Universidad Manuela Beltrán. Gómez I. Hoyos P. Vaca A.

MEDICIÓN DE VIABLES O DILUCIONES SERIADAS

Gómez Ulloa Indira Solanyi, Hoyos Gómez Yenifer Paola, Vaca Salinas Angie Lorena
Universidad Manuela Beltrán
Faculta de ingeniería Ambiental
Septiembre 2016
OBJETIVOS
INTRODUCCIÓN
OBJETIVO GENERAL
En Colombia, la problemática actual de
los sitios contaminados con  Determinar el crecimiento de
hidrocarburos, es que hasta hace pocos microorganismos, utilizando diferentes
años, prácticamente no existía una diluciones de la cepa Pseudomona sp y
conciencia del grado de dificultad y del establecer si esta puede metabolizar
enorme costo de la remediación de suelos, gasolina.
cuerpos de agua y atmósfera
contaminados, lo que representa hoy para OBJETIVOS ESPECÍFICOS
la sociedad un gran costo económico
(KANTACHOTE, D., 2001; MITRA, J,  Realizar diluciones de 10-1 – 10-4
2011). Dicha contaminación está utilizando la cepa pseudomona sp para
ocasionando el deterioro progresivo de la observar el crecimiento de
calidad del medio ambiente y genera una microorganismos de acuerdo con su
amenaza real a la salud pública, así como concentración inicial.
la extinción de gran cantidad de especies  Determinar la capacidad de
vegetales y animales. crecimiento de la cepa pseudomona sp
utilizando diferentes medios de cultivo
Este trabajo pretende mostrar los  Medir la absorbancia de las
resultados obtenidos en la práctica diluciones por medio del
realizada sobre diluciones seriadas, las espectrofotómetro.
cuales se realizaron desde la dilución 10-1  Aplicar los conceptos
– 10-4; de las cuales posteriormente se posteriormente obtenidos en clase teórica
procedió a trasferir a los agares y laboratorio.
proporcionados (agar nutritivo y agar de  obtener habilidades para el uso de
gasolina). instrumentos de laboratorio, en el manejo
de cepas bacterianas y la evaluación en
Esta práctica de laboratorio tiene como biorremediación.
fin establecer el crecimiento de la
pseudomona sp en diferentes agares para JUSTIFICACIÓN
determinar si esta metaboliza derivados
del petróleo (gasolina) y establecer si esta Esta práctica de laboratorio se llevó a
se puede implementarse en tratamientos cabo con el fin de aplicar los conceptos
de recuperación de suelos a través de adquiridos en teoría de una manera
biorremediación. práctica, para así ver como utilizando un
tipo de cepa y las diluciones seriadas
influyen en el crecimiento de
microorganismos. De igual manera se
pudo adquirir habilidades para realizar
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diluciones y posterior a esto poder ser
transferidas a un medio de cultivo;
ayudando esto para la vida que nos espera
profesionalmente como Ingenieros
Ambientales para identificar por medio de
estas la presencia de microorganismos
que puedan llegar a estar presentes en los
diferentes problemas ambientales que se
presentan en nuestro alrededor ya se por
medio del recurso agua, suelo, etc.
MARCO TEÓRICO
Diluciones
Las diluciones seriadas consisten en
adicionar una dilución a un diluyente que
puede ser un caldo nutritivo, en donde se
parte de una muestra con una gran
cantidad de microrganismos y a partir de
ella se realizan las diluciones seriadas en
un medio líquido, el volumen de esta
dilución se determina con la cantidad que
contenga de esa forma se obtiene el factor
de dilución que se expresa en términos
UFC/ml y UFC/g, (Gómez, G; Aracíl, B
& Gil, Y. 2009). Se puede observar en la
imagen 1.
Ilustración 1. Diluciones seriadas a
partir de muestras sólidas y liquidas
Tomado de: Gómez, G; Aracíl, B & Gil,
Y. (2009).
Biorremediación
Es un método utilizado para degradar,
transformar y remover compuestos
orgánicos tóxicos a productos menos
tóxicos, por medio de organismo vivos
como: plantas hongos y bacterias, la
biorremediación depende del catabolismo
de los organismos y de la utilización de
los contaminantes como fuente de
alimento y energía por ello las
condiciones de crecimientos y
degradación deben ser óptimas, algunos
contaminantes utilizados son el petróleo y
sus derivados EPA,(2012)
El funcionamiento de la biorremediación
requiere una temperatura específica,
nutrientes y alimentos, cuando son
ineficientes las absorciones de
contamínate se pueden mejorar agregando
adictivos, estos pueden ser productos que
se encuentran en casa como la melaza y el
aceite vegetal o aire, esto es más utilizado
para descontaminación de suelos(
EPA,2012)
La biorremediación de suelos, consiste en
la recuperación de las condiciones
naturales del mismo, haciendo uso de
procesos biológicos, para resolver
problemas específicos medioambientales,
como la contaminación. La
Biorremediación puede ser empleada para
atacar contaminantes específicos del
suelo, por ejemplo en la degradación
bacteriana de compuestos organoclorados
o de hidrocarburos. (Flavio B, Et al,
1999).
En el agua, la mancha generada por los
hidrocarburos vertidos flota por
diferencia de densidades impidiendo la
entrada de luz y el intercambio gaseoso,
dando comienzo a la solubilización de
compuestos hidrosolubles y a la afección
de diferentes poblaciones: la primera
población afectada por un derrame es el
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plancton, en segundo lugar son afectados
los macroinvertebrados, y la última
población afectada son los Bentos o
población de macroinvertebrados que
viven en los fondos de los ríos y
ciénagas( EPA, 2012)
Los organismos utilizados en la
biorremediación de suelo son plantas
(fitorremediación), hongos bacterias
(naturales o modificadas) e incluso
animales, como por ejemplo la lombriz de
tierra la cual absorbe los contaminantes a
través de sus tejidos.
Las bacterias son las más empleadas en el
proceso de biorremediación, aunque
también se han empleado otros
microorganismos como hongos, algas,
cianobacterias y actinomicetos para la
degradación de compuestos tóxicos en el
suelo.( HUANG, Y. 2007)
Las bacterias del género pseudomonas
poseen la habilidad para utilizar diversos
substratos, incluyendo aquellos creados
por el petróleo. Las pseudomonas son
bacterias Gram negativas, que pertenecen
a la subclase gamma del Proteo bacterias.
Las Pseudomonas son bacterias
productoras de biosurfactantes como los
ramnolipidos involucrados en procesos de
remoción de aceites y productos
relacionados, Bushnell y Hass fueron de
los primeros en describir bacterias
productoras de biosurfactantes, como el
Corynebacterium simplex y cepas de
pseudomonas (Flavio B, Et al, 1999).
METODOLOGÍA
En el laboratorio de biotecnología se
realizó la práctica correspondiente a
diluciones seriadas para cuantificar el
crecimiento de la cepa Pseudomona sp.
Se precedió a seguir los siguientes pasos
 se trabajó con la cepa Pseudomona
sp la muestra se encontraba en
liquido por lo que tuvimos que
sacarla con una asa de un medio
solido al líquido asignado durante la
práctica y posteriormente se mezclo
 Se procede a realizar las diluciones
con una pipeta graduada estéril de
2ml , tomando 1ml de la solución
madre en este caso Pseudomona sp
a un tubo de 9ml donde se obtendrá
una dilución de 10-1
 Luego se transfiere 1ml de la
dilución anteriormente obtenida ol
tubo 2 donde se obtiene la dilución
10-2
 Posteriormente se realizó el mismo
procedimiento hasta llegar a la
dilución 10-4.
 se transfiere 1ml de cada una de las
diluciones obtenidas al agar
nutritivo y el agar de gasolina,
distribuyendo uniformemente
 Después de esto, se llevaron las
cajas de agar nutritivo y gasolina a
la incubadora durante 24 horas a
37°C
 Luego de que se realizó las
siembras se hacen las mediciones
espectrofotométricas de las
-1 -4
diluciones 10 a la 10 y el blanco,
se llevaron al espectrofotómetro
para hacer la medición de
absorbancia a 540nm
 Finalmente pasado las 24 horas se
hace el recuento en placa de las
colonias de pseudomonas sp de
cada una se las diluciones y se
determinó si creció en el medio
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RESULTADOS Tabla N. 2: Medición

Espectrofotométrica
Los resultados de crecimiento microbiano DILUCIÓN VALOR
de la pseudomona sp fueron evaluados ABSORBANCIA A 540
mediante diluciones seriadas desde la nm
dilución 10-1 a la 10-4; los cuales se blanco 0,001
cultivaron en agar nutritivo y agar de 10-1 0,088
derivados de petróleo (gasolina). 10 -2
0,010
10-3 0,008
-4
10 0,002
Tabla N. 1: diluciones seriadas de
pseudomona sp. En la tabla N. 2 se puede observar la
Técnica Diluc Número de UFC/ml por absorbancia de todas las diluciones varía
ión Colonias en dilución de acuerdo con la concentración y con
semb el agar estos datos creamos una recta de
rada calibrado para luego calcular
vertido en 10-1 Incontables Incontables concentraciones de muestras
placa desconocidas.
vertido en 10-2 Incontables Incontables
placa Grafica N. 1: recta de calibración.
vertido en 10-3 Incontables Incontables
placa
vertido en 10-4 Incontables Incontables
placa

En la Tabla N. 1: diluciones seriadas de

pseudomona sp se reporta el número de
colonias en el agar y de unidades
formadoras de colonias por ml de
solución dando como incontables, este se
reporta así porque en todas las diluciones
habían más 300 colonias, por ende se
puede determinar que en todas las Una vez obtenida la gráfica N. 1 recta de
diluciones sembradas habían más de calibración se determina la función
30(105) UFC/ml. matemática que presenta dicha recta a
través del tratamiento estadístico, la cual
La absorbancia se midió para conocer la relaciona la absorbancia y la
concentración del pseudomona sp que concentración del analito.
contiene la mezcla, como se evidencia en
la tabla N. 2. Obteniendo la siguiente ecuación:

y = -0,0263x + 0,0925 (1)

Luego se mide la absorbancia de la

solución problema y se interpola su valor
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en la gráfica o se reemplaza en la
ecuación (1), para obtener el valor de
concentración del analito.
DISCUSIÓN
2. Consulte las rutas metabólicas
utilizadas por los microorganismos para
la degradación de hidrocarburos alifáticos
y aromáticos.

Experimentalmente se pudo determinar Degradación de hidrocarburos

que la pseudomona sp utiliza la gasolina alifáticos en presencia de oxigeno:
como fuente de alimentación a una
temperatura de 37 °C. Teniendo esta la Ilustración 2 Degradación Hidrocarburos
capacidad de sintetizar ramnolipidos. Las Alifáticos
bacterias del género Pseudomonas poseen
la habilidad para utilizar diversos
substratos, incluyendo aquellos creados
por el petróleo. (Demaneche S, Et al,
2001).

Estudios con relación al desempeño

metabólico de la pseudomona ha
permitido identificarla como degradadora
de gran cantidad de sustratos como el n-
hexadecano, mineralización de
compuestos alifáticos en condiciones
anaerobias, y degradadora de
hidrocarburos aromáticos y poli
aromáticos, así como la gasolina (Fan C,
Et al, 2003;).

En los resultados obtenidos en la Tabla

N. 2: Medición Espectrofotométrica se
puede evidenciar que la cantidad de
microorganismos van disminuyendo a
medida que disminuye la concentración
de la muestra.
CUESTIONARIO
1. Se observa que las Pseudomonas
consumen la gasolina o el pesticida?
Se observa que las Pseudomonas
consumen la gasolina ya que en los
resultados se evidenció la cantidad de
microorganismos que crecieron en el agar
gasolina mostrando esto que esta cepa es
de gran ayuda para procesos de
biorremediación.
Tomado de: (Burgos, 2003).
Para que los microorganismos puedan
degradar alcanos primero deben de oxidar
con oxígeno el último carbono de la
molécula gracias al complejo
multienzimático que no hacen más que
incorporar esta molécula de oxígeno. Así
se obtiene un hidrocarburo con un grupo
alcohol siendo así una molécula más
reactiva. Mediante otras enzimas este
grupo alcohol se oxida más hasta grupo
aldehído y finalmente carboxílico. Así se
obtiene una molécula similar a un ácido
graso y puede ser degradado a acetil-CoA
por b-oxidación. Este proceso de
oxidación también puede darse en
carbonos no terminales dando lugar a dos
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ácidos grasos que se procesarán por b-
oxidación (Burgos, 2003).
Degradación de hidrocarburos
aromáticos en presencia de oxigeno:
Los microorganismos que utilizan estos
compuestos aromáticos como fuente de
carbono ,lo que hacen es que en lugar de
utilizar una enzima monooxigenasa
específica para cada molécula diferente,
utilizan unas vías bioquímicas llamadas
vías altas, es decir, la gran variedad de
compuestos aromáticos que se pueden
encontrar son modificados y convertidos
a estas dos moléculas. A partir de estas
dos moléculas que convergen todos los
compuestos, ya se puede llevar a cabo el
rompimiento del anillo mediante enzimas
específicas. Esta segunda fase en la
degradación seria lo que se conocería
como vías bajas (Burgos, 2003).
Ilustración 3 Degradación Hidrocarburos
Aromáticos
Tomado de: (Burgos, 2003).
Degradación anaeróbica:
Actualmente se está trabajando mucho en
este insólito campo por la importancia
que tiene y las aplicaciones potenciales
que pueda tener en la biorremediación.
Hay que tener en cuenta que en la
mayoría de los lugares contaminados
donde se quiere aplicar estas técnicas de
biorremediación hay condiciones
anoxigénicas o de seguida se consume el
oxígeno (Burgos, 2003)
3. Consulte las rutas metabólicas
utilizadas por los microorganismos para
la degradación de pesticidas.
Los mecanismos de degradación
dependen de disponer los
microorganismos adecuados (un
ecosistema microbiano, sucesión de
microorganismos y cometabolitos),
bacterias u hongos con habilidad
fisiológica y metabólica para degradar los
contaminantes, bajo las condiciones
ambientales correctas para que ocurra la
degradación (Boopathy, 2000).
Biodegradación aerobia de DDT
La estructura química del DDT,
incluyendo mitades aromáticas y
alicíclicas ofrece varias posibilidades de
ataque bioquímico. En la figura 1 se
muestra la ruta aerobia de degradación de
DDT. En el paso A, el DDE es atacado
por una dioxigenasa en las posiciones
orto y meta. Este ataque da como
resultado al intermediario 2,3-dihidrodiol-
DDE. En los pasos B y D, el 2-(4'-
clorofenil)-3,3-dicloropropenoato
produce, vía decarboxilación, el 1,1-
dicloro-(4'-clorofenil) etano, el cual
sufrirá oxidación en el lado alifático de la
cadena para producir 1,1-dicloro-(4'-
clorofenil)etanol que es nuevamente
oxidado a 4-cloroacetofenona. El grupo
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metilo terminal del 1,1-dicloro-(4'- organismos que pueden iniciar esta ruta
clorofenil) etano sufrirá también de degradación pero otros
oxidación para producir ácido microorganismos también pueden llevar a
fenilacético. En el paso C, la cabo los pasos sucesivos posteriores.
transformación de 4-cloroacetofenona a
4-cloronenzaldehido puede darse
mediante oxidación y subsecuente ilustración 4 Ruta de degradación
decarboxilación del grupo metilo aerobia de DDT como sustrato
terminal. En el paso E, el producto
resultante del rompimiento del anillo será
degradado a un ácido clorado de 5 o 6
carbonos, dependiendo del sitio donde
ocurra el rompimiento hidrolítico
(UMBBD, 2008).

Biodegradación anaerobia de DDT

Las condiciones anaerobias mejoran la

descomposición de algunos pesticidas
clorados o su
Conversión a otros compuestos en el
suelo, demostrándose que la adición de
residuos de alfalfa incrementa la
conversión de DDT a DDD ya que provee
a los microorganismos de nutrientes como
carbohidratos solubles y aminoácidos que
ejercen un efecto favorable sobre la
transformación, aunque las primeras
etapas de la degradación de DDT ocurren
en la ausencia de oxígeno atmosférico.
Los estudios in vitro sugieren que la etapa
de escisión del anillo del DDT requieren
de una oxigenasa, por lo cual la completa Tomado de: (UMBBD,1998).
destrucción de DDT necesita de
condiciones aerobias (PFAENDER, F,
1972).

En la ilustracion 4 las reacciones A, D, E

y F son pasos múltiples cuyos
intermediarios no han sido plenamente
identificados, son catalizados por la
enzima dehalogenasa DDT reductiva para
producir DDD. El paso E y sus sucesores
degradan DDM aerobicamente. Los pasos
B y C pueden ser reacciones no
enzimáticas. Synechococcus sp. y
Klebsiella pneumoniae subsp. son los
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Ilustración 5. Ruta de degradación
anaerobia de DDT como sustrato
Tomado de: (UMBBD,1998).
Biodegradación fúngica de DDT
Las poblaciones microbianas en un suelo
con historial amplio de contaminación
con DDT es una buena fuente de
microorganismos resistentes a DDT,
siendo los del reino Fungí los que
presentan mayor resistencia al compuesto,
como evidencia de procesos de
adaptación que sufren estos
microorganismos para asimilar nuevas
fuentes de carbono (KANTACHOTE, D.,
2001; MITRA, J, 2011).
Huang y colaboradores han demostrado
que el micelio de hongos ectomicorrícicos
está rodeados por limos, que ubicados
alrededor de la hifa pueden cumplir las
funciones de buffer donde se capturan
compuestos químicos tóxicos como el
DDT. Esto permite una reducción de la
toxicidad a la célula (HUANG, Y, 2007).
Se ha verificado la habilidad del hongo
ligninolítico de degradar contaminantes
debido a la producción de la enzima
extracelular lacasa. Esta se considera
involucrada en reacciones de decloración
de compuestos clorofenólicos (JUHASZ,
A, 1999).
4. Consulte otras técnicas para el
conteo de poblaciones de
microorganismos.
ANEXO 1
CONCLUSIONES
 Luego de realizar las diferentes
diluciones con la cepa Pseudomona sp se
pudo evidenciar el crecimiento de
microorganismos en el agar gasolina e
igualmente que la cepa si metaboliza en
el mismo.
 Se pudo observar el crecimiento
de microorganismos luego de realizar las
respectivas diluciones e incubar los
agares, dando estas como resultado
incontables debido a la gran cantidad de
microorganismos que crecieron.
 luego de completar el tiempo de
incubación se pudo determinar que la
cepa Pseudomona sp tiene la capacidad
de crecer en diferentes medios de cultivo
en este caso agar gasolina y nutritivo.
 Al realizar las respectivas
diluciones se pudo medir la absorbancia
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de las mismas utilizando un strains of soil fungus Fusarium solani.

espectrofotómetro dando como resultado: Biodegradation.
10-1: 0.088, 10-2: 0.01, 10-3: 0.008 y 10-4:
0.001. HUANG, Y. (2007) Uptake and
biodegradation of DDT by 4
 Al terminar la práctica de ectomycorrhizal fungi. The Science of the
laboratorio se aprendió a manipular de total environment.
manera adecuada los instrumentos de
laboratorio, haciendo un buen manejo de JUHASZ, A. L., NAIDU, R. (1999)
las cepas bacterianas. Apparent degradation of 1,1,1-trichloro-
2,2-bis(pchlorophenyl)ethane ( DDT ) by
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