
10 0,002
Tabla N. 1: diluciones seriadas de
pseudomona sp. En la tabla N. 2 se puede observar la
Técnica Diluc Número de UFC/ml por absorbancia de todas las diluciones varía
ión Colonias en dilución de acuerdo con la concentración y con
semb el agar estos datos creamos una recta de
rada calibrado para luego calcular
vertido en 10-1 Incontables Incontables concentraciones de muestras
placa desconocidas.
vertido en 10-2 Incontables Incontables
placa Grafica N. 1: recta de calibración.
vertido en 10-3 Incontables Incontables
placa
vertido en 10-4 Incontables Incontables
placa

En la Tabla N. 1: diluciones seriadas de


pseudomona sp se reporta el número de
colonias en el agar y de unidades
formadoras de colonias por ml de
solución dando como incontables, este se
reporta así porque en todas las diluciones
habían más 300 colonias, por ende se
puede determinar que en todas las Una vez obtenida la gráfica N. 1 recta de
diluciones sembradas habían más de calibración se determina la función
30(105) UFC/ml. matemática que presenta dicha recta a
través del tratamiento estadístico, la cual
La absorbancia se midió para conocer la relaciona la absorbancia y la
concentración del pseudomona sp que concentración del analito.
contiene la mezcla, como se evidencia en
la tabla N. 2. Obteniendo la siguiente ecuación:

y = -0,0263x + 0,0925 (1)

Luego se mide la absorbancia de la


solución problema y se interpola su valor
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en la gráfica o se reemplaza en la
ecuación (1), para obtener el valor de 2. Consulte las rutas metabólicas
concentración del analito. utilizadas por los microorganismos para
la degradación de hidrocarburos alifáticos
DISCUSIÓN y aromáticos.

Experimentalmente se pudo determinar Degradación de hidrocarburos


que la pseudomona sp utiliza la gasolina alifáticos en presencia de oxigeno:
como fuente de alimentación a una
temperatura de 37 °C. Teniendo esta la Ilustración 2 Degradación Hidrocarburos
capacidad de sintetizar ramnolipidos. Las Alifáticos
bacterias del género Pseudomonas poseen
la habilidad para utilizar diversos
substratos, incluyendo aquellos creados
por el petróleo. (Demaneche S, Et al,
2001).

Estudios con relación al desempeño


metabólico de la pseudomona ha
permitido identificarla como degradadora
de gran cantidad de sustratos como el n-
hexadecano, mineralización de
compuestos alifáticos en condiciones
anaerobias, y degradadora de
hidrocarburos aromáticos y poli
aromáticos, así como la gasolina (Fan C,
Et al, 2003;).

En los resultados obtenidos en la Tabla


N. 2: Medición Espectrofotométrica se Tomado de: (Burgos, 2003).
puede evidenciar que la cantidad de
microorganismos van disminuyendo a Para que los microorganismos puedan
medida que disminuye la concentración degradar alcanos primero deben de oxidar
de la muestra. con oxígeno el último carbono de la
molécula gracias al complejo
CUESTIONARIO multienzimático que no hacen más que
incorporar esta molécula de oxígeno. Así
1. Se observa que las Pseudomonas se obtiene un hidrocarburo con un grupo
consumen la gasolina o el pesticida? alcohol siendo así una molécula más
reactiva. Mediante otras enzimas este
Se observa que las Pseudomonas grupo alcohol se oxida más hasta grupo
consumen la gasolina ya que en los aldehído y finalmente carboxílico. Así se
resultados se evidenció la cantidad de obtiene una molécula similar a un ácido
microorganismos que crecieron en el agar graso y puede ser degradado a acetil-CoA
gasolina mostrando esto que esta cepa es por b-oxidación. Este proceso de
de gran ayuda para procesos de oxidación también puede darse en
biorremediación. carbonos no terminales dando lugar a dos
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ácidos grasos que se procesarán por b- Degradación anaeróbica:


oxidación (Burgos, 2003).
Actualmente se está trabajando mucho en
Degradación de hidrocarburos este insólito campo por la importancia
aromáticos en presencia de oxigeno: que tiene y las aplicaciones potenciales
que pueda tener en la biorremediación.
Los microorganismos que utilizan estos Hay que tener en cuenta que en la
compuestos aromáticos como fuente de mayoría de los lugares contaminados
carbono ,lo que hacen es que en lugar de donde se quiere aplicar estas técnicas de
utilizar una enzima monooxigenasa biorremediación hay condiciones
específica para cada molécula diferente, anoxigénicas o de seguida se consume el
utilizan unas vías bioquímicas llamadas oxígeno (Burgos, 2003)
vías altas, es decir, la gran variedad de
compuestos aromáticos que se pueden 3. Consulte las rutas metabólicas
encontrar son modificados y convertidos utilizadas por los microorganismos para
a estas dos moléculas. A partir de estas la degradación de pesticidas.
dos moléculas que convergen todos los
compuestos, ya se puede llevar a cabo el Los mecanismos de degradación
rompimiento del anillo mediante enzimas dependen de disponer los
específicas. Esta segunda fase en la microorganismos adecuados (un
degradación seria lo que se conocería ecosistema microbiano, sucesión de
como vías bajas (Burgos, 2003). microorganismos y cometabolitos),
bacterias u hongos con habilidad
fisiológica y metabólica para degradar los
Ilustración 3 Degradación Hidrocarburos contaminantes, bajo las condiciones
Aromáticos ambientales correctas para que ocurra la
degradación (Boopathy, 2000).

Biodegradación aerobia de DDT

La estructura química del DDT,


incluyendo mitades aromáticas y
alicíclicas ofrece varias posibilidades de
ataque bioquímico. En la figura 1 se
muestra la ruta aerobia de degradación de
DDT. En el paso A, el DDE es atacado
por una dioxigenasa en las posiciones
orto y meta. Este ataque da como
resultado al intermediario 2,3-dihidrodiol-
DDE. En los pasos B y D, el 2-(4'-
clorofenil)-3,3-dicloropropenoato
produce, vía decarboxilación, el 1,1-
dicloro-(4'-clorofenil) etano, el cual
sufrirá oxidación en el lado alifático de la
Tomado de: (Burgos, 2003). cadena para producir 1,1-dicloro-(4'-
clorofenil)etanol que es nuevamente
oxidado a 4-cloroacetofenona. El grupo
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metilo terminal del 1,1-dicloro-(4'- organismos que pueden iniciar esta ruta
clorofenil) etano sufrirá también de degradación pero otros
oxidación para producir ácido microorganismos también pueden llevar a
fenilacético. En el paso C, la cabo los pasos sucesivos posteriores.
transformación de 4-cloroacetofenona a
4-cloronenzaldehido puede darse
mediante oxidación y subsecuente ilustración 4 Ruta de degradación
decarboxilación del grupo metilo aerobia de DDT como sustrato
terminal. En el paso E, el producto
resultante del rompimiento del anillo será
degradado a un ácido clorado de 5 o 6
carbonos, dependiendo del sitio donde
ocurra el rompimiento hidrolítico
(UMBBD, 2008).

Biodegradación anaerobia de DDT

Las condiciones anaerobias mejoran la


descomposición de algunos pesticidas
clorados o su
Conversión a otros compuestos en el
suelo, demostrándose que la adición de
residuos de alfalfa incrementa la
conversión de DDT a DDD ya que provee
a los microorganismos de nutrientes como
carbohidratos solubles y aminoácidos que
ejercen un efecto favorable sobre la
transformación, aunque las primeras
etapas de la degradación de DDT ocurren
en la ausencia de oxígeno atmosférico.
Los estudios in vitro sugieren que la etapa
de escisión del anillo del DDT requieren
de una oxigenasa, por lo cual la completa Tomado de: (UMBBD,1998).
destrucción de DDT necesita de
condiciones aerobias (PFAENDER, F,
1972).

En la ilustracion 4 las reacciones A, D, E


y F son pasos múltiples cuyos
intermediarios no han sido plenamente
identificados, son catalizados por la
enzima dehalogenasa DDT reductiva para
producir DDD. El paso E y sus sucesores
degradan DDM aerobicamente. Los pasos
B y C pueden ser reacciones no
enzimáticas. Synechococcus sp. y
Klebsiella pneumoniae subsp. son los
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alrededor de la hifa pueden cumplir las


Ilustración 5. Ruta de degradación funciones de buffer donde se capturan
anaerobia de DDT como sustrato compuestos químicos tóxicos como el
DDT. Esto permite una reducción de la
toxicidad a la célula (HUANG, Y, 2007).

Se ha verificado la habilidad del hongo


ligninolítico de degradar contaminantes
debido a la producción de la enzima
extracelular lacasa. Esta se considera
involucrada en reacciones de decloración
de compuestos clorofenólicos (JUHASZ,
A, 1999).

4. Consulte otras técnicas para el


conteo de poblaciones de
microorganismos.

ANEXO 1

CONCLUSIONES

 Luego de realizar las diferentes


diluciones con la cepa Pseudomona sp se
pudo evidenciar el crecimiento de
Tomado de: (UMBBD,1998). microorganismos en el agar gasolina e
igualmente que la cepa si metaboliza en
Biodegradación fúngica de DDT el mismo.

Las poblaciones microbianas en un suelo  Se pudo observar el crecimiento


con historial amplio de contaminación de microorganismos luego de realizar las
con DDT es una buena fuente de respectivas diluciones e incubar los
microorganismos resistentes a DDT, agares, dando estas como resultado
siendo los del reino Fungí los que incontables debido a la gran cantidad de
presentan mayor resistencia al compuesto, microorganismos que crecieron.
como evidencia de procesos de
adaptación que sufren estos  luego de completar el tiempo de
microorganismos para asimilar nuevas incubación se pudo determinar que la
fuentes de carbono (KANTACHOTE, D., cepa Pseudomona sp tiene la capacidad
2001; MITRA, J, 2011). de crecer en diferentes medios de cultivo
en este caso agar gasolina y nutritivo.
Huang y colaboradores han demostrado
que el micelio de hongos ectomicorrícicos  Al realizar las respectivas
está rodeados por limos, que ubicados diluciones se pudo medir la absorbancia
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de las mismas utilizando un strains of soil fungus Fusarium solani.


espectrofotómetro dando como resultado: Biodegradation.
10-1: 0.088, 10-2: 0.01, 10-3: 0.008 y 10-4:
0.001. HUANG, Y. (2007) Uptake and
biodegradation of DDT by 4
 Al terminar la práctica de ectomycorrhizal fungi. The Science of the
laboratorio se aprendió a manipular de total environment.
manera adecuada los instrumentos de
laboratorio, haciendo un buen manejo de JUHASZ, A. L., NAIDU, R. (1999)
las cepas bacterianas. Apparent degradation of 1,1,1-trichloro-
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