Plasmídeos

• ​DNA dupla fita extracromossômico;

• Circular e autoreplicante;
• Tamanho variável (3000pb a 400000pb);
• Podem ter potencial integrativo;
• Comumente encontrados em bactérias;
• Contem genes não essenciais, mas geralmente
benéficos às bactérias
Quando de ocorrência natural em
bactérias:
• Classe F ou conjugativos;
• Resistência a antibióticos ou outros reagentes;
• Degradativos
• Produtores de bacteriocinas
• Outros fenótipos
Utilizados em Biologia Molecular como
moléculas carreadoras de DNA de
interesse (Vetor)
Histórico. ​Os plasmídeos de ocorrência natural
isolados de bactérias foram engenheirados para uso
como ferramentas de Biologia Molecular
PLASMÍDEO DE OCORRÊNCIA NATURAL COM
TRANSPOSON COMPOSTO
Tn3 está dentro de Tn4
Cada transposon pode ser transferido independentemente ou;
Em conjunto como um grande segmento determinante de multi-resistência
a drogas (amp+ ampicilina; kan+ kanamicina; tet+ tetraciclina; sm+
streptomicina; su+ sulfonamida; Hg+ mercúrio)
O caráter auto-replicante de um plasmídeo é
determinado pelo Replicon: “unidade genética com
ORI e elementos de controle associados capazes de
replicação autônoma do plasmídeo”
• Plasmídeos low-copy: baixo número de cópias por célula, por
volta de 20 cópias, sob controle rígido (estringente);
• Plasmídeos high-copy: alto número de cópias por célula, por
volta de centenas-milhares de cópias, sob controle relaxado;
Exemplo: colE1 e pMB1 (replicons serviram de base na
construção dos plasmídeos atuais)
O caráter auto-replicante de um plasmídeo é
determinado pelo Replicon: “unidade genética com
ORI e elementos de controle associados capazes de
replicação autônoma do plasmídeo”
• Plasmídeos low-copy: baixo número de cópias por célula, por
volta de 20 cópias, sob controle rígido do replicon (estringente);
• Plasmídeos high-copy: alto número de cópias por célula, por
volta de centenas-milhares de cópias, sob controle relaxado do
replicon;
Exemplo: colE1 e pMB1
Histórico 1973-1978: Série pBR
Histórico 1979-1984: Série pUC
 Clonagem (Tecnologia do DNA recombinante) 1a
ETAPA: Corriqueiro uso de enzimas de restrição
para
linearizar o plasmídeo
A especificidade das enzimas de restrição​. A ponta 5 ́ de cada fita de DNA e o sítio de
clivagem (setas vermelhas) são indicados. O ponto indica o sítio de simetria rotacional
de cada sítio de reconhecimento. As posições de corte podem diferir para cada tipo de
enzima, produzindo extremidades simples fita (sticky ends) nas pontas 5 ́ ou 3 ́ de cada
molécula dsDNA ou produzirndo extremidades cegas (blunt ends). (a) Três sítios de
reconhecimento formados por hexanucleotídeos e enzimas de restrição que os cortam.
Note que um sítio produz uma ssDNA 5 ́, outro produz ssDNA 3 ́, e outro produz
extremidades cegas. (b) Exemplos de enzimas que cortam sítios de reconhecimento
com tetranucleotídeos.

Clonagem (Tecnologia do DNA recombinante) ​2a

ETAPA: Obter o inserto para hibridizar com vetor
previamente linearizado com enzimas de restrição;
promover ligação (vetor + inserto)
Formação de molécula recombinante​. A enzima de restrição EcoRI corta uma molécula
circular dsDNA resultado em molécula linear dsDNA com pontas coesivas. Por causa
da complementaridade de bases, outras moléculas com pontsa coesivas
complementares podem hibridizar com a molécula de DNA linearizada, formando a
molécula recombinante.

Direct Injection into

Nucleus
Eukaryotic ​Virus
Infection

Biolistic ​Method
 D​N​A ​coated m
​ icrop​ro​jectiles
Nucleus

Un

Electroporation
y
Liposome
Fusion
un

D​NA​-​Calcium ​phosphate
Coprecipitate
Clonagem (Tecnologia do DNA recombinante)
a) Digestão vetor e inserto:
1. Digerir o plasmídeo com endonucleases de restrição para
produção de pontas cegas (blunt ends) ou pontas coesivas
complemen tares ao inserto. 2. Digestão do DNA, eletroforese em
gel de
agarose, e purificação dos fragmentos do gel; 3. Eletroforese em
gel de agarose, e purificação
dos fragmentos do gel
b) Incubação vetor + inserto.
c) Proceder com a ligação das moléculas com
adição de DNA ligase.
d) Introdução da molécula recombinante
vetor-inserto em hospedeiro:
1.​Transformação/Eletroporação ​(bactérias e
leveduras) 2.​Transfecção ​(eucariotos em geral)
Produção de DNA plasmidial recombinante contendo fragmentos derivados de DNA
doador.
Questões!
1. Qual reação de ligação é a prevalente? (a)
Recombinante vetor-inserto,
(b) Ou recircularização do vetor?
2. Pode-se usar 2 (duas) enzimas diferentes para
linearizar o vetor? Qual
a vantagem?
3. É possível usar um produto de PCR como inserto de
interesse na
Clonagem (Tecnologia do DNA
clonagem?​
recombinante)
EcoRI 5 ́ GAATTC 3 ́
BamHI 5 ́ GGATCC 3 ́

Clonagem (Tecnologia do DNA

recombinante) C​ omo obter amplicon com sítio desejado
para enzima de restrição nas extremidades?
Adição de novas seqüências na ponta 5 ́ de produtos de PCR. (a) Um par de primers
de PCR é desenhado de modo que somente a região 3 ́ hibridize com a sequência alvo,
enquanto as pontas 5 ́ contém sítios para enzimas de restrição. (b) No fim do primeiro
ciclo, as pontas 5 ́ são ssDNA e não hibridizam com a seqüência alvo. (c) No próximo
ciclo, (somente as fitas recém-sintetizadas são mostradas), os primers novamente
hibridizam e desta vez produzem dsDNA, como em uma PCR convencional. (d) Os
amplicons do segundo ciclo e de todos os ciclos subsequentes apresentam sítios de
restrição em ambas as extremidades. (e) Digestão com EcoRI e XhoI produz pontas
coesivas no amplicon
Bsu151 ​23
Hi​n​dili ​29 ​EcoRI​, Xapl 4359,
Eco321 185 ​Aatll 42​84
Bambl 375
N​hel 229/ ​Sspl 4168
​ grAl 409 ​P​ael 562
/Tstl 389 ​/S

Xagl 622 ​S​al​l 65​1 ​Boxl 712

Scal 3844
VW

Pvul 373​3
14153
....

Ps​t​i 3607 Vspl 3537

bl​a ​(Ap)
wwwwwwwwwww
www

tet ​(Tef)
wwwww
NNNN

Eco311 3433
E
E​co521 939 ​sp681 972
Bv​el 106​3
Eam11051 3361
*******

3​293 _​3​133
PBR322 ​4361 bp
1276
www.
Cail 288​4
​ MB1)
rep (P
wwwwwwwwww

2
2519

51
1915
.

1915
2106
.

Mva12691 1353 KEco1301 1369

Eco​881 1425
Mlsl 144​4 ​Bpu101 1580 ​Bsgl 1650
Kpn21 1​66​4
BseJI 16​6​8
www

V
2106
..
.
.

Afill, Pscl 2473/

гор , ​Sapl 2350
​ fol 2117 ​Bst11071 2​24​4​) ​Esp3|
Pvull 2064 ​Ndel 2295​/ 1 P
2122
BsaAl 2225/ Psyl 2217
P​ol ​46
Eco01091 ​25​74
Aatil ​2617 ​Sspl ​2501
B​S​TAPI ​17​9 ​/​.​Ndel ​183
Ehel ​235
Pdml ​2294 Bogl 2215 ​Scal ​21​77
12486
14823
MCS
bla ​(Ap)
PUC18/19
2686 bp
BsaXI 659 -Sap 333
L​E

Y
AFIMI, Pscl 806
wwwww

Gsul 1784 ​Cfr10l 1779/ ​Eco311 1766/

Eam11051 1694/
rep ​(PMB1)
Bseyi 1110
\Cail 1217
 Possibilidades para seleção de clones positivos
(Sistema com Cassetes Duplos de Resistência a
Antibióticos)
Inserção em pBR322 é detectada pela inativação de um dos dois genes de resistência
a drogas (tet​+ ​ou amp​+​). No exemplo, a entrada do inserto é indicada pelo fenótipo de
sensibilidade a tetraciclina (tet)

Possibilidades para seleção de clones positivos

(Sistema com α-complementação)
Inserção em puc18 é detectada pela inativação da atividade de β-galactosidase de
lacZ, resultando na incapacidade de converter o substrato artificial X-Gal em corante
azul de índigo

REVISÃO: Operon LAC BACTERIANO

REVISÃO: Operon LAC BACTERIANO. A seleção
de clones positivos baseada na atividade da
β​-galactosidase ​(Sistema α-complementação)
α-complementação ​(fragmento N-terminal alpha “α” da
β-galactosidase expresso pelo plasmídeo associa-se com fragmento
C-terminal omega “ω” da β-galactosidase expresso pelo DNA bacteriano.
REVISÃO: Operon LAC BACTERIANO. A seleção
de clones positivos baseada na atividade da
β​-galactosidase ​(Sistema α-complementação)
α-complementação ​(fragmento N-terminal alpha “α” da
β-galactosidase expresso pelo plasmídeo associa-se com fragmento
C-terminal omega “ω” da β-galactosidase expresso pelo DNA bacteriano.

As propriedades funcionais das DNA

 polimerases utilizadas no PCR
INTERFEREM com a ​processividade
e a ​fidelidade ​dos fragmentos de
interesse.
Qual DNA polimerase eu devo utilizar?
(a) Non-proofreading com alta processividade
versus (b) Proofreading com alta fidelidade
Quais são as propriedades do amplicon produzido
pela DNA polimerase?
Ex: DNA polimerase III E. coli
Quais são as propriedades do amplicon produzido
pela DNA polimerase?
Tabela – Comparação das propriedades dos amplicons
produzidos por algumas DNA polimerases termoestáveis
comerciais
A escolha pela DNA polimerase non-proof
reading ou
proofreading depende do propósito do
experimento! ​Taxa de Fidelidade das Polimerases Phusion
High-Fidelity DNA polimerase (tampão HF) fidelidade 4.4 x 10​-7
Phusion High-Fidelity DNA polimerase (tampão GC) fidelidade 9.5
x 10​-7 ​Pyrococcus furiosus DNA polimerase fidelidade 2.8 x 10​-6
Taq DNA polimerase fidelidade 2.28 x 10​-5
http://www.finnzymes.fi/pcr/fidelity_calc.php ​A
probabilidade da ocorrência de erros tem relação
exponencial com o número de ciclos
Polimerase amplicon 1kb amplicon 3kb
Valores (%) correspondem a percentagem de moléculas
produzidas com ao menos um nucleotídeo errôneo após
30 ciclos
Clonagem direta dos amplicons sem
digestão prévia com enzimas de
restrição é possível, mas dependerá da
DNA polimerase utilizada durante a
PCR
Possibilidades para otimizar a clonagem (Sistema
TA-cloning; exemplo pGEM-T Promega)
Possibilidades para otimizar a clonagem (Sistema
TA-cloning; exemplo pGEM-T Promega)
Purificar fragmento de PCR produzido por uma DNA polimerase de alta
fidelidade
Preparar reação PCR com Taq DNA polimerase convencional: tampão,
MgCl2, enzima, + ​dATP 0,2mM​)
Incubar a 72​°​c por 15-30 minutos
Usar o amplicon com 3​ ́ -A overhangs em reação com vetor do sistema
 TA-cloning
QIAGEN ​pDrive Cloning Vector The pDrive Cloning Vector has a number of useful
features designed to facilitate analysis of cloned PCR products. These include a large
number of unique restriction enzyme recognition sites, universal sequencing primer
sites, and promoters for in vitro transcription. In addition, the vector allows both
ampicillin and kanamycin selection as well as blue/white screening of recombinant
colonies.

Possibilidades para otimizar a clonagem (Sistema

TU-cloning; exemplo pDRIVE Qiagen)
Possibilidades para otimizar a clonagem (Sistema
Blunt-cloning; exemplo pJET 1.2 Fermentas)
O produto (proteína) do gene eco47IR é tóxico para a bactéria receptora
do plasmídeo. Sobrevivência exclusiva para as bactérias com inserto
clonado na ORF de eco47IR
Possibilidades para otimizar a clonagem (Uso da
Topoisomerase TIPO I substituindo a DNA ligase –
TOPO CLONING®)
Possibilidades para otimizar a clonagem (Uso da
Topoisomerase TIPO I substituindo a DNA ligase –
TOPO CLONING®)
Sistema TOPO TA cloning substitui a DNA ligase com topoisomerase. ​(a) Um produto
de PCR é preparado com Taq DNA polimerse, a qual introduz uma adenina nas pontas
3 ́ do amplicon (3 ́ overhang). O vetor é tratado com topoisomerase I do vírus Vaccinia,
a qual se liga especificamente ao DNA e cliva a ligação fosfodiéster após sequência 5 ́
CCCTT. A topoisomerase permanece covalentemente ligada ao DNA através do
resíduo de fosfato 3 ́ . O vetor, o qual tem resíduos 3 ́ T nas extremidades, é misturado
com o produto de PCR. (b) O grupamento 5 ́ -OH do produto de PCR ataca a ponte
entre o grupo fosfato e a topoisomerase. (c) Após catalisar a reação, topoisomerase é
dissociada do vetor, levando a formação de recombinante vetor-inserto. O requerimento
de terminais 5 ́ -OH torna a reação altamente seletiva para produtos de PCR, uma vez
que, os primers são sintetizados sem um 5 ́ -P. Outros fragmentos de DNA na reação
(as outras moléculas de vetor) não podem se ligar ao menos que eles também tenham
um 5 ́ -OH.

Possibilidades para otimizar a clonagem (Uso da

Topoisomerase TIPO I substituindo a DNA ligase –
TOPO CLONING®)
Quais cuidados devem ser tomados na escolha da
célula hospedeira? Qual bactéria é mais adequada
para receber o vetor?
•Resistência a antibiótico para evitar contaminações no estoque
Ex: Tn10(Tc)
•Ausência de eventos de recombinação Ex: rec A1
• Ausência de endonu- cleases para otimizar a ex- tração de
DNA; Ex: end A1
• Ausência do sistema en- dógeno de restrição contra DNA
exógeno Ex: hsdR17
Leveduras​:

​ ces c​erevisia​e ​e ​S​chizos

Sa​c​charomy ​ ​a​c​charomy​ce​s
pombe

Por ​que ​leveduras​?

Eucariotos ​unicelulares ​Haplóides ​Crescimento
rápido ​Fácil ​m​anu​tençã​o ​Apresenta plasmideo
natural (​2​) ​- clonagem e expressão Realiza
pro​c​essamento do RNA hn Realiza modificações
pós-traducionais
YIPs (​Yeast integrative plasmids​)

• ​Plasmideo bacteriano com gene de levedura (ori,

genes seleção, sitios clonagem)
• ​Se​m or​i de levedura
• Integração no DNA genômico ​. M​ais usado em
experimentos de mutagenese, recombinação etc.
Selectable yeast marker

Selectable ​bacterial ​marker

-
Bacterial replication origin

YE​Ps (Ye​a​st epissoma​l ​plasmids​)

Cloned region of interest

​ dos do plasmideo natural (2​4​) ​- 6.000 pb ​Ori levedura e ori

Deri​va
bactéria - Shuttle vector ​Genes de seleção(metabolismo de
aminoácidos ou resistência) Há variações altamente
manipuladas contendo regiões de replicação
cromossomicas (multiple coply) e CEN (single copy)

2-um plasmid DNA

LEVEDURAS: Após “transformação” de leveduras,

como devo proceder com as condições de seleção
durante o plaqueamento de leveduras
 transformadas?
Seleção em leveduras é mediada por prototrofia:
Sobrevivência depende da expresão de genes
plasmidiais que resgatam o metabolismo em cepas
mutadas ​Exemplos:

​ ast artificia​l c​hromosomes)

Y​A​Cs ​(​Ye

Ori ​de levedura ​e ​bactéria ​(​shuttle) ​Genes de ​seleção ​Sitios

de clonagem ​CEN ​T​E​L

​ rigin
Yeast ​replication o
Y​east ​centromere Cloned region ​of ​interest
Selectable ​yeast ​marker
Telomere
Telomere