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RESUMEN
EI sindrorne de la hoja amarilla es una enfermedad de la calla de azucar que fue detectada en Colombia por
primera vez en 1998. Cenicana esta tratando de lograr un control eficiente de la enfermedad utilizando diferen-
tes herramientas pertenecientes a diversas areas como entomologia, patologia, biologia molecular y biotecnologia.
Dentro de estas dos ultimas areas, esta contemplado el producir plantas transgenicas resistentes a la enferme-
dad. Con este fin se han bombardeado callos de la variedad CC 84-75 con parte del gen que codifica para la
capside del virus causante de la enfermedad, el cual confiere resistencia contra el virus como se ha demostrado
previamente. Un numero total de 69 plantas han sido obtenidas despues de bombard eo y seleccion con 50 mgIL de
geneticina. Hasta ahora 12 plantas de un total de 19 plantas evaluadas han resultado positivas mediante la
tecnica de "Southern" despues de hibridizacion, mostrando un fragmento de 0,45 Kb despues de digestion del
ADN total con Pst I. Las plantas que den positivas usando "Southern" seran posteriormente evaluadas mediante
"Northern", y su resistencia contra el virus sera evaluada en invernadero de bioseguridad.
ABSTRACT
Yellow leaf syndrome in sugarcane was detected in 1998 for the first time in Colombia. In order to control this
syndrome Cenicana is using several approaches including different disciplines as Entomology, Pathology,
Molecular Biology and Biotechnology. One of this approach is the production of transgenic plants resistant to
the virus causal agent of the syndrome. For this purpose embriogenic calli of variety CC 84-75 have been
bombarded. This variety is susceptible to the syndrome and is largely grown in Colombia. The genomic
construction used in the bombardments includes a sequence coding for the coat protein of the virus. Sixty nine
plants have been regenerated after selection with geneticin (50 mg/L). So far, 12 plants were positive using
Southern Blot showing a 0.45 Kb fragment in the Pst I digests. Positive plants by Southern will be tested by
Northern and resistance to the virus will be evaluated in biosafety greenhouse.
INTRODUCCION
EI sfndrome de la hoja amarilla es una enferme- Africa (Ricaud, 1968). En los ultimos cinco arios
dad de la caria de azucar registrada por primera se ha observado en las zonas cafieras de Brasil,
vez en 1994 en Hawai (Schenk et el., 1994). Sin Argentina, EI Salvador, Guatemala, Mauricio,
embargo, desde 1968 existen registros de Surafrica, Malawi, Marruecos, Reunion, Estados
sintomatologfa similar en cultivos del oriente de Unidos, Peru, Australia y Zimbabwe. En Brasil,
* Centro de Investigaci6n de la Caria de Azucar de Colombia Cenicafia. A.A. 9138, Cali, Valle. e-mail: fangel@cenicana.org
** Centro Internacionalde Agricultura Tropical, CIAT. A.A. 6713, Cali, Valle.
*** Texas A&M University, Weslaco, TX 78596.
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TRANSFORMA(ION DE PLANTAS DE (ANA DE AZU(AR SUS(EPTIBLES AL SINDROME DE LA HOJA AMARILLA
esta enfermedad ha sido detectada principalmente en cion y utitizacion de este material puede contribuir enor-
la variedad SP 71-6163; presenta sintomas severos e memente al control de la enfermedad, generando por
indica alta sensibilidad hacia el virus, 10 que ha repre- medio de la ingenieria qenetica, plantas resistentes a
sentado perdidas en la productividad hasta de un 80%. esta enfermedad tan importante en Colombia.
EI sindrome de la hoja amarilla fue registrado en EI virus del sindrome de la hoja amarilla es un
Colombia por primera vez en mayo de 1998 en la varie- virus ARN y ha sido aislado, purificado, caracterizado,
dad SP 71-6163, encontrandose en anal isis posterio- clonado y en parte secuenciado (Moonan et al., 2000).
res en la mayoria de lotes comerciales sembrados con EI virus fue clonado en varios fragmentos de ADN com-
diferentes variedades (Victoria et el., 1998). La inciden- plementario, y su mapa qenomico construido con base
cia de la enfermedad en el ario 2000 fue de 4,3%, pre- en los clones de ADN producidos. Varios clones que
sentando mayor incidencia en algunas variedades, es- codifican para parte de la proteina de la capside viral
pecialmente la variedad CC 84-75, la cual ocupa han sido evaluados para conferir resistencia a la en-
actual mente el segundo lugar en area sembrada en fermedad mediante transtorrnacion qenetica. Uno de
Colombia, 10 que indica el alto riesgo para la industria los clones fue escogido como el mas eficiente para
azucarera colombiana y el peligro inminente en caso conferir resistencia a la enfermedad, y ha sido incluido
de no realizar un control adecuado de ella. Esta enfer- en una construccion genetica que contiene el promo-
medad se ha encontrada asociada con disminuciones tor del gen de ubiquitina de maiz, su correspondiente
en la concentracion de sacarosa y en la produccion de intron, el gen 0 cion de ADN complementario y la se-
caria, incluso en cultivos sin sfntomas externos visibles. fial correspondiente de terrninacion. Con el objetivo
En Colombia, como se rnenciono anteriormente, la va- de obtener plantas de la variedad CC 84-75 resisten-
riedad mas afectada por la enfermedad es la CC 84-75, tes al sindrome de la hoja amarilla, se han bornbar-
la cual rnostro una disrninucion de 1,2 toneladas de caria deado callos ernbrioqerucos con esta construcci6n
por hectarea y 0,21 toneladas de azucar por hectares qenetica acompafiada del gen de resistencia a
menos por cad a 1% de inteccion, kanamicina utilizado como gen de selecci6n.
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Los callos bombardeados que Tabla 1. Bombardeos realizados con el plasmido pActina 1-D en
sobrevivieron fueron pasados a me- diferentes experimentos.
dia de regeneraci6n, en el cual se eli-
Experimento No. de callos No. de callos No. de callos %decallos
minaron las hormonas de crecimien- GUS- GUS+
disparados GUS+
to, se disminuy6 la concentraci6n de
1 161 103 58 640
agua de coco a 5% y de sacarosa a 848
2 184 156 28
2%, agar 0,4% y se adicion6 carb6n 3 215 122 93 56,7
activado al 0,2% como agente 4 150 23 127 15,3
antioxidante. Se hizo una exposici6n 5 112 31 81 27,7
gradual de los callos a la luz, empe-
zando can 15 dfas en oscuridad, lue-
go 15 dfas en penumbra y finalmente fueron expuestos
a luz directa. Posteriormente, una vez las plantulitas
midieron 5 mm se pasaron a media de propagaci6n de
meristemos y elongaci6n denominado MS I (sales MS
completo, de sacarosa 2%, 100 mg/L de inositol, 0,01
mg/L de ISA, 0,1 mglL de GA3, 150 mg/L de acido citri-
co y 5% de agua de coco) bajo luz directa hasta que
lograron un tarnario aproximado de 2 cm.
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TRANSFORMACION DE PLANTAS DE (ANA DE AZIJcAR SUS(EPTIBLES AL SINDROME DE LA HOJA AMARILLA
Tabla 2. Bombardeos realizados can los plasrnidos pFM395, pFM 396 Y el gen de resistencia al
antibi6tico en diferentes experimentos.
Experimento No. de callos No. de callos No. de callos No. de callos No. de plantas
bombardeados en 30 mglL en 50 mg/L vivos regeneradas
1 136 1 0 0 0
2 147 40 26 9 12
3 166 30 5 1 4
4 258 137 112 11 20
5 280 65 40 2 9
6 184 120 33 8 8
7 182 122 49 0 0
8 198 158 51 12 6
9 177 160 41 9 7
10 397 237 71 2 2
11 112 6 4 0 0
12 141 40 13 3 1
13 111 25 0 0 0
--. -"-
Pst! 2003
~ NOS·term
~-",
Figura 2. Estructura del plasrnido pFM395 con parte del gen que
LSal1 2460 Beml-'ll 2196
codifica para la capside viral de 487 pb (en negro), y los sitios de
Pst1 2,490
corte para las diferentes enzimas de restriccion,
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TRANSFORMA(ION DE PLANTAS DE (ANA DE AZU(AR SUS(EPTIBLESAL SINDROME DE LA HOJA AMARILLA
sonda el plasrnido pFM395, el cual fue previamente cotransformation of sugarcane usin visible or
cobombardeado con el gen de selecci6n 0 de resis- selectable markers. Molecular Breeding. 2:
tencia al antibi6tico. Por esta razon es posible que 239-249.
las siete plantas que no dieron hibridizacion positiva
tengan el gen de seleccion perc no tengan el plasmido Butterfield, M. K., Irvine, J. E., Valdez Garza, M.,
pFM395. Este problema se solucionaria si se tuviera Mirkov, E. 2002. Inheritance and segregation of
en la misma construccion todos los genes que se quie- virus and herbicide resistance transgenes in
ren introducir en la planta transqenica. sugarcane. Theor. Appl. Genet. 104: 797-803.
A pesar de que las monocotiledoneas no se con- Chan, M. T., Chan, H. H., Ho, S. L., Tong, W. F., Yu,
sideran huespedes naturales de Agrobacterium S. M. 1993. Agrobacterium-mediated production
tumefaciens (De Cleene y Deley, 1976) algunos grupos of transgenic rice plants expressing a chimeric
de investiqacion recientemente han intentado transfor- alfa amylase promoter beta glucuronidase gene.
mar algunas de elias usando este vector, especial men- Plant Mol. Bioi. 22: 491-506.
te arroz (Chan et al., 1993; Hiei et al., 1994), trigo
(Mooney et al., 1991), rnaiz (Ishida et el., 1996) y caria Chowdhury, M. K. U., Vasil, I. K. 1992. Stably
de azucar (Arencibia et el., 1998; Enriquez-Obregon et transformed herbicide resistant callus of
el., 1998; Matsuoka et al., 2001). La transtormacion sugarcane via microprojectile bombardment of
con A. tumefaciens tiene ventajas sobre el bombardeo cell suspension cultures and electroporation of
de particulas como la posibilidad de introducir fragmen- protoplasts. Plant Cell Reports. 11: 494-498.
tos de mayor tarnario y tener menos rearreglos del
transqen. Esta podria ser una nueva alternativa para la De Cleene, M., Deley, J. 1976. The host range of
produccion de plantas resistentes al sind rome de la hoja crown gall. Bot. Rev. 42: 389-466.
amarilla en un futuro cercano. Sin embargo, el trabajo
que resta por ahora de la presente investiqacion es eva- Elliot, A. R., Campbell, J. A. Dugdale, B., Brettell, R.
luar las plantas producidas mediante hibridizacion del I. S. Grof, C. P. L. 1999. Green fluorescent protein
ADN (Southern), del ARN (Northern) y medir la respues- facilitates rapid in vivo detection of genetically
ta a la mfeccion por el virus en las plantas que resulta- transformed plant cells. Plant Cell Reports. 18:
ron positivas por metod os moleculares. 707-714.
Arencibia A., Carmona, E. R., Tellez, P., Chan, M., Falco, M. C., Neto, A. T., Ulian, E. C. 2000.
Yu, S., Trujillo, L. E., Oramas, P. 1998. An Transformation and expression of a gene for
efficient protocol for sugarcane (Saccharum spp. herbicide resistance in a Brazilian sugarcane.
L.). Transformation mediated by Agrobacterium Plant Cell Reports. 19: 1188-1194.
tumefaciens. Transgenic Research. 7: 213-222.
Franks, T., Birch, R. G. 1991. Gene transfer into intact
Bower, R., Elliot, A. R., Potier, B. A. M., Birch, R.G. sugarcane cells using microprojectile bombar-
1996. High efficiency microprojectile mediated dment. Aust. J. Plant Physiol. 18: 471-480.
59
REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGIA VOL. IV NO.1
Gallo-Meagher, M., Irvine, J. E. 1993. Effects of tissue suspension culture with a novel method. Proc.
type and promotor strength on transient GUS Int. Soc. Sugar Cane Technol. 24: 660-662.
expression in sugarcane following particle
bombardment. Plant Cell Reports. 12: 666-670. McQualter, R. B., Harding, R. M., Dale, J. L., Smith,
G. 2001. Virus derived transgenes confer
Gallo-Meagher, M., Irvine, J. E. 1996. Herbicide resistance to Fiji disease in transgenic sugarcane
resistant transgenic sugarcane plants containing plants. Proc. Int. Soc. Sugar Cane Technol. 24:
the bar gene. Crop Sci. 36: 1367-1374. 584-585.
Gonzales-Cabrera, J., Coego-Gonzales, A, Martfnez- Moonan, F., Molina, J., Mirkov, E. 2000. Sugarcane
Gil, A F., De la Riva, G. A., Vazquez-Padron R. Yellow Leaf Virus: An emerging virus that has
I. 1998. Optimization of transgene expression evolved by recombination between Luteoviral and
in sugar cane cells. Biotechnology Techniques. Poleroviral ancestors. Virology. 269: 156-171.
12: 793-796.
Mooney, R., Goodwin, P., Dennis, E., Llewellyn, D.
Harrison, D. K., Bower, R., Berdinq, N., Carrol, B. J. 1991. Agrobacterium tumefaciens gene transfer
Birch, R. G. 2001. Inheritance and expression into wheat tissues. Plant Cell Tissue Orga. Cult.
of transgenes in sugarcane. Proc. Int. Soc. Sugar 25: 209-218.
Cane Technol. 24: 663-664.
Nutt, K. A, Allsopp, P. G., Mcghie, T K., Sheperd,
Hiei, Y, Ohta, S., Komari, T, Kumashiro, T 1994. K. M., Joyce, P. A., Taylor, G. 0., McQualter, R.
Efficient transformation of rice (Oryza sativa) B., Smith, G. 1999. Transgenic sugarcane with
mediated by Agrobacterium and sequence increased resistance to cane grubs. Proc. Aust.
analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Soc. Sugar Cane Technol. 21: 171-176.
Journal. 6: 271-282.
Ricaud, C. 1968. Yellow wilt of sugarcane in
Ingelbrecht, I. L., Irvine, J. E., Mirkov, T E. 1999. Eastern Africa. Sugarcane Pathologist
Posttranscriptionally gene silencing in transgenic Newsletter. 1: 45-49.
sugarcane. Dissection of homology-dependent
virus resistance in a monocot that has a Schenck, S., Hu, J. S., Lockhart, B. E. 1994. Use of
complex polyploid genome. Plant Phisiology. a tissue blot immunoassay to determine the
119: 1187-1197. distribution of sugarcane virus in Hawai.
Sugarcane. 4: 5-8.
Ishida, Y, Saito, H., Ohta, S., Hiei, Y, Komari, T,
Kumashiro, T 1996. High efficiency transformation Victoria, J. L., Garces, F.,Guzman, M. L., Angel, F. 1998.
of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium Sfndrome de la hoja amarilla en Colombia. Carta
tumefaciens. Nature Biotechnology. 14: 745-750. Trimestral (Ceniceiie) Ano 20, No. 2-3:3-7.
Joyce, P. A, McQualter, R. B., Handley, J. A, Dale, Waterhouse, P. M., Graham, M. w., Wang, M. 1998.
J. L., Harding, R. M., Smith, G. R. 2001. Virus resistance and gene silencing in plants can
Transgenic sugarcane resistant to sugarcane be induced by simultaneous expression of sense
mosaic virus. Proc. Aust. Soc. Sugar Cane and antisense RNA Proc. Nat!. Acad. Sci. U.S.A.
Technol. 20: 204-210. 95: 13959-13964.
60