Guia de Practicas Microbiologia 2019 PDF

Universidad Nacional Mayor de San
Marcos
Universidad del Perú (DECANA DE AMÉRICA)
FACULTAD DE FARMACIA Y
BIOQUÍMICA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y
PARASITOLOGÍA BÁSICA Y APLICADA
E.A.P. TOXICOLOGÍA
GUÍA DE PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA GENERAL
ELABORADO POR:
 MG. JULIO REYNALDO RUIZ QUIROZ

 DRA. MARIA ELENA SALAZAR SALVATIERRA
 Q.F. ROBERT DANTE ALMONACID ROMAN
2019
GUÍA DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA GENERAL - 2019 E.A.P. TOXICOLOGÍA
INDICE
4 PRESENTACIÓN
5 NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO
6 PRACTICA I: INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PREPARACIÒN

DE MEDIOS DE CULTIVO
 Reconocimiento de equipos, aparatos y materiales de laboratorio, horno,
autoclave, estufa de incubación.
 Preparación de medios de cultivo.
 Proceso de esterilización por calor seco y calor húmedo.
12 PRÁCTICA II: TÉCNICAS DE CULTIVO

 Siembra en medio líquido, sólido y semisólido.
 Lectura de colonias, estudio de crecimiento microbiano.
 Caracterización de las colonias de los microorganismos.
18 PRÁCTICA III: TINCIONES MICROBIANAS

 Preparación de frotices bacterianos.
 Coloración por tinción simple y tinción diferencial Gram.
 Coloración de bacterias ácido resistentes.
 Tinción de estructuras microbianas: cápsula, pared celular y esporas.
27 PRÁCTICA IV: GENÉTICA MICROBIANA Y ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS

 Genética microbiana:
 Obtención de mutantes resistentes a antibióticos.
 Obtención de mutantes resistentes a la luz ultravioleta.
 Acción de agentes físicos y químicos:
 Enfrentar microorganismos a la acción de desinfectantes
 Enfrentar microorganismos a la acción de antisépticos.
36 PRÁCTICA V: NUTRICIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

 Requerimientos nutricionales mínimos para el crecimiento microbiano
(nutrientes, pH, temperatura, y demanda de oxigeno).
42 PRÁCTICA VI: METABOLISMO MICROBIANO

 Metabolismo de carbohidratos (oxidación y fermentación) en bacterias
 Metabolismo de proteínas: Hidrólisis de caseína
 Metabolismo de lípidos: Hidrólisis de lecitina y ácidos grasos.
47 PRÁCTICA VI: INTRODUCCIÓN A LA INMUNOLOGIA

 Reconocimiento de órganos linfoides.
 Reacciones antígeno-anticuerpo.
56 PRÁCTICA VII: BACILOS GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES, NO FERMENTADORES Y

FERMENTADORES OXIDASA POSITIVOS
Enterobacterias patógenas
Cultivo e identificación bioquímica de:
Escherichia coli, Salmonella, Shigella.
Enterobacterias oportunistas
 Klebsiella, Enterobacter, Proteus y Serratia.
Bacilos Gram negativos no fermentadores y fermentadores oxidasa positivos
 Pseudomonas, Alcalígenes, Acinetobacter, Aeromonas y Vibrio cholerae.
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Departamento de Microbiología y Parasitología Básica y Aplicada. pág. 2
65 PRÁCTICA VIII: BACILOS GRAM POSITIVOS Y COCOS GRAM POSITIVOS

Bacilos Gram positivos no esporulados aerobios
Cultivo e identificación bioquímica de :
 Lactobacillus
Bacilos Gram. Positivos esporulados: aerobios
Cultivo e identificación bioquímica
 Bacillus subtilis Y Bacillus cereus
Cocos Gram positivos
Cultivo e identificación bioquímica de :
 Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis
 Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae
76 PRÁCTICA IX: VIROLOGÍA

Aislamiento de bacteriófagos
78 PRÁCTICA X: MICOLOGÍA
 Cultivo de levaduras y mohos ambientales.
 Cultivo de dermatofitos
81 PRÁCTICA XI:
PARASITOLOGÍA BÁSICA
85 REFERENCIAS BILIOGRÁFICAS
86 ANEXOS:
 ANEXO1: MEDIDAS DE EMERGENCIA
 ANEXO 2: BIOSEGURIDAD
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PRESENTACIÓN
La Microbiología, es una ciencia relativamente nueva con respecto a otras ramas de la Biología.
El estudio de los microorganismos se inició a partir de que Antonie Van Leewenhoek, en 1670
inventó el microscopio, y que a partir de los estudios de Luis Pasteur en 1876, se logró el mayor
desarrollo y reconocimiento de los microorganismos como actores de una gran diversidad de
procesos.
Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de enfermedades
en plantas, animales y humanos también es cierto que desde la antigüedad algunas especies
microbianas han sido utilizadas en procesos de producción de alimentos fermentados como
quesos, vino, pan y cerveza, entre otros y actualmente se ha reconocido su importancia en
diversas áreas de investigación básica, en la industria alimentaria, ambiental y toxicología.
El objetivo general del curso práctico de Microbiología General es que el alumno se inicie en el
conocimiento de la biología básica de los microorganismos, en sus características morfológicas,
nutricionales de crecimiento, control y que adquiera las habilidades necesarias para su
manipulación necesarias para su manipulación en el laboratorio.
Esta guía está dirigida a estudiantes que iniciarán sus experiencia en el manejo de los
microorganismos, por lo que consideramos de gran importancia incluir al principio del mismo una
serie de recomendaciones necesarias con las reglas generales del laboratorio y los principales
procedimientos que el estudiante deberá aprender, para que manipule en forma adecuada a los
microorganismos y garantizar tanto su seguridad como la de sus compañeros.
Esta guía contiene 13 semanas de prácticas, diseñadas para que el estudiante se familiarice
gradualmente con los procedimientos de cultivo y observación de bacterias y hongos. El orden
de presentación corresponde al curso de Microbiología General, ciclo 2019–I, de la Escuela
Académico Profesional de Toxicología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad
Nacional Mayor de San Marcos.
En cada práctica se presenta una introducción teórica para facilitar la comprensión del tema,
seguida de los objetivos, materiales necesarios y procedimientos en forma de instrucciones que
se complementan con algunas figuras y esquemas.
Posteriormente, en cada práctica se proponen formas de presentación de los resultados.

También se incluyen preguntas en forma de cuestionarios que el estudiante deberá resolver
consultando los materiales bibliográficos sugeridos al final de esta guía.
Los Autores
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NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

INSTRUCCIONES GENERALES
El alumno deberá presentarse a las clases prácticas:
 Puntualmente (máximo 10 minutos de tolerancia).
 Con mandil blanco y limpio
INSTRUCCIONES ESPECÍFICAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

 No ingresar al laboratorio con: mochilas, portafolios, carteras, etc.
 Está terminantemente prohibido salir del laboratorio una vez iniciada la práctica.
 Evitar los movimientos innecesarios que favorezca el movimiento del aire y promueva la
contaminación del ambiente.
 No abrir las ventanas durante el desarrollo de las prácticas
 No participar en los trabajos si se está resfriado o si se tiene heridas en las manos
 Lavarse las manos antes y después de cada sesión de trabajo.
 Evitar el contacto de las manos y lapiceros con la boca nariz y ojos.
 El acceso al laboratorio de prácticas sólo se permite a los alumnos que estén realizando las
prácticas. No se admiten visitas por razones de seguridad.
 Comunicar inmediatamente al responsable cualquier incidente en el laboratorio por pequeño
que sea.
 Conservar su mesa de trabajo limpio y ordenado todo el tiempo.
NORMAS A SEGUIR EN EL LABORATORIO
 Cada alumno debe llevar a todas las prácticas: guía de prácticas, marcador de vidrio,
encendedor y lapiceros.
 Limpiar la superficie de la mesa de trabajo con una solución desinfectante al principio y al
final de cada sesión de laboratorio.
 Rotular las muestras y material empleado con T1, T2, T3 ó T4.
 Manipular las muestras con instrumentos estériles, nunca directamente con las manos.
 Se deben usar los mecheros con precaución, no dejando material inflamable cerca y evitando
el posible contacto con pelo y ropas. Se comprobará que se ha apagado el gas al finalizar el
experimento y al abandonar el laboratorio.
 Las operaciones de manipulación de muestra (siembra, repicado, diluciones, etc.), se
realizaran siempre cerca del mechero.
 Colocar las pipetas y portaobjetos usados en un recipiente con desinfectante.
 El material ya utilizado se debe colocar en recipientes especiales rotulados para evitar
confusión.
 Si se derrama o quiebra un recipiente con material contaminado no tocar nada y avisarle al
responsable del laboratorio (ver anexo 1).
 Está prohibido pipetear con la boca.
 Trabajar siguiendo normas de bioseguridad (ver anexo 2).
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PRÁCTICA I: INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA
 Reconocimiento de equipos, aparatos y materiales de
laboratorio, horno, autoclave y estufa de incubación.
 Preparación de medios de cultivo.
 Proceso de esterilización por calor seco y calor húmedo.
RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS, APARATOS Y MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave: Aparato en el que se logran temperaturas superiores a la

temperatura de ebullición del agua por medio de un aumento de presión,
funciona a 15 lb/pulg2 (1,18 kg/cm2) por encima de la presión atmosférica.
Al mantener una temperatura de 121ºC por 15 minutos, se logra la
destrucción de toda forma de vida, es decir se logra la esterilización
mediante el vapor de agua, en la cual se produce la coagulación de
proteínas estructurales y enzimas bacterianas cesando así su función
biológica.
Horno: Es utilizado en operaciones que requieren calor muy intenso, como

la desecación y esterilización de materiales mediante el calor seco, se
realiza a una temperatura no menor de 170 ºC por una hora. Se pueden
esterilizar placas Petri de vidrio; recipientes vacíos de vidrio, porcelana y
metal, los recipientes salen secos a diferencia del autoclave.
Estufa de Incubación: Es utilizada para lograr el

crecimiento de los microorganismos en un tiempo
más corto, gracias a que la temperatura es de 37 ºC
(temperatura óptima de crecimiento de bacterias).
También se tiene estufas a 42 ºC, 28 ºC, etc.;
dependiendo de la temperatura óptima del
microorganismo que estemos utilizando.
Asa de Siembra: Un asa de siembra o

asa bacteriológica es un instrumento de
laboratorio tipo pinza que consta de una
base de platino, acero, aluminio y un
filamento que puede ser de nicromo,
tungsteno o platino que termina en aro o
en punta; también existen asas de
siembra descartables de plástico. Se emplean para arrastrar o transportar microorganismos de
un medio a otro para su adecuado desarrollo, así como para la realización de frotis.
Placas Petri: La placa de Petri, es un

recipiente circular de vidrio o de
plástico. En microbiología, la placa
de Petri se utiliza para poder mezclar
una muestra con algún reactivo, o
poder mezclar, por ejemplo, sales,
nutrientes, aminoácidos, e incluso
antibióticos. Cuando la muestra se
solidifica, se crean colonias de
bacterias que están preparadas para recibir “tratamiento microbiológico”.
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ESTERILIZACIÓN
Proceso por el cual se elimina todo agente microbiano de una superficie inerte o no inerte.
La esterilización se puede conseguir por agentes físicos, químicos o mecánicos.
Agente Sistema de Esterilización Método

Calor húmedo Autoclave
Incineración y flameado
Calor seco Estufa Pasteur
FISICO Horno Poupinell
Ionizantes (rayos γ, x)
Radiaciones No ionizantes (rayos UV, IR)
Oxido de etileno (OE)
Gases Formaldehído
QUÍMICO
Alternativos del OE
Líquidos Glutaraldehído, etc.
Sónicas
MECÁNICO Ondas
Supersónicas
ELIMINACIÓN Y LIMPIEZA DE MATERIAL CONTAMINADO

En Microbiología es necesario una pulcra y esmerada limpieza del material. Asimismo es
importante la recuperación del material reciclable y la eliminación del material desechable.
Todos los objetos sucios o contaminados deben recogerse en recipientes adecuados. Debido a
que los objetos contaminados tienen una cantidad importante de materia orgánica, se
recomienda usar mayores concentraciones de desinfectante y tiempos más largos de tratamiento
que para la desinfección o esterilización de material limpio.
Generalmente para la eliminación y limpieza de material contaminado se usa el autoclave a 20
lb/pulg2 por 20 – 30 min. Una vez efectuado el tratamiento, se procede a su lavado, sumergiendo
el material en agua caliente jabonosa o utilizando detergentes, mezcla crómica u otros. Para un
descarte total de material microbiológico contaminado se usa el método de incineración.
PROCESO DE ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO Y CALOR

HÚMEDO
La esterilización tiene por objeto eliminar todas las formas viables
de los microorganismos, así como las formas latentes o esporas. La
susceptibilidad de los microorganismos al tratamiento térmico está
en función de la especie, su estado vegetativo o esporulado,
temperatura-tiempo, naturaleza del medio, duración del tratamiento
y número de gérmenes. El calor seco oxida a las proteínas y
otras moléculas mientras que el calor húmedo produce la
coagulación de proteínas.
PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL

El material que va esterilizarse debe prepararse de tal manera que
se conserve sin contaminar una vez esterilizado.
En el caso de materiales de vidrio (tubos, matraces, etc.) se tapan

con algodón o con tapones metálicos. Además cuando se usa algodón, ha de cubrirse éste con
papel kraft.
En el caso de las pipetas, se le coloca en la boquilla un trocito de algodón que actuará como
filtro. Una vez preparado el material se introduce el estuches o cajas metálicas o se envuelven
individualmente con papel kraft.
Las soluciones y medios de cultivo líquidos se envasan en matraces, frascos o tubos y se

esterilizan, generalmente, en autoclave. Tener cuidado con algunos medios de cultivo ó
suplementos de los mismos, que no son autoclavables (ej. Agar XLD, vitaminas, etc.).
Existen varios métodos para llevar a cabo el proceso de esterilización y la elección de un método
determinado viene condicionado por el tipo de material que se quiere esterilizar.
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OBJETIVOS
Conocer la importancia de la esterilización y familiarizarse con el manejo de los procedimientos
más frecuentemente utilizados para llevarla a cabo.
EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS y REACTIVOS

 Horno Pasteur Sabías que…
 Autoclave El calor húmedo elimina los microorganismos a
 Materiales a tratar (Placas Petri, pipetas, tubos, viales, temperaturas menores, ya que la presencia de agua
acelera la rotura de los puentes de hidrógeno
 matraces) responsables de la estructura terciaria de las proteínas,
 Papel Kraft haciendo que éstas se desnaturalicen y pierdan por tanto
su funcionalidad.
PROCEDIMIENTO
Acondicionamiento del material para esterilizar

Acondicionar el material para la esterilización, en el caso de pipetas, viales y matraces, hacer
sus respectivos tapones de algodón y luego proceder a envolverlas con papel Kraft.
En el caso de las Placas Petri, agruparlas en grupos de 2 o 4 y con la tapa para abajo y envoverlas
con papel kraft.
Esterilización por calor seco

Colocar en el horno el material debidamente acondicionado (pipetas, matraces, tubos y Placas
Petri) y encender el horno. Se utiliza para este proceso una temperatura de 170 ºC por 1 hora.
Esterilización por calor húmedo

Colocar el material debidamente acondicionado, por
ejemplo tubos con medio de cultivo, en el autoclave.
Proceder a realizar el autoclavado, teniendo en cuenta los
parámetros de esterilización para material limpio que son:
 Presión: 15 lb/pulg2
 Tiempo: 15 minutos
 Temperatura: 121 ºC
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Describa los pasos para el manejo del autoclave usado en el laboratorio de Microbiología:
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PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo son soluciones acuosas de sustancias nutritivas orgánicas e inorgánicas
y de principios activos, que en condiciones adecuadas de temperatura, humedad, tensión de
oxígeno, CO2, pH, y potencial redox, favorecen el crecimiento de microorganismos para el
estudio de sus propiedades morfológicas y bioquímicas. Los medios de cultivo contienen
sustratos nutritivos como fuente de carbono, nitrógeno, y energía, factores de crecimiento,
agente gelificante (agar), sustancias inhibidoras e indicadores de pH.
Algunos microorganismos pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo,
otros microorganismos necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en
ninguno de los medios desarrollados hasta ahora.
Todos los medios de cultivo deben cumplir los siguientes requisitos:
 Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del microorganismo que se
siembra.
 Han de mantenerse estériles hasta el momento de la siembra.
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el laboratorio, la
mayoría de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando algunos sólo la adición de agua
o la esterilización.
Los medios de cultivo pueden clasificarse:
A) Por el estado físico en que se encuentran en:
1.-Medios líquidos o caldos: Son aquellos que contienen, disueltos en agua, los nutrientes
necesarios para el crecimiento de los microorganismos.
2.-Medios sólidos: Contienen nutrientes disueltos en agua pero se les añade un agente
solidificante, el agar. El agar es un polisacárido complejo que se obtiene de algas rodofíceas de
origen marino cuyas propiedades son de gran utilidad en la preparación de medios de cultivo
sólidos: No es degradado enzimáticamente por los microorganismos (a excepción de algunos
microorganismos de ambientes marinos), funde aproximadamente a 100ºC y permanece en
estado líquido mientras la temperatura no descienda por debajo de 45-50ºC.
Generalmente el agar se añade a una concentración de 10-20 g/L ó mayor. Los medios con agar
se envasan en tubo o en placa de Petri.
3.-Medios semisólidos: Son similares a los medios sólidos, pero la concentración del agente
solidificante es menor, generalmente ≤ 2,5 g/L con lo que, una vez solidificados mantienen una
consistencia gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, para determinar la movilidad de los
microorganismos.
B) Por su composición
1.-Medios complejos: Contienen todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de muchos
tipos de microorganismos, pero no se conocen todos los componentes que forman parte de ellos,
ni las concentraciones exactas de cada uno de ellos. Por ejemplo medios que tienen extracto de
carne o levadura.
2.-Medios definidos: Son aquellos que contienen los distintos nutrientes en forma de productos
químicos puros (pero no extrapuros) y en concentraciones conocidas. Así, un medio definido que
permita el desarrollo de un microorganismo heterótrofo y "poco exigente", como E. coli, debería
contener sales inorgánicas y fuentes de carbono y nitrógeno: MgSO 4, KPO4H2, Na2PO4H, glucosa
y NH4Cl.
C) Por su utilización
1.- Medios generales en los que se pueden desarrollar una gran variedad de microorganismos
con distintos requerimientos nutricionales. Ej. Agar nutritivo, agar tripticasa soya, etc.
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2. Medios de enriquecimiento: son medios líquidos o semisólidos, contienen sustancias que

estimulan el crecimiento de los m.o. permitiendo el desarrollo de la población microbiana a partir
de un número reducido de celulas de un m.o. en presencia de otros. Ejemplos: caldo selenito,
caldo Mossel, caldo Rappaport Vassiliadis, etc.
2.- Medios selectivos: Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo determinado de
microorganismos, inhibiendo el desarrollo de los demás. Algunos de estos medios contienen un
agente selectivo como antibióticos, productos químicos, colorantes, etc. Ej. Agar jugo de tomate
(para lactobacillus), agar feniletanol (para Staphylococcus y Streptococcus), etc.
3.- Medios diferenciales: Son aquellos diseñados para distinguir unos microorganismos de
otros, a partir de una población mixta, por la apariencia distinta que toman sus colonias. Estos
medios de cultivo ponen de manifiesto propiedades que un determinado tipo de microorganismo
posee. Por ejemplo, el agar sangre es un medio nutritivo enriquecido y es a la vez un medio
diferencial, ya que permite reconocer aquellos microorganismos capaces de producir hemólisis.
OBJETIVO
Conocer y aprender la preparación de los diferentes medios de cultivo.
EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS y REACTIVOS

 Agar tripticasa soya (TSA)  Frascos de vidrio
 Agar-agar  Papel Kraft
 Caldo tripticasa soya (TSB)  Placas Petri
 Agua destilada  Tubos de ensayo
 Algodón  HCl 0,1N
 Autoclave  NaOH 0,1N
 Cocinilla u horno microondas
PROCEDIMIENTO
Medio sólido:
La preparación de un medio sólido se puede hacer de dos maneras: Preparar el caldo y añadir
agar-agar al 15 g/L o bien utilizar un medio sólido comercial (ej. agar tripticasa soya).
Una vez pesado el medio de cultivo deshidratado para un volumen determinado de agua, se
reconstituye en agua destilada, dejamos hidratar el polvo y agitamos hasta disolver los
componentes, calentando la mezcla hasta ebullición. No olvidar regular el pH (con HCL 0.1 N ó
NaOH 0.1 N), de acuerdo a lo indicado en frasco de medio de cultivo. El medio preparado se
distribuye en tubos de vidrio o en frascos, luego se taponan estos y se envuelven en papel Kraft
para llevar a esterilizar. La esterilización de los medios de cultivo se realiza en autoclave a 121ºC,
15 libras de presión/pulg2 por 15 minutos.
Los medios sólidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en posición vertical, si van a ser
inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al solidificarse en esa posición
adopte la forma inclinada que proporciona una mayor superficie de siembra.
Si se desean preparar placas de Petri, se utilizará el medio de cultivo que ha sido esterilizado en
un matraz o frasco y, una vez atemperado, se verterá en placas estériles vacías en un ambiente
aséptico, como el que proporciona la proximidad de la llama de un mechero o una campana de
flujo laminar.
Medio semisólido:
Pesar el TSB en cantidad suficiente para el volumen deseado y añadir agar-agar a la
concentración de 2,5 g/L. Adicionar agua destilada, mezclar y calentar hasta disolver (a 100
ºC), medir el pH y repartir en tubos en caliente, acondicionar y autoclavar.
Caldo:
Pesar la cantidad suficiente del medio TSB para el volumen deseado, adicionar agua destilada y
disolver completamente, verificar el pH, repartir en tubos y autoclavar.
Para balancear el pH, se utiliza NaOH 0,1 N ó HCl 0,1 N.
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En la presente práctica se prepararán: Caldo tripticasa soya, medio semisólido y agar tripticasa
soya.
RESULTADOS
Anote los cálculos del medio que le tocó Sabías que…
Hacer en la práctica Si se han de incorporar al medio compuestos
termolábiles, como vitaminas o antibióticos, se
esterilizarán éstos por filtración y se añadirán al medio
de cultivo previamente esterilizado en autoclave y una
vez que este se haya atemperado. En todos los casos se
han de seguir las instrucciones del fabricante.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué otras formas de esterilización se usan en un laboratorio de microbiología?

2. ¿Por qué algunos medios de cultivo no se autoclavan? ¿Qué procedimiento utilizaría para
su esterilización?. Mencione algunos ejemplos.
3. Usted necesita asegurarse de que ha realizado una correcta esterilización por calor húmedo,
teniendo en cuenta que no tiene ni cinta indicadora ni cepas de Bacillus stearothermophilus.
¿Qué haría ud.?
4. ¿Se podrá eliminar las esporas de Bacillus, en un proceso de autoclave que sólo llegue a
100 ºC?. Explique
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PRÁCTICA II: TÉCNICAS DE CULTIVO

 Siembra en medio líquido, sólido y semisólido.
 Lectura de colonias, estudio de crecimiento microbiano.
 Caracterización de las colonias de los microorganismos.
La siembra de microorganismos consiste en poner en contacto los microorganismos (en
cantidades muy pequeñas) o la muestra conteniendo los microorganismos problemas; con medio
de cultivo estéril fresco, para que en las condiciones de laboratorio (temperatura, humedad, etc.)
se desarrollen y se multipliquen “in-vitro” y se pueda aislar el microorganismo en cultivo puro
para su estudio e identificación; o cuando se tratan de microorganismos aislados, ponerlos en
contacto con medio de cultivo “fresco” y estéril para su conservación (“replicar un cultivo”).
Condiciones para la siembra de los microorganismos:

a) Identificar los microorganismos y muestras a sembrar.
b) Rotular los materiales con lápiz marcador de vidrio o plumón de tinta
indeleble (nombre, tipo de muestra, fecha, especie, etc.)
c) Asepsia rigurosa y estricta:
 Sembrar cerca a la llama del mechero, evitar las corrientes de aire.
 Esterilizar el asa de siembra en llama directa y luego enfriar cerca del
mechero.
Esterilización del Asa Bacteriológica:

- Prender el mechero
- Tomar el asa bacteriológica por el mango y colocarla en posición vertical,
sobre la llama del mechero, hasta que el alambre quede al rojo vivo.
- Dejar enfriar al costado del mechero, antes de tomar las colonias.
Manejo del asa de siembra durante una inoculación
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Sabías que…
Las asas bacteriológicas básicamente son alambres unidos a un mango que permite
manipularlas. El alambre puede ser de diferente material (fierro níquel, nicromo,
platino, etc.) y la forma (recta, curva, etc.) dependiendo de la necesidad.
Inoculación en Medios de Cultivo en Tubo de Ensayo
1. Siembra en Medio Líquido (Caldo)

- Obtener la muestra con asa bacteriológica
- Introducir en el caldo de cultivo, haciendo movimientos de rotación.
2. Siembra en Agar Inclinado (pico de flauta)
- Obtener la muestra con asa
- Hacer estrías en la superficie del medio
3. Siembra en medio semisólido (taco)
- Obtener la muestra con asa recta
- Introducir en el medio semisólido, como se observa en la figura 3.
- Tener la precaución de retirar el asa recta, por el mismo sitio donde se introdujo.
Fig. 2: Siembra en agar inclinado
Fig. 3: Siembra
en medio
Fig. 1: Siembra en medio líquido semisólido
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Sembrado en placas de agar

Para la siembra por “agotamiento” (en agar sólido en placa de Petri), se comprueba
previamente la esterilidad del medio de cultivo, y la ausencia de pequeñas gotas de agua sobre
la superficie del medio, si lo hubiera, eliminar esas gotas de agua (“desecar”) colocando las
placas en la estufa durante 20 o 30 minutos (la base sobre la tapa, ambas en posición invertida).
Sembrar las placas “agotando” el contenido del asa, mediante estrías sobre la superficie del
medio.
Para la siembra por aislamiento seguir los pasos del gráfico.
Siembra por Siembra por aislamiento

agotamiento
Después de la siembra incubar los medios de cultivo en la estufa a la temperatura de 37 ºC para

las bacterias durante 18 – 24 horas y a 25 – 28 ºC para los hongos y levaduras durante 20 horas
o más.
LECTURA DE COLONIAS, ESTUDIO DE CRECIMIENTO MICROBIANO

En los cultivos líquidos no tiene lugar la formación de colonias, por lo tanto se examinará la
existencia de enturbiamiento más o menos intenso, la formación de una película o velo sobre la
superficie, la aparición de sedimento en el fondo del tubo, etc. La utilización de medios de cultivo
líquidos permite la obtención de una población microbiana grande, con un elevado número de
microorganismos, para ser utilizados posteriormente.
En medio sólido (agar inclinado) se observará el aspecto general del medio y la aparición de
crecimiento sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo de microorganismos
aerobios o anaerobios facultativos. Además, se utiliza para almacenar cultivos durante cortos
períodos de tiempo, a temperaturas de 4ºC.
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En medio semisólido se podrá comprobar si el microorganismo es o no móvil, ya que en el primer

caso se observará que el crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura,
detectándose turbidez. Por eso es tan importante que, cuando se inocula el medio de cultivo, no
se distorsione el agar y se vuelva a sacar el hilo por el mismo sitio de inoculación. Los
microorganismos inmóviles crecerán únicamente a lo largo de la picadura. Este tipo de siembra
en picadura sirve, también, como otro de método de conservación de microorganismos
anaerobios facultativos.
CARACTERIZACIÓN DE LAS COLONIAS DE LOS MICROORGANISMOS

En el medio líquido (sin agitar):
a) Presencia de una “película” superficial que por la agitación suave caen al fondo del tubo
o permanecer en la superficie.
b) Presencia de un crecimiento superficial impregnado al tubo tomando el aspecto de un
anillo superficial.
c) Crecimiento con un sedimento en el fondo del tubo y que puede ser fino, grumoso o
mucoso, al agitar el tubo puede suspenderse con facilidad o permanecer sin cambios.
Características de las “colonias” en el agar (en placa de Petri), con ayuda de una lupa observar:
Tamaño: Pequeñas, regular, grande

Forma: Circular, irregular, elíptica, puntiforme, filamentosa.
Elevación: Plana, elevada, convexa, pulvinada o monticular, umbeliforme, umbilicada
Borde: Entero, ondulado, lobulado, crenado o dentado, filamentosa, rizado.
Superficie: Lisa, rugosa, granular.
Consistencia: Cremosa, membranosa, mucosa.
Densidad: Opaca, transparente, translucida
Cromogénesis: Pigmento verde, amarillo, rojo, blanquecino.

Pigmento difusible o confinado a la colonia.
Medio de cultivo: Observar posibles cambios del medio de cultivo alrededor de la colonia.
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OBJETIVO
Emplear las diferentes técnicas de cultivo de microorganismos, para estimular su crecimiento.
MATERIALES
 Asa de siembra  Placa Petri.
 Mechero  Solución salina fisiológica
 Tubos de 13 x 100
MEDIOS
 Agar tripticasa soya (TSA)
 Medio semisólido
 Caldo tripticasa soya (TSB)
CEPAS
 Staphylococcus aureus
 Pseudomonas aeruginosa
 Escherichia coli
 Bacillus subtillis
PROCEDIMIENTO
 Siembra en medio liquido
 Siembra en medio semisólido
 Siembra en medio sólido
Staphylococcus aureus
Medio Descripción
TSB
Semisólido
Agar tripticasa soya
Pseudomonas aeruginosa
Medio Descripción
TSB
Semisólido
Escherichia coli
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Medio Descripción de colonias típicas
TSB
Semisólido
Bacillus subtillis
Medio Descripción
TSB
Semisólido
CUESTIONARIO
1. ¿Qué es una colonia bacteriana? ¿A qué se le denomina cepa en microbiología?

2. Describa otros métodos de siembra en placa de agar, distinto de siembra por agotamiento.
¿Cuál es el fin del método?
3. ¿Cuál es el fin de usar la solución fisiológica salina?
4. ¿Qué es el sistema de patrón de turbidez de Mc Farland?¿Cómo elaboro dicha escala?
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PRÁCTICA III: TINCIONES MICROBIANAS

 Preparación de frotices bacterianos.
 Coloración por tinción simple y tinción diferencial Gram.
 Coloración de bacterias ácido resistentes.
 Tinción de estructuras microbianas: cápsula, pared celular y
esporas.
La mayoría de las bacterias son transparentes, por lo que resulta difícil su observación con el
microscopio óptico. El uso de colorantes nos permite aumentar artificialmente el contraste entre
las células bacterianas y el medio circundante.
Los colorantes nos permiten observar la morfología de los microorganismos, permitiendo
distinguir los diferentes tipos de célula, además de revelar la presencia de ciertas estructuras
celulares como flagelos, cápsulas, esporas, pared celular e inclusiones.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica
por los materiales celulares. Los colorantes pueden dividirse en tres grupos:
 Ácidos o aniónicos: Colorantes de moléculas cargadas negativamente y por lo tanto se
combina con estructuras celulares cargadas
positivamente, como las proteínas. Estos
colorantes no tiñen a la célula y se usan sobre
todo para teñir el fondo de la lámina o para
contraste. Dentro de estos colorantes tenemos a
la eosina, fucsina ácida, rojo congo, ácido pícrico
y verde malaquita
 Básicos o catiónicos: Son moléculas cargadas
positivamente y se combinan con intensidad con
los constituyentes cargados negativamente,
como los ácidos nucleicos, polisacáridos ácidos.
Dentro de estas sustancias tenemos al azul de
metileno, safranina, fucsina básica, violeta de
metilo, rojo neutro y tionina.
 Neutros: Como Giemsa, Wright y Leishman
Las tinciones simples son en las cuales se usa un

solo colorante. Mientras que las tinciones
diferenciales son capaces de diferenciar estructuras
o incluso microorganismos que poseen
características superficiales distintas. En este tipo de
tinciones se requieren el empleo de más de un
colorante. Las tinciones estructurales sirven para
identificar determinadas estructuras que pueden estar
presentes en ciertos microorganismos. Con esta
técnica se evidencia cápsulas, endosporas, flagelos y
pared celular.
1. PREPARACIONES DE FROTICES
BACTERIANOS
Es un paso precede a la técnica de tinción. Se

realiza a partir de muestras biológicas (secreción
vaginal, LCR, etc.) o de un cultivo.
El frotis bacteriano asegura una adecuada
separación entre células y facilita que la tinción
posterior se distribuya de manera homogénea.
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Con la ayuda de un asa de siembra o aguja de inoculación, previamente llevada a flama, se

coloca en el portaobjetos siguiendo las indicaciones de la figura de
Extensión: con el asa de siembra la muestra se suspende en la SSF o agua, siguiendo los
pasos indicados en la figura, luego procedemos a extender la muestra con el asa.
Secado: se deja secar la lámina a temperatura ambiente o colocar cerca del mechero.
Fijación: La lámina se pasa 3 veces por la llama del mechero de forma rápida. Este paso
tiene como finalidad evitar el desprendimiento del preparado durante la coloración y lavado
así como también preservar la forma original de los microorganismos.
En algunos casos en los cuales se necesitan procedimientos suaves, en la fijación en ves de
usar el calor, se emplean agentes fijadores como el etanol, metanol, etc.
Sabias que ….
Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por
sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; él cual se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí
podrá atacar el colorante. Un mordiente habitual es el ácido tánìco.
2. COLORACIÓN POR TINCIÓN SIMPLE
En este tipo de coloración se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras
celulares se tiñen con la misma tonalidad. Nos permite observar la morfología y tamaño de
la célula bacteriana y su forma de agrupamiento.
Entre los colorantes usados están: fucsina básica, el azul de metileno, la safranina y el cristal
violeta, todas en soluciones acuosas.
3. COLORACIÓN POR TINCIÓN DIFERENCIAL GRAM
Esta coloración permite separar los microorganismos en Gram (+) y Gram (-). Y consiste que
el preparado fijado por calor se trata en primer lugar con el cristal violeta, luego se agrega
la solución de lugol como solución mordiente, se decolora con alcohol-acetona y
finalmente se contracolorea con fucsina o safranina.
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Fundamento
La técnica se fundamente en el uso de un primer

colorante, que debe ser de naturaleza básica y por
lo tanto posea afinidad por las estructuras cargadas
negativamente como la pared celular de las
bacterias, el más usado es el cristal de violeta. Una
solución mordiente que se combina con el primer
colorante formando un complejo, el cual no altera la
coloración que adquirieron las bacterias. Los
mordientes mas empleados son las sales metálicas,
ácidos o bases. Un agente decolorante, él cual es
un disolvente orgánico o una mezcla de solventes, el
cual no tiene la capacidad de disolver el complejo
formado entre el primer colorante y la solución
mordiente. Por último de un colorante de contraste,
de carácter básico de distinto color que el primer
colorante, y solo teñirá a las bacterias que han
perdido el primer colorante debido al agente
decolorante.
Sabias que…
El paso crítico de esta técnica es la decoloración, ya que si se prolonga demasiado resultarán
decoloradas las bacterias incluso las Gram (+).
Además que las bacterias Gram (+) en fase estacionaria pueden aparecer como Gram (-)
debido a procesos de degradación y autólisis de su capa de peptidoglicano.
4. COLORACIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO – ALCOHOL RESISTENTES
La mayoría de las células procariotas de dominio Bacteria se pueden clasificar en función

del resultado de la tinción Gram como gram(+) o gram(-).Pero determinadas bacterias Gram
(+) (Corineformes, Nocardia y en especial Mycobacterium) presentan una pared celular muy
compleja, con abundancia de lípidos. Estas bacterias no se tiñen con los colorantes
normales, pero una vez que se han teñido con fucsina (forzando mediante calentamiento de
la preparación), tienen resistencia a decolorarse por una mezcla de ácido clorhídrico al 3%
en etanol de 96º. Por ello se denominan como bacterias ácido – alcohol resistentes.
Fundamento
La ácido-alcohol resistencia se correlaciona con el alto contenido en lípidos de la pared
celular y con la presencia de un tipo específico de ácidos grasos llamados ácidos micólicos.
Los cuales confieren a la célula una alta hidrofobicidad y la propiedad de resistir la
decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos.
Para poner de manifiesto la acido-alcohol resistencia, la tinción de Ziehl Neelsen requiere el
empleo sucesivo de 3 soluciones
1. Mezcla de fucsina-fenol (carbofucsina), que cuando se aplica en caliente es capaz de

teñir todo tipo de células bacterianas. El fenol cumple la función de facilitar la penetración
de la fucsina en la pared celular.
2. El agente decolorante él cual consiste en una solución de HCl 0.36N en etanol. Que
posee un elevado poder decolorante pero es insuficiente para arrastrar la fucsina
asociada a la pared celular de Mycobacterium.
3. Colorante de contraste. El azul de metileno
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Tras el tratamiento con fucsina y fenol las

bacterias se tiñen de rosa-rojo. Pero al
agregar el decolorante, las bacterias ácido-
alcohol resistentes no cambian de color
mientras que el resto de bacterias se
decoloran y podrán tomar posteriormente el
colorante de contraste. En consecuencia las
células de Mycobacterium quedarán teñidas
y las bacterias ácido alcohol sensibles
aparecerán de color azul.
Procedimiento
 El frotis se tiñe con Carbofucsina
fecnicada aplicando calor suave hasta
emitir vapores (evitando que el frotis se
seque por la evaporación del colorante) y
luego lavar el exceso de colorante con
agua.
 Decolorar con la solución acido - alcohol
y lavar con agua.
 Teñir durante 30-60 segundos con Azul
de Metileno (otra alternativa es el verde
de malaquita) , lavar y proceder a secar
 Proceder a observar con el microscopio
óptico con el objetivo de inmersión.de
inmersión
5. TINCIÓN DE ESTRUCTURAS MICROBIANAS:
 CÁPSULA
Algunas especies bacterianas patógenas (Streptococcus, Bacillus anthracis, Klebsiella

pneumoniae, etc) y de uso industrial, además de hongos y levaduras patogenas
(Cryptococcus neomorfans, etc), están rodeadas de una capa generalmente gruesa
denominada cápsula, la cual esta constituida por exopolimeros casi siempre de naturaleza
exopolisacárida que la propia bacteria excretada a través de su pared celular.
TINCIONES NEGATIVAS:
Los colorantes que se emplean en tinciones negativas se
caracterizan porque no son capaces de fijarse ni penetrar
en las células. Por lo tanto las bacterias se ven en negativo
es decir sin teñir con un fondo coloreado.
Las cápsulas por sus características químicas no se tiñen
por lo general con colorantes básicos como el cristal
violeta. Sin embargo, se pueden observar indirectamente
mediante la tinción negativa con la tinta china, nigrosina
y eosina
Los polisacáridos capsulares rechazan el colorante
entonces las células se observaran sin teñir sobre un fondo
de color oscuro mientras que la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los
microorganismos.
_____________________________________________________________________________
Sabias que…
a. La exposición previa a los anticuerpos específicos (reacción de Quellung) aumenta la refractividad e impide su
retracción lo cual favorece la tinción
b. El tamaño de las bacterias observadas por esta técnica es mayor que el real por lo tanto no se debe utilizar
para la medición de microorganismos
c. Para distinguir bien la cápsula del resto de la célula se debe aumentar el contraste cerrando el diafragma del
condensador. En estas condiciones, la cápsula aparecerá como un halo transparente alrededor de la célula,
que se verá de color grisáceo.
 PARED CELULAR
El espesor de la pared celular en las bacterias Gram positivas oscila entre 0.150 um y 0.50um
y hasta 0.8um en algunas cepas de Lactobacillus acidophilus. En las bacterias Gram
negativas la pared celular (membrana externa de la envoltura celular) mide aprox 0.015.um
de espesor. La pared celular se colorea con colorantes derivados del trifenilmetano en
solución de pH 7.0 y por lo general se utilizan mordientes (ácido tánico, ácido fosfomolíbdico).
La pared celular se tiñe de color azul sobre un fondo amarillento.
 ESPORAS
Las bacterias que forman esporas pertenecen principalmente a los géneros Streptomyces,
Clostridium y Bacillus. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una
nueva forma vegetativa. Algunas de las bacterias productoras de esporas son patógenas
para el hombre, por lo que su estudio y observación son de enorme interés.
Tinción de esporas (Wirtz-Conklin)

Fundamento
Las endosporas poseen unas
cubiertas exclusivas que las hacen
resistentes a los factores ambientales
adversos. Además, estas cubiertas
hacen que las esporas aparezcan en
el microscopio óptico como
estructuras refringentes y de difícil
tinción.
La tinción específica de esporas
requiere dos colorantes:
 Verde malaquita: colorante que
es capaz de teñir las esporas en
caliente.
 Safranina: colorante de contraste
que tiñe las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, mientras
que las formas vegetativas si lo harán, y quedarán teñidas con el segundo colorante.
Procedimiento
 Sobre el frotis bacteriano agregar el verde de malaquita
 Calentar por 5 min. hasta que se emitan vapores.
 Proceder a lavar el exceso de colorante con agua.
 Luego teñir con safranina por 1min y luego lavar el exceso de colorante
 Secar la muestra a temperatura ambiente y proceder a observar con el microscopio.
TÉCNICA DE DORNER: Se sensibiliza y colorea la espora con fucsina fenicada en caliente y

luego se extiende sobre nigrosina. La nigrosina extraerá el colorante de todas las estructuras
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celulares excepto de las esporas y por consiguiente, se verán las espora de color rojo, y el resto
de la bacteria se observa incolora con el fondo oscuro.
Procedimiento
 Preparar una suspensión del cultivo a analizar en 1 ml de SSF
 Añadir 1 ml de fucsina fenicada (solución acuosa de fucsina 1 % y fenol 5 %) y colocar la
mezcla en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos.
 Con la ayuda del asa de siembra colocar la muestra en un portaobjetos. Añadir una solución
acuosa, saturada, fresca y filtrada de nigrosina (10 %). Mezclar bien y extender en forma de
óvalo.
 Dejar secar y observar con objetivo de inmersión
 Hacer un extendido del material a examinar. Secar y fijar cubriendo con alcohol, encendiendo
y dejando apagar.
TÉCNICA DE MOELLER, Utiliza el ácido crómico y la fucsina fenicada en caliente para

sensibilizar y colorear la espora. La decoloración se realiza con ácido-alcohol y se contracolorea
con azul de metileno. Se observan las esporas rojas y el resto de la bacteria azul.
Procedimiento
 Hacer un extendido del material a examinar. Secar y fijar cubriendo con alcohol.
 Cubrir el preparado con solución de ácido crómico al 5% durante 5 minutos para sensibilizar.
 Lavar y cubrir luego con solución de fucsina fenicada en caliente durante 10 minutos
(calentar pasando un hisopo embebido en alcohol hasta emisión de vapores y volver a
calentar ocasionalmente para mantener la temperatura).
 Lavar con agua corriente.
 Decolorar con ácido sulfúrico al 5 % o ácido nítrico al 10 %. Puede terminarse la
decoloración con alcohol.
 Lavar y colorear con azul de metileno (1 %) durante 3 minutos.
 Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión.
PARTE EXPERIMENTAL
1. TINCIÓN SIMPLE
Objetivos:
 Observar microorganismos el microscopio y estudiar su morfología y agrupación
Materiales:
 Cultivos bacterianos en medios líquidos y sólidos.
 Asa de siembra.
 Láminas portaobjetos limpias y sin grasa.
 Microscopio óptico con lente de inmersión.
 Colorantes: azul de metileno o safranina
Procedimiento:
1. Se coloca el frotis bacteriano sobre un puente de coloración, y agregamos una gota de
azul de metileno o safranina.
2. Se deja pasar un minuto y procedemos a lavar el exceso de colorante con la piceta o
con agua del caño (chorro fino).
3. Llevamos la lámina a secar cerca de la llama del mechero o a temperatura ambiente.
4. Proceder a observar en el microscopio a inmersión con el objetivo 100X
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2. TINCION DIFERENCIAL GRAM
Objetivos:
 Clasificar y diferenciar a las bacterias
según la tinción Gram
 Estudiar la morfología y agrupación de
las bacterias ( cocos, bacilos, etc)
Materiales:
 Cultivos bacterianos en medios
líquidos y sólidos.
 Asa de siembra
 Colorantes:
 Solución de Cristal violeta.
 Solución de Lugol
 Solución de Alcohol – acetona
(decolorante)
 Solución de Safranina
 Láminas portaobjetos limpias y sin
grasa.
 Microscopio óptico con lente de
inmersión
Procedimiento
 Sobre el frotis bacteriano se agrega la
solución de cristal violeta, y se deja fijando
a temperatura ambiente 1min o con ayuda
de calor, luego se lleva a un puente de
coloración y se lava el exceso de colorante
con agua destilada.
 Agregar la solución de lugol por 1min y
proceder a lavar el exceso.
 Luego se procede a decolorar con I-II
gotas de alcohol-acetona, e
inmediatamente se lava.
 Agregar I o II gotas de safranina por 30
segundos. Y luego lavar
 Se seca la lámina cerca de la llama del
mechero o a temperatura ambiente y se
procede a observar al microscopio con el
objetivo de inmersión.
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RESULTADOS Y CONCLUSIONES
Anotar y dibujar las estructuras que observe en microscopio óptico tanto en la tinción simple
como la tinción Gram, en la guía
Tipo de tinción: __________________________________________________________

Microorganismo: _________________________________________________________
Observación Descripción
Tipo de tinción: __________________________________________________________

Microorganismo: _________________________________________________________
Tipo de tinción: __________________________________________________________

Microorganismo: _________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
Tipo de tinción: __________________________________________________________

Microorganismo: _________________________________________________________
CUESTIONARIO
1. ¿Qué paso es el más crucial o menos apropiado para causar pobres resultados en la
coloración Gram?
2. ¿Qué tipo de sustancias químicas han sido identificadas en las cápsulas bacterianas?
3. ¿Se podrá reemplazar un colorante por otro en la tinción de Ziehl Neelsen?
4. Esquematice algún procedimiento para la tinción de flagelos
_____________________________________________________________________________
PRÁCTICA IV:
GENÉTICA MICROBIANA
 Obtención de mutantes resistentes a antibióticos.
 Obtención de mutantes resistentes a la luz ultravioleta.
ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS
 Enfrentar microorganismos a la acción de desinfectantes
 Enfrentar microorganismos a la acción de antisépticos.
ALTERACIÓN DEL ADN DE LA BACTERIA POR UN AGENTE FÍSICO Y

QUÍMICO
La luz UV así como otras radiaciones y algunas sustancias químicas alteran la estructura
del ADN bacteriano y si los cambios no son reparados, el efecto puede ser letal o producir una
mutación superviviente.
Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios químicos en las moléculas
absorbentes, de modo que aparecen moléculas alteradas denominadas genéricamente
fotoproductos. Los fotoproductos originan la inactivación de macromoléculas, aunque, el ADN
dispone de mecanismos para paliar o eliminar estas modificaciones potencialmente lesivas. La
inactivación del único cromosoma de la bacteria tiene efectos letales primarios y efectos
mutagénicos secundarios. Por lo tanto, el espectro de acción biológica de la luz UV equivale al
de absorción del UV por el ADN (260 nm).
El uso práctico de la luz UV como agente esterilizante está limitado, ya que tiene poco
poder penetrante: no entra en objetos sólidos, y además se ve apantallada por el cristal y penetra
poco en los líquidos. Su aplicación concreta más frecuente es en el control de infecciones por
vía aérea: lámparas de desinfección en salas de hospitales y de laboratorios de investigación.
En Microbiología se emplea la luz UV como agente mutagénico en bacterias (en muchos estudios
que requieran obtener mutantes correspondientes a cualquier tipo de fenotipos, para conocer las
correspondientes bases genéticas).
LUZ UV vs. CRECIMIENTO BACTERIANO
OBJETIVO
Observar el efecto de la luz UV sobre el crecimiento bacteriano
MATERIALES
 Cultivos en caldo nutritivo de E. coli,
Klebsiella, Staphylococcus aureus
 Placas de TSA
 Lámpara de luz UV
 Espátulas de vidrio
_____________________________________________________________________________
PROCEDIMIENTO
 Aplicar 0,1 mL de la suspensión bacteriana en la placa de TSA y hacer una extensión con
una espátula de vidrio.
 Exponer las placas destapadas a la luz UV; manteniendo constante la distancia de 50 cm a
los tiempos de 0, 5, 10 y 15 minutos.
 Hacer el experimento por duplicado y a una de las placas envolverla con papel Kraft antes
de incubar.
 Llevar a incubar las placas a 37 ºC por 24 horas.
Comparar el número de colonias sobrevivientes en los diferentes tiempos de exposición; así

como en la placa cubierta con papel Kraft y en la placa normal.
_____________________________________________________________________________
CRECIMIENTO BACTERIANO vs. ANTIBIÓTICO
Las bacterias presentan algunas características biológicas que les facilitan la adquisición de
resistencia a antibióticos. En primer lugar tienen una alta velocidad de duplicación: muchas de
las bacterias patógenas
en humanos pueden doblar su población en apenas 30 minutos en medios de cultivo adecuados.
Sin embargo, su sistema de reparación de ADN no está tan desarrollado como en eucariotas
superiores y, como consecuencia, presentan una alta tasa de mutaciones espontáneas. Si,
debido al azar, una de esas mutaciones les permite sobrevivir en presencia de un antibiótico, la
misma presión selectiva de éste (mata a todas las sensibles) va a favorecer la aparición de una
población bacteriana resistente.
Los mecanismos mediante los cuales las bacterias resisten la acción de un antibiótico son
complejos, pero se pueden clasificar en dos grandes grupos:
Los generados como consecuencia de mutaciones

espontáneas en genes constitutivos de las bacterias.
Los que se derivan de la adquisición de material genético
extraño a la bacteria y que le confiere alguna capacidad que
le permite sobrevivir al antibiótico.
OBJETIVO
Observar la acción de los antibióticos sobre las bacterias
MATERIALES Y MEDIOS
Cultivo de 24 h en caldo nutritivo de E. coli (Klebsiella).

Agar tripticasa soya a 45 ºC
Agar tripticasa soya con 100 ug/mL de ciprofloxacino a 45 ºC.
Otros: placas estériles, pipetas estériles, espátulas de vidrio, etc.
PROCEDIMIENTO
 Licuar 10 mL de agar
tripticasa soya, enfriar
hasta 45 ºC.
 Vaciar a una placa estéril y dejar que solidifique en forma inclinada
 Luego vaciar 10 mL de agar tripticasa soya a 45 ºC con ciprofloxacino y dejar solidificar.
 Sembrar E. coli, por el método de estrías.
 Llevar a incubar a 37 ºC por 24 h.
Leer las placas después de la incubación e interpretar los resultados.
_____________________________________________________________________________
MÉTODO ALTERNATIVO
MATERIALES
 Tubo en caldo tripticasa soya
 Tubos patrón de turbidez de SO4Ba estándar
 Placas Petri con agar Mueller Hinton conteniendo 25 mL para placa de 90 mm
 Torundas estériles
 Pinzas estériles
 Viales con alcohol
 Viales con discos de antimicrobianos
 Tubos con solución salina
PROCEDIMIENTO
1. Usar solamente cultivos identificado y puros
2. Seleccionar 4 o 5 colonias de similares características y suspender en 5 ml de caldo
tripticasa soya
3. Incubar el cultivo a 35 ºC x 2 a 8 h. Verificar turbidez.
4. Comparar la turbidez con el del patrón de SO4Ba. Este estándar debe colocarse en un tubo
del mismo calibre del medio del cultivo reemplazado cada mes.
5. Diluir la turbidez del cultivo con solución salina estéril hasta igualar la densidad del patrón.
6. Secar las placas Petri conteniendo el medio Mueller Hinton 30 minutos antes de inocular.
7. Sumergir la torunda en el cultivo y eliminar el exceso de humedad escurriendo por las
paredes del tubo previamente para la siembra.
8. Con la torunda estriar la placa en 3 direcciones con el objeto de obtener un crecimiento
uniforme y confluente.
9. Después esperar 3 a 15 minutos a temperatura ambiente.
10. Seleccionar apropiadamente los discos de acuerdo a la bacteria
11. Colocar los discos con pinza estéril, apretar el centro suavemente para asegurar un buen
contacto con la superficie del medio Mueller Hinton. Tener cuidado de guardar cierta
distancia entre disco y disco y del borde de la placa. Solamente se debe colocar 7 discos
para la placa de 90 mm
12. Las placas deben incubarse a 37 ºC, enseguida o dentro de los 30 minutos después de la
aplicación de los discos.
13. La lectura de las placas se hace entre las 18 y 24 h., con regla milimetrada.
14. Medir solamente las zonas que muestren completa inhibición.
_____________________________________________________________________________
ACCION DE LOS AGENTES FISICOS Y QUÍMICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS
Debido a su pequeño tamaño y a su estilo de vida individual, las células procarióticas sufren los
cambios ambientales de un modo mucho más directo e inmediato que las células de los
organismos pluricelulares. A lo largo de miles de millones de años, los procariotas han venido
estando sometidas a diversas presiones ambientales, y han respondido evolutivamente creando
numerosos mecanismos de adaptación. Actualmente, las únicas formas de vida existentes en
determinados ambientes extremos son exclusivamente procarióticas (bacterias)
No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. Así,
unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio
ser neutras o beneficiosas para otra.
Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguir entre los
efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden
simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciación (si la hubiera) o de
reproducción.
AGENTES FÍSICOS
Entre los cuales tenemos:
 Temperatura
 Desecación
 Radiaciones (ionizantes y no ionizantes)
 Luz visible
 Ondas sonoras
 Presión osmótica
 pH.
EFECTO DE LA TEMPERATURA
Fundamento
Los microorganismos tienen una mínima, una óptima y una máxima temperatura para su
crecimiento. Temperaturas por debajo de la mínima usualmente tienen acciones paralizantes en
los microorganismos. Éstas inhiben el crecimiento microbiano por un enlentecimiento del
metabolismo, sin embargo no es necesaria para matarlos. Las temperaturas por encima de la
máxima tienen acción letal o subletal, dado que desnaturalizan enzimas microbianas y otras
proteínas. Si el tratamiento es corto en duración y se efectúa a una temperatura no
excesivamente alta, los daños que la bacteria sufre son reparables y, por eso, se habla de efectos
subletales. Cuando el tratamiento es más fuerte, en temperatura o en duración, los daños se
hacen irreparables y la bacteria pierde de forma irreversible su capacidad de formar colonias, se
habla entonces de efecto letal.
La temperatura es una manera muy común y efectiva de controlar a los microorganismos.
ALTAS TEMPERATURAS
CALOR HÚMEDO
1. Autoclavado
2. Agua hirviendo
CALOR SECO
1. Esterilización con aire caliente
2. Incineración
PASTEURIZACIÓN
_____________________________________________________________________________
BAJAS TEMPERATURAS
Las bajas temperaturas inhiben el crecimiento microbiano por disminución del metabolismo
microbiano. Los ejemplos incluyen refrigeración y congelamiento. Refrigeración a 5ºC disminuye
el crecimiento de microorganismos y mantiene los alimentos frescos por unos pocos días. El
congelamiento a -10ºC detiene el crecimiento microbiano, pero generalmente no los destruye y
mantiene los alimento frescos por varias semanas.
OBJETIVO
Observar el comportamiento de las cepas de estudio, bajo los efectos de la ebullición.
MATERIALES
 Asa de Kohle
 Mechero de Bunsen
 Tubos con suspensión de Bacillus subtilis, Escherichia coli
 Placa Petri con agar tripticasa soya
PROCEDIMIENTO
Se dispondrá de un tubo con un cultivo Bacillus subtilis, Escherichia coli y de una placa de Petri
con agar tripticasa soya (TSA).
1. Separar la placa en cuatro partes iguales con el marcador de vidrio y nombrar cada parte
con el tiempo de incubación a estudiar. Es decir 0, 10, 20, y 30 minutos.
2. Tomar una asada del cultivo y extenderlo sobre la parte de la superficie de la placa
correspondiente al tiempo t = 0 min.
3. Luego, colocar el tubo en el baño de agua en ebullición. Repetir el paso 2 a t = 5, 10, y 30
minutos.
4. Incubar la placa a 37ºC durante 24 horas.
5. Al día siguiente, hacer un recuento de las colonias a los diferentes tiempos.
_____________________________________________________________________________
AGENTES QUIMICOS
Existen ciertas sustancias químicas que influyen negativamente sobre las bacterias, pudiendo
ejercer dos tipos de efectos diferentes:
 Bacteriostáticos: Cuando impiden el crecimiento bacteriano.
 Bactericidas: Cuando destruyen (matan) las bacterias.
En general, no sólo nos referimos a las bacterias, sino a cualquier tipo de microorganismos,
hablamos respectivamente de agentes microbiostáticos y microbicidas. Ahora bien, para una
misma sustancia química, la línea de demarcación entre un efecto microbiostático y otro
microbicida depende muchas veces de la concentración de dicha sustancia y del tiempo durante
el que actúa.
¿Cómo podemos saber que un microorganismo está “muerto”?
Rpta: El único criterio válido es la pérdida irreversible de la capacidad de división celular,

es decir, de la pérdida de viabilidad, y se suele comprobar empleando técnicas con placas de
Petri (es decir, confirmando que no crecen en medios sólidos adecuados).
Antes de proceder al estudio de las diversas moléculas que pueden afectar el crecimiento o la
viabilidad de los microorganismos, veamos unas cuantas definiciones básicas.
AGENTES ESTERILIZANTES
Son aquellos que producen la inactivación total de todas las formas de vida microbiana (o
sea, su “muerte” o pérdida irreversible de su viabilidad). (También existen agentes físicos
esterilizantes, como ya vimos en los dos capítulos anteriores).
AGENTES DESINFECTANTES (O GERMICIDAS)

Son agentes (sobre todo químicos) antimicrobianos capaces de matar los microorganismos
patógenos (infecciosos) de un material. Pueden (y en muchos casos suelen) presentar
efectos tóxicos sobre tejidos vivos, por lo que se suelen emplear sólo sobre materiales
inertes.
AGENTES ANTISÉPTICOS
Son sustancias químicas antimicrobianas que se oponen a la sepsis o putrefacción de
materiales vivos. Se trata de desinfectantes con baja actividad tóxica hacia los tejidos vivos
donde se aplican.
QUIMIOTERÁPICOS
Son compuestos químicos con actividad microbicida o microbiostática, con una toxicidad
suficientemente baja como para permitir su administración a un organismo superior, en cuyos
fluidos corporales y tejidos permanece estable un cierto tiempo a concentraciones tales que
los hacen eficaces como antimicrobianos dentro del organismo.
Todos los días usamos agentes químicos para controlar el crecimiento microbiano: detergentes
y jabones para el cuerpo y la ropa, cloración de las aguas potables, antisépticos para la piel y el
tratamiento de heridas, desinfectantes para tratar superficies en la industria y en los laboratorios,
etc.
Tanto en los laboratorios como en industrias alimentarias es necesario a menudo tratar

superficies inertes (mesas, suelos, paredes, maquinaria) con desinfectantes, a ser posible con
efecto microbicida. Por ejemplo se pueden usar sales cuaternarias de amonio como el cloruro de
benzalconio. El formaldehido es un agente alquilante que en solución al 3-8% sirve bien para
tratar superficies.
_____________________________________________________________________________
OBJETIVO
Comprobar la acción de los agentes químicos (antisépticos y desinfectantes) frente a las cepas
de trabajo
MATERIALES Y REACTIVOS
 Antisépticos: Alcohol yodado, peróxido de hidrógeno, yodopovidona al 10%, timerosal o

similar.
 Desinfectantes:Hipoclorito de sodio al 5,25%, alcohol 96 °, etc.
 Placas Petri con agar tripticasa soya
 Hisopos de algodón con mango de madera estériles
 Discos de papel filtro estériles
 Mechero Bunsen
 Tubos con suspensión de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus, y Bacillus subtilis.
 Pinzas metálicas
PROCEDIMIENTO
1. Separar la placa en tres partes iguales con el marcador de vidrio y nombrar cada parte con
el antiséptico o desinfectante a estudiar
2. Tomar 0,1 mL de una suspensión bacteriana, y colocarla en el centro de la placa con agar
TSA.
3. Luego proceder a esparcirla en toda la superficie de la placa con la ayuda de una espátula
de Drigalsky, y sembrar en 3 direcciones; horizontal, vertical y oblicua
4. Luego con la ayuda de una pinza previamente flameada se toma un “disco” y se lo embebe
con cada uno de los desinfectantes o antisépticos escogidos.
5. Se deja caer el disco al centro del área designada para tal fin.
6. Incubar la placa a 37ºC durante 24 horas.
7. Interpretar el efecto de cada uno de las sustancias utilizadas según el diámetro del halo
de inhibición.
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CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del uso de rayos UV?

2. Tendrá alguna utilidad el uso del UV como agente mutagénico de microorganismos
3. ¿Qué tipo de resistencia antibiótica es más común en las bacterias de origen hospitalario?
4. ¿Qué estrategias se debe tener en cuenta a la hora de elegir un antiséptico o desinfectante?.
Fundamente
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PRÁCTICA V: NUTRICIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

 Requerimientos nutricionales mínimos para el crecimiento
microbiano (nutrientes, pH, temperatura, y demanda de
oxígeno)
La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las
sustancias químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y
se requieren para dos objetivos:
Fines energéticos (reacciones de mantenimiento)

Fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo).
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
Los requerimientos nutricionales de los microorganismos se

relacionan con la fuente de energía y con la fuente de carbono.
 Bacterias Autótrofas: Son aquellas bacterias que sintetizan
todos sus elementos celulares a partir del CO 2 como fuente de
carbono que toman del medio ambiente y sales inorgánicas para
su crecimiento. Ejemplos: Bacterias Acidithiobacillus thioxidans,
nitrosomas-hidrogenomonas.
 Bacterias Heterotróficas: Son aquellas que requieren para su
crecimiento una fuente de carbono y energía a partir de
compuestos orgánicos. Ejemplo: Salmonella, Staphylococcus,
Escherichia coli.
OBJETIVO
Determinar en que medio de cultivo se encuentra mayor crecimiento microbiano.
MATERIALES
Cepas :
 Pseudomonas aeruginosa
 Escherichia coli.
 Bacillus subtilis
 Staphylococcus aureus
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Medios de cultivo Agar Base para 1 L:

 M1 = Agar Base (AB) • Agar-agar 20,0 g
 M2 = AB + Glucosa al 5%. • ClNH4 1g
 M3 = AB + Glucosa al 5% + extracto de levadura 2% • K2HPO4 1g
• SO4Mg 0,2 g
• SO4Fe 0,01 g
• Cl2Ca 0,01 g
PROCEDIMIENTO • Agua c.s.p.1L
 Sembrar cada microorganismo en los medios anteriores.

 Incubar a 37° C por 24 horas.
 Observar el crecimiento y anotar los resultados
RESULTADOS E INTERPRETACION
Bacteria/Medios M1 M2 M3 M4
Escherichia coli
Bacillus subtilis
+ = Poco crecimiento
++ = Regular crecimiento
+++ = Mayor crecimiento
CUESTIONARIO
1.- ¿A qué se debe que ciertos microorganismos puedan crecer en determinado medio de cultivo
y otros no lo hagan?
2.- ¿Qué nutrientes adicionales considera usted que pueden ser importantes para el crecimiento
adecuado de ciertos microorganismos patógenos? De ejemplos.
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EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LOS IONES HIDROGENIONES
Los iones H+ y OHˉ tienen importancia decisiva en el crecimiento microbiano, pequeñas

alteraciones en la concentración tienen efectos considerables en el crecimiento. Cada
microorganismo tiene un pH óptimo. Respecto del margen normal de pH a los que crecen las
bacterias, éstas se pueden clasificar en:
 Neutrófilas: Si crecen de modo óptimo en torno a la neutralidad (entre pH 5.5 y 8).

 Acidófilas: Si crecen normalmente entre pH 0 y pH 5.
 Alcalófilas: Si crecen entre pH 8.5 y pH 11.5.
OBJETIVO
Determinar el pH óptimo para cada una de las bacterias de experimentación.
MATERIALES
Cepas:
 Bacillus subtilis
 Escherichi coli
 Staphylococcus aureus
 Pseudomonas aeruginosa
Medios de cultivo:
Caldo nutritivo en tubos de 10 mL cada uno a diferentes pH (4, 7, 10).
PROCEDIMIENTO
 Sembrar los microorganismos en los tubos con caldo nutritivo a diferentes pH
 Incubar a 37°C por 24 horas.
 Observar el crecimiento y calificar por cruces.
Bacteria pH 4 pH 7 pH 10
Bacillus subtilis
Escherichia coli
++ = Regular Crecimiento
CUESTIONARIO
1. ¿Qué adaptaciones usan los microorganismos para poder soportar altos y bajos
valores de pH de crecimiento?
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EFECTO DE LA TEMPERATURA
Psicrófilas
Su temperatura óptima de crecimiento está entre 5ºC - 15 ºC. Suelen encontrarse en
regiones árticas, antárticas y en los glaciares
.
Mesófilas
Son microorganismos que crecen a temperaturas moderadas. Su temperatura óptima de
crecimiento está entre 25ºC y 45ºC. La mayoría de las bacterias pertenecen a este grupo,
incluyendo las bacterias comunes del suelo y las que infectan al organismo humano.
Termófilas
La temperatura óptima de estos microorganismos está entre 50 ºC – 80ºC y son
comúnmente encontradas en las aguas termales.
Hipertermófilas
Estas bacterias crecen a muy altas temperaturas. Su temperatura óptima de crecimiento está
entre 80ºC - 113ºC. Generalmente éstos pertenecen al dominio Archaea y se encuentran
cerca de hidrotermas en las grandes profundidades del océano.
OBJETIVO
Observar cual es la temperatura adecuada de cada bacteria y cual es su clasificación.
MATERIALES
Cepas Sabias que …..
 Bacillus subtilis Los microorganismos
pertenecientes al dominio
 Escherichia coli Arquea pueden sobrevivir a
 Pseudomonas aeruginosa temperaturas de ebullición, en
ácidos, cerca de fuentes
Medio de Cultivo: Caldo tripticasa soya en tubos sulfurosas de ventilación en los
océanos o en otros ambientes
extremos.
PROCEDIMIENTO
 Sembrar cada microorganismo en tres tubos de caldo nutritivo

 Incubar los tubos a diferente temperatura (4° C, 37° C, 45° C)
 Observar el crecimiento y calificar mediante cruces
Bacteria/Temperatura 4° C 37° C 45° C

Bacillus subtilis
Escherichia coli
++ = Regular crecimiento
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EFECTO DE LA TENSIÓN DE OXÍGENO.
Los microorganismos presentan variación considerable en relación al oxígeno del medio de

cultivo:
 Anaerobios estrictos u obligados:

Son aquellos que no necesitan del oxígeno del aire, inclusive es letal para ellas.
 Aerobios:
Cuando el microorganismo utiliza el oxígeno molecular.
 Anaerobio facultativos:
Son indiferentes a la presencia o ausencia de oxígeno.
 Microaerófilos:
Necesitan cantidades moderadas de oxígeno molecular.
 Anaerobio aerotolerante:
Al igual que los anaerobios obligatorios, no usan el oxígeno para su crecimiento, pero son
tolerados medianamente bien. Éstos obtienen energía a partir de la fermentación.
OBJETIVO
Observar si existe crecimiento de microorganismos en cada uno de los medios utilizados
después de la incubación.
MATERIALES
Cepas: Sabias que …..
 Lactobacillus. El potencial Redox es crítico para el
 Streptococcus mutans desarrollo de los microorganismos. Es
 Staphylococcus aureus la capacidad del medio a la transferencia
de electrones y depende en gran medida
 Clostridium sporogenes del oxígeno disuelto en el medio. Los
anaerobios estrictos necesitan un medio
Medio de cultivo: carente de oxígeno ya que se desarrollan
 Medio semisólido o medio tioglicolato en medios reductores y son inhibidos a
potenciales mayores de -0,100mV.
 Frascos con parafina estéril
PROCEDIMIENTO
 Calentar los tubos en baño de agua por 30 minutos.

 Enfriar con chorro de agua fría para bajar la temperatura hasta 38°C – 40 ªC
 Sembrar los microorganismos en cada tubo.
 Incubar a 37°C por 24 horas.
 Observar el crecimiento.
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CUESTIONARIO
1.- ¿Por qué un Clostridium no puede usar oxígeno y una Pseudomonas si puede?
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PRÁCTICA VI: METABOLISMO MICROBIANO

 Metabolismo de carbohidratos (oxidación y fermentación)
en bacterias.
 Metabolismo de proteínas: hidrólisis de caseína.
 Metabolismo de lípidos: Hidrólisis de lecitina
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
Los azúcares son los sustratos orgánicos utilizados por los m.o. mediante la fermentación (en
ausencia de O2) y la oxidación. Los azucares son convertidos en ácidos orgánicos y con
frecuencia se liberan gases con variación de hidrógenos en el medio, este hace variar el color
del indicador de pH ácido. El uso de azúcares sirve para la clasificación e identificación de los
m.o.
OBJETIVO
Determinar la capacidad de un microorganismo de degradar un hidrato de carbono incorporado

a un medio de cultivo, produciendo alcohol, ácido y/o gas.
MATERIALES:
Microorganismos:
 Staphylococcus epidermidis
Medios de cultivo:
 Medio semisólido rojo de fenol conteniendo el azúcar al 1% (glucosa, sacarosa, lactosa,
manitol).
 Agar Citrato
PROCEDIMIENTO:
 Medio semisólido: Sembrar con asa de aguja un mismo microorganismo en cada uno de
los tubos, hasta los 2/3 del tubo.
 Agar citrato: Sembrar con el asa de aguja haciendo estrías en la parte inclinada del agar.
 Incubar todos los tubos a 37º C x 24 horas.
 Observar el cambio de color y la presencia de gas (CO2 y H2), siempre que el
microorganismo haya metabolizado el azúcar.
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Resultados del medio rojo de fenol
glucosa manitol sacarosa lactosa

E. coli
P.aeruginosa
S. aureus
S. epidermidis
Resultados agar citrato

E. coli
P. aeruginosa
S .aureus
S. epidermidis
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
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PRUEBA OXIDATIVA-FERMENTATIVA
OBJETIVO
Identificar si las bacterias utilizan de carbohidratos por oxidación y/o fermentación.
MATERIALES
 Cepas
o Pseudomonas aeruginosa.
o Escherichia coli
o Staphylococcus aureus
o Staphylococcus epidermidis
 Medio de cultivo
o Medio de Hugh & Leifson (O/F)
PROCEDIMIENTO
 Sembrar en medio O/F, con el asa de aguja hasta el fondo, se siembra en dos tubos uno con
capa parafinada y otra sin ella. Se deja incubar por 24 h a 37 ºC.
INTERPRETACIÓN DE PRUEBA OXIDATIVA – FERMENTATIVA
Tubo abierto Tubo cubierto
Acido (amarillo) Alcalino (verde) Oxidativo
Acido (amarillo) Acido (amarillo) Fermentativo
ANOTAR RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Resultados
E. coli
S. aureus
S, epidermidis
P. aeruginosa
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METABOLISMO DE PROTEÍNAS Y LÍPIDOS
Las numerosas reacciones bioquímicas que constituyen el metabolismo de síntesis y el

energético de los microorganismos se realizan por medio del control de enzimas.
a.- METABOLISMO DE LÍPIDOS
Hidrólisis de Triglicéridos
Los triglicéridos son esteres de glicerol y ácidos grasos, los m.o utilizan los triglicéridos después
de la hidrólisis del enlace éster que llevan a cabo las enzimas extracelulares llamadas lipasas,
dando como resultado glicerol y ácidos grasos libres ,las lipasas no son muy específicas y atacan
triglicéridos con ácidos grasos de longitud de cadena variable.
OBJETIVO
Reconocimiento e identificación de la actividad lipolítica de las bacterias.
MATERIALES:
Microorganismos:
 Bacillus subtilis
Medios de cultivo:
 Agar tripticasa soya conteniendo grasa vegetal (margarina) al 4%
 Agar tripticasa soya conteniendo yema de huevo al 10%
PROCEDIMIENTO:
 Dividir la placa en cuatro cuadrantes

 Sembrar un m.o en cada cuadrante.
 Incubar a 37º C X 24 hrs.
 En la placa de grasa vegetal, observar el crecimiento y agregar sulfato de cobre 2%.
Reposo por 10 min. Alrededor del crecimiento de la colonia aparecerá una coloración
verde azulada indicando hidrólisis del glicerol y una coloración azul brillante sobre el
crecimiento indica la presencia de ácidos grasos.
 En la placa de agar yema de huevo, interpretar directamente luego de la incubación. Se
observa un halo opaco o transparente.
Resultados Placa de grasa vegetal Agar yema de huevo

E. coli
S .aureus
S. epdidermidis
P. aeruginosa
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b.- METABOLISMO DE PROTEÍNAS

Degradación de la Caseína: Los microorganismos poseen diferente capacidad proteolítica,
liberando aminoácidos o sus derivados metilmercaptanos, SH2, indol, etc.
OBJETIVO:
Reconocimiento e identificación de la actividad proteolítica de las bacterias.
MATERIALES:
Microorganismos:
Medios de cultivo:
 Agar tripticasa soya conteniendo leche descremada al 5%
PROCEDIMIENTO:
 Dividir la placa en tres partes

 Sembrar un m.o en cada división.
 Incubar a 37 ºC X 24 hrs.
 Observar la zona de hidrólisis (halo) en los alrededores de la colonia lo cual traduce la
acción de la exoenzima.
 En el caso del agar gelatina finalizada la incubación agregar ácido pícrico directamente
sobre toda la placa y se observa un halo transparente que significa que la gelatina ha
sido hidrolizada.
ANOTAR RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Degrada caseína Degrada gelatina

Bacilus subtilis
Bacilus cereus
S. aureus
CUESTIONARIO
1. ¿Qué formas de evaluar la acidez y la fermentación en un medio de cultivo existen?

2. ¿Qué importancia tendrán las lipasas de microorganismos en su patogenicidad?
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PRÁCTICA VI: INTRODUCCIÓN A LA INMUNOLOGÍA

 Reconocimiento de órganos linfoides
 Reacciones antígeno-anticuerpo
RECONOCIMIENTO DE LOS ORGANOS LINFOIDES EN EL LABORATORIO
El sistema inmune consta de una serie de órganos, tejidos y células ampliamente repartidos por
todo el cuerpo- Funcionalmente, los órganos se clasifican en primarios (regenerativos) y
secundarios (periféricos). Los primeros suministran el microambiente para la maduración de
linfocitos, mientras que los segundos se encargan de capturar al microorganismo o antígeno
mediante células presentadoras de antígeno, suministrando el entorno adecuado para que los
linfocitos interactúen con él. Los distintos órganos linfoides están interconectados por vasos
sanguíneos y vasos linfáticos, de modo que constituyen un sistema unitario, entrelazado y bien
comunicado. Estos vasos sanguíneos transportan células del sistema inmune, de las cuales el
tipo central es el linfocito.
DISTRIBUCION DE LAS CÉLULAS INMUNOCOMPETENTES

Las células que componen el sistema linfoide se agrupan formando órganos discretamente
encapsulados o bien acúmulos difusos de tejido linfoide (Figura 1). Los órganos linfoides
contienen linfocitos en estado variable evolutivo y se clasifican en primarios (órganos centrales)
y en secundarios (órganos periféricos). Actualmente se consideran órganos linfoides terciarios a
las neoformaciones de acúmulos linfoides que se generan en las infecciones crónicas y en las
afecciones autoinmunes.
Figura 1. Representación de la distribución de los

órganos linfoides y vasos linfáticos
Los órganos linfoides primarios constituyen el principal origen de la linfopoyesis, es decir,

donde los linfocitos se diferencian a partir de células madre linfoides y proliferan y maduran hacia
células con capacidad efectora. En mamíferos, incluyendo al hombre, los linfocitos T son
producidos en el timo, mientras que los linfocitos B se producen en el hígado fetal y en la médula
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ósea fetal y adulta. En los órganos linfoides primarios, los linfocitos adquieren sus receptores
antigénicos específicos, y también aprenden a discriminar entre autoantígenos, que serán
tolerados y antígenos extraños que serán atacados.
Los órganos linfoides secundarios que incluyen bazo, ganglios linfáticos y MALT (mucosal
associated lymphoid tissue) (amígdalas, placas de Peyer del intestino y cúmulos linfoides del
tracto urogenital), proporcionan el medio en el que las células implicadas (macrófagos, células
presentadoras de antígeno, linfocitos T y B) pueden interaccionar entre sí y con el antígeno.
Órganos linfoides primarios

Timo
Es un órgano linfoepitelial de forma bilobulada situado en posición retroesternal sobre la cara
anterior del pericardio. Deriva de un esbozo epitelial formado a partir de la tercera y cuarta bolsas
faringeas, de aparición muy temprana en el embrión. En el hombre su estructura aparece
completamente desarrollada en el tercer mes de gestación. El parénquima tímico está constituido
por una malla de células epiteliales rellena de células linfoides (denominadas timocitos) y se
organiza formando lobulillos tabicados por trabéculas conjuntivas. Dentro de cada lobulillo se
puede distinguir una zona externa o corteza, que contiene la gran mayoría de los timocitos, y una
zona interna o medular que es pobre en timocitos (Figura 2).
El estroma del timo está constituido fundamentalmente por la

malla de células epiteliales que adoptan diferentes formas. En
la médula se hallan también células dendríticas interdigitadas,
derivadas de la médula ósea, que son células presentadoras
de antígeno. En la unión corticomedular se hallan también
macrófagos. En la médula existen, además, unas estructuras
denominadas corpúsculos de Hassal formados por células
epiteliales y macrófagos dispuestos de forma concéntrica. Las
células epiteliales del timo, tanto de la corteza como de la
médula, expresan una gran riqueza en moléculas del MHC
clase II, imprescindibles para el reconocimiento de
autoantígenos por los linfocitos T.
Bursa de Fabricio y su equivalente en mamíferos

En las aves, los linfocitos B se diferencian en la bolsa de
Fabricio, órgano constituido por un segmento intestinal con
pliegues dirigidos hacia una luz central. Estos pliegues se
componen de tejido linfoide formando corteza y médula. En los
mamíferos, islotes de tejido linfoide en el hígado fetal y en la
médula ósea fetal y adulta se ocupan de la producción de
linfocitos B.
Órganos linfoides secundarios

Bazo
Se trata de un órgano situado en el hipocondrio izquierdo, detrás del estómago y cerca del
diafragma. Su superficie externa se compone de una cápsula fibrosa con algunas fibras
musculares lisas y penetra profundamente en el parénquima del órgano. Básicamente, en el bazo
se distingue la pulpa roja que es un reservorio vascular para hematíes y la pulpa blanca que
contiene el tejido linfoide, el cual se dispone alrededor de una arteriola central, presentando áreas
T y B. Las células T se disponen más próximas y alrededor de la arteriola central, mientras las
células B se disponen exteriores a la misma. También son frecuentes las células reticulares
dendríticas y macrófagos en el centro germinal, así como macrófagos especializados en la zona
marginal (área que rodea a los folículos linfoides) que junto a las células foliculares dendríticas
de los folículos primarios (folículos no estimulados sin centro claro germinal) se ocupan de la
presentación del antígeno al linfocito B (Figura 3)
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Ganglios linfáticos
Conforman junto a los vasos linfáticos una compleja red corporal cuya función es filtra los
antígenos procedentes del espacio extracelular y la linfa durante su circulación desde la periferia
hasta el ducto torácico.
Los ganglios linfáticos, en el humano, son redondeados u ovoides y presentan un hilio donde los
vasos sanguíneos entran y salen respectivamente. Básicamente, se distingue un área B
denominada córtex, un área T denominada paracórtex y un área medular central (Figura 4).
Figura 4. Representación de un ganglio linfático y la zona del mismo indicada. Se

observan las partes de la corteza, paracorteza y médula. También se ha incluído
un corte histológico de un ganglio linfático donde se observan los centros
germinales con folículos primarios y secundarios con claridad
El paracórtex, contiene linfocitos T y abundantes células presentadoras de antígeno (células

interdigitantes o histiocitos de la zona T) quienes presentan abundantes antígenos MHC clase II
en superficie. La zona medular presenta algunos cordones linfoides separados por espacios
vasculares (senos medulares) que contienen la mayor parte de las células plasmáticas y los
macrófagos sinusales de los ganglios linfáticos.
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El córtex contiene agregados de linfocitos B dispuestos

formando folículos primarios y secundarios. Los folículos
primarios son primordiales sin centro claro germinal
(anteriores al estímulo antigénico) y los folículos
secundarios poseen claros centros germinales (tras el
estímulo antigénico). Estos últimos contienen además
células presentadoras de antígeno y algunos
macrófagos, linfocitos T, y células NK, quienes junto a los
macrófagos sinusales parecen jugar un papel en el
desarrollo de la respuesta de las células B, como su
adquisición de memoria; esta parece ser la función
primordial de los centros germinales (Figura 5).
PRÁCTICA
1. Observar al microscopio láminas preparadas de cortes
histológicos del órgano linfoide primario TIMO, a 10X y
40X.
2. Observar al microscopio láminas preparadas de cortes
histológicos del órgano linfoide secundario TIMO, a 10X
y 40X.
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PRACTICA DE REACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO

INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO
La unión antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) es una interacción reversible en la que están involucrados
enlaces no-covalentes. En la interacción in vitro de un antígeno (Ag) con su correspondiente
anticuerpo (Ac) se distinguen dos etapas, la interacción primaria no visualizable y la
interacción secundaria, que sigue a la anterior y se caracteriza por la aparición de un fenómeno
visible como la aglutinación o la precipitación. Por otro lado, no siempre que se produce la
interacción primaria Ag-Ac, se produce la interacción secundaria, ya que, para conseguir
fenómenos visibles, son indispensables determinadas concentraciones y características de los
Ags y Acs.
INTERACCIÓN PRIMARIA Ag-Ac

Si bien la interacción primaria Ag-Ac no es visible, existen distintos métodos que hacen posible
visualizarla. La estrategia consiste en "marcar" al Ac ó al Ag mediante la unión covalente
(conjugación) de determinadas moléculas, tales como FLUOROCROMOS, ISOTOPOS
RADIOACTIVOS ó ENZIMAS, para poder hacer visible esa primera interacción. Tal como se
observa en la Tabla, dependiendo del marcador que se utilice, la técnica inmunológica recibe un
determinado nombre y utiliza un sistema de detección diferente. Las técnicas que veremos a
continuación no son tan sencillas y económicas como las que vimos anteriormente, sin embargo
son mucho mas sensibles, es decir, son capaces de detectar menores concentraciones de Ag o
Ac.
Interacción Secundaria Ag-Ac

Las técnicas inmunológicas que evidencian la interacción Ag-Ac a través de una reacción
secundaria (precipitación ó aglutinación) son, generalmente, más económicas y sencillas que
aquellas que permiten visualizar la interacción primaria
Reacciones de precipitación
Al mezclar cantidades suficientes de Ag soluble con Acs específicos, la interacción Ag-Ac puede
dar lugar a una red capaz de ser visualizada como un precipitado. Esa red de la que hablamos,
no es otra cosa que grandes complejos inmunes (CI) formados por la interacción Ag-Ac. Tal como
se observa en la figura, cuando se agregan concentraciones crecientes de Ag soluble a una
cantidad fija de suero conteniendo Acs específicos, a medida que la cantidad de Ag agregado
aumenta, la cantidad de precipitado se incrementa hasta alcanzar un máximo, luego del cual
declina.
En un extremo de la curva de precipitación, cuando se agregan pequeñas cantidades de Ag, los
CI se forman en exceso de Ac. En el otro extremo, al agregar grandes cantidades de Ag, los CI
se forman en exceso de Ag siendo pequeños y probablemente constituidos por una molécula
de Ac y dos de Ag. Entre estas dos situaciones extremas se encuentra la zona de equivalencia,
en donde la relación Ag-Ac permite la formación de grandes redes de CI que precipitan.
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La reacción de precipitación depende de la VALENCIA del Ac y del Ag. La valencia del Ac da

idea del número de sitios que posee para reconocer al Ag. De esta manera, un Ac bivalente
posee dos sitios capaces de reconocer al Ag. Del mismo modo, la valencia de un Ag nos habla
del máximo número de epitopes que posee. Para que se pueda producir la interacción secundaria
Ag-Ag con la consecuente formación del precipitado, tanto el Ag como el Ac deben ser, al menos,
bivalentes.
Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de precipitación.
1- Inmuno Difusión Radial (IDR)
2- Inmunoelectroforesis (IEF).
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REACCIONES DE AGLUTINACIÓN
Se denomina aglutinación a la interacción secundaria in vitro de un antígeno “particulado” con
su anticuerpo específico. Si el Ag (proteína, hidrato de carbono, etc.) se encuentra presente en
la superficie de células, bacterias u otras partículas naturales el fenómeno se denomina
aglutinación directa.
Cuando el Ag con el que interacciona el anticuerpo específico no forma parte de la estructura
nativa de la partícula, sino que se incluye artificialmente en su superficie, la aglutinación que tiene
lugar se denomina genéricamente aglutinación pasiva o indirecta.
Las partículas utilizadas como soportes pueden ser inertes (partículas de látex) o bien glóbulos
rojos, en cuyo caso el método recibe el nombre de hemoaglutinación pasiva o indirecta.
La aglutinación pasiva se denomina “directa” cuando se inmoviliza el Ag a la partícula inerte o
“reversa” cuando se inmoviliza el Ac.
A bajas diluciones del suero la aglutinación puede estar ausente, debido a un exceso de
moléculas de Ac, este fenómeno se denomina efecto de prozona.
Las metodologías de aglutinación son ampliamente utilizadas en el laboratorio clínico para la
detección serológica de anticuerpos en diferentes patologías infecciosas y para la tipificación de
grupos sanguíneos.
Es importante recordar que el anticuerpo a investigar por aglutinación debe ser por lo menos
funcionalmente bivalente. Aquellos anticuerpos que poseen un solo paratope útil de alta afinidad
se denominan anticuerpos incompletos o asimétricos (funcionalmente monovalentes).
Para poder evidenciarlos utilizando reacciones de interacción secundaria es necesario recurrir a
otras pruebas como la reacción de Coombs. Ésta se utiliza frecuentemente, entre otras
aplicaciones, para la detección de anticuerpos anti-Rh (anti-Ag D) en el suero de pacientes Rh
negativo. Esta reacción se basa en la utilización de Acs anti-Ig humana (suero de Coombs) para
producir la aglutinación luego de la interacción del Ag con los Acs incompletos.
La ventajas de las reacciones de aglutinación desde el punto de vista de su utilidad en el

laboratorio es que son muy sencillas de realizar, no requieren de ningún equipamiento para su
lectura, son rápidas y fáciles de implementar. Además, presentan una mayor sensibilidad que las
reacciones de precipitación por lo que las han sustituido en muchos casos. Sin embargo, cabe
mencionar, que las reacciones de aglutinación presentan una menor sensibilidad que las
reacciones de interacción primaria tales como ELISA e Inmunofluorescencia indirecta. Esto hace
que en determinados casos se prefiera el empleo de una de estas 2 técnicas para la detección
de Ac contra un determinado agente patógeno. Las ventajas enumeradas hacen de las
reacciones de aglutinación una valiosa herramienta para diversos estudios serológicos
(búsqueda de Acs específicos contra agentes patógenos) y para la detección de antígenos en
fluidos biológicos.
De acuerdo a las características de las partículas aglutinantes, las reacciones de aglutinación

pueden clasificarse en:
- reacciones de aglutinación activa; o
- reacciones de aglutinación pasiva.
Las reacciones de aglutinación activa se basan en el empleo de la partícula aglutinante como

antígeno. Como ejemplos podemos mencionar:
Partícula aglutinante Reacción Utilidad diagnóstica

Glóbulos rojos Determinación de grupo sanguíneo y factor Rh
Glóbulos rojos Coombs indirecta Determinación de sensibilización por
incompatibilidad Rh
Glóbulos rojos Coombs directa Determinación de eritroblastosis fetal
Bacterias (Brucella) Huddleson Búsqueda de Ac anti-Brucella en sueros humanos
(banco de sangre)
Parásitos (Trypanosoma cruzi AD-Chagas Búsqueda de Ac anti-T. cruzi en sueros
humanos (banco de sangre)
Parásitos (Toxoplasma gondii) AD-Toxo Búsqueda de Ac anti-T. gondii en sueros humanos
(banco de sangre)
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Las reacciones de aglutinación pasiva se basan en el empleo de una partícula aglutinante inerte
a la cual se la ha unido un antígeno. Como ejemplos podemos mencionar:
Partícula aglutinante Reacción Utilidad diagnóstica

Glóbulos rojos + lisado de T. cruzi HAI-Chagas Búsqueda de Ac anti-T. Cruzi en sueros
Glóbulos rojos + lisado de T. gondii HAI-Toxo Búsqueda de Ac anti-T. Gondii en sueros
Látex + gp120 Búsqueda de Ac anti-VIH en sueros
Látex + sHBV Búsqueda de Ac anti-HBV en sueros
Látex + estreptolisina O ASTO Búsqueda de Ac anti-estreptolisina O en
sueros humanos (infección por estreptococo
β-hemolítico)
Tipos de reacciones de aglutinación pasiva según la identidad de la especie “pegada” a

las partículas aglutinantes:
Considerando que es posible inmovilizar muchos tipos diferentes de proteínas a distintos tipos
de partículas inertes, es posible clasificar las reacciones de aglutinación pasiva en:
- reacciones de aglutinación pasiva directa; o
- reacciones de aglutinación pasiva reversa.
Las reacciones de aglutinación pasiva directa se basan en la sensibilización de la partícula

inerte con el Ag, por lo que resultan útiles para la detección y titulación de Ac en distintos fluidos
biológicos. Como ejemplos, basta repasar la información brindada en la tabla anterior.
Por el contrario, las reacciones de aglutinación pasiva reversa se basan en la inmovilización
del Ac (en general, se inmoviliza un anticuerpo monoclonal –AcMo-) en la superficie de la
partícula inerte, siendo este tipo de reacciones particularmente útiles para la detección de Ag en
distintas muestras biológicas.
Test de aglutinación cuantitativa: Para la “titulación” de un suero: se diluye el suero y se

enfrenta a una cantidad fija de Ag.
TITULO: corresponde a la máxima dilución del suero en el que la aglutinación es positiva.
Efecto Prozona: Por altas concentraciones de Ac. Puede también deberse a la presencia de Ac
“no aglutinantes”.
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TRABAJO PRÁCTICO
1) Aglutinación directa
A) Tipificación de Grupo Sanguíneo
Objetivo: Tipificación de grupos sanguíneos en muestras de sangre humana.
Reactivos y materiales:
– Sangre entera humana heparinizada
– Suero anti-A, suero anti–B y suero anti–D.
– Portaobjetos.
Protocolo:
1 – Limpiar los porta objetos con alcohol 70% y dejar secar.
2 – Colocar una gota de sangre entera.
3 – Colocar una gota de anti–suero.
4 – Rotar (despacio) el portaobjetos.
5 – Observar.
CUESTIONARIO
1.- ¿Cuáles son las diferencias y semejanzas entre aglutinación y precipitación? ¿Tienen igual
sensibilidad?
2.- ¿Qué es el fenómeno de prozona y cuáles pueden ser las causas que lo expliquen?
3.- ¿Qué son los anticuerpos incompletos?
4.- ¿Qué medidas se pueden usar para evitar la eritroblastosis fetal?
_____________________________________________________________________________
PRÁCTICA VII:
BACILOS GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES
Enterobacterias patógenas
Escherichia coli, Salmonella, Shigella
Enterobacterias oportunistas
Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Serratia
BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES Y
FERMENTADORES OXIDASA POSITIVAS
 Pseudomonas, Alcalígenes, Acinetobacter, Aeromonas y
Vibrio cholerae
BACILOS GRAM NEGATIVOS: ENTEROBACTERIAS PATOGENAS
 Escherichia coli  Shigella
 Salmonella  Yersinia
La familia Enterobacteriaceae es el grupo más grande y heterogéneo de bacilos gramnegativos

con importancia clínica. Con 40 géneros de más de 150 especies. Estos géneros se han
clasificado según sus propiedades bioquímicas, estructura antigénica e hibridación y
secuenciación de los ácidos nucleicos. Aunque muy compleja, menos de 20 especies son las
responsables de más del 95% de las infecciones. Las enterobacteria son microorganismos
cosmopolitas, se encuentran en el suelo, el agua y la vegetación; y también en la flora intestinal
normal de muchos animales, incluido el ser humano. Producen muchas enfermedades en el ser
humano, como el 30% al 35% de las septicemias, más del 70% de las infecciones del aparato
urinario (ITU) y muchas infecciones intestinales.
Algunos microorganismos (p. ej., Salmonella typhi, Shigella, Yersinia) se asocian siempre a
enfermedad, mientras que otros (p. ej., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus
mirabílis) forman parte de la microflora comensal normal y pueden producir infecciones
oportunistas. Algunos de los géneros comúnmente de importancia clínica son:
ENTEROBACTERIAS PATÓGENAS ENTEROBACTERIAS OPORTUNISTAS

 Escherichia coli  Klebsiella
 Salmonella  Enterobacter
 Shigella  Proteus
 Yersinia  Serratia
CARACTERÍSTICAS DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE
Esta familia tiene unos requerimientos nutricionales sencillos: Son

Bacilos Gamnegativos, no forman esporas, Aerobio o anaerobios
facultativos, catalasa Variable- por lo común positivos-, presencia de
Capsulas variable, Movilidad variable (si es positiva tiene flagelos
peritricos) – caso especial es el denominado movimiento ondulante de
la especie Proteus conocido como Swarming dentro del cultivo en aga,
interfiriendo con su aislamiento- también se caracterizan por ser Oxidasa
Negativas, O/F (oxido- fermentación de la glucosa), algunas especies de
esta familia tienden a producir gas CO2 y H2S, Temperatura optima de
crecimiento es de 37ºC, reducen los nitratos a nitratos. La ausencia de
actividad de citocromo oxidasa es una característica importante, debido
a que se puede determinar rápidamente mediante una sencilla prueba, y se utiliza para
_____________________________________________________________________________
diferenciar a las enterobacterias de otros bacilos gramnegativos fermentadores y no

fermentadores. Crecimiento sugerido en agar MacConkey.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Las características de las colonias de estos microorganismos en los diferentes medios se han
utilizado para distinguir a los miembros más frecuentes de esta familia. Por ejemplo, la capacidad
de fermentar lactosa se ha utilizado para distinguir a las cepas fermentadoras de lactosa
(Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter y Serratía) de las cepas que no fermentan
lactosa o lo hacen lentamente (Proteus, Salmonella, Shigella y Yersinia spp.). Las sales biliares
en algunos medios selectivos se ha utilizado
para separar a los patógenos entéricos
(Shigella, Salmonella) de los
microorganismos comensales que se
inhiben con las sales biliares (bacterias
grampositivas y algunas gramnegativas
presentes en el S. digestivo). Algunos son
resistentes a ciertos colorantes con
inhibición bacteriostática (verde brillante).
BACILOS GRAM NEGATIVOS ENTEROBACTERIAS OPORTUNISTAS

 Klebsiella  Proteus
 Enterobacter  Serratia
Las enterobacterias son microorganismos cosmopolitas, se encuentran en el suelo, el agua y la vegetación;

y también en la flora intestinal normal de muchos animales, incluido el ser humano.
Anteriormente vimos y reconocimos las características de estos microorganismos en el aspecto patógeno,
En el caso de esta practica veremos también microorganismos de esta misma familia, pero que son
oportunistas, que existen en el medio ambiente en forma libre, pero debido a una circunstancia como,
exposición extrema, disminución de las defensas u otras como contaminación por cateterismo producen la
infección muy frecuente de este grupo de bacterias.
Entre las que comúnmente se les encuentra en forma libre están, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Proteus mirabílis, Enterobacter sp. Y Serratia sp. que forman parte de la microflora comensal normal y
pueden producir infecciones oportunistas. Algunos de los géneros comúnmente tienen afecciones
específicas en niños, enfermos y ancianos.
OBJETIVOS
 Utilizar medios selectivos y diferenciales para el aislamiento de enterobacterias.

 Identificacar las enterobacterias del tipo patógenos, mediante pruebas bioquímicas.
 Reconocer las características particulares de cada género patógeno en los aislamientos.
MATERIALES:
Cepas de Enterobacterias
Escherichia coli Klebsiella
PATOGENAS Shigella OPORTUNISTAS Proteus
Salmonella Enterobacter
Medios de cultivos
 Agar MacConkey - MAC

 Agar Eosina azul de metileno – EMB
 Agar hierro tres azúcares – TSI
 Agar lisina hierro – LIA
 Agar Citrato de Simmons
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 Agar movilidad indol ornitina – MIO
PROCEDIMIENTO:
Aislamiento:
Para el aislamiento se utilizan medios que son selectivos, donde podremos ver la morfología,
color y otras características de los distintos tipos de microorganismos presentes en la muestra.
Inocular la cepa de enterobacteria en los medios de cultivos (agar Mac Conkey, EMB) con el asa
de Kolle. Incubar por 24 h a 37 ºC.
IDENTIFICACIÓN
_____________________________________________________________________________
 Trabajar con las colonias aisladas previamente en agar Mac Conkey.

 En TSI inocular con asa de Kolle en aguja hasta los 2/3 del agar y al retirar el asa hacer
estrías en la parte inclinada.
 En LIA inocular con el asa de Kolle en aguja, picando dos veces hasta los 2/3 partes del
agar y al retirar el asa hacer estrías en la parte inclinada.
 En Citrato sembrar con el asa en aguja en forma de estrías en la parte inclinada.
 En el medio MIO sembrar con el asa de Kolle en aro.
 Incubar todos los tubos de pruebas bioquímicas por 18 a 24 horas a 37 ºC.
 Agregar gotas del reactivo de Kovacs (para Indol) al resultado del MIO
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN.
Descripción de crecimiento en agar:
 Agar MacConkey:
- m.o. 1:
- m.o. 2:
 Agar EMB:
- m.o. 1:
- m.o. 2:
Discusión de resultados
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
_____________________________________________________________________________
Microorganismo 1:
MIO
Agar TSI LIA Citrato
M I O
Microorganismo 2:
MIO
Agar TSI LIA Citrato
M I O
Discusión de resultados
CUESTIONARIO
1. ¿Qué enzimas poseen los microorganismos que fermentan la lactosa?
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2. ¿Cómo puedo aislar las cepas de Shigella y Salmonella, comúnmente hallados en las
comidas?
3. ¿Cómo puedo diferenciar los diferentes tipos de Escherichia coli que infectan a los humanos?
4. Una especie de Salmonella, genera una intoxicación alimentaria debido al consumo de
mayonesa, casualmente solo en verano. ¿Por qué la incidencia de la patogenia aumenta en
dicha estación?
5. ¿Los microorganismo Oportunistas se presentan en niños, ancianos y personas débiles,
¿Por qué no afecta mucho a los adultos?
BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES
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Los bacilos Gram negativos no fermentadores son un grupo de bacilos aerobios no formadores
de esporas que no utilizan los hidratos de carbono como fuente de energía o los degradan a
través de vías metabólicas diferentes a la fermentación.
Dentro de estos bacilos tenemos al Género Pseudomonas, Acinetobacter, y Alcalígenes, son
algunos de ellos, en general desprovistos de grandes atributos de virulencia demostrables, los
m.o. que de este tema son saprófitos en la naturaleza no producen enfermedad en el individuo
sano pero pueden comportarse como oportunistas en enfermos inmunodeprimidos. Todos ellos
comparten una característica común: son incapaces de fermentar la glucosa.
Género Pseudomonas
 Bacilos Gram negativos, rectos o ligeramente curvados.
 No forman esporas.
 Mide aprox. 0,6 x 2 μm.
 Móviles mediante flagelos polares.
 Crecen bien en agar sangre y Mac Conkey
 Elaboran pigmentos verdoso (pioverdina), azulado (piocianina), rojo oscuro (piorrubina),
etc.
 Es aerobio obligado, excepto aquellas que utilizan la desnitrificación como medio de
respiración.
 Es oxidasa positiva.
 La Pseudomonas aeruginosa crece bien a 42 ºC a diferencia de las otras especies del
género como P. fluorescens, P. putida, P. mullei, P. cepacia.
Género Acinetobacter
 Bacilo o cocobacilo Gram negativo.
 A menudo se ven en pares.
 Se encuentran diseminadas en suelo y agua.
 Crecen bien en agra Mac Conkey y producen un suave pigmento azul.
 También puede detectarse un olor parecido al amoniaco.
 Aerobio obligado.
 Oxidasa negativa
Género Alcalígenes
 Bacilos Gram negativos
 Oxidasa positivos
 Móviles mediante flagelos perítricos.
 Alcalinizan el medio con citrato y el medio O/F que contiene glucosa.
 Negativos a ureasa.
 Pueden formar parte de la flora bacteriana humana normal.
P. aeruginosa es la especie patógena aislada con mayor frecuencia en muestras humanas. Es

un bacilo aeróbico obligado que mide aproximadamente de 0,5 a 1 µm de ancho por 3 a 4 µm de
largo, posee un solo flagelo, pero en forma ocasional algunos pueden tener dos o tres. Producen
dos pigmentos de importancia clínica: piocianina, que puede colorear de azul verdoso el pus de
una herida, y pioverdina (fluoresceína), pigmento amarillo verdoso que fluoresce bajo la luz
ultravioleta. Esta especie puede infectar heridas, vías urinarias, quemaduras y el tracto
respiratorio inferior, especialmente en individuos inmunosuprimidos, considerado además un
patógeno oportunista, causante principal de mortalidad en pacientes con fibrosis quística,
enfermedades neoplásicas y quemaduras severas. En los ambientes hospitalarios tiene la
capacidad de sobrevivir y multiplicarse en medios húmedos, con el mínimo de materia orgánica,
condiciones favorables para convertirse en un gran patógeno nosocomial. Actualmente, este
grupo de bacterias ocasiona un problema de salud pública, principalmente la especie P.
aeruginosa, debido a la notable incidencia en las infecciones intrahospitalarias; además ha
mostrado elevada multirresistencia a diferentes antibióticos.
OBJETIVO
_____________________________________________________________________________
Identificar el género Pseudomonas mediante pruebas bioquímicas y comprobar que es una

bacteria no fermentadora.
FUNDAMENTO
PRUEBA OXIDATIVA-FERMENTATIVA Hugh & Leifson (O/F)

En el medio OF la concentración de
peptonas está disminuída, la de
carbohidratos aumentada y la de agar
disminuída (lo que le da consistencia
semisólida) en comparación con los
medios de fermentación.
La relación de proteínas:carbohidratos
más baja reduce la formación de aminas
alcalinas capaces de neutralizar la
pequeña cantidad de ácidos débiles que
pueden formarse por el metabolismo
oxidativo. La mayor cantidad de
carbohidratos sirve para aumentar la
cantidad de ácidos que pueden
formarse potencialmente y la
consistencia semisólida del agar
permite que los ácidos que se forman en
la superficie del agar infiltren todo el
medio lo que hace fácil su visualización
del cambio de pH del indicador.
PRUEBA DE LA OXIDASA
La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema de
citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es
reducido por el oxígeno molecular. La prueba utiliza ciertos reactivos
colorantes como clorhidrato de p-fenilendiamina, que sustituye al O2
como aceptor de electrones.
Se basa en la capacidad del colorante tetrametil-p-fenilendiamonio
de oxidarse al ceder electrones al citocromo c en su presencia,
produciendo formas coloreadas (azul/morado). Permite diferenciar el
grupo Enterobacteriaceae (que carecen de citocromo c) del género
Pseudomonas (que posee citocromo c).
MATERIALES
 CEPAS
o Pseudomonas aeruginosa.
o Escherichia coli.
 PRUEBAS BIOQUIMICAS
o LIA, TSI, Citrato, MIO
.
 MEDIOS DE CULTIVO
o Agar Mac Conkey
o Agar Cetrimide
o Agar Tripticasa Soya
o Medio Hugh & Leifson (O/F)
 REACTIVOS
o Sol. de α-naftol / etanol.
_____________________________________________________________________________
o Sol. de Dimetil p-fenilendiamino/agua.
PROCEDIMIENTO
 Sembrar en agar Mac Conkey las cepas de Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli
tratando de obtener colonias aisladas para poder sembrar en los medios de identificación
bioquímica; incubar a 37 ºC x 24 h.
 Sembrar de una colonia aislada del agar Mac Conkey, en los medios de identificación
bioquímica. Luego incubar a 37 ºC x 24 h, transcurrido ese tiempo realizar las lecturas
correspondientes.
 Sembrar en medio O/F, en este medio se siembra por puntura hasta el fondo, se siembra en
dos tubos uno con capa parafinada y otra sin ella. Se deja incubar por 48 h a 37 ºC.
 Sembrar en TSA para ver la producción de oxidasa, se deja incubar por 24 h a 37 ºC, luego
de los cuales se agrega los reactivos: 0,2 mL de la sol. de α-naftol y 0,3 mL de la solución
de Dimetil-p-fenilendiamino y proceder a leer. Alternativamente se puede coger un papel
embebido con un reactivo de oxidasa; en este papel se extiende con el asa de siembra un
colonia. La reacción de color positiva se produce a los 5 a 10 segundos (color azul-violeta).
PRUEBA OXIDATIVA-FERMENTATIVA
PRUEBA DE OXIDASA
CUESTIONARIO
1- ¿Qué tipo de medio de cultivo es el Agar Cetrimide? ¿Las bacterias que crecen en él requieren
factores de crecimiento? ¿Requiere altas concentraciones de NaCl?
2- En la siembra en Mac Conkey. ¿De qué color son las colonias de P. aeruginosa? ¿ a que se
debe esta coloración?
_____________________________________________________________________________
PRÁCTICA VIII:
BACILOS GRAM POSITIVOS
Bacilos Gram positivos no esporulados
 Lactobacillus
Bacilos Gram positivos esporulados aerobios
 Bacillus subtillis, Bacillus cereus
COCOS GRAMPOSITIVOS
Cultivo e identificación bioquímica del género:
 Staphylococcus
 Streptococcus
Los bacilos Grampositivos aerobios incluyéndose a los anaerobios facultativos son comúnmente
hallados en el laboratorio de microbiología clínica, sobresaliendo por su naturaleza los géneros
Bacillus y Lactobacillus. La mayoría de estos bacilos son ubicuos en la naturaleza y habitan en
suelos, aguas, en la piel y mucosas de diversos animales; en el hombre especies de estos
bacilos causan enfermedades importantes.
Es esencial que el microbiólogo reconozca y diferencie si el bacilo Grampositivo aerobio esporula

o no, pues la formación de endosporas le confiere a estas bacterias, patogenicidad y resistencia
al calor y agentes químicos, constituyéndose en un gran problema tanto en medicina como en
la industria alimentaria.
BACILLUS
Este género es prototipo de la familia Bacillaceae. Son Bacilos Gram Positivos(BGP) grandes y
esporulados, no exigentes y en general móviles. Incluye bacterias aerobias y anaerobias
facultativas. Están ampliamente distribuidos en la naturaleza; algunos forman parte de la flora
normal y suelen ser contaminantes del laboratorio. El Bacillus anthracis es el más importante en
microbiología médica y veterinaria. Existe una gran diversidad de contenido G+C en su genoma,
32-62 mol % dentro del género, lo que refleja su gran heterogeneidad.
Ciertos miembros del género tienen implicancias médicas por la producción de antibióticos como
polimixina y bacitracina, además de uso industrial en la producción de solventes, enzimas,
vitaminas, etc.
Microscopía: se observan bacilos Gram positivos grandes (1

por 3 a 10 μm) de extremos rectos, aislados, en pares o cadenas
con tinción de Gram. Se observan áreas claras sin teñir que
corresponden a endosporas, ovoides, de posición subterminal,
que no deforman el soma bacteriano. Pueden teñirse con
técnicas de coloración especiales como el verde de Malaquita.
La endospora solo se observa a partir de cultivos viejos o
mediante técnicas que provoquen la esporulación, no a partir de
muestras clínicas. Lo opuesto sucede con la expresión de la
cápsula, que se pierde al ser cultivada en medios artificiales.
Macroscopía: para su observación deben ser cultivados en
medios ricos y simples tales como agar sangre, agar chocolate
y agar nutriente.
_____________________________________________________________________________
LACTOBACILLUS
El género Lactobacillus está constituído por bacilos Grampositivos no esporulados clasificados

en la familia Lactobacillaceae.
Los lactobacilos carecen de sistema de citocromos y son incapaces de utilizar oxígeno como
aceptor de electrones. En lugar de ello estos bacilos aerotolerantes producen ácido láctico a
partir de azúcares sencillos y crecen bien en medios ácidos.
Son componentes importantes de la flora autóctona encontrándose en la vagina, tracto intestinal

y cavidad oral. También son utilizados en la industria producir yogurt, encurtidos y mantequilla.
Desarrollan generalmente en agar sangre y en agar chocolate. También se obtiene buen

desarrollo en el medio selectivo de Rogosa, agar jugo de tomate que tienen pH ácido.
Identificación de Bacilos Gram Positivos (BGP)
Al igual que para la identificación de cualquier especie bacteriana, lo primero a realizar es un

frotis con tinción de Gram. Luego debemos conocer los requerimientos atmosféricos de la cepa
a identificar, ya que sabemos que este grupo posee tanto bacterias aerobias como aerobias
facultativas y anaerobias. Para esto sembramos en un caldo de tioglicolato. Realizaremos
posteriormente un cultivo en medios agar simple, agar sangre y las diferentes pruebas
bioquímicas.
Grandes
esporulados
 Bacillus subtilis
-  Otros
Catalasa + Lecitinasa
+  Clostridium
Sabias que ………

Es un desafío diferenciar B. anthracis de las muchas especies no patógenas que se encuentran
en el ambiente como contaminantes.
Las pruebas más comúnmente realizadas son las que se observan en el diagrama (en la parte
superior): lecitinasa, movilidad, y otras como indol, nitratos, citrato, Voges Proskauer, etc.;
además de la observación de la macroscopía y microscopía, bastante características de cada
especie en particular.
También se pueden utilizar técnicas de biología molecular como análisis de los fragmentos de
restricción o métodos inmunológicos para detección de las toxinas.
_____________________________________________________________________________
OBJETIVO:
Reconocer y diferenciar las especies Grampositivas aerobias o anaerobias facultativas

esporuladas y no esporuladas de los géneros Bacillus y Lactobacillus de importancia clínica y
alimentaria.
MATERIALES:
Microorganismos
 Bacillus cereus
 Bacillus subtilis
 Lactobacillus
Medios de Cultivo
 Agar TSA
 Agar Mossel
 Agar M.R.S.
 Agar sangre de carnero al 5%
 Medio tioglicolato
PROCEDIMIENTO
 Sembrar por la técnica de aislamiento en agar TSA y hacer dos líneas en los otros agares
con las muestras de Bacillus cereus y Bacillus subtilis
 Incubar las placas a 37 ºC x 24 h
 En la placa de agar Mossel, interpretar directamente luego de la incubación. Se observa un
halo opaco o transparente.
 En el agar M.R.S. sembrar la cepa de Lactobacillus, y luego incubar en condiciones
anaeróbicas
 En el agar sangre de carnero al 5% sembrar todas las cepas de Bacillus
 En los tubos con medio tioglicolato sembrar con el asa en aguja
 Realizar la prueba de catalasa, tomando una colonia aislada de una placa y disolviendo en
una gota de suero, luego agregar gotas de peróxido de Hidrógeno, es positivo cuando se
generan burbujas.
RESULTADOS:
Hemólisis Mossel Tioglicolato Catalasa
Bacillus cereus
Bacillus subtilis
Lactobacillus
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CUESTIONARIO
1. ¿Qué pruebas moleculares se pueden usar para diferenciar Bacillus cereus y Bacillus
anthracis?
2. Si se realiza la prueba de catalasa a partir de las bacterias de la práctica aisladas en agar

sangre, ¿Qué resultados obtendrá?
3. Describa el procedimiento y la importancia de pruebas a realizar para la identificación de:

Bacillus anthracis, Corynebacterium diphteriae, y Listeria monocytogenes.
_____________________________________________________________________________
COCOS GRAM POSITIVOS

 Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis
 Streptococcus pyogenes y Streptococcus mutans
El creciente aumento de las infecciones estafilococósicas adquiridas en los hospitales y

resistentes a la terapia antimicrobiana, ha dado como resultado el desarrollo de numerosas
pruebas para la identificación de estafilococos.
Los cocos Gram positivos se pueden clasificar de acuerdo a sus requerimientos de oxígeno en:
 Cocos Gram positivos anaerobios estrictos

 Cocos Gram positivos aerobios
 Cocos Gram positivos anaerobios facultativos
IDENTIFICACIÓN DEL GÉNERO: COCO GRAM-POSITIVOS
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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ESTAFILOCOCOS

El creciente aumento de las infecciones estafilococósicas adquiridas en hospitales y resistentes
a la terapia antimicrobiana, ha dado como resultado el desarrollo de numerosas pruebas para la
identificación de estafilococos.
En ocasiones las colonias de estafilococos y micrococos en medio de agar, se pueden confundir
con las de algunos estreptococos. La diferenciación se lleva a cabo rápida y fácilmente mediante
la prueba de la catalasa, los estafilococos y micrococos descomponen el peróxido de hidrogeno
(catalasa positivo), pero no los estreptococos.
Morfología microscópica: Para la misma se debe realizar un frotis, de preferencia a partir de

medio liquido, realizando luego la tinción de Gram lo que nos permitirá apreciar la forma,
agrupación y comportamiento al Gram de la cepa en estudio.
En el Agar sangre Colonias circulares de 1-2mm de diámetro, lisas. Habitualmente producen

hemólisis (β-hemólisis) las cepas de Staphylococcus aureus.
Las cepas de Staphylococcus epidermidis en cambio tienen gamma-hemólisis (alguna literatura
ya no considera este tipo de hemólisis).
En el Agar manitol salado: Staphylococcus aureus da colonias grandes, convexas, con halo
amarillo intenso (debido a la producción de ácido a partir del manitol, lo que hace virar al indicador
rojo de fenol).
Las cepas de Staphylococcus epidermidis en cambio son pequeñas y sin cambio de color.
El medio de Baird Parker permite el crecimiento de estafilococos y otros gérmenes Gram
positivos presentándose las colonias de Staphylococcus aureus negras con borde incoloro,
convexas, rodeadas de una zona opaca con una zona clara externa.
El agar DNasa. Contiene DNasa, y se utiliza para detectar la presencia de desoxirribonucleasa
en bacterias S. aureus producirá una lisis del DNA presente en la placa si posee esta enzima,
con el consiguiente aclaración del medio.
OBJETIVO
_____________________________________________________________________________
Aislar e identificar estafilococos

Materiales:
 Cepas de Bacterias
o Staphylococcus aureus
o Staphylococcus epidermidis
 Medio de cultivo
o Placas de agar sangre
o Placas de agar manitol salado
o Placas con agar tripticasa soya
o Placas con agar DNA
o Tubos con gradiente de solución salina (1%, 5% y 10%)
 Reactivos
o Set de colorantes para Gram.
o Acido clorhídrico concentrado.
PROCEDIMIENTO
 Sembrar por la técnica de aislamiento en agar sangre, TSA, manitol salado y Baird
Parker las muestras de Staphylococcus aureus y S. epidermidis.
 Sembrar las muestras en forma de estría en agar DNAsa.
 Incubar las placas a 37 ºC x 24h.
 Realice un frotis de las colonias aisladas en manitol salado y colorear con Gram.
 Observar con el microscopio de inmersión.
 Sembrar las muestras en los tubos con la gradiente de concentración salina.
 Agregar ácido clorhídrico concentrado a la placa de agar DNA y observar un halo
transparente alrededor de las colonias.
Reacción de Fermentación
Especimen Hemólisis DNAsa
Gram De Manitol
S. aureus
S. epidermidis
_____________________________________________________________________________
CUESTIONARIO
1. Describir los siguientes medios para el aislamiento y diferenciación de los estafilococos.
a) Agar Chapman
b) Agar Vogel Johnson
2. Describa la prueba de la coagulasa para confirmar la patogenicidad de los Staphylococcus.
3. ¿Qué haría usted para mejorar la visualización en la prueba del DNAsa?
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AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ESTREPTOCOCOS

Los estreptococos tienen una historia interesante y como género bacteriano individual han
causado probablemente más enfermedad y morbilidad humana a través de los siglos que casi
cualquier bacteria, con la posible excepción del bacilo tuberculoso. Originalmente han sido
agrupados por su capacidad para producir lisis de los hematíes; y así tenemos los estreptococos
alfa hemolíticos, estreptococos beta hemolíticos y los estreptococos gamma hemolíticos según
la lisis sea parcial, total y nula respectivamente.
De gran importancia en la constitución de la flora microbiana normal y en la patogenicidad del
sistema respiratorio, su virulencia depende de la producción de ciertas toxinas (hemolíticas,
leucocidina, eritrogénicas, etc.) y enzimas (fibribolisina, hialuronidasa, etc.)
Podemos clasificar a los Estreptococos de muy diversas formas según sea el objetivo y
necesidad de dicha clasificación.
Según el tipo de hemólisis producida:
α-hemólisis β-hemólisis Gamma hemólisis

Streptococcus pyogenes
NO SIEMPRE NO
Streptococcus agalactiae
NO GENERALMENTE AVECES
Streptococcus bovis
A VECES AVECES GENERALMENTE
Streptococcus neumoniae
SIEMPRE NO NO
Streptococcus Grupo
GENERALMENTE NO NO
Viridans
Según sus antígenos específicos: (Grupos de Lancefield):

Los estreptococos poseen unos antígenos específicos de naturaleza hidrocarbonada que pueden
ser puestos de manifiesto mediante diversas técnicas inmunológicas, como la aglutinación.
Los grupos antigenos mas importantes son los grupos A, B y D seguidos de C, F y G.
Algunos Streptococcos como S. pneumoniae no poseen antigenos de Lancefield demostrables.
Los Streptococcus no agrupables y alfa hemolíticos se conocen con el nombre de Streptococos
viridans.
ANTIGENO ESPECIE HEMÓLISIS

GRUPO A S. pyogenes Β hemolítico, siempre
GRUPO B S. agalactiae Β hemolítico generalmente
GRUPO D E. faecalis No hemolitico generalmente
GRUPO D S. bovis No hemolitico generalmente
No agrupable S. pneumoniae α hemolítico siempre
No agrupable Estreptococos grupo viridans α hemolítico generalmente
Agrupable o no Estreptococos grupo milleri Alfa, beta o no hemolítico
_____________________________________________________________________________
OBJETIVO
Entrenar al estudiante en el aislamiento, coloración e identificación de estreptococos.
MATERIALES
 CEPAS DE BACTERIAS
o Streptococcus sp.
o Streptococcus mutans
 MEDIOS DE CULTIVO
o Placas de agar sangre
o Placas con Agar BHI
o Tubo con caldo tioglicolato
 REACTIVOS
o Set. de colorantes para Gram
PROCEDIMIENTO
 Siembre con un asa de Kolle procurando aislar las bacterias en las placas de agar sangre.
 Siembre en el tubo que contiene caldo tioglicolato.
 Incubar a 37 ºC por 24 horas en anaerobiosis.
 Después de la incubación, seleccione una colonia β-hemolítica y realice una coloración
Gram.
 Observe con lente de inmersión.
Realizar la lectura teniendo en cuenta:
 En el caldo tioglicolato: Desarrolla grumos pequeños sin producir turbidez
 En el agar sangre: Observe de preferencia las colonias puntiformes y rodeadas de β hemólisis
β-hemólisis son aquellos que producen una hemólisis total de los glóbulos rojos, observándose
como un halo transparente alrededor de las colonias.
α-hemólisis Son aquellos que producen hemólisis parcial la cual se observa como un halo con
tonalidad verdosa alrededor de las colonias.
Gamma –hemólisis Son aquellos que no producen hemólisis sobre el agar sangre.
 Anote las características de forma y reacción Gram.
_____________________________________________________________________________
CUESTIONARIO
1. ¿Qué anticoagulantes se usan para preparar la sangre con miras a la preparación del agar
sangre?
2. Describir el procedimiento y el objetivo de la prueba de Bilis-esculina.
3. Describir el fundamento y objetivo de la prueba de CAMP.
4. ¿Para qué sirven los discos de Optoquina y Bacitracina, en la identificación de
Streptococcus?
_____________________________________________________________________________
PRÁCTICA IX: VIROLOGÍA

 Aislamiento de Bacteriófagos
Aislamiento de Bacteriófagos
I. Introducción:
Bacteriófago, también llamado virus bacteriano o, abreviadamente, fago, virus capaz de
infectar las bacterias. Los bacteriófagos están presentes en los desechos humanos, en el suelo
y en las aguas residuales.
La mayor parte de los virus bacterianos que se han estudiado infectan principalmente
bacterias como Escherichia coli o Salmonella typhimurium, aunque se conocen virus que infectan
tanto eubacterias como arqueobacterias.
El material genético de este tipo de virus puede ser tanto ARN como ADN. Unos cuantos
poseen una envoltura de lípidos, pero la mayoría carecen de ella. Muchos bacteriófagos
presentan estructuras complejas con cabeza y cola. En este último caso la infección de la
bacteria se produce por la penetración del ácido nucleico, ya que la cabeza y la cola se quedan
en la superficie de la bacteria, y las partículas víricas se forman en el interior de ésta hasta
producir el “estallido” o lisis de la misma.
Al infectar un virus a una bacteria ocurre lo siguiente : adsorción del virus y penetración en
las células, dilución o lisis de la bacteria con liberación del virus. Esta fase de lisis se pone de
manifiesto por el aclaramiento de los cultivos bacterianos en medios líquidos o por la formación
de calvas o placas en cultivos en medios sólidos. Esta lisis se puede inhibir por medio de sueros
antibacteriófago.
Al estudiar las propiedades físicas y químicas así es necesario preparar un gran lote del
mismo purificado, libre de material celular (huésped) y esto se considera como el medio del
aislamiento de fagos.
Los bacteriófagos se emplean actualmente como vectores de clonación en el campo de la
ingeniería genética y su estudio tiene implicaciones importantes en la medicina y la genética, en
concreto en la comprensión de las infecciones virales, defectos genéticos, problemas de
desarrollo, causas del cáncer y la resistencia de las bacterias a los antibióticos.
II. Objetivo:
Aislar virus bacterianos utilizando técnicas adecuadas.
III. Materiales:
Material Biológico:
 Cepa bacteriana (Escherichia coli o Pseudomonas sp.)
 Agua residual o servida
Material de Laboratorio:
 Medio de cultivo: Caldo Doble Concentrado
 Caldo Tripticasa Soya
 Agar tripticasa soya
 Filtro de porcelana.
 Frascos y botellas estériles.
 Viales, placas, pipetas, papel filtro, tubo para centrifugar, asas bacteriológicas (en anillo
y en punta).
 Centrífuga refrigerada.
 Estufa
_____________________________________________________________________________
 Bomba de vacío
 Matraz
IV. Procedimiento:
 En una botella estéril colocamos 50 ml. de caldo doble concentrado (CDC).
 Luego, sembramos la cepa problema en el CDC (1 azada si la cepa está en medio líquido o
4 colonias si está en placa).
 Incubamos por 4 a 5 horas en el caso de E. coli.
 Luego, agregamos el agua servida a la botella (previamente se lo pasa por papel filtro), 50
ml.
 Luego, incubar a 37°C por 18 a 24 horas.
 Pasado el tiempo, volveremos a filtrar en papel filtro, para luego centrifugar ese filtrado a
1500 rpm por 5 a 10 min., de esta manera libramos a la muestra de macroimpurezas.
 Luego el sobrenadante lo filtramos con el filtro bacteriológico de porcelana (aquí se usa un
matraz estéril y la bomba de vacio).
 Luego, el filtrado obtenido, de manera aséptica, lo pasamos a viales (estériles), luego
taponamos y lo guardamos en refrigeración.
Comprobación de fagos:
 En una placa con agar tripticasa soya sembramos con hisopo la cepa problema (E. coli),
luego incubamos de 4 a 6 horas.
 Pasado el tiempo, con el asa añadimos 1 gota de filtrado sobre la placa
 Por último, incubamos a 37°C por 18 a 24 horas (observar la formación de calvas o placas).
V. Resultados:
CUESTIONARIO
1. ¿Qué aplicaciones prácticas tendrían el uso de bacteriófagos en la toxicología?
_____________________________________________________________________________
PRÁCTICA X: MICOLOGÍA
 Cultivo de mohos ambientales y levaduras.
 Cultivo de dermatofitos.
LOS HONGOS - GENERALIDADES
Los hongos son organismos:
Constituidos por células que poseen orgánulos membranosos y

Eucarióticos
núcleo rodeado por membrana.
No pueden fotosintetizar por carecer de clorofila y, por tanto,

Heterótrofos
deben utilizar el carbono de los compuestos orgánicos.
Es decir sólo son capaces de incorporar nutriente simples

Se nutren por absorción
solubles.
En la mayoría de los casos la quitina es el componente más

Presentan pared celular rígida
importante.
Morfología y estructura
En la naturaleza pueden encontrase formas muy simples como las levaduras, formas
filamentosas multinucleadas y estructuras macroscópicas más complejas como los denominados
hongos de sombrero.
- Levaduras: Son hongos unicelulares. Pueden ser esféricas, ovoides, elípticas,

cilíndricas o muy alargadas. La mayoría de las veces se encuentran aisladas, pero,
en algunos casos permanecen unidas formando pseudohifas, cuyo
entrecruzamiento constituye el pseudomicelio. Ejemplo: Candida albicans,
Saccharomyces cerevisiae.
- Hongos filamentosos: Están constituidos por un conjunto de filamentos

llamados hifas, cuyo entrecruzamiento constituye el micelio. Las hifas pueden
poseer septos a intervalos regulares o carecer de ellos. Cuando un hongo
presenta hifas no septadas se dice que su micelio es cenocítico. Ejemplo:
Cladosporium, Penicillium, Alternaria, Aspergillus, Mucor.
- Hongos de sombrero: Presenta

estructuras subterráneas formadas por la
ramificación y el entrecruzamiento de las hifas.
Además desarrollan un conjunto de hifas
aéreas que forman un cuerpo
denominado seta. Ejemplo: Pleurotus ostreatus,
Agaricus bisporus (Champiñón).
Micelio
Según su función, el micelio de los hongos se diferencia en:
- Micelio vegetativo: Constituida por hifas que crecen dentro y sobre el sustrato que contiene
los nutrientes. Cumple funciones de absorción.
_____________________________________________________________________________
- Micelio aéreo o de reproducción: Constituida por estructuras aéreas que se originan a partir
del micelio vegetativo y, como su nombre lo indica, cumple funciones relacionadas con la
reproducción y multiplicación.
REPRODUCCIÓN
Pueden presentar dos tipos de reproducción: Sexual y asexual.

No todos los hongos se reproducen de las dos maneras, algunos sólo de forma asexual, los
hongos que se reproducen de forma asexual son los hongos imperfectos (anamorfos). Los
hongos que se reproducen tanto asexual como sexual son los hongos perfectos (teleomorfos).
Esporas asexuales Esporas sexuales
 Endosporas Oosporas
- Esporangiosporas
Zigosporas
 Exosporas (Conidias)
- Artroconidias Ascosporas
- Blastoconidias
- Clamidosporas Basidioesporas
DERMATOFITOS
Son un grupo de hongos que presentan la capacidad de invadir los tejidos queratinizados (piel,
pelo, uñas) del hombre y de los animales, produciendo una enfermedad que se denomina
dermatofitosis o, más comúnmente, tiña.
Su identificación rutinaria en el laboratorio se basa fundamentalmente en criterios morfológicos,

macro y microscópicos. Los géneros que agrupan a las especies productoras de dermatofitosis
son: Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton.
_____________________________________________________________________________
En medios selectivos para el aislamiento de dermatofitos son hongos hialinos que forman
colonias que presentan en general colores claros, con gamas de color restringidas a tonos
blanquecinos, amarillentos y marronáceos.
Existen diferentes estructuras microscópicas a tener en cuenta para la identificación de estos

hongos (clamidosporas, distintos tipos de hifas, etc.). No obstante, la forma y distribución de
macroconidias y microconidias es fundamental a la hora de definir los géneros y especies.
OBJETIVOS
 Observar diferencias morfológicas entre hongos filamentosos y levaduras.
 Observar colonias de diferentes especies de levaduras.
 Poner de manifiesto las principales características microscópicas de las levaduras, hongos
filamentosos y dermatofitos.
MATERIALES:
 Cultivos puros en Agar Sabouraud de Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae y
Aspergillus niger
 Cultivos puros en Agar selectivo para dermatofitos de Microsporum canis
 Portaobjetos y cubreobjetos
 Solución de KOH al 10%
 Placas de Agar Sabouraud
 Agar Selectivo para Dermatofitos (DTM)
PROCEDIMIENTO:
1. A partir de los cultivos puros se inoculan las dos levaduras en placas de agar Sabouraud.
Para ello se toma una pequeña parte de una colonia aislada y se realizan estrías en una
porción de la placa. Se incuban las placas durante tres días a temperatura ambiente.
_____________________________________________________________________________
2. Observar al microscopio las estructuras características de cada especie. Colocar en un

portaobjetos una gota de solución de KOH al 10% sobre al cual se suspenderá una pequeña
cantidad de inóculo. Observar con objetivo de 10 X y 40 X
3. Exponer placas destapadas de agar Sabouraud durante un período no menor de 10 minutos.
Luego incubar a temperatura ambiente por una semana.
4. A partir de un cultivo puro de dermatofitos, sembrar en agar selectivo para dermatofitos
(DTM).
RESULTADOS:
1. Observación microscópica y macroscópica: Esquematice y describa las estructuras

observadas
- Levadura:
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
- Hongo Filamentoso: __________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
- Dermatofito:
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
_____________________________________
CUESTIONARIO
1. ¿Qué tipo de esporas son claves para identificar Aspergillus y Penicillium de importancia
patológica?
2. ¿Cómo puedo diferenciar Candida albicans de Candida auris por pruebas de laboratorio?
3. Mencionar tres tipos de basidiomicetos con propiedades medicinales y toxicas.
_____________________________________________________________________________
PRÁCTICA XI: PARASITOLOGÍA BÁSICA

1. OBJETIVOS
 Conocer los exámenes de diagnóstico de los parásitos.
 Analizar muestras de heces humanas para conocer la morfología macroscópica y
microscópica de los parásitos.
 Observar el ciclo de vida de los parásitos en heces humanas.
PARÁSITOS
Los parásitos son organismos que requieren para su supervivencia a otro organismo, el cual es
denominado como huésped. Los parásitos varían en tamaño, existen de organismos unicelulares
llamados protozoarios, hasta gusano, los cuales se puede observar a simple vista. Durante el
desarrollo de su ciclo de vida pueden afectar uno o más organismos.
MORFOLOGÍA
 Forma  Color
 Tamaño  Estructura interna y externa
2. MATERIALES Y REACTIVOS
 Láminas porta y cubre objetos  Lugol
 Microscopio  Sulfato de Zinc 33.3%
 Vaguetas  Muestra biológica: heces humana
3. MÉTODOS
Métodos macroscópicos y microscópicos
3.1 Observación directa
Método: Consiste en la observación directa de los parásitos en la muestra, la observación puede
ser a simple vista donde se visualiza las formas adultas o los partes visibles de los parásitos de
mayor tamaño como Áscaris lumbricoides. Las formas no visibles a simple vista como los huevos,
se visualizan con el uso de un microscopio.
PROCEDIMIENTO
Observar en la muestra directamente las formas o las partes del parásito.
Para la observación microscópica: tomar una muestra de heces aproxi. 0.5 g, colocar sobre el
porta objetos, agregar una gota de suero fisiológico, homogenizar con una vagueta, cubrir con el
cubreobjetos, observar en el microscopio a 10x.
Agregar lugol por los lados del cubre objeto, observar a 10x.
OBSERVACIONES:………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
3.2 Técnica de flotación: Método de Faust o de Sulfato de Zinc al 33%

Método: El método de flotación emplea un medio líquido más pesado que los parásitos
permitiendo que los mismos suban a la superficie y puedan ser recuperados de la película
superficial. La concentración de sulfato de zinc al 33.3 % para hacer flotar los elementos
parasitarios tiene un peso específico de 1.180
Ventajas: el preparado es más límpido, facilitando la observación microscópica.
PROCEDIMIENTO
 Mezclar 10 gramos de heces con 50 mL de solución fisiológica.
 Tamizar a través de un colador metálico.
 Filtrar sobre gasa en un embudo.
 Recoger 10 mL del filtrado sobre un tubo de centrífuga.
_____________________________________________________________________________
 Centrifugar x 5 minutos a 1500 rpm. Descartar el sobrenadante.

 Repetir esta operación 3 veces o hasta que el sobrenadante quede límpido.
 Agregar al sedimento final 2 a 3 mL de solución de sulfato de zinc al 33% y homogeneizar
con varilla.
 Enrazar con sulfato de zinc el tubo de centrífuga sin volver a homogeneizar.
 Centrifugar 1 a 2 minutos a 1500 rpm.
 Extraer con una vagueta unas gotas de la película superficial sin retirar el tubo de la
centrífuga o haciéndolo con sumo cuidado para evitar que por agitación se destruya la
película.
OBSERVACIONES:………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
Ciclo de vida de Ascaris

lumbricoides.
HUEVOS DE PARÁSITOS
_____________________________________________________________________________
CUESTIONARIO
1. Realice un cuadro con los ecto y endoparásitos que afectan al hombre.
2. Realice un cuadro con los ecto y endoparásitos que afectan a los animales.
3. Mencionar los parásitos con sus respectivos hospederos intermediarios y hospederos
finales.
4. Realice un cuadro con parásitos visibles a simple vista y los parásitos no visibles a simple
vista.
5. Realizar un diagrama del ciclo vital de Taenia solium
_____________________________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Benson HJ. Microbiological Applications: A Laboratory Manual in General Microbiology”. 8ª ed. New
York: Mc Graw-Hill Education; 2001.
2. Botero M, Toro D, Castaño J. Manual Práctico de Microbiología. Manizales: Editorial Universidad de
Caldas; 2011.
3. Camacho S. Ensayos Microbiológicos. Madrid: Editorial Síntesis; 2014.
4. FDA/BAM. Bacteriological Analytical Manual [Internet].2018. [citado 02 marzo 2019]. Disponible
en: https://www.fda.gov/food/foodscienceresearch/laboratorymethods/ucm2006949.htm
5. Gamazo C, Sánchez S, Camacho AI. Microbiología basada en la experimentación. Barcelona: Elsevier;
2013.
6. Kaiser GE. BIOL 230 Microbiology Lab Manual. 9ª ed. Baltimore. 2007
7. Lindquist JA. General Microbiology: A Laboratory Manual, Fourth Edition. New York: McGraw-Hill;
2006.
8. Mac Faddin JF. Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica 3ª ed. Buenos
Aires: Médica Panamericana; 2003.
9. Madigan MT, Martinko JM, Parker J. Brock. Biología de Los Microorganismos. 15vª ed. Madrid:
Pearson Education; 2015.
10. Merck Microbiology Manual 12th Edition. Darmstadt: Merck; 2007.
11. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Microbiología Médica. 8Vª ed. Madrid: Elsevier; 2017.
12. Organización Mundial de la Salud. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. – 3ª ed. Ginebra:
OMS; 2005.
13. Winn, WC, Allen, SD, Janda W, Koneman EW. Diagnóstico Microbiológico, 6ª Edición. Buenos
Aires: Editorial Médica Panamericana; 2008.
LABORATORIOS Y PÁGINAS WEB

1. Laboratorios Britania
Laboratorio argentino de medios de cultivo
https://www.britanialab.com/productos
2. Laboratorios Oxoid
Excelente página donde encontrará información sobre medios de cultivo
http://www.oxoid.com/uk/blue/index.asp
3. IMAGE GALLERY
Página de la asociación americana de microbiología, tiene una interesante galería de fotos de acceso
libre y muchos recursos mas.
http://www.asmscience.org/content/education/imagegalleries
4. SCIENCE EDUCATIONAL LINKS MICROBIOLOGY
Página con links a numerosos recursos web
https://www.scienceprofonline.com/science-ed-links/science-education-links-microbiology.html
6. BASE DE DATOS SISTEMA DE BIBLIOTECAS DE LA UNMSM
Página con los links a numerosas bases de datos de libros y revistas. Acceso desde la universidad y
en algunos casos hay acceso remoto con el usuario de su correo de la UNMSM
http://sisbib.unmsm.edu.pe/
_____________________________________________________________________________
ANEXO 1
MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA
A continuación mencionaremos los pasos que se deben seguir en caso de que ocurran los
siguientes accidentes:
Derrame de material biológico sobre el cuerpo

 Remover la ropa inmediatamente.
 Lavar vigorosamente el área expuesta con agua y jabón por un minuto.
 Reportar el incidente al profesor.
 Buscar atención médica si es necesario.
 La ropa contaminada debe ser colocada en una solución desinfectante antes de ser lavada.
Salpicaduras en los ojos con materiales biopeligrosos

 Lavar inmediatamente el globo ocular e interior de la superficie del párpado con abundante
agua durante 15 minutos aproximadamente. Abrir el ojo para asegurar efectivamente el
lavado, comenzando por los párpados.
 Reportar el incidente al profesor.
 Buscar atención médica inmediatamente.
Cortadas menores y heridas por pinchazo

 Lavar vigorosamente la herida con agua y jabón por varios minutos.
 Reportar el incidente al profesor.
 Buscar atención médica inmediatamente.
En el caso de derrames
 Reportar el incidente al profesor.
 Limpiar y desinfectar inmediatamente el área.
 La persona que realice la operación debe llevar puesto guantes. Para limpiar la porción del
derrame, los trozos de vidrio rotos y/o cultivo deben cubrirse con toallas de papel
impregnadas en solución desinfectante. Al cabo de diez minutos debe limpiarse empleando
nuevas toallas de papel y desinfectante.
 El material contaminado debe ser colocado en un recipiente para material contaminado o
bolsa de desechos, la cual debe esterilizarse junto con los guantes utilizados.
_____________________________________________________________________________
ANEXO 2
BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es un conjunto de medidas probadamente eficaces para evitar la adquisición
accidental de infecciones con patógenos contenidos en las muestras, así como los riesgos
relacionados con la exposición a agentes químicos, físicos o mecánicos a los que está expuesto
el personal en los laboratorios.
DEFINICIONES
Agente biológico: Todo organismo viviente capaz de causar infección, enfermedad o muerte en
el ser humano con inclusión de los genéticamente modificados y endoparásitos humanos
susceptibles de originar cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad.
Antisépticos: Se definen como agentes germicidas para ser usados sobre la piel y los tejidos
vivos. Aunque algunos germicidas pueden ser utilizados como desinfectantes y antisépticos
(alcohol 70-90%), su efectividad no es necesariamente la misma en cada caso, un buen
antiséptico puede no ser eficaz como desinfectante y viceversa.
Área contaminada: Área donde se manipulan microorganismos de riesgo. Ejemplo:
Laboratorios donde se manipulan virus, producción de antígenos, etc.
Área limpia: Área del laboratorio donde no se manipulan microorganismos de riesgo. Ejemplo:
donde se mantienen los medios de cultivos celulares, se preparan los medios de cultivo y a la
vez se realiza la formulación de la vacuna.
Acción correctiva: Procedimiento realizado para eliminar la causa de una disconformidad,
defecto u otra situación no deseable y existente con el propósito de evitar que vuelva a suceder.
Acción preventiva: Acción tomada para eliminar las causas de una disconformidad, defecto u
otra situación potencial no deseada a fin de evitar que se produzca.
Bioseguridad: Conjunto de medidas preventivas reconocidas internacionalmente orientadas a
proteger la salud y la seguridad del personal y su entorno. Complementariamente se incluye
normas contra riesgos producidos por agentes físicos, químicos y mecánicos. Modernamente se
incorporan también las acciones o medidas de seguridad requeridas para minimizar los riesgos
derivados del manejo de un organismo modificado genéticamente (OMG), sus derivados o
productos que los contengan, y uso de la tecnología del ADN recombinante (ingeniería genética)
y otras técnicas moleculares más recientes.
Cabina de seguridad biológica: Son equipos que proporcionan una barrera de contención para
trabajar de forma segura con agentes infecciosos. Permiten proteger según su diseño y
clasificación al trabajador, medio ambiente o al producto. Es una combinación de elementos
electromecánicos/electrónicos y procesos físicos que impulsan el aire a través de unos filtros
especiales de gran superficie estratégicamente situados, que tienen una eficiencia mínima de
retención de partículas del 99,99%, cuando el tamaño de éstas es de 0,3 μ.
Desinfección: Proceso que mediante el empleo de agentes (sobre todo químicos), es capaz de
eliminar los microorganismos patógenos de un material. Generalmente se presentan efectos
tóxicos sobre tejidos vivos, por lo que se emplea sólo sobre materiales inertes.
Equipo de Protección Personal (EPP): El equipo de protección personal está diseñado para
proteger a los empleados en el lugar de trabajo, de lesiones o enfermedades serias que puedan
resultar del contacto con peligros químicos, radiológicos, físicos, eléctricos, mecánicos u otros.
Además de caretas, gafas de seguridad, cascos y zapatos de seguridad, el PPE incluye una
variedad de dispositivos y ropa tales como gafas protectoras, overoles, guantes, chalecos,
tapones para oídos y equipo respiratorio.
Filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air): Diseñado específicamente para proteger el
sistema respiratorio del ser humano. HEPA es un filtro de alta eficiencia en el control de partículas
suspendidas. También son conocidos como filtros ABSOLUTOS debido a su eficiencia. Retiene
y filtra todas las partículas del aire desde un tamaño de 0,3 μ con una eficiencia del 99,97%
Inmunización: Proceso destinado a brindar protección mediante la aplicación de
inmunobiológicos (gammaglobulinas, toxoides, vacunas) a personas en riesgo de contraer
enfermedades.
Peligro: Todo aquello que puede producir un daño o un deterioro de la calidad de vida individual
o colectiva de las personas.
Peligro biológico: Todo agente biológico y materiales que son potencialmente peligrosos para
los seres humanos, animales o plantas.
_____________________________________________________________________________
Producto biológico: Es una vacuna producida con microorganismos vivos o atenuados,

componentes celulares, reactivos de diagnóstico o productos terapéuticos de naturaleza
biológica destinados para uso humano o animal y fabricados según los requisitos estándares.
Riesgo: Probabilidad de que ante un determinado peligro se produzca un cierto daño, pudiendo
por ello cuantificarse.
Sustancia infecciosa: Es aquella que contiene microorganismos viables (bacterias, virus,
rickettsias, parásitos, hongos o recombinantes híbridos mutantes) que pueden causar
enfermedades tanto en el hombre como en los animales. No incluye toxina que no contiene
ninguna sustancia infecciosa.
Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo
Grupo de riesgo 1 (riesgo individual y poblacional escaso o nulo)

Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano
o los animales.
Grupo de riesgo 2 (riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo)
Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen
pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población,
el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección
grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es
limitado.
Grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo)
Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que
de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas
eficaces.
Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado)
Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales
y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente. Normalmente no
existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces.
¿Cómo ocurre el riesgo de adquirir una infección en el laboratorio?

Vías más comunes de exposición
Ingestión:
• Pipeteo con boca.
• Salpicaduras en boca.
• Colocación en boca de artículos o dedos contaminados.
• Consumo de comida en lugar de trabajo.
Inoculación:
• Accidentes con agujas.
• Cortaduras con objetos punzo cortantes.
• Mordedura de animales.
Contaminación de piel o mucosas:
• Contacto con superficies, equipo o artículos contaminados.
• Salpicaduras en piel intacta o no intacta (con algún tipo de lesión).
• Salpicaduras en ojos, boca o nariz.
Inhalación:
• Por diversos procedimientos que producen aerosoles.
Los laboratorios se clasifican como sigue:

 laboratorio básico – nivel de bioseguridad 1
 laboratorio básico – nivel de bioseguridad 2
 laboratorio de contención – nivel de bioseguridad 3, y
 laboratorio de contención máxima – nivel de bioseguridad 4.
Las designaciones del nivel de bioseguridad se basan en una combinación de las características
de diseño, construcción, medios de contención, equipo, prácticas y procedimientos de operación
necesarios para trabajar con agentes patógenos de los distintos grupos de riesgo.
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
MANEJO DE DESECHOS BIOLÓGICO-INFECCIOSOS

En una conferencia de las Naciones Unidas sobre el Medio Ambiente y el Desarrollo se establecieron las
recomendaciones para el manejo de desechos, las cuales se resumen en cuatro postulados:
 Prevenir y minimizar la producción de desechos
 Reutilizar o reciclar hasta donde sea posible
 Tratar los desechos con métodos seguros y que no dañen al ambiente
 Disponer de ellos en sitios cuidadosamente diseñados y confinados.
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________

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Universidad Nacional Mayor de San

 MG. JULIO REYNALDO RUIZ QUIROZ

5 NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

6 PRACTICA I: INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PREPARACIÒN

12 PRÁCTICA II: TÉCNICAS DE CULTIVO

18 PRÁCTICA III: TINCIONES MICROBIANAS

27 PRÁCTICA IV: GENÉTICA MICROBIANA Y ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS

36 PRÁCTICA V: NUTRICIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

42 PRÁCTICA VI: METABOLISMO MICROBIANO

47 PRÁCTICA VI: INTRODUCCIÓN A LA INMUNOLOGIA

56 PRÁCTICA VII: BACILOS GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES, NO FERMENTADORES Y

65 PRÁCTICA VIII: BACILOS GRAM POSITIVOS Y COCOS GRAM POSITIVOS

76 PRÁCTICA IX: VIROLOGÍA

Posteriormente, en cada práctica se proponen formas de presentación de los resultados.

NORMAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

INSTRUCCIONES ESPECÍFICAS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

NORMAS A SEGUIR EN EL LABORATORIO

PRÁCTICA I: INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE

RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS, APARATOS Y MATERIALES DE LABORATORIO

Autoclave: Aparato en el que se logran temperaturas superiores a la

Horno: Es utilizado en operaciones que requieren calor muy intenso, como

Estufa de Incubación: Es utilizada para lograr el

Asa de Siembra: Un asa de siembra o

Placas Petri: La placa de Petri, es un

Agente Sistema de Esterilización Método

ELIMINACIÓN Y LIMPIEZA DE MATERIAL CONTAMINADO

PROCESO DE ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO Y CALOR

PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL

En el caso de materiales de vidrio (tubos, matraces, etc.) se tapan

Las soluciones y medios de cultivo líquidos se envasan en matraces, frascos o tubos y se

EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS y REACTIVOS

Acondicionamiento del material para esterilizar

Esterilización por calor seco

Esterilización por calor húmedo

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

A) Por el estado físico en que se encuentran en:

2. Medios de enriquecimiento: son medios líquidos o semisólidos, contienen sustancias que

EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS y REACTIVOS

1. ¿Qué otras formas de esterilización se usan en un laboratorio de microbiología?

PRÁCTICA II: TÉCNICAS DE CULTIVO

Condiciones para la siembra de los microorganismos:

Esterilización del Asa Bacteriológica:

Manejo del asa de siembra durante una inoculación

Inoculación en Medios de Cultivo en Tubo de Ensayo

1. Siembra en Medio Líquido (Caldo)

Fig. 2: Siembra en agar inclinado

Sembrado en placas de agar

Siembra por Siembra por aislamiento

Después de la siembra incubar los medios de cultivo en la estufa a la temperatura de 37 ºC para

LECTURA DE COLONIAS, ESTUDIO DE CRECIMIENTO MICROBIANO

En medio semisólido se podrá comprobar si el microorganismo es o no móvil, ya que en el primer

CARACTERIZACIÓN DE LAS COLONIAS DE LOS MICROORGANISMOS

Tamaño: Pequeñas, regular, grande

Cromogénesis: Pigmento verde, amarillo, rojo, blanquecino.

Emplear las diferentes técnicas de cultivo de microorganismos, para estimular su crecimiento.

Agar tripticasa soya

Agar tripticasa soya

Medio Descripción de colonias típicas

Agar tripticasa soya

1. ¿Qué es una colonia bacteriana? ¿A qué se le denomina cepa en microbiología?

PRÁCTICA III: TINCIONES MICROBIANAS

Las tinciones simples son en las cuales se usa un