 Describir la técnicas básicas de

fitomejoramiento que emplean cultivo in vitro

como fundamento principal.
 Métodos de mejoramiento que no implican
Ingeniería Genética
◦ Método Haplodiploide
 Androgénesis
 Ginogénesis
◦ Selección Celular in vitro
◦ Selección Somaclonal in vitro
◦ Hibridación interespecífica sexual y rescate de
embriones
◦ Hibridación interespecífica somática (Fusión de
Protoplastos)
 Métodos de mejoramiento que usan Ingeniería
Genética
◦ Organismos genéticamente modificados
◦ “Molecular Farming”
 Concepto
◦ Fundamento
 Uso de haploides
◦ Tipos y nomenclatura
 Fases esporofítica y gametofítica
 Tipos
◦ Androgénesis
◦ Ginogénesis
 Aplicaciones
“El método haplodiploide es un método de
mejoramiento genético que involucra la
creación de líneas puras perfectas, a través de
la duplicación del genoma de células y/o
tejidos haploides”

 Estascélulas o tejidos pueden ser obtenidos

de forma natural (por procesos espontáneos
dentro de las plantas), o por cultivo in vitro
de células y tejidos haploides.
 Cultivo in vitro COLCHICINA

Genotipo Generación de Líneas

Obtención
Plantas Duplicación

planta original gametos

de de homocigotas
haploides haploides haploides
(puras)

ABC ABC AABBCC

ABc ABc AABBcc

aBC aBC aaBBCC

aBc aBc aaBBcc

AbC AbC AAbbCC

…AaBbCc… Abc Abc AAbbcc

abC abC aabbCC

abc abc aabbcc

Morfología
Morfología
Diploide (n=24) Tetraploide (n=48)

Aneuploide (n=22) Aneuploide (n=21)

Contenido de DNA en una
planta control de
Pelargonium x hortorum cv.
“370”.

Contenido de DNA en una

planta aneuploide (+) de
Pelargonium x hortorum cv.
“370”.

Contenido de DNA en una

planta aneuploide (-) de
Pelargonium x hortorum cv.
“370”.
 Se identificaron los primeros haploides en plantas
hace más de 80 años (Belling and Blakeslee, 1922)

 Se pueden obtener haploides de forma espontánea

con una eficacia muy baja

 La primera planta haploide obtenida mediante cultivo

de anteras se obtuvo en Datura (Guha and
Maheshwari, 1964)

 La obtención de dobles haploides sirve como

complemento a distintos métodos de mejora genética
tanto clásicos como biotecnológicos (Baenzinger,
1996; Khush and Virmani, 1996; Gepts, 2002)
 Célula o individuo que contiene un solo miembro
de cada cromosoma homólogo (número haploide
= n) por lo que su número cromosómico coincide
con el gamético.
 Se ha constatado la aparición de forma natural de
haploides de distintas especies (Harlow et al., 1996)

 En Brassica  líneas homocigotas diploides a partir de

haploides (Thompson, 1974)

 En cebada, Hordeum vulgare  gen hap controla la

formación de haploides (Hagberg and Hagberg, 1980)

 En maíz  una mutación en el gen ig  formación de

embriones haploides (Kermicle, 1969)

 En algodón  formación de embriones sin la participación

de las células espermáticas (Turcotte and Feaster, 1974)
 Hay tres formas de obtener plantas haploides con
una eficacia relativamente alta (Maluszynski et
al., 2003)

1. Androgénesis, donde se cultivan anteras o

microsporas aisladas y se obtiene una respuesta
morfogénica de forma directa o tras el paso por una
fase de callo desorganizado

2. Ginogénesis, donde se cultivan óvulos aislados no

fertilizados, ovarios o yemas florales y se obtienen
embriones a partir de las células del saco embrionario

3. Rescate de embriones obtenidos mediante ginogénesis

in situ o mediante cruces interespecíficos
 Gametofito

esporofito
 Androgénesis
◦ Microesporogénesis
◦ Desviación del proceso de gametogénesis
◦ Androgénesis directa e indirecta
◦ Cultivo de Anteras
 Fundamento metodológico
 Factores que influyen en la respuesta
androgenética
◦ Cultivo de microesporas aisladas
 Métodos de obtención de microesporas
 Factores a tener en cuenta
 Resultados y problemas actuales
 La androgénesis se define como el proceso de generación de un
individuo cuyo fondo genético proviene exclusivamente de un núcleo de
origen masculino.

 Es decir, consiste en la generación de una planta a partir exclusivamente

de un gameto masculino o de su precursor haploide (gametofito)

 Una vez obtenido el embrión o el callo, se pueden regenerar las plantas

doble haploides mediante técnicas comunes de cultivo in vitro.

 Las microsporas/polen se pueden desviar de la ruta gametofítica e

inducir a formar un embrión o un callo haploide de dos maneras: o bien
aislándolas de la antera y cultivándolas en medio de cultivo líquido
(cultivo de microsporas), o bien cultivando directamente la antera que
las contiene en medio sólido (cultivo de anteras).
Microgametogénesis:
Desviación del proceso
Cultivo de polen maduro
 Tulecke (1953) : Proliferación celular a partir de granos de polen
maduros de Ginkgo biloba
Cultivo de anteras
 Guha y Maheshwari (1964) : Embriones en cultivo de anteras de
Datura innoxia

 Bourgin y Nitsch (1967) : Embriones somáticos y plantas haploides en

cultivo de anteras de Nicotiana tabacum
Cultivo de microsporas aisladas
 Nitsch (1974) : Aislamiento y cultivo de microsporas Nicotiana
tabacum
 Reinert et al (1975) : Haploides a partir de microsporas de Nicotiana
tabacum
Nicotiana tabacum
La anteras dehicen producto de la maduración in vitro y las
microesporas se trasnforman en embriones somáticos
Los embriones somáticos
germinan y se transforman en
plantas haploides
Plantas haploides de Nicotiana tabacum Plantas diploides de Nicotiana tabacum
Flor masculina de espárrago Separación de las anteras
Cultivo de las anteras en medios de inducción

Formación de callo
embriogénico
Elongación
Individualización
“379” “41-D” “Multibloom escarlata” “Rojo elite”
 Genotipo
◦ Especie
◦ Variedad
◦ Cultivar
◦ Línea
 Estado vegetativo de la planta madre
◦ Período y estación
◦ Cultivo de las plantas en condiciones adecuadas
◦ ¿Plantas jóvenes o plantas adultas?
◦ Tratamientos estresantes
 Estado de flores y anteras
◦ Ventana de desarrollo (fase de microespora uninucleada)
◦ Desarrollo de células germinales
◦ Relación entre el desarrollo de las flores, anteras y
microesporas
1. Tétradas
2. Microesporas uninucleadas en fase G1
3. Microesporas uninucleadas en fase S y G2
4. Granos de polen inmaduros
5. Granos de polen
 Solución Mineral
 Fuente de Carbono
 Vitaminas
 Reguladores: Androgénesis directa vs
Indirecta
 Otros componentes: Carbón activo
 L-glutamina
 Bajas temperaturas (4-5ºC/24-48 horas)
 Androgénesis
◦ Cultivo de microesporas aisladas
 Métodos de obtención de microesporas
 Factores a tener en cuenta
 Resultados y problemas actuales
 Aislamiento de
microesporas

Anteras
androgenéticas

Agregados celulares

Embriogénesis Organogénesis Indirecta

Proembriones Callos haploides

Embriones somáticos haploides

Embriogénesis Organogénesis
Liberación espontánea de las microsporas en medio liquido. Desinfección
de las anteras y precultivo en medio liquido y oscuridad durante un
período variable (2-10 días). Durante la fase de precultivo, las anteras
liberan las microsporas en el medio.

Precultivo de las anteras en medio líquido y agitación posterior (eg.

agitador magnético) para facilitar la liberación de las microsporas

Aislamiento mecánico. Presión de las anteras, con un instrumento de

cristal o teflón, en una malla que permita la retención de los tejidos de las
anteras y el paso de las microsporas.

Homogenización de las anteras en una licuadora o “mixer”. Desinfección de

las anteras, y homogenización en una licuadora de alta velocidad en medio
liquido con altaconcentración de azúcar (>10%) y sin hormonas durante un
corto período (eg. 6-7 seg). A continuación, se filtra la mezcla en malla
(100 μm → 50 μm) y se hacen 2-3 lavados por centrifugación (50 a 350g,
10 min).
Centrifugación por gradientes  Flotación en una solución concentrada de
un osmolito

Lisado de anteras Medio de cultivo

Medio de cultivo Microsporas

Sacarosa (20-24%)
Ficoll (10%)
Percoll (10%) Restos celulares

Recuperación del anillo que se forma en el gradiente

- Micropipeta
- Pipeta pasteur estéril
Embriones somáticos procedentes
de microsporas de Brassica napus
Embriones somáticos
procedentes de microsporas
de Brassica rapa
 Bajas temperaturas (4-5ºC/12-72 horas)
 Altas temperaturas (33-55ºC/pocos minutos)
 Gravedad: centrifugación de anteras y
microesporas (500 g/1 h)
 Privación de nutrientes
◦ Ausencia de sacarosa
◦ Ausencia de sacarosa y cultivo con bajas y altas
temperaturas
 Técnicas Nodriza: Co-cultivo de trigo con
ovarios
 Macroesporogénesis y macrogametogénesis in
vivo
 Ginogénesis directa e indirecta
 Cultivo de ovarios, segmentos y rodajas de
ovarios
◦ Fundamento metodológico
◦ Factores que influyen la respuesta ginogenética
◦ Resultados alcanzados y problemas existentes
 Cultivo de óvulos aislados
◦ Fundamento metodológico
◦ Factores a tener en cuenta
◦ Resultados alcanzados y problemas actuales
Macrogametogénesis
Gametofito femenino
monospórico

Gametofito femenino
de maíz
Ginogénesis directa Ginogénesis casi directa
Ginogénesis indirecta
 Cultivo de ovarios

Cultivo de segmentos de ovarios

Cultivo de rodajas de ovarios

 Genotipo
 Estado fisiológico de la planta grande
 Estado de la Flor
◦ Ventana del Desarrollo: antes de la antesis o el
momento de la antesis
 Medio de cultivo
 Baja respuesta en algunos genotipos
 Ausencia de conocimientos básicos
◦ Desviaciones del proceso de ginogenésis in vitro
◦ Ventana del desarrollo
◦ Inducción de la respuesta ginogenética
 Crecimiento a partir de las células de la pared
del ovario
◦ Plantas de origen somático
◦ Inhibición del desarrollo de los óvulos
 Crecimiento a partir de los tejidos somáticos
del óvulo
 Aislamiento de los Óvulos
◦ Accesibilidad
◦ Situación
◦ Tamaño
 Medios de cultivo específicos
◦ Ginogénesis directa
◦ Ginogénesis indirecta
Placenta con óvulos de Ginogénesis en cultivo
Dianthus trifasciculatus de óvulos aislados de
Dianthus trifasciculatus
 Plantas comestibles
◦ Pepino
◦ Melón
◦ Sandía
◦ Trigo
 Plantas Ornamentales
◦ Kalanchoe
◦ Gérbera
◦ Geranio