Métodos para la determinación de Proteínas

Existen diversos métodos que permiten la cuantificación de proteínas en muestras biológicas. No

existe un sistema totalmente satisfactorio para determinar la concentración proteica de una
muestra. La elección de un método u otro se basa en la naturaleza de la proteína y del resto de
componentes de la muestra y en la sensibilidad y precisión requeridos.

Metodo de Kjeldahl (Johann Kjeldahl 1883)

Análisis químico que se basa en determinar el contenido en nitrógeno de una sustancia

química (comúnmente se utiliza para estimar el contenido de proteínas de los alimentos), Esta
técnica se basa en una Digestión, en la cual se efectúa la destrucción oxidativa de la materia
orgánica de la muestra y la reducción del nitrógeno orgánico a sulfato de amonio, mediante
ebullición a una temperatura de 400º C y adición previa de ácido sulfúrico y catalizadores. La
mezcla digerida se neutraliza con una base. Posterior a esto se realiza una separación por arrastre
de vapores del amonio. El destilado se recoge en una solución de ácido bórico. Los aniones del
borato así formado se titulan con HCl (o H2SO4) estandarizado para determinar el nitrógeno
contenido en la muestra. El resultado del análisis es una buena aproximación del contenido de
proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no proteicos.

Ventajas
 Apropiado para varios tipos de productos.
 Alta fiabilidad.
 Usado como método de referencia.

Desventajas
 Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.
 Uso de catalizadores tóxicos o caros.
 Elección del factor de conversión

Método de Lowry

Método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un

reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color
proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer.

Este método consta de dos etapas:

1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos
de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro.
Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose
los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+
se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.

2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos
de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como
catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido
fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un
complejo de color azul intenso.
Por espectrofotometría pueden leerse las muestras tratadas con este método entre 650 a 750 nm.
La cantidad de proteína puede ser estimada utilizando una curva estándar con otra proteína, es
decir, cuya concentración sea conocida como la albúmina bovina sérica.

Ventajas:
 Muy sensible y relativamente simple
 Menos afectado por la turbidez de la muestra
 Más específico que la mayoría de los otros métodos

Desventajas:

 tiempo de la reacción
 La incompatibilidad con detergentes y agentes reductores.

Método del Ácido Bicinconínico (Paul K. Smith en 1985)

Se basa en el principio de que las proteínas reducen los iones cúpricos a iones cuprosos
bajo condiciones alcalinas. La conversión es definida como la reacción de Biuret. Esta reacción es
influenciada por cuatro aminoácidos (cisteína, cistina, tirosina y triptófano) y también por la
cadena peptídica. BCA es un reactivo cromogénico específico para Cu1+ y en el segundo paso de la
reacción dos moléculas de BCA reaccionan con una de ión Cu1+. La cantidad de Cu2+ reducido es
función de la concentración de proteínas y puede ser determinada espectrofotométricamente por
un cambio en el color de la solución a púrpura, que absorbe a 562 nm. La absorbancia es
directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la solución y puede ser estimada
por comparación con un estándar de proteína conocido, tal como la albúmina sérica bovina (BSA,
por sus siglas en inglés)

Ventajas:
 sensibilidad comparable a la del método de lowry (0.5mg a 10mg)
 La mezcla en un paso es más fácil que en el método de lowry
 El reactivo es más estable que el reactivo de lowry
 Las sales de buffer y detergente no iónico no interfieren con la reacción

Desventajas:
 El color no es estable con el tiempo, se necesita controlar cuidadosamente el tiempo entre
el análisis y la lectura en absorbancia.
 Los azúcares reductores interfieren con la reacción
 Altas concentraciones de sulfato de amonio interfieren con la reacción

Metodo de Absorcion UV a 280nm

Método espectrofotométrico que se basa en la propiedad de las proteínas de tener un máximo

de absorción ultravioleta a 280 nm debido al contenido en los aminoácidos aromáticos tirosina y
triptófano y ligeramente de fenilalanina y puentes disulfuros. Dado que cada proteína tiene una
composición única de aminoácidos aromáticos, el coeficiente de extinción o su absortividad molar
deben ser determinados para proteínas individuales para la estimación del contenido proteico.
Obliga a añadir un factor de corrección aportado por la absorbancia del enlace peptídico a 205 nm.
 Ventajas
 Método simple, rápido
 Muestra puede utilizarse en otro análisis
 Volumen de muestra pequeño

Desventajas
 Los ácidos nucléicos también absorben en la región de 280nm
 Contenido de aminoácidos aromáticos difiere considerablemente en varias proteínas.
 La solución debe ser clara e incolora.
 La turbidez puede producir resultados erráticos
 Se requiere un sistema relativamente puro para utilizar este método

Método de Bradford (Marion Bradford en 1976)

Es uno de los métodos más populares para la determinación de la concentración de proteínas. En

condiciones adecuadas los grupos ácidos o básicos de las proteínas pueden interaccionar con
grupos orgánicos de determinados colorantes para dar lugar a precipitados con un color
característico.

Método químico colorimétrico que se basa en la formación de un complejo entre el

colorante azul brillante de Coomassie G-250 y las proteínas en solución, se une a los residuos de
aminoácidos y a sus bases aromáticas. En condiciones ácidas, el colorante presenta coloración roja
con un máximo de absorción de 470 nm. La unión del colorante a las proteínas induce la
conversión del colorante a una forma estable no protonada, de coloración azul, y con un máximo
de absorción de 596 nm. Esta forma, azul y no protonada es detectada por la lectura de
absorbancia a 595 nm por espectrofotometría a fin de cuantificar la concentración de proteínas.
Durante la formación de este complejo, dos tipos de interacción suceden. Las interacciones iónicas
e hidrófilas estabilizan la forma aniónica del colorante, causando un cambio visible del color. Es un
método sensible, pues el complejo proteína colorante presenta un coeficiente de extinción molar
elevado.

Ventajas:
 Método rápido, se puede completar en 2 minutos
 Reproducible, sensible.
 Compatibilidad con agentes reductores

Desventajas:
 Interferencia con detergentes
 El complejo proteína-colorante formado puede unirse a las celdas de cuarzo
 El color varía con diferentes tipos de proteínas.
 La proteína estándar debe seleccionarse con mucho cuidado

Método de Turbidimetría y Nefelometría

 La turbidez se define como la reducción de la transparencia de un líquido causada por la
presencia de partículas no disueltas de material distinto al propio líquido. Al ser un indicador de
apariencia óptica, ocasionado por la dispersión y absorción de la energía lumínica a través del
líquido, la turbidez solo puede ser medida usando técnicas ópticas. Se fundamenta en la relación
de la intensidad de la luz incidente y de la luz dispersada por el medio, mediante la ley de Lambert-
Beer, en la que la turbidez es proporcional a la concentración de partículas. La turbidez se mide
utilizando:

La turbidimetria: Método de análisis que se basa en la disminución de la intensidad de la luz,

debido a fenómenos de dispersión o reflexión producidos por una muestra concentrada de
partículas en suspensión de tamaño pequeño a grande. Utilizando para ello un espectrofotómetro
(detector en la misma dirección del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para soluciones
concentradas (para que haya una buena disminución de la luz transmitida) ej. Determinación de
proteínas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las proteínas precipiten con TCA o ácido
sulfosalicílico).

La nefelometría: Mide la radiación dispersada o reflejada por las partículas (generalmente con
ángulos que oscilan entre 15 y 90º). Utiliza como instrumento el nefelómetro (en el que el detector
se ubica con un ángulo que oscila entre 15 y 90º ej. a 90º). Se suele utilizar para concentraciones
más diluidas. Permite la valorización cuantitativa, sin separar el producto de la solución.

Ventajas:
 Método rápido, simple
 Permite la valorización cuantitativa, sin separar el producto de la solución

Desventajas:
Alto costo del equipo
 Requiere método de respaldo
 Interferencia de partículas que produzcan una dispersión de luz no deseada

Método de Electroforesis

Una de las técnicas más sencillas para la separación (y posterior cuantificación) de proteínas es
la electroforesis

Técnica en la cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medio aplicando un
campo eléctrico). Cuando se aplica un campo eléctrico a un medio que contiene partículas
cargadas, las partículas cargadas negativamente migran hacia el ánodo o polo positivo mientras
que, las cargadas positivamente migran hacia el electrodo negativo (cátodo). Este principio se
puede aplicar para separar las fracciones de proteínas puesto que los aminoácidos (aa)
constituyentes de la proteínas, y por tanto las proteínas, son compuestos anfóteros que se
comportan como ácidos 6 (ceden protones y quedan con carga negativa) o bases (captan protones
y quedan con carga positiva) dependiendo del medio en el que estén.

Ventajas:
 Alta sensibilidad entre las diferentes moléculas
 Alta eficacia, poder de resolución y versatilidad
 Tiempo de análisis corto

Desventajas