PRACTICA N° 02 BIOTECNOLOGIA AGROINDUSTRIAL

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE LEVADURAS PRODUCTORAS DE ETANOL

1. OBJETIVOS
 Aislar levaduras productoras de etanol de diferentes frutas de la región
 Familiarizar al alumno con las técnicas de aislamiento se las levaduras.
2. FUNDAMENTO TEORICO
Las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y pueden ser
encontradas como parte de la flora normal del alimento, así como de levaduras y
frutas. Ciertas levaduras son utilizadas en la manufactura de varios alimentos, tal es el
caso de algunos quesos inmaduros y fermentaciones industriales.
Las levaduras pueden aislarse de diversas fuentes naturales como los mostos de las
frutas, los néctares de algunas flores (desde donde pueden llegar al ovario y causar
fermentación de los frutos deteriorándolos), de bebidas fermentadas, y de la
superficie de frutas muy dulces, ya que el azúcar favorece su multiplicación.

Las levaduras son hongos unicelulares que pueden ser clasificados en dos grupo filetico:
levaduras ascomicetos asanamórficas y teleomórficas y levaduras basidiomicetos
asanamórficas BOEKHOUT, T., ROBERT, V., SMITH [1].
Debido a su gran diversidad fisiológica pueden crecer en un amplio rango de hábitats.
Al ser organismos heterotróficos requieren para su crecimiento nutrientes minerales y
una cantidad significativa de carbono orgánico. La variedad de hábitats en los cuales se
pueden encontrar levaduras incluyen: suelos, insectos, plantas, frutas, exudados de
·árboles, algas, ambientes marinos y la atmosfera. De igual manera, su presencia
también es común en alimentos manufacturados, bebidas fermentadas, en intestinos
de animales entre otros KURTZMAN, C.P. and ROBNETT, C.J. (1998).
Las frutas son micro hábitats importantes para una variedad de especies de levaduras
en la naturaleza debido a su alta concentración de azúcares simples, bajo pH y la
constante visita por insectos vectores, ROSI, I., VINELLA, M. and DOMIZIO, P (1994)
En estos sustratos la sucesión de levaduras está involucrada en varios procesos
bioquímicos y ecológicos, incluyendo el deterioro de las frutas. Esto ocurre debido a la
habilidad de las levaduras para utilizar rápidamente azúcares simples presentes en los
sustratos. La presencia de especies proteolíticas y pectinolíticas sobre estos sustratos
puede cumplir un papel muy importante en el establecimiento y mantenimiento de la
comunidad levaduriforme TRINDADE, R.C., RESENDE, M.A., SILVA, C.M. (2002)
Durante la colonización de las frutas algunos de estos factores pueden conferirle
ventajas adaptativas a algunas especies. La presencia de cepas productoras de b-
glucosidasa puede contribuir a mejorar las características aromáticas de las frutas,
además de ser de importancia biotecnológica para su aplicación en la industria
alimenticia. ROMO-S£NCHEZ, S., ALVES-BAFFI, M., (2010)

3. MATERIALES Y MÉTODOS

 MATERIALES
a) Materiales Biológicos
Pulpa de fruta de la región en estado de pre incubación
b) Medios de cultivo
- Agar sabouraud glucosado
c) Reactivos
 - Set de coloración GRAM
- Aceite de Cedro
d) MATERIALES DE VIDRÍO

- Frascos estériles

- placa Petri

- laminas portaobjetos y cubreobjetos

e) EQUIPOS

- Microscopio óptico

- Incubadora reguladora a 20-25°C

 MÉTODOS
1.- En un frasco de vidrio de boca ancha estéril, colocar pulpa molida o licuada de
frutas de la región (licuar sin agua)
2.- Dejar incubar a 37°C Por 2 a 3 días
3.- Sembrar por estrías con ayuda del asa bacteriológica en Agar Sabouraus e incubar a
37 °C por 24 horas.
4.- Realizar

IDENTIFICACION DE LAS LEVADURAS NATIVAS PRESENTES EN FRUTAS NATIVAS

PRACTICA N° 03: ESTUDIO DEL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS:

SEGUIMIENTO DEL CRECIMIENTO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

I. Objetivos

 Determinar la curva de crecimiento en microorganismos como levaduras cultivados

en aerobiosis utilizando diferentes fuentes de carbono.
 Determinar la velocidad de fermentación utilizando un medio definido con diferentes
fuentes de carbono.
 Comparar las tasas de crecimiento específico durante la fermentación de
Saccharomyces cerevisiae con diferentes fuentes de carbono.
 Controlar la fermentación por producción de CO2 y decrecimiento en peso del medio
de cultivo.

II. Marco teórico

2.1. Metabolismo de azúcares por levaduras

Bajo condiciones de crecimiento estrictamente anaeróbicas, la fosforilación a nivel

del substrato en la glucólisis es la única fuente de ATP en Saccharomyces cerevisiae y
posibilita un rendimiento neto de 2 ATP por cada molécula de glucosa convertida en dos
moléculas de piruvato. La disimilación de glucosa a piruvato vía la glucólisis está unida
a la reducción de NAD+ en la reacción catalizada por la gliceraldehído-3-fosfato-
deshidrogenasa. Un balance redox cerrado en disimilación es logrado por
 descarboxilación de piruvato a acetaldehído, el cuál (NAD+) subsecuentemente actúa
como un aceptor de electrones para la reoxidación de NADH2.1
El NADH2 y el NADPH tienen diferentes funciones en la red metabólica de
Saccharomyces cerevisiae. El NADPH es preferentemente usado en vías asimilatorias.
La glucólisis juega un rol esencial en la disimilación de azúcar, pero también genera
bloques constituyentes para la biosíntesis. Además, aunque muchas reacciones
biosintéticas usan NADPH como un reductor, algunas reducciones unidas a NADH
ocurren en la conversión de metabolitos centrales (piruvato, oxalacetato, acetil CoA) a
monómeros celulares, por ejemplo en la biosíntesis de aminoácidos. Durante el
crecimiento de Saccharomyces cerevisiae sobre azúcar, la preferencia del NADH en
reducciones disimilatorias (en la reducción de acetaldehído a etanol y la reducción del
pool de quinona de la cadena respiratoria) es muy fuerte.

En Saccharomyces cerevisiae, el mantenimiento de las condiciones de cultivo aeróbico

no es suficiente para lograr metabolismo respiratorio de azúcar. Incluso cultivos
totalmente aeróbicos exhiben un metabolismo mixto respiro-fermentativo, a menos que
ellos sean desarrollados con un suplemento limitado de azúcar a tasas bajas de
crecimiento específico.2, 3 Este fenómeno de fermentación aeróbica (frecuentemente
referido como efecto de la “glucosa” o “Crabtree”) es parcialmente debido a la represión
de la síntesis de enzimas respiratorias por exceso de glucosa.4, 5
Durante el crecimiento respiratorio sobre azúcares, la reoxidación del NADH2 formado
en la glucólisis puede ocurrir vía respiración mitocondrial, de esta manera rinde ATP
adicional vía fosforilación oxidativa. Además por otra parte, la reoxidación respiratoria
de NADH2 glucolítico implica que el piruvato no tiene que ser convertido en acetaldehído
(aceptor de electrones), pero puede ser posteriormente oxidado. La oxidación de
piruvato a acetil coenzima-A, ocurre predominantemente vía el complejo mitocondrial
piruvato-deshidrogenasa, y subsecuentemente el acetil-CoA es oxidado a CO2 y H2O
por las enzimas del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA).6 Los análisis cuantitativos de
culturas respiratorias, han concluido que la eficiencia in vivo de este proceso en
Saccharomyces cerevisiae es menor que en muchos otros microorganismos, esta baja
estequiometría de fosforilación oxidativa está relacionado con la ausencia de un protón
de translocación NADH deshidrogenasa en Saccharomyces cerevisiae, la disimilación
respiratoria completa de glucosa rinde aproximadamente 16 ATP por molécula de
glucosa (cuatro ATP desde la fosforilación a nivel del substrato y cerca de 12 a partir de
la fosforilación oxidativa).

Gay-Lussac fué el primero en mostrar que la fermentación de la glucosa rinde

aproximadamente pesos iguales de etanol y CO2 (45 partes de glucosa rinden 23 partes
de alcohol y 22 partes de CO2). Pasteur encontró que 100 partes de sucrosa rinden
105.4 partes de azúcar invertida, el cual fué fermentada a 51.1 partes de etanol, 49.4
partes de CO2, 3.2 partes de glicerol y 1.7 partes de ácido succínico.
El rendimiento de etanol en fermentaciones de vinos no alcanza el valor teórico, el cual
debe ser 51.1% por peso basado en glucosa fermentada. Este rendimiento se debe a la
formación de sub-productos durante la fermentación alcohólica y a la asimilación de
azúcar por la levadura, además de esto el rendimiento es afectado por diversas
variables incluyendo la temperatura, pH, cantidad de inóculo y presencia ó ausencia de
O2, en la práctica 47.0 – 47.5 gramos de etanol son usualmente obtenidos por cada 100
gramos de azúcar fermentado.

III. Culturas, reactivos y materiales

Levadura 10 g Bagetas 02
Saccharomyces
cerevisiae
 Glucosa, sucrosa 20g Pinzas 01
c/u
Extracto de levadura 5.0 g/L Chapitas 30
KH2PO4 4 g/L Espectrofotómetro 01
MgSO4.7H2O 2 g/L Balanza analítica 01
(NH4)2SO4 5 g/L Potenciómetro 01
Agua destilada 5L Algodón 01 rollo
HCl al 10% 50ml Cinta mazkin 01
Matraces Erlenmeyer de 02 Rotulador 01
1L
Matraces Erlenmeyer de 06 Papel aluminio 01 rollo
250ml
Pipetas de 10 ml 02 Tijera 01
Vasos de precipitación de 04 Pabilo 01 rollo
200ml
Espátulas 02
Pizeta 01
Pipetas 5ml, 10ml 02 c/u

IV. Metodología

Preparación de inóculo: Preparar 100 ml de una solución que contenga: Glucosa ó

sacarosa 2 g, extracto de levadura 0.1 g, KH2PO4 0.5 g, MgSO4.7H2O 0.04 g, ajustar
el pH a 3.8. Luego de esterilizarlo a 121 ºC por 20 minutos a 15 libras/pulg2, inocular
asépticamente con la levadura Saccharomyces cerevisiae usando una asa de siembra
y cultivar por 24 horas en agitación a 28ºC.

Medio de fermentación: Preparar 250 ml de una solución que contenga: Glucosa ó

sacarosa 5 g, extracto de levadura 0.25 g, (NH4)2SO4 0.5 g, KH2PO4 1.0 g,
MgSO4.7H2O 0.1 g.

V. Procedimiento

En cada uno de 3 matraces Erlenmeyer de 400 ml se adicionan 250 ml de medio de

fermentación de composición citada anteriormente, el pH se ajusta a 3.8 con HCl al 10%.
Luego se esteriliza a 121 ºC por 20 minutos a 15 libras/pulg2, seguidamente se deja
enfriar hasta alcanzar los 28 ºC (temperatura de cultivo con Saccharomyces cerevisiae).
Luego asépticamente se inocula con el 5% del inóculo cultivado anteriormente. El
inóculo a utilizar debe centrifugarse previamente a 3 000 rpm x 10min., y enjuagado con
agua destilada antes de inocular al medio de fermentación.