Asignatura I: Bases Físico-Químicas de la cromatografía

28/09/2018

Tareas:
 Completar perfil personal
 Inscribirse grupos pequeños asignatura instrumentacion (jueves/viernes)
 Inscribirse grupos laboratorio (miercoles a viernes)
 Visita biblioteca 5 de octubre de 16:00 a 16:30

¿Qué es un sistema de HPLC?

Bomba impulsa fase móvil (de un litro o mayor) que recoge la muestra para llevarla
a la columna de separación (lo más importante del equipo, lo cual requiere conocer bien
a la hora de seleccionarla según lo que vayamos a separar). Que llegará al detector,
igualmente de importante que las columnas (depende de la muestra y el tipo de análisis
que vamos a hacer, ni más caro ni más barato, sino el adecuado, que dependerá ademas
de las propiedades físico-químicas de los analitos a separar).
Puede existir sistemas con más de una bomba, instaladas en paralelo o en serie. Si
fuese en paralelo además necesitaría un mezclador (de alta o baja presión, dependiendo
de si se encuentran antes o después de las bombas).
¿Objetivo HPLC?
Separar una muestra completa en sus diferentes componentes.
Ejemplo: Meter en un cartucho relleno de gel de silice (zapatos) la tinta de un
cartucho de impresora eluyendo alcohol. Nos daremos cuenta de que el color negro se
separa en muchos colores. Sería una separación cualitativa, igual que la que haría un
sistema HPLC.
Se tiene que hacer esta separación y comprarla con un patrón para ver si tienes las
mismas características, por ejemplo fructosa. Estos patrones habrá que prepararlos en
el momento o cuidar de su conservación dependiendo de su estabilidad (algunos
requieren temperaturas de -20, temperaturas de -80, atmósfera inerte, protección
contra la luz…).
Características patrones
 Pureza 98-100 %
 Buscando siempre MRC (características NIST)
 Sin sustancias que puedan interferir con nuestras muestras
Una vez tenemos nuestra recta patrón construida, se pinchará cada día una muestra
control mínimo, y requiriéndose una muestra control cada 10 análisis, con el objetivo de
otorgar fiabilidad al método. Esta muestra control no deberá estár próxima a ningún
extremo de la recta, ya que el comportamiento de los detectores no suele ser lineal,
presentando un mayor ruido en la zona baja de la recta.
 Una de las principales normas de HPLC es que tanto la fase estacionaria como la
móvil tienen que ser SIEMPRE inmiscibles; compatibles pero inmiscibles.
Tenemos un analito con diferente constante de solubilidad entre dos disolventes.
Ejemplo: en un vaso con aceite y agua si tiramos sal se disuelve completamente
en el agua. Pero si tiramos vinagre, se repartirá en porcentajes diferentes entre el aceite
y el agua. Esta idea sería el coeficiente de partición:
[𝑆]2 𝐶𝑠
𝐾= =
[𝑆]1 𝐶𝑚
Cs = concentración en la fase estacionaria
Cm = concentración en la fase móvil
K es constante a una determinada presión y temperatura

K es un indicador de la solubilidad/afinidad relativa de un analito por la fase móvil

y fase estacionaria

En este ejemplo si tenemos una concentración de Pb de 11 ppm, siempre se nos

irá 10 ppm a la fase superior y 1 a la fase inferior (si siempre respetamos las dos fases,
la temperatura y la presión). Siempre tendremos el mismo factor de K.
Realmente no se hace un reparto tal cual, sino que cada molécula esta un tiempo
mayor en la fase superior que en la inferior (10 veces más tiempo arriba) (mirar
diapositivas para ver movimiento).
Tendriamos que entender el coeficiente de partición como un cociente de
tiempos.
𝐶𝑠 𝑡𝑠
𝐾= =
𝐶𝑚 𝑡𝑚
 Pasaría lo mismo por ejemplo con el ácido acético, que se encuentra todo el
tiempo asociándose y disociándose, y su estado varía en el tiempo.

En un ácido, Ka es fuerte (acido fuerte) si pasa la mayor parte del tiempo disociado
y es débil si pasa la mayor parte del tiempo protonado.
Todo el tiempo que el analito va a quedar disuelto o interaccionando con la fase
estacionaria no se va a desplazar. El analito no va a ir nunca más rápido que la fase móvil,
pero si podrá ir más lento, fruto de esta interacción.
Cada analito tiene su coeficiente de partición, podriamos definirlos “Kx” y “Ky”. La
idea es buscar que estos coeficientes de partición sean lo más distintos posibles (mirar
diapositiva 12 en movimiento).
Aquel analito que fluye más rapido a través de la columna tendrá un menor
coeficiente de partición, una menor adherencia a la fase estacionaria (solubilidad
relativa). No tiene nada que ver con la acidez, la polaridad ni otras características físico-
químicas.
El tiempo que tarda en salir el analito se define como tiempo de elución. Si un
compuesto carece totalmente de afinidad por la fase estacionaria, o tiene una
solubilidad igual a cero, el coeficiente de partición tenderá a cero.
El tiempo mínimo se define tiempo de volumen vacío (tm). Eso en el cromatograma
se manifiesta como un gran pico al principio. Este pico/frente de inyección representa a
la mezcla de todos los analitos de la muestra cuyo tiempo de retención/elución es 0, o
es igual al tiempo de volumen vacío.

Los analitos se irán separando conforme avanzan en la columna, siendo esta

separación progresiva y proporcional a la dieferencia de afinidad por la fase
estacionaria. Mientras antes salga un analito menor será su valor de K. La distancia que
queda entre un analito y otro en cualquier momento sería siempre progresiva y
proporcional a la diferencia entre sus coeficientes de partición.

El tiempo de retención (en la columna) sería la suma entre el tiempo retenido en

la fase estacionaria y el tiempo de volumen vacío.

Cuando decimos un analito sale en el minuto 15 realmente estamos midiendo su

valor de t’r (tiempo de retención). El tercer analito no ha estado retenido en la fase
estacionaria 3 minutos, sino que ha estado retenido 2,2 minutos en la fase estacionaria
(3 minutos de su pico menos 0,8 minutos del frente de inyección señalado en rojo,
pudiendo decir que ha estado en la fase móvil 0,8 minutos).
Si cambiamos la fase móvil por una que reduzca a la mitad el coeficiente de
partición, reduciremos el tiempo retenido en fase estacionaria, es decir pasariamos de
2,2 a 1,1; siendo siempre el frente de inyección 0,8. Este frente de inyección depende
del tipo de la columna.
Este factor de retención K debería estar comprendido idealmente entre 1 y 5 (el
analito se retiene 5 veces más tiempo en la fase estacionaria), dándonos cromatogramas
de menos de 10 minutos. Valores de K superiores a 20 (para el último analito siempre)
indican separaciones muy largas (no quiere decir que sean 20 minutos). En otras
palabras, la longitud del cromatograma lo marca el tiempo de retención del último
analito de interés. El caudal de la fase móvil o la presión puede modificar, cambiando la
longitu del cromatograma, pero nunca cambiara el coeficiente de retención (mayor
caudal, menor tiempo, picos más cercanos).
El flujo nunca nos va a ayudar a separar, el único que nos ayudará será la diferencia
de los coeficientes entre los analitos. Aumentando este los picos aparecerán más
cercanos entre ellos y más cercanos al frente de inyección, pero nunca van a solaparse.
Si encontramos dos picos solapados, habría que cambiar las condiciones (fase
móvil, fase estacionaria,…).
Los picos más estrechos suelen estar al principio y los más anchos al final.
Formatos habituales de columnas
 5 - 15 centímetros de longitud, 2 – 5 mm de diámetro interno (muy
importante para no alargar la columna)
 0,5 – 2,5 cm3 de volumen
 Esferas de 1 – 5 m (tamaño 1-1,5 m se utilizan para ultra HPLC)
 Normalmente son de acero, pero las hay de vidrio (baja presión) y de
plástico (media-alta presión)
Las columnas tiene muy poco volumen interno, por tanto es de esperar que los
flujos sean de 0,5 (quizás llegan hasta 1,5)
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Es conveniente usar la columna siempre en el mismo sitio (cabecera y cola no
intercambiable). La cabecera tiende a contaminarse con algunas partículas que puedan
llegar a pasar. Si intercambiamos el sentido, es probable que estas particulas atasquen
la salida y nos salgan un cromatograma raro.
La porosidad de las partículas de la fase estacionaria suele encontrarse entre el 25
-50 % (pudiendose pedir por encargo la que deseemos). A mayor porcentaje de
porosidad mayor es la superficie superficial. A mayor porosidad mayor sera la carga
máxima de analitos que pueden separar (se aumenta superficie de exposición de la fase
móvil).
Desde el punto de vista químico, estas partículas tienen un “corazón” de sílice, que
contiene principalmente dióxido de silicio, SiO2.

Estas moléculas pueden formar largas cadenas que terminarán siempre con algún
tipo de grupo terminal que puede variar mucho.
Estos grupos van a determinar la selectividad que tiene la columna, puesto que
sus propiedades químicas van a variar. (grupos OH pueden formar puentes de
hidrógeno,…). Con esto queremos decir que la razón de ser de la fase estacionaria es la
superficie de las partículas, el silicio solo daría un “soporte”.
Una columna aguantará mayor presiones si las partículas no son muy porosas, o
de látex. Normalmente, las partículas que mas aguante soportan son aquellas con centro
metálico o de algún mineral fuerte.
Antiguamente teniamos partículas de mayor tamaño e incluso tenían formas
irregulares. Estas eran mucho menos selectivas que las que tenemos hoy en día, ya que
la fase móvil no se movía de igual manera por toda la columna, ya que había diversos
caminos.
 ¿Qué diferencia hay entre columnas de gama alta (600-700 euros) y de gama
media (300-400), siendo de las mismas dimensiones y tamaño de partícula?
La gama alta tiene menos variabilidad de tamaño entre sus partículas, con lo que
se consigue una menor difusión y un mayor rendimiento de la columna. No es lo mismo
una columna con partículas de 5  0,1 m (2% por arriba y por abajo), que de 5  0,5
m (10% por arriba y por abajo).

A mayor calidad de la columna, esta distribución sería mas estrecha (mejor calidad
a la hora de separar).
¿Qué consecuencia tiene esto en el cromatograma?
En los espacios huecos que quedan debido a la diferencia de tamaño, los analitos
podrán difundir con mayor facilidad (principal problema que surge en esta técnica),
provocando el ensanchamiento de los picos en el cromatograma.

En el primer caso (columna de gama alta), los tres caminos que recorren el analito
tienen caminos prácticamente exactos. Suelen aguantar 3000 pinchazos.
En el segundo caso (columna de gama media), dependiendo del camino que tome
el analito debido a la difusión, el tiempo puede variar, aumentando el riesgo de que los
picos puedan solaparse. Suelen aguantar 5000-5500 pinchazos.
Por otra parte, también afecta la penetración en las partículas del analito. Hay
copias de analitos que van a interaccionar solo con la superficie (flecha azul), pero
también va a haber otras que aprovechando la porosidad van a interaccionar con el
interior de la partícula hasta el corazón sólido (flecha roja). Con esto queremos decir,
que a mayor porosidad, los picos se ensancharán (mismo efecto que la variabilidad del
tamaño de partículas)

Por esta razón, ahora se apuesta fuerte por las columnas con partículas de núcleo
sólido. ¿Qué sacrificamos con esto? Ganamos resolución pero estamos perdiendo
superficie.

Para arreglar esto, se rodea al núcleo de la partícula con otras partículas de

tamaño muy pequeño, de unos 100 nm, con sus respectivo núcleo sólido, adquiriendo
una superficie altísima. Esto se traduce en cromatogramas casi perfectos (como el de la
imagen de arriba).
Estas columnas serían las ideales cuando queramos separar muestras con muchos
analitos de interés.
El uso de columnas de esta gama, suele emplearse para purificar productos de alta
calidad, como puede ser una vacuna. Esto no quita que la muestra haya que tratarla
anteriormente para que no tenga impurezas en exceso.
La dispersión espacial de las moléculas depende de la energía cinética de los
analitos. Si los analitos tienen alta energía cinética, difunden de forma más rápida. Esta
energía cinética depende de:
  La temperatura (mayor temperatura menos viscosidad)
 La viscosidad de la fase móvil (propia de cada sustancia)
 El peso molecular
 La concentración del analito.
¿Qué diferencia hay entre la viscosidad y la densidad?
La densidad es una relación entre la masa y el volumen; mientras que la viscosidad
se mide en cP (centiPoints), y esta seria la facilidad o dificultad que tienen las moléculas
de un fluido en rozarse unas con otras. Si existe mucho rozamiento significa que tiene
mucha viscosidad. Brevemente dicho, es la facilidad que tiene para difundir.
Si tengo una fase móvil muy viscosa, la capacidad de los analitos para difundir a
través de esta fase móvil será menor, porque le cuesta trabajo difundir a las propias
moléculas de la fase móvil. Si además, el analito tiene que pasar por medio de estas
moléculas, el esfuerzo que tiene que hacer para viajar a través de la fase móvil es grande.
Ejemplo: si vertemos en un vaso dos gotas de tinta, una muy concentrada y otra
menos concentrada, la gota concentrada difundirá más en el vaso en las tres
dimensiones de forma azarosa. Al ser mas viscosa, las propias partículas chocan entre sí
mucho más veces que la gota menos concentrada, debido a un mayor gradiente de
concentración.
Si tuviesemos esa gota en una columna sin introducir un flujo de la fase móvil, esta
difundiría también en las tres dimensiones (aunque de forma más costosa debido a la
existencia de tantas partículas), pero si introducimos flujo la difusión no sería igual en
las tres dimensiones del espacio.
La difusión en el eje vertical sería prácticamente la misma. Hacía el sentido de la
columna por donde entra el flujo no difundiría, y hacía el sentido del flujo se podría decir
que no le da tiempo de difundir. Si no lo imaginamos se formaría un cuadrado dentro
de la columna, lo que llamaríamos disco de difusión.
 Si ampliaramos ese disco de difusión nos encontrariamos que en el centro de este
disco la concentración del analito sería mayor que en las zonas alejadas del centro.

Lo primero que ocurre cuando el analito entra por la cabecera de la columna, es

que antes de pasar la primera capa de partículas, lo primero que hace es ocupar todo el
espacio de la columna (a tiempo cero). Conforme pasa a través de la fase móvil, el pico
(que inicialmente era fino como una aguja) se va ensanchando, ya que tiene más tiempo
para difundir, aunque en el centro del pico o disco de difusión siempre habrá más
cantidad de analito (a mayor tamaño de columna, mayor tiempo para difundir, picos
más anchos).
En los cromatogramas esto es palpable. Los primeros picos en aparecer son más
estrechos, mientras que los últimos son más anchos. Otra forma de estrechar los picos
sería forzandolo con un flujo mayor. No todo es cierto, de hecho esto favorece también
a la difusión.
La difusión en la columna depende de tres componentes.
  El primer componente es constante
 En el segundo componente, al aumentar el flujo , disminuye la difusión.
Llega un momento en el que casi se anula.
 El tercer componente (mayor o menor permeabilidad en las partículas) el
flujo aparece multiplicando, por tanto aumenta este aspecto negativo.
este es lineal
Aumentar la difusión disminuye la difusión, pero a la misma vez ensancha el pico.

Lo ideal sería el flujo que representa el mínimo de esta curva. Por eso casi siempre
se trabajan con los mismos flujos, moviéndonos en una orquilla entre 0,5 – 1,0 mL/min
(mínimo de la curva).
En la curva se habla de velocidad de la fase móvil, no habla de mL/min. Esto se
mide en cm/segundos, ya que depende del tamaño de la columna varía el flujo en
mL/min, pero hablamos siempre de la misma velocidad lineal. En el segundo gráfico
tenemos una correlación entre flujo en mL/min y el tamaño de la partícula de la columna
para igualar la velocidad lineal.

Conforme menor es el tamaño de la partícula menor es el tamaño de plato (H),

picos mas estrechos. Además, cuando trabajamos con partículas pequeñas no hay
apenas diferencias de H al cambiar el flujo (para 3 m es practicamente invariable)
Ejemplo: en las guías turísticas, siempre habrá gente que se detiene mucho y frena
al resto para ver un escaparate, y otros incluso entran. El guía sigue caminando y algunos
turistas siguen avanzando. Las personas que han entrado (han permeado en la
partícula), se dan cuenta de que el guía está lejos, el grupo está muy disperso y estirado.
 Respecto al tamaño del analito, a mayor peso molecular, menos difusión. Habría
que apartar más parctículas de la fase móvil para poder difundir. Ejemplo: en Semana
Santa, los niños se pierden rápido pero a un adulto le cuesta la vida apartar a gente.
La eficiencia se refiere al número de picos o analitos diferentes que es capaz de
separar esto se mide en platos teóricos (se habla de nº de platos / metros).
¿Cómo sabemos el nº de platos por metro?
El nº de platos teóricos sería la distancia entre la altura de la columna.
𝐿
𝑁=
𝐻
Esto no ocurre en la realidad, donde los teóricos serían picos finos como agujas,
puesto que aparecen picos anchos (menor nº de platos reales).
Esta sería la fórmula para calcular el nº de platos máximos de esa columna:

La fracción entre tiempo de retención y el ancho del pico es una constante. Con
esta fórmla podemos hacer un cálculo de cuantos analitos podremos separar, siempre
según el método. Eficiente es la columna, eficaz el método.

Hemos dicho que lo más eficiente sería tener el menor tamaño de partícula. No
todo iba a ser mejor. El precio que deberiamos pagar sería la presión necesaria.
 Ejemplo: si tenemos un cubo de playa y lo llenamos de piedra, no es necesario
aplicar presion para que fluja el agua. Si metiesemos arena le costaría mas pero tampoco
seria necesario. En cambio, si trabajamos con arcilla necesitariamos aumentar la presión
para que el agua fluya.
Al aumentar la presión estamos forzando toda las piezas, aumentando su desgaste
(cabezal bomba, tubing, mezcladores…)
En la gráfica vemos que si queremos pasar de 1,7 m a 1,0 m, o lo que es lo
mismo, aumentar la eficacia 70 %, deberiamos trabajar con una presión de un 780 %
mayor.

La resolución se cálcula así:

∆𝑡𝑟
𝑅𝑆 =
𝑤
̃

Es el cociente entre la diferencia del tiempo de retención, y la media de la anchura

de pico.
Hablamos de unos picos bien resueltos cuando Rs > 1,5.
Cuando los picos son más estrechos el tiempo de retención entre ellos es mayor,
mayor separación.
Es conveniente que sea 1,5 o ligeramente mayor, pero a medida que aumentemos
el valor de Rs no quiere decir que el método sea más eficaz. No interesa que haya mucha
distancia entre un pico y otro, ya que se alargan los tiempos y esta distancia entre un
pico y otro no nos aporta ningún tipo de información.
 Lo ideal sería la cuarta situación (y lo que siempre tenemos que buscar y
encontrar), sobretodo cuando trabajamos con normas de calidad. Si no es el caso, a
veces podemos conformarnos con una menor resolución y recurrir a la intregración
parcial de los picos para resoluciones Rs > 0,75 (truco).
El triangulo con línea continua en ambos picos se trata de un pico sin contaminar.
Por tanto podriamos integrar la mitad de un pico y multiplicarla por dos y tendriamos
una aproximación del área real del pico, suponiendo que el pico es totalmente simétrico,
lo cual no podemos asegurarlo, ya que no podemos imaginar que pasa entre los dos
picos.
La desviación estándar de los picos, siempre que sean simétricos se calcula
cortando el pico por la mitad, y despejando la anchura del pico en esta formula que es
siempre constante.
𝑤ℎ = 2,355 · 𝜎
 Eso es lo ideal, pero normalmente puede haber asimetría en los picos. Para ello se
corta el pico al 10 % de su altura y se divide las dos anchuras para darnos un coeficiente
de asimetría.

Si el pico tiene cola y frente, puede indicarnos de que la columna está mal, o que
las condiciones cromatográficas que estoy utilizando no son las mejoras.
Si todos los picos presentan la misma forma, y antes las cosas salían bien
estaríamos hablando de la primera situación.
Si pasa de forma aislada hablariamos de las condicioens cromatográficas. Pero no
siempre tenemos que alarmarnos, ya que hay analitos que se comportan de forma
diferente, tienen una característica especial, y es que el valro del coeficiente de partición
depende de su propia concentración:
[𝑆]2 𝐶𝑠
𝐾= = ≠ 𝑐𝑡𝑒
[𝑆]1 𝐶𝑚
Los analitos normales se comportan de esta forma:
 [𝑆]2 𝐶𝑠 0,1 𝑝𝑝𝑚 0,2 0,3
𝐾= = = = =
[𝑆]1 𝐶𝑚 1,3 𝑝𝑝𝑚 2,6 3,9
Estos analitos especiales se comportan así:
[𝑆]2 𝐶𝑠 0,1 𝑝𝑝𝑚 0,4
𝐾= = = ≠
[𝑆]1 𝐶𝑚 1,3 𝑝𝑝𝑚 6,1
Ejemplo:
Si vamos al centro y hay un bar lleno y otro vacío queremos ir al bar lleno.

Si aumenta K tenemos un pico con frente, y si disminuye nuestro pico tiene cola.
Que aparezca un pico con frente también puede significar que la columna esta
sobrecargada de ese analito en concreto. Puede darse el caso de que dentro de ese pico
(o debajo) pueda haber otro.
¿Qué debo hacer para ver que ocurre?
Pinchando menos volumen para ver si bajamos en el gráfico.

Hay analitos que subiendo la concentración aumenta su solubilidad con la fase

movil, disminuye K y aparece cola en el pico (y viceversa).
A parte de la columna tenemos otras variables que afectan direcatemente con al
eficiencia de las columnas:
 Eficacia de un método:
 Minimizar separación entre picos
 Minimizar tiempos retención (recortar un minuto por cada 10 minutos
podriamos recortar 2 horas cada 24)
 Maximizar alturas
 Minimizar anchuras
 Minimizar costes
Parámetros a recordar:
 Coeficiente partición
 Tiempo retención ajustado
 Volumen retencion
 Factor retención
 Numero de platos
 Tamaño de platos
 Resolución
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16/10/2018 (Clase ONLINE I)

SIMULADOR HPLC
¿Qué tipo de columna tenemos?
Nos fijamos en etilparaben (tr = 1,07) , en propilparaben (tr = 1,78) y el butilparaben (tr
= 3,16). El más hidrofóbico es el de mayor cadena, el butilparaben.
Si el más hidrofóbico sale el último (mayor apetencia por fase estacionaria, mayor K), la
naturaleza de nuestra columna será hidrofóbica, fase reversa.
Con las fenonas pasa igual, siendo el más hidrofobo la benzofenona.

19/10/2018

La pre-columna tiene como misión proteger a la columna. ¿Cuándo merece la

pena tener una? Se suele utilizar cuando se utilizan muestras que tienen componentes
que se enlazan fuertemente con la fase estacionaria. Las características de esta (tipo de
fase, tamaño de partículas y demás) tienen que ser semejantes a la columna, pero de
menor tamaño (suele ser de 1 cm).
En los casos en los que es necesario, si no la instalasemos puede alterar tiempo de
retención, ensanchamiento de picos, en definitiva, afectar a la resolución

Hay varios criterios de separación en columna LC: fase normal, reversa,

intercambio iónico, exlusión por tamaño (filtración), afinidad y quiralidad (para
separación de mezcla racémica). Para elegir correctamente el critorio, deberiamos
conocer correctamente las características químicas de nuestros analitos: pKa, Log o/w,
disociación, solubilidad…
Podemos consultar la base de datos PubChem para conocer los analitos.
 Separación por hidrofobicidad (la más común, entre ellas superan el 80 %
de las publicaciones existentes)
o Fase normal: se utiliza para separar compuestos hidrofóbicos como
los aceites, grasas, lípidos, fosfolípidos,… (industria petroquímica)
Para mover estas sustancias a través de la columna necesitamos
disolventes orgánicos (apolares) fuertes como el hexano,
cloroformo, alcoholes,… Ejemplo: C18
o Fase reversa: la más utilizada de las dos (industria farmacéutica),
normalmente utilizada para sustancias biológicas (solubles en
agua) por lo que utilizaremos como fase móvil alcoholes de cadena
corta, acetonitrilo, tampones,... Ejemplo: aquellas que no tengan la
ramificación C18 y acaban con grupos –OH ó aminos.
  Intercambio iónico: empleada para separar iones inorgánicos, ácidos,
bases,... (tienen que ser disociables, tener cargas). Fase móvil suelen ser
disoluciones iónicas, tampones,…
 Exclusión por tamaño: separa polimeros, proteinas, ácidos nucléicos,…
Fase móvil empleada disolvente orgánicos, tampones,..
 Afinidad: empleado para enzimas y sustratos, proteínas,… Fase movil
disolución acuosa, tampones…
 Quilaridad: separa enantiomeros (azúcares D,L; isómeros R,S). Se utilizan
disolventes orgánicos y acuosos.

¿Cómo elegir el tipo de separación?

1. Mi analito de interés, ¿qué tamaño tiene? Consideraremos pequeña si

tienen menor de 2000. Nunca podremos separarla por exclusión por
tamaño.
2. ¿Mi analito es soluble en solvente orgánico o en agua?
3. Si es soluble en solvente orgánico, ¿es soluble en solventes orgánicos
polares, o apolares?
4. Si es soluble en agua, ¿prefiere solvente ionico o no iónico? ¿Se disocia o
no se disocia?.
Columna fase normal de sílice
 La fase móvil debe tener pH y composición compatible con la fase
estacionaria.
 El relleno se hidroliza a pH mayores de 8, sin embargo se comportan bien
con fases móviles ácidas (entre pH 2-8)
 Compatibles con fase móvil acuosa
Hidrofobicidad: C30 > C18 (lo habitual) > C8 (especial para pH más bajos de 2)
Si queremos separar un analito muy hidrofóbico, deberiamos tener una columna
hidrófoba o reversa, pero no habría que irse a una columna muy hidrófoba, porque el
valor de K sería muy elevado, y esto se traduciría en tiempos de retención muy largos.

Colapso de columna (o colapso hidrofóbico). Cuando introducimos agua en un

sistema hidrofóbico, se separa inmediatamente. Esto produce una deshidratación,
situación reversible si le introducimos una fase móvil que no sea tan polar, o
directamente algo apolar. Se produce una separación de fase y el analito o se va
completamente a un lado o al otro, no produciendose una buena separación. Essto se
puede evitar metiendo como mínimo un 10 % de metanol (o menos del 10 % si es
propanol que es más hidrofóbico)
Serie hidrofóbica-hidrofílica:
 Propanol  Etanol  Metanol  Agua  Disoluciónes/ tampones salinos
(hidrofílico)
26/10/2018

Matrices de intercambio iónico

Los tiempos de elución dependeran de la carga del analito en cuestión y de cómo
interacciona con la fase estacionaria, que también deberá tener carga (resina iónicas).
La superficie de estas resina en vez de tener grupos C18, tienen grupos ácidos, grupos
aminos,… que tienene carga eléctrica.
Estas resinas intercambiadoras podrán clasificarse en dos grupos: aniónicas y
catiónicas.

La forma de encontrar la resina ideal es elegir resinas débiles para analitos fuertes,
o viceversa, nunca resinas fuertes con analitos fuertes.
Una base fuerte, cuyo pKa es alto, la base siempre está disociada, siempre tiene
carga. Ejemplo: el amoniaco lo echamos en agua y siempre es amonio NH4+.
Si tiene un pKa bajo (base débil), tendrá carga en un mayor o menor porcentaje.
Lo ideal sería encontrarnos en la parte derecha del equilibrio, donde la base está
protonada, y tiene carga, ya que B al no tener carga no podríamos separarlo por este
método.
𝐵 0 + 𝐻 + ↔ 𝐵𝐻 +
𝐵𝐻 +
En función del porcentaje 𝐵0 (%), será el tiempo que estará protonada, y por
tanto el tiempo que estará atraida por la fase estacionaria.
Si pongo unas condiciones en el que este porcentaje esté cercano al 100 %, tendré
siempre la especie protonada (podríamos subir la temperatura para ayudar a que esté
protonado, pero tambien dificultariamos la interacción con la fase estacionaria).
 La mejor forma de jugar con esto sería modificar la fase móvil, donde utilizariamos
una bajada de pH para que la especie se encuentre protonada en la mayoría del tiempo.
Salen primero las bases más débiles, las bases más fuerte (protonadas) se retienen
más con la resina iónica.
Ejemplo: tenemos pH 5.4; y el valor de k de los últimos analitos de interés es mayor
de 20. La mejor opción sería meter un gradiente de pH, elevando el pH, para que estos
últimos analitos no se encuentren “tan protonados”, su retención será menor al estar
menos cargados, y saldrán antes en el cromatograma.
Si tenemos una base con pKb = 14, necesitariamos un pH muy ácido, lo cual no
aguantaria la resina (mirar diapositiva problemática pH, donde no podíamos bajar de pH
2 con columnas normales). En este caso con la fase móvil no podriamos hacer nada.
Lo ideal sería tocar la fase estacionaria, aunque siempre respetando la fase
estacionaria negativa (ácida).
Si para las bases débiles empleabamos fases estacinarias formadas por ácidos
fuertes, como el sulfúrico o nítrico; en el caso de bases fuertes, utilizariamos una
columna con grupos ácidos débiles, como el acético.
ANALITOS COLUMNAS
Fuerte Débil
Débil Fuerte

En el caso contrario, si queremos separar ácido débiles, emplearemos una resina

catiónica fuerte con grupos amino. Si como en el ejemplo de antes, tenemos los últimos
analitos con valores de k > 20; introduciriamos un gradiente de pH el cual el pH irá
bajando. Si bajamos el pH (añadimos protones), el equilibrio se desplaza para la derecha,
y al no tener carga no tiene capacidad para retenerse en la fase estacionaria.
𝐴− + 𝐻 + ↔ 𝐴𝐻

El valor pKa significa lo siguiente:

𝑝𝐾𝑎 = − log 𝐾𝑎
¿Qué pasa cuando pH = pKa?
El ácido se disocia y se asocia al 50 %. Por tanto, un ácido fuerte tiene un pKa
bajo.
¿Si tenemos un pH = 3, que ácido sería más fuerte, el de pKa = 5.5 ó pKa = 1.5?
Con pH = 3, el ácido con pKa 1.5 se encuentra más protonado.

Si tengo una fase estacionaria de una base orgánica (¿débil o fuerte?), y tenemos
un pH ácido, la base estará protonada. Si queremos sacar antes los últimos analitos, lo
que aremos es subir el pH para hacerlo más básico, por tanto la base no estará
protonada (no tendrá carga), y por tanto, los analitos tendrán mayor afinidad por la fase
móvil y no quedarán retenidos por la fase estacinaria.

La forma de elegir el grupo de la fase estacinaria sería irse al catálogo y mirar los
valores de pKa.

Cuando ya llegamos a pH límites, como pH = 2, la alternativa es aumentar la fuerza

iónica de la fase móvil, dificultando la interacción de analito-fase estacionaria.
Por ejemplo, si introducimos mayor porcentaje de acetato de amonio se disocia
en Ac-NH4+, donde a pH ácido, los acetatos se unirán rápidamente a las cargas positivas
de la fase estacionaria básica que al tener pH ácido se encontraran protonadas (carga
positiva).
 En este tipo de separación, el detector ideal sería por conductividad (detección
directa).
Supresión iónica
Con el gradiente iónico, la señal de fondo irá aumentando, y los picos irán
“subiendo” (ver apuntes). Habrá un momento que habrá tal cantidad de fuerza iónica
que saturará el detector y se manifestará como una linea horizontal, lo cual a partir de
ahí perderemos picos, y los cercanos a esta saturación no serían muy fiables (los
detectores en los límites de trabajo no son lineales).
Esto podríamos solucionarlo con supresores iónicos, que són unos tubbin que está
entre la columna y el detector conductivímetro que llevan un revestimiento por donde
circula agua (𝐻 + + 𝑂𝐻 − ↔ 𝐻2 𝑂) a contracorriente. Entre el tubbin y el revestimiento
de agua se encuentra una membrana semipermeable, solo dejando pasar determinados
compuestos (iones de bajo peso molecular como acetato), a los cuales se le aplica un
campo eléctrico.

Ejemplo: pasa una sal de KCl.

Si generamos campo eléctrico negativo, del tubbing pasaría la membrana
semipermeable los cationes K+, y esto sería reemplazado por los protones del agua.
Si generamos campo eléctrico positivo, se irá los aniones Cl-, y lo sustituirá los
OH-
Si nuestra fase móvil es HCl, generamos un campo positivo, los cloruros se irían,
y lo sustituiría los grupos hidroxilos, formando agua, que no se detectaría por el
detector, lo que se traduciría en un cromatograma lineal de nuevo.

Cromatografía de par iónico

Quizás no tengamos presupuesto para comprar una columna iónica. En estos
casos, se podría convertir una columna C18 hidrofóbica en una columna de separación
iónica, introduciendo una fase móvil que contiene SDS (dodecilsulfato sódico). Se utiliza
esta porque es un detergente muy anfipático (tiene una parte muy polar y otra parte
muy apolar).
Como la fase móvil (C12) es hidrofóbica y tenemos una columna hidrófoca (C18),
ambas se atraen, lo que se traduciría en una saturación de la columna, ya que se
quedaría fuertemente retenida. Además, quedarían en la parte externa de la resina unas
“cabezas de sulfato” cargadas negativamente, ya que los cationes sodio se disuelven
fácilmente. En este caso ya no se separaria los analitos por hidrofobicidad, sino que
tendríamos una columna de intercambio iónico.
Si despues queremos dejar la columna como estaba en un inicio deberíamos
limpiar la columna con una fase móvil fuertemente APOLAR (hexano, propanol,
butanol,…), ya que la parte hidrofóbica del SDS tiene más afinidad por estas fases
móviles apolares que por el relleno de la columna. El hexano con el agua no se lleva bien,
por tanto deberíamos ir metiendo un gradiente cada vez más apolar.
Cromatografía de filtración
 Los compuestos más pequeños salen más tarde ya que penetran más facilmente
por los poros de la fase estacionaria y “se entretiene” más tiempo.
Matrices de afinidad
Yo pido por catálogo una fase estacionaria con corazón de silice o polímero
correspondiente, y en la superficie tiene glucosa. Si quiero que se retenga mi analito
este tiene que tener afinidad por la glucosa. Se podría decir que separariamos analitos
por afinidad biológica.
¿Qué hago si la proteina se queda fuertemente adherida a la glucosa?
Hay que darle lo que quiere, habría que meter un gradiente de glucosa para que
se fueran con la fase móvil y se liberen de la fase estacionaria.
La elución en este caso dependera de la afinidad por la fase estacionaria, que se
medirá en Km.
Matrices quirales
Son aquellas capaces de separar isómeros. El método de separación es por la
estereoselectividad. Ideal para separar mezclas racémicas. En esta tecnología en el
cromatograma solo aparecerá uno o dos picos.
Preparación de muestras
En algunos casos la muestra no se puede inyectar directamente, y es necesario
tratar la muestra.
Uno de esos tratamientos sería una extracción orgánica, con dos solventes que
son inmiscibles entre ello. Se producirá una separación acorde a la solubilidad entre un
solvetne y otro
[𝑆1 ]
𝐾=
[𝑆2 ]
En este caso aunque se disuelva mejor en un disolvente mejor que en otro, habrá
una parte de muestra que se quede retenida en la fase donde es menos soluble.

Aunque la proporción sea la misma, mientras más solvente de uno meta más
cantidad se irá a este.
 Supongamos que el 75 % se va al solvente 2 y el 25 % al solvente 1. Hemos perdido
un cuarto de muestra, pero si sobre ese 25 % que ha quedado en el solvente 1, le
hacemos otro ciclo de lavado, conseguiremos arrastrar un 75 % de ese 25 % inicial.

Con tres ciclos conseguiriamos un 87,5 % del inicial. Manteniendo el volumen 1:1,
si elegimos un buen disolvente (mayor eficiencia) podremos elevar mucho el porcentaje
de analito extraido.
Esto quiere decir, que es muy importante extraer el analito, y elegir bien el
solvente para hacerlo.
Efecto del carácter ácido/base
Supongamos una base neutra, que se encuentra en equilibrio del 50 %. La fase
ionizada es más soluble en la fase acuosa (S1), y la otra en la fase orgánica.
En este caso tendremos dos valores de K.
Si quiero forzar que esta base neutra se me vaya al solvente orgánico, tengo que
subir el pH, para quedarme con la base sin carga y protones.
Solvente de la muestra
El solvente utilizado para extraer el analito de la muestra, debe ser parecido a la
fase móvil.
06/11/2018 (Clase ONLINE 2)