Aislamiento y caracterización de microorganismos productores de antibióticos y su

aplicación en salud.

Introducción:

El suelo es un reservorio natural de microorganismos, capaces de originar muchos productos

biológicamente activos, incluidas las moléculas antibióticas, que frecuentemente se producen en
respuesta al estrés ambiental o la competencia con otros microorganismos. Los metabolitos
microbianos son fuentes ricas para el desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos, de origen
natural. Siendo los Actinomicetos y hongos filamentosos, la principal fuente de los antibióticos
naturales.

La función de un antibiótico es suprimir el crecimiento de otros microorganismos y en algunos

casos eliminarlos. Pero, a pesar de que más de 5.000 sustancias antibióticas han sido identificadas
a partir de los cultivos de hongos filamentosos y bacterias, Gram positivas y Gram negativas, sólo
alrededor de 100 antibióticos se han utilizado comercialmente para el tratamiento de
enfermedades en humanos, animales y plantas, muchas veces por su alta toxicidad. Al mismo
tiempo que, la aparición de agentes patógenos resistentes a múltiples de estos fármacos, requiere
la búsqueda continua de nuevos compuestos antimicrobianos eficaces para controlar la
propagación de agentes patógenos resistentes, así como, para el tratamiento de enfermedades
mortales como el cáncer.

El tratamiento antibiótico ha jugado un papel muy importante en el manejo de las enfermedades

infecciosas en el siglo 20. Desde el descubrimiento de la Penicilina en 1920 y su disponibilidad
para el uso clínico en la década del 40 muchos nuevos antimicrobianos aparecen todos los años
para su uso clínico. Mientras que este gran número de antibióticos permiten una gran flexibilidad
al médico en el uso de estas drogas, también exige un mayor conocimiento y experiencia para su
uso adecuado. La información que debe manejarse incluye lo habitual para cualquier fármaco más
conocimiento sobre el espectro de acción o actividad antibacteriana, penetración tisular,
resistencia a mecanismos bacterianos de inactivación antibiótica.

En general, la aparición de nuevos antibióticos para uso clínico, si bien suele solucionar problemas
terapéuticos también generan nuevas dificultades como la emergencia de "nuevos mecanismos
de resistencia". Así, el uso indiscriminado de "viejos" y "nuevos" antimicrobianos lleva al
desarrollo de una presión de selección que resulta en la emergencia de nuevos mecanismos de
resistencia. Por ejemplo, el uso durante más de 3 décadas de la Ampicilina en el tratamiento de
una gran cantidad de infecciones comunes ha llevado a que prácticamente en todo el mundo la
incidencia de cepas resistentes de Escherichia coli a este antibiótico sea del 70% de los
aislamientos.

Concepto de antibióticos

Los antibióticos son sustancias producidas por varias especies de microorganismos (bacterias,
hongos, actinomices), que suprimen el crecimiento de otros microorganismos y eventualmente
pueden destruirlos. Se han definido también como antibacterianos obtenidos por síntesis química
como: sulfonamidas y quinolonas. De igual forma este término ha sido utilizado para incluir a
todos los medicamentos quimioterapéuticos que poseen actividad antibacteriana.

La época de las sustancias antimicrobianas se desarrolla a inicios de 1935 con el descubrimiento

de las sulfonamidas por Domagk. En 1940, Ernest Chain y Howard Florey demostraron que la
penicilina descubierta por Alexander Fleming en 1929 era una sustancia quimioterapica efectiva.
La edad de oro de los antibióticos se da en 1941 con la industrialización de la penicilina y su
aplicación clínica. Posteriormente las investigaciones dieron prioridad a sustancias bacterianas de
origen microbiano a las cuales se denominó antibióticos. En la década de 1970 se desarrollan
antibióticos de segunda generación y en 1980 los de tercera generación.

Antibiosis:

Se define como la asociación de dos organismos donde uno es dañado o eliminado por el otro. La
antibiosis se aplica a partir de la obtención de la penicilina, al desarrollar tanto carácter
antibacteriano como antiinfeccioso.

La acción de los antibióticos afecta a componentes esenciales de la multiplicación celular o a

estructuras necesarias para el mantenimiento de la vida bacteriana (Florez, 2007, pág. 3). La
acción antibiótica se da a través de la membrana celular y su permeabilidad, la cual es
determinada por el espectro bacteriano.

Los antibióticos como metabolitos secundarios de interés industrial.

Las fermentaciones, se pueden definir en sentido estricto como procesos metabólicos donde el
oxígeno no se utiliza
como aceptor final de la
cadena de transporte
electrónica. por lo tanto,
un sustrato orgánico se
utiliza generalmente
como aceptor final,
llevando a la
acumulación de
moléculas reducidas,
tales como lactato,
etanol u otras moléculas
simples. Más
ampliamente, una
definición general de
fermentación es "un
Tabla 1. Microorganismos productores de antibióticos proceso productivo que
supone la utilización de
células (microbianas)".

Una clasificación más

avanzada de las
diferentes
fermentaciones, se basa
en el tipo de ruta
metabólica involucrada, a menudo diferenciando entre metabolismo primario y secundario. El
metabolismo primario, incluye todas las rutas necesarias para permitir la reproducción celular y
su viabilidad, mientras que el metabolismo secundario produce componentes celulares no
esenciales para la vida celular y no se encuentran en todas las células en crecimiento.

Los metabolitos secundarios productos de este último, son moléculas sintetizadas por
determinados microorganismos, normalmente en una fase tardía de su ciclo de crecimiento,
cuyas características son:

 No son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce. En estado
natural, sus funciones se hallan ordenadas a la supervivencia de la especie, pero cuando
los microorganismos que los producen se desarrollan en cultivo puro los metabolitos
secundarios no desempeñan esa misión.
  Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados químicamente
entre sí. Por ejemplo, una única cepa de una especie del género Streptomyces produce
32 antraciclinas diferentes.
 Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de organismos.
 La producción puede perderse fácilmente por mutación espontánea, por lo que son muy
importantes las técnicas de conservación de estos microorganismos.

De todos los productos tradicionales obtenidos por fermentación, los más importantes para la
salud humana son los metabolitos secundarios.

Los metabolitos secundarios mejor conocidos son los antibióticos, de los que se han descubierto
más de 5000, cifra que aumenta a razón de una media aproximada de 300 por año, aunque la
mayoría carecen de utilidad pues son tóxicos para los organismos vivos. Aproximadamente el 75%
de los antibióticos conocidos son producidos por actinomicetos. Algunas especies son
excepcionales productores de antibióticos, por ejemplo, Streptomyces gryseus produce al menos
40 antibióticos diferentes.

Relaciones entre la Trofofase y la Idiofase

En el metabolismo secundario las fases de crecimiento se denominan trofofase, fase de

crecimiento logarítmico donde normalmente
no se producen los metabolitos secundarios,
e idiofase, fase estacionaria donde
normalmente se producen los metabolitos
secundarios. Aunque es una simplificación
pensar sólo en dos fases, esta simplificación
nos permite comprender mejor la
fermentación industrial de los metabolitos
secundarios. Es decir, si nosotros queremos
producir un metabolito secundario primero
debemos asegurar las condiciones
apropiadas durante la trofofase para un buen
crecimiento y después, debemos alterar esas
condiciones en el momento adecuado para
asegurar una excelente producción del
metabolito secundario.

Este retraso en la formación de metabolitos

secundarios es uno de los principales mecanismos mediante el cual los microorganismos
productores de antibióticos evitan el suicidio, puesto que al comienzo de la fase logarítmica de
crecimiento son sensibles a su propio antibiótico, para posteriormente, durante la idiofase,
volverse resistentes al antibiótico que están produciendo.

Los factores que ponen en marcha la producción de metabolitos secundarios al final de la

trofofase no se conocen; únicamente se sabe que este mecanismo se dispara normalmente
cuando algún nutriente del medio se ha agotado. En algunas ocasiones el nutriente responsable
es una fuente de Carbono, en otras, sin embargo, es el Nitrógeno o el Fósforo. La explicación
puede ser que al faltar nutrientes se alteren los metabolitos primarios y se originen inductores de
los enzimas encargados de la síntesis de los metabolitos secundarios. Otra explicación puede ser
que al faltar la fuente de Carbono cesa la represión por catabolito, sintetizándose a partir de este
momento los enzimas necesarios para la biosíntesis de estos metabolitos secundarios.

Cualquiera que sea el mecanismo general por el que se dispara el metabolismo secundario al final
de la trofofase, es un hecho que en este punto hay unos cambios muy fuertes en la composición
enzimática de las células, apareciendo los enzimas que están específicamente relacionados con la
formación de metabolitos secundarios. Sin embargo, e independientemente de este aspecto
 general del metabolismo secundario, se ha puesto de manifiesto la existencia de sistemas de
regulación que juegan un papel importante en la síntesis de determinados productos industriales.

I. Efecto de los Precursores

Las manipulaciones, tanto del medio de cultivo como de las condiciones ambientales que se
llevan a cabo durante el screening secundario de una forma sistemática, incluyen la adición
de centenares de aditivos en los medios de cultivo que puedan actuar como posibles
precursores del producto que estamos investigando. Ocasionalmente se encuentra un
precursor que incrementa de forma notable la producción de este metabolito secundario. El
precursor puede incluso dirigir la síntesis de un determinado producto de entre varios que se
producían anteriormente; es lo que se conoce como biosíntesis dirigida.
Como ejemplos de precursores están el ácido fenilacético en el caso de la producción de bencil
penicilina; determinados aminoácidos específicos en la producción de actinomicinas y
tirociclinas; ácidos benzoicos sustituidos en la formación de novobiocinas.

En muchas fermentaciones, sin embargo, los precursores no muestran ninguna actividad. Esto
es debido a que su síntesis por el microorganismo no es el factor limitante de la producción
del metabolito secundario. En estos casos, la adición de aditivos ha revelado efectos
dramáticos, tanto estimuladores como inhibidores en la producción del metabolito secundario
por parte de una molécula no precursora. Este efecto se debe normalmente a la interacción
de estos compuestos con los mecanismos reguladores del microorganismo productor.
Precisamente, estudiando estos efectos se puso de manifiesto que los mecanismos
reguladores de los microorganismos ejercen un efecto notable en la producción de los
metabolitos secundarios.

II. Inducción Enzimática

A lo largo de los estudios sobre el papel que el triptófano juega como estimulador de la
biosíntesis de alcaloides por Claviceps (Cornezuelo del centeno) se puso de manifiesto que la
inducción enzimática juega un papel importante en la producción de metabolitos secundarios.
Si bien el triptófano es un precursor en la biosíntesis de estos alcaloides, no es un factor
limitante; ya que su efecto estimulador se debe en gran parte a la inducción de la síntesis de
los enzimas que dan lugar a la síntesis de los alcaloides.

Otro efecto de inducción similar es el de la metionina en la biosíntesis de cefalosporina por

Cephalosporium acremonium. A pesar de que la metionina provee azufre al antibiótico, la
estimulación de la formación de cefalosporina C se debe a un efecto de inducción. Se llegó a
esta conclusión ya que la metionina debe añadirse durante la trofofase; además, la metionina
puede ser reemplazada por su análogo norleucina que no tiene azufre en su molécula, por lo
que su efecto no puede ser debido al hecho de aportar azufre.

III. Regulación por Retroalimentación

La regulación por retroalimentación también parece jugar un papel fundamental en el
metabolismo secundario. Por ejemplo, el cloranfenicol al igual que la cicloheximida, penicilina
y otros antibióticos limitan su propia producción actuando por retroalimentación
generalmente sobre el primer enzima de la ramificación que conduce a la síntesis de este
metabolito.

Otro caso de regulación por retroalimentación sucede cuando la ruta metabólica ramificada,
mediante la cual se sintetiza el metabolito secundario, conduce a su vez a la síntesis de un
metabolito primario, como es el caso de la lisina y la penicilina en Penicillium chrysogenum. En
un primer momento se encontró que la L-lisina disminuía la producción de penicilina, pero no
se sabía por qué; hasta que se descubrió que el α -aminoadipato es un intermediario en la
biosíntesis de los dos, lisina y penicilina. La disminución en la formación de penicilina por lisina
 está causada por la inhibición por retroalimentación de la homocitrato sintasa, que es el primer
enzima en la biosíntesis de lisina.

IV. Regulación catabólica

La represión catabólica fue observada en la industria de antibióticos mucho antes de que se
conociera y se entendiera el significado
general de este fenómeno. Durante el
desarrollo de la producción de penicilina se
observó que la glucosa, que era una magnífica
fuente de carbono para el crecimiento del
microorganismo, era un sustrato muy malo
para la producción de penicilina; sin embargo,
se observó que la lactosa, que soporta un
crecimiento muy pobre, es un buen sustrato
para la producción de penicilina. Por lo tanto,
el medio clásico de Jarvis y Johnson lleva una
mezcla de glucosa y lactosa.
Los mecanismos moleculares de la regulación
catabólica se esclarecieron en la década de los
70. Hoy sabemos que la regulación catabólica
está mediada por el nivel intracelular de un
nucleótido especial, el monofosfato cíclico de
adenosina (AMPc), cuyo nivel intracelular es
inverso a la concentración de glucosa en el medio de cultivo.

Mientras existe glucosa en el medio de cultivo el nivel intracelular de AMPc es sumamente

reducido, debido a que la glucosa inhibe la actividad adenilciclasa, enzima que interviene en la
síntesis de AMPc. Cuando la glucosa del medio se agota, la concentración intracelular de AMPc
aumenta rápidamente. El AMPc sintetizado forma un complejo con una proteína existente en
la célula, denominada "proteína receptora de AMPc". Este complejo de proteína receptora y
AMPc actúa sobre el gen promotor al objeto de inducir la síntesis de los enzimas necesarios
para la utilización de otras fuentes de carbono distintas a la glucosa.

La glucosa inhibe gran cantidad de metabolitos secundarios: ácido giberélico, ácido lisérgico,
penicilina, cefalosporina, cloranfenicol, bacitracina actinomicina.

La represión catabólica también juega un papel importante en la determinación de la

concentración relativa de cada uno de los antibióticos de una misma familia química que se
producen en una fermentación. Este es el caso de la producción de estreptomicina por
Streptomyces gryseus. Aquí, el manano es el inductor de la manosidasa que convierte la
manósido estreptomicina en estreptomicina; sin embargo, este enzima no se sintetiza si hay
glucosa (>0,5%) en el medio debido a la represión catabólica. Sólo cuando la glucosa ha
desaparecido se produce el enzima que es inducido por manano. En este caso la represión
catabólica juega un papel fundamental en el porcentaje de manósido estreptomicina
producido en esta fermentación.

Producción de penicilina por fermentación:

La penicilina es un antibiótico producido por el crecimiento de un hongo. Este hongo, del tipo
Penicillium, es mantenido inicialmente como esporas, liofilizadas (conservadas a bajas
temperaturas y secadas al vacío) o en nitrógeno líquido, en esta etapa lo que se desea es
mantener el desarrollo vegetativo antes de entrar al siguiente proceso.
 En la siguiente etapa, proceso de Fermentación, es donde ocurre el crecimiento de la cepa.
Este proceso se inicia con el desarrollo de las cepas en Erlenmeyer, para luego pasar a
fermentadores de agitación, del tipo Fed- Batch, su volumen está entre 150 – 200 m3 y su
agitadores deben tener una potencia mecánica alrededor de 3-4 kW/m3. La alimentación de
los nutrientes debe ocurrir en forma continua (medios nutritivos alimentados al fermentador)
se puede utilizar glucosa o melaza a una concentración final de 100 g/L, la principal fuente
nitrogenada empleada hasta la década del 70 fue "cornsteep liquor" debido a que aumentaba
los rendimientos del antibiótico probablemente al suministrar compuestos como aminoácidos,
factores de crecimiento, precursores de la cadena lateral, además de elementos trazas. El
proceso se debe mantener a un pH 6,5 y una temperatura de 25º C durante un tiempo de 180
Hrs.

Un perfil tipo del proceso de fermentación se presenta por la ecuación:

𝑡𝑓
𝑃𝑉 = 𝑃0 𝑉0 + ∫ 𝑞𝑝 𝑋𝑉 𝑑𝑡
𝑡

Donde:
𝑃 = Concentración de penicilina al tiempo, tf
𝑃0 = Concentración inicial de penicilina
1 𝑑𝑃
𝑞𝑝 = 𝑋 𝑑𝑡 = Velocidad especifica de producción de penicilina [1⁄𝑚𝑔 ∙ ℎ]

𝑡 = Tiempo inoculación
𝑡𝑓 = Tiempo de cosecha
𝑉0 = Volumen inicial
𝑉 = Volumen al tiempo t

Esta ecuación mide la cantidad de penicilina obtenida en el fermentador, (PV) es función de la

concentración de células (X), de la velocidad de producción de penicilina (qp), del tiempo de
fermentación (t) y del volumen del medio de cultivo (V).

Después del proceso de fermentación los productos que salen son la penicilina G o V las cuales
tienen más comercialización en el mercado, pero estos productos salen inmersos en un caldo.
Este caldo está formado no sólo de penicilina, sino también de micelio (biomasa originada del
crecimiento hongo) y producto alimentados en el reactor. Por eso es necesaria una etapa de
separación y purificación para llegar al producto final.

En el proceso de Separación se consideran las siguientes etapas:

 Filtración: En esta etapa el micelio se separa del caldo que contiene penicilina
utilizando un filtro rotatorio a vacío, luego de la separación el micelio se recupera y se
vende como fuente de proteínas para ganado.

 Extracción por Solvente: La penicilina filtrada se debe extraer muy cuidadosamente, ya

que al menor cambio esta se puede degradar. Por eso lo más aconsejable es que sea
extraída en forma ácida (debido a que son solubles en muchos solventes orgánicos),
usando acetato de amilo o acetato de butilo, para extraerla con un alto rendimiento.
 Tratamientos con carbón: Para remover pigmentos y otras impurezas, el solvente que
contiene penicilina se trata con carbón activo. Terminado el tratamiento el carbón es
separado del extracto mediante un filtro rotatorio a vacío recubierto y se lava con un
solvente.

 Cristalización: Se adiciona acetato de potasio o sodio, para que la penicilina G o V sea

cristalizado por esas sales. Esta después se lleva a unos filtradores rotatorios al vacío
donde se recolectan los cristales.

 Secado y Limpieza de los cristales: Los cristales de penicilina se limpian con alcohol
isopropílico, alcohol butílico u otro solvente volátil que remueva impurezas residuales
como pigmentos, acetato de sodio o potasio no usado, etc. Luego de la limpieza se
filtran, se lavan con un solvente y se secan con aire caliente dando como resultado final
penicilina G o V.

Diagrama de flujo de producción de Penicilina

Diagrama de flujo de purificación de penicilina

Bibliografías

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