Protocolo de Salting out para la extracción de ADN en sangre

periférica y electroforesis en gel.

Resumen

El análisis de la molécula de ADN se ha constituido como una herramienta muy

importante debido a que ha permitido desarrollar métodos aplicados a la investigación,
como por ejemplo el estudio del genoma humano que ha ayudado en el campo de la
criminalística, al diagnóstico de enfermedades genéticas, entre otros. Se han implementados
muchas técnicas para su estudio, debido a que este se tiene que extraer y purificar para
poder obtener buenos resultados. Esta práctica se realizó con el fin de extraer ADN de la
sangre periférica por medio de un protocolo de Salting out, para posteriormente analizar su
rendimiento y pureza mediante la evaluación por electroforesis y espectofotometría. Se
utilizaron 12 muestras, las cuales fueron divididas en dos grupos; un primer grupo en el
cual las muestras poseían proteínasa K y otro grupo que no poseía. Dando como resultado
que la proteínasa K no influyó en la corrida de la electroforesis. Y que el ADN obtenido no
fue de buena calidad ya que se observaron bandas corridas y contaminadas.

Palabras claves: Salting Out, Extracción, ADN, Electroforesis, Leucocitos.

Introducción

Los datos moleculares han permitido estudiar con mayor precisión patrones de diversidad
genética, interacciones biológicas, la composición, funcionamiento y dinámica de
comunidades, las relaciones filogenéticas, entre otros (Sunnucks 2000; Schlötterer 2004;
Hudson 2008). La aplicación de técnicas moleculares inicia con la extracción de ADN y la
obtención exitosa de datos confiables depende en gran medida, del adecuado aislamiento de
la molécula que debe ser íntegro y puro. Para aislar el ADN de interés existen una serie de
protocolos que facilitan el proceso. El proceso general de extracción involucra algunos
pasos como son; primero, la lisis de las membranas celulares, mediante el uso de Buffer
específico, que están constituidos por sales caotrópicas, las cuales son las que ayudan a
romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas o los ácidos
nucleicos consiguiendo su desnaturalización. Y la adición de un detergente como el SDS es
necesaria a menudo para eliminar las membranas, además de las altas temperaturas.
Segundo, la degradación de las proteínas por incubación con proteínasa K y /o sales
saturadas, la fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el
acetato de amonio o el acetato sódico. Y tercero la purificación del material se lleva a cabo
en tres fases:
Precipitación del ADN; el ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar
etanol frío o isopropanol y recuperar mediante una centrifugación.
Lavado del pellet; se realiza con alcohol frío volviendo a centrifugarse.
Recuperación; el sedimento se puede resuspender en agua o tampón Tris, tras ser secado
completamente.
Para evaluar los resultados se realiza una prueba de espectofotometría, con la que podemos
conocer la pureza de la muestra. El análisis de la absorción UV de los nucleótidos
constituye un método confiable para la determinación de la concentración de los ácidos
nucleicos en una muestra. Las purinas y pirimidinas de los ácidos nucleicos muestran una
absorción máxima a 260nm, mientras que la lectura a 280nm proporciona la cantidad de
proteínas en la muestra.
Y también se realiza la electroforesis en gel de agarosa, en este método la cuantificación del
ADN se realiza mediante la visualización de la intensidad de las bandas obtenidas luego de
la corrida electroforética y se basa en la tinción fluorescente del ADN con bromuro de
etidio, que es un marcador molecular que se intercala entre las bases.
La cantidad de ADN puede establecerse por la comparación del campo de fluorescencia de
la muestra, con una serie de estándares de concentraciones conocidas. Además de la
cuantificación, este método también permite analizar la calidad de ADN ya que muestras
degradadas forman barridos o no, permitiendo la definición de una banda única de ácidos
nucleicos. En general, el fundamento de la electroforesis es separar moléculas según su
peso o tamaño molecular. Este, hace que las moléculas migren a lo largo de un campo
debido a la influencia de un campo eléctrico. Las muestras se depositan en un campo
poroso (papel o gel semisólido) que se coloca a su vez en una solución conductora de
energía como lo es el TAE. El TAE es una dilución tampón compuesta de Tris, encargado
del tamponamiento; Acetato, contribuye a mantener el pH deseado; y EDTA (Ácido
etilendiaminotetracetico), es un quelante de cationes divalentes cuya función es secuestrar
el Mg2+, con lo que se evita que las posibles nucleasas presentes degraden los ácidos
nucleicos de la muestra. Esta práctica se realizó con el objetivo de adquirir habilidades para
la extracción de esta biomolécula tan importante como lo es el ADN por medio de
protocolos como lo es Salting out, además de establecer relaciones entre cada uno de los
componentes (reactivos) que se utilizan en el proceso.

Metodología
Esta práctica fue realizada en dos partes. La primera correspondió a la extracción de ADN
por el método de Salting out y la segunda parte correspondió a una electroforesis en gel de
agarosa.

Parte 1: Extracción de ADN

* Se tomaron muestras de sangre de dos estudiantes. Por pareja de laboratorio se

escogieron dos tubos eppendorf y se agregaron 300µl de la muestra sanguínea, se
mezclaron con 900µl de solución de lisis de glóbulos rojos y se realizaron movimientos
leves, se dejó 10minutos en reposo a temperatura ambiente. Una vez cumplido el tiempo se
centrifugaron las muestras a 16.000rpm durante 20s. Luego se descartó el sobrenadante y
se conservó el pellet en cada tubo.

* Posteriormente se vertió en un tubo eppendorf 600 µl de tampón de lisis de glóbulos

blancos. En el cual se agregó el pellet de glóbulos blancos de los dos tubos y se combinaron
formando un único tubo con la muestra. Se disoció el pellet con la ayuda de una punta de
micropipeta y se procedió a mezclar en el vórtex unos segundos para tener una solución
homogénea.

* Se realizó una división de las muestras, a la mitad de ellas (6 muestras) se le agregó

proteínasa K, y se le agregaron 200 µl acetato de sodio. Se mezcló en el vórtex y fueron
colocadas a temperatura de 64°C y se dejaron incubadas.

* Las muestras las cuales no se les agregó proteínasa K fueron colocados por 5 minutos a
una temperatura de -30°C. Y luego se les agregaron 200 µl acetato de sodio y se procedió
a mezclar en el vórtex, para la precipitación de proteínas. Luego estas muestras se llevaron
a centrifugar por 3min a 16.000rpm. El sobrenadante obtenido se transfirió a otro pellet que
contenía isopropanol, se mezcló bien y se centrifugó por un minuto. Después se removió el
sobrenadante y se agregó 600 µl de etanol al 70% al pellet, se centrifugo nuevamente por
un minuto, se removió el sobrenadante y se colocó el pellet en la cabina de flujo laminar
por 15 min. Finalmente se redisolvió el pellet de ADN en 100 µl de TE.

Parte 2: Electroforesis

Se preparó el gel de agarosa y se vertió en la base de corrida. Se colocó el peine en la

ranura correspondiente, y se dejó enfriar el gel por 20min aproximadamente. Luego el
peine fue retirado y se agregó a la cámara de electroforesis el buffer. Después se procedió a
agregar en cada pocillo 5 µl de la muestra, 1 µl del marcador de peso molecular y 0,6 µl
del buffer de carga. Luego se tapó la cámara, teniendo en cuenta que los polos
correspondan a su respectiva ubicación. Se encendió la fuente de energía a 100V y se dejó
correr la electroforesis aproximadamente durante dos horas y media. Una vez terminado el
tiempo, la cámara fue trasladada al transluminador UV para observar la corrida.

Resultados y Discusiones

En la electroforesis se pudo apreciar la presencia de ADN, pero no en buen estado, se

observan muestras degradadas y también hay muestras en las cuales las bandas se
desviaron del carril correspondiente, como es el caso de la banda que corresponde al pocillo
11. Las mejores muestras que se observaron fueron las que pertenecieron a los pocillos 4, 8
16 y 20 (ver figura 1). Además de observar la presencia de manchas en las bandas que son
indicadores de contaminación.

El bromuro de etidio es una sustancia que se une a las bases nucleotídicas del ADN. Este
reactivo posee una longitud de onda de 300nm, lo cual permitió la observación de la
macromolécula.

Figura 1. Corrida electroforética de 12 muestras de ADN, con un marcador de peso

molecular de 1kb.

Tabla1. Muestras de ADN y su ubicación en cada pocillo del gel.

Muestras de Pocillos Muestras de Pocillos

ADN con ADN sin
proteínasa K proteínasa K
1 3 4 6
 2 4
3 5
1 9
2 10
3 11
1 15
2 16
3 17
5 7
6 8
4 12
5 13
6 14
4 18
5 19
6 20

Las muestras se dividieron en dos; las que contenían proteínasa K y las que no contenían
(ver tabla1). La proteínasa K es una proteasa muy activa del tipo de la subtilisina que se
obtiene a partir de Tritirachium álbum; esta proteasa libera el DNA nuclear al medio y
digiera a las proteínas (Monrroy et al., 2014), lo que ayuda a purificar el ADN. Según este
fundamento las muestras que contenían proteínasa K debieron tener una mejor corrida
electroforética, pero esto no sucedió. En general la corrida no fue óptima en ninguna
muestra y esto pudo deberse a factores tales como; el campo eléctrico y este depende de
muchas variables como lo son la intensidad de corriente, la diferencia de potencial, la
resistencia de las cargas, el pH de las muestras entre otros. Otro factor que afecta a los
resultados de esta prueba es el gel agarosa. La clave de la separación de las muestras está en
la matriz porosa que se utiliza; esta, restringe más la migración de moléculas grandes o
pequeñas (Klug, 2011). La continua licuación de la agarosa incrementa su concentración
por deshidratación alterando el perfil de las bandas al final del resultado (Yabar, 2003).
Otro factor es la falta de protocolo de desinfección, lo que se pudieron contaminar las
muestras. Como el mal pipeteo que aumenta el riesgo de contaminación disminuyendo la
purificación de la muestra (Baena et al., 2013). En el caso de los pocillos 3, 5, 12 y 17 no se
lograron observar las bandas según Yabar, 2003, esto puede ser causado porque el gel de
agarosa no se diluyó muy bien quedando zonas más gruesas que otras, lo que interfiere en
la visibilidad de las bandas.

Tabla 2. Medida de Absorbancia de 260/280 en cada muestra.

Número de pocillo Nombre de muestra A260/A280 Grado de pureza

1 blanco 1 0,578 Contaminado

 2 control 1 1,894 Optimo
3 muestra 1 1,877 Optimo
4 muestra 2 1,889 Optimo
5 muestra 3 1,864 Optimo
6 muestra 4 1,861 Optimo
7 muestra 5 1,824 Optimo
8 muestra 6 1,846 Optimo
9 muestra 1 1,779 Aceptable
10 muestra 2 1,477 Contaminado
11 muestra 3 1,795 Aceptable
12 muestra 4 1,772 Aceptable
13 muestra 5 1,717 aceptable
14 muestra 6 0,815 contaminado

° Los números en negrilla corresponden a los datos del segundo grupo de laboratorio.

Para medir el grado de pureza y concentración que presentaron las muestras se realizó la
espectrofotometría, que mide la absorción UV de los nucleótidos. La concentración de la
muestra de ADN se mide teniendo en cuenta la absorbancia (A) obtenida a una longitud de
onda de 260nm y la relación A260/280 nos indica la pureza de la muestra ver gráfica 1,
(Banco ADN, 2003).

La relación A260/280 es muy estable y se considera que un ADN de pureza óptima tiene un
valor entre 1.8-2.0. Un ADN de pureza aceptable debe tener al menos una relación
A260/280 mayor a 1.6. Y un valor A260/280 menor a 1.6 indica una posible contaminación
por compuestos aromáticos como fenoles y proteínas. (Banco ADN, 2003). Teniendo en
cuenta estos datos se determinó el grado de pureza de cada uno de las muestras (ver tabla
2). La mayor parte de las muestras obtuvo un rendimiento óptimo, sólo tres muestras
estaban contaminadas y cuatro se considera que tiene una pureza aceptable. Aunque los
resultados de la espectrofotometría nos muestran que hay ADN óptimo, esto no se pudo
evidenciar en la corrida de electroforesis y esto se debe a que la electroforesis se puede ver
la calidad de la muestra, si está fragmentado o no, proceso que no se puede determinar con
la espectrofotometría.
 2
1.8
1.6
Absorbancia 260/280

1.4
1.2
1
0.8 A260/A280
0.6
0.4
0.2
0

Gráfica 1. Absorbancia 260/280 de las muestras de ADN

Conclusión

Se han implementado muchas técnicas para la extracción de ADN, una muy eficaz fue la
que se planteó en esta práctica que es la técnica de Salting out, aunque en este caso no se
pudo obtener una buena muestra de la macromolécula. Esto pudo ser porque el marcador de
peso molecular fue más pequeño que las muestras por lo que corrió más rápido. Y también
por factores respecto a la inadecuada manipulación de las herramientas de trabajo. Por ende
para hacer este tipo de prácticas es necesario el conocimiento y función de cada reactivo.
Lo que nos ayudará a utilizar las cantidades adecuadas del reactivo y también que hacer en
caso que no halla el reactivo primario para la realización del procedimiento.

Referencias

 M. Riera, M. Rojas, P. Zapata, Protocolo de extracción de DNA por salting-out

para pequeños volúmenes de sangre (2010).

 D. Fonseca, H. Mateus, N. contreras prácticas de laboratorio: Biología molecular,

su aplicación en genética. Universidad del Rosario. (2010).

 L. Alejos, M. Aragón, A. cornejo. Extracción y purificación de ADN.

 Riera, Mario A,;Rojas, Maria E.;Zapata, Pedro D. Protocolo de Extracción de DNA
por Salting- Out para Pequeños Volúmenes de Sangre. Revista de Ciencia Y
Tecnología. Facultad de ciencias exactas Química Y Naturales. UNAM.