ENUMERACION DE COLIFORMES EN MUESTRAS DE AGUA

INTRODUCCION :

Las bacterias del grupo coliformes se utilizan desde el inicio del siglo XX como
indicadoras de contaminación fecal. Fueron definidas siempre como bastoncillos gram
negativos, no formadoras de esporas, que pueden crecer en presencia de sales biliares
o de otros agentes tensoactivos y que fermentan la lactosa a 37°C, con producción de
ácido (ácidos orgánicos y aldehidos) y gas en 24 horas. En las heces, están en la
concentración de 108-1010 microorganismos por gramo. Tradicionalmente los
coliformes son clasificados en un grupo denominado coliformes totales y dentro de este
existe un subgrupo conocido como Coliformes Fecales. Los coliformes totales son
clasificados como bacilos gram negativos aerobios y anaerobios facultativos no
esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas después de
incubación durante 24-48 horas a 35°C. Incluye los géneros Citrobacter spp., Klebsiella
spp., Enterobacter spp., en este último se encuentra la E. coli, exclusiva de heces
animales homeotérmicos. Los coliformes fecales constituyen un subgrupo de los
coliformes totales, y se diferencian de los anteriores por ser tolerantes a temperaturas
mas altas, creciendo a 44.5°C, (APHA, 1995). Se denominan termotolerantes por su
habilidad de soportar temperaturas más elevadas.

OBJETIVOS :

 Deteccion presuntiva de coliformes en muestra de agua de rio o agua estancada

 Realizar la prueba confirmativa de la presencia de coliformes
 Determinar el NMP/100 ml

MATERIALES :

 Tubos de ensayo
 Gradilla
 Pipetas
 Medios de cultivo
 Mechero
METODOLOGÍA:

 La técnica del NMP comprende siempre una prueba presuntiva y otra

confirmativa.
 Esto es así porque una positividad en un tubo de la prueba presuntiva no indica
necesariamente la presencia del grupo bacteriano a determinar (Coliformes
Totales, Coliformes Fecales o Estreptococos Fecales), sino tan solo es una
presunción, que habrá de confirmarse posteriormente.

 Sin embargo, una negatividad en la prueba presuntiva permite dictaminar la

ausencia de dicho grupo bacteriano en el agua examinada.

 La denominada prueba presuntiva consiste en una metodología de tipo general

para cualquier grupo de bacterias, mientras que la prueba confirmativa es
específica.
RESULTADOS :

TERMOTOLERANTES :
CONCLUSIONES :

 En la prueba presuntiva, la presencia de gas y turbidez nos indica que es

Positivo, porque el grupo coliforme tiene la propiedad de fermentar la lactosa que
presenta el caldo, produciendo ácido (acidificación) y gas (gas atrapado en la
campana).
 En las pruebas confirmativas la peptona aporta los nutrientes necesarios para el
adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes
selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram
negativas a excepción de Coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono
fermentable.
 Es importante anotar de qué tubo de caldo lactosado se inocula cada tubo de
verde brillante ya que esta prueba se utiliza para confirmar que los tubos
presuntamente positivos (prueba presuntiva) lo son en realidad. La presencia de
gas atrapado nos confirmara la presencia de coliformes
INVESTIGACION Y ENUMERACION DE ENTEROCOCCUS EN MUESTRAS
DE AGUA

INTRODUCCION :

El agua es considerada como uno de los alimentos y productos de mayor consumo en

el mundo. Sin embargo es también uno de los vehículos más efectivos como transmisor
de infecciones, ya que se han encontrado muchos agentes patógenos en
abastecimientos de agua, supuestamente potable. El mayor riesgo de infecciones
gastrointestinales asociado al agua para consumo humano son las enfermedades
causadas por bacterias, parásitos y virus.

Bacterias utilizadas como indicadoras de contaminación fecal son aquellas del género
Enterococcus que se encuentran presentes en heces de humanos y animales. Los
enterococos son más persistentes en el ambiente que E. coli y los coliformes
termotolerantes, por lo que pueden ser utilizados como buenos indicadores de la calidad
microbiológica de agua para consumo humano y el monitoreo de la eficacia de los
tratamientos de desinfección utilizados para garantizar la potabilidad (3,4). Debido a su
resistencia ante condiciones ambientales adversas, se les considera como los
principales microorganismos indicadores en aguas recreacionales dulces y marinas.

OBJETIVOS :

 Deteccion presuntiva de Enterococcus en muestra de agua o agua estancada

 Realizar la prueba confirmativa de la presencia de Enterococcus

METODOLOGIA :

Técnica de fermentación en tubos múltiples

 La técnica de fermentación en tubos múltiples (FTM) para enumerar coliformes

se ha usado durante alrededor de 80 años como método de monitoreo de la
calidad del agua.
 El método consiste en inocular una serie de tubos con diluciones decimales de
la muestra de agua. La producción de gas, formación de ácido o abundante
 crecimiento en los tubos después de 48 h de incubación a 35ºC constituyen
resultados presumiblemente positivos.
 Todos los tubos con reacción presumiblemente positiva son inmediatamente
sometidos a pruebas de confirmación.
 La formación de gas en Caldo Lactosado y Bilis Verde Brillante en los tubos de
fermentación tras 48 h de incubación a 35ºC constituye una prueba de
confirmación positiva.
 La prueba de coliformes fecales usando medio Bilis Verde Brillante, puede
aplicarse para determinar coliformes totales y fecales, la producción de gas
después de 48 h de incubación a 44,5 ºC en caldo se considera un resultado
positivo.

PRUEBA PRESUNTIVA:

1. Preparar tres series sucesivas de 3 tubos con Caldo Azida de Sodio, una de
doble concentración y las otras dos de concentración sencilla.

2. Etiquetar las series con 10, 1 y 0.1 mL, respectivamente.

3. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces antes de tomar el

volumen que se va a inocular, a efecto de homogeneizar.

4. Antes y después de realizar las inoculaciones, la boca del frasco de la muestra

deberá ser flameada con objeto de evitar contaminación.

5. Inocular con una pipeta de 10 mL este volumen de muestra en la serie de tubos

con caldo de doble concentración, con otra pipeta de 1 mL para 1 mL de muestra
en la segunda serie de tubos con caldo de concentración simple.

6. Igualmente con la misma pipeta podrá inocularse la tercera serie de tubos con
0.1 mL de muestra.

7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 37.5 °C (± 1 °C) durante 24-48 h.
 8. Después de 24 h de incubación, hacer una primera lectura. La reacción positiva
de algún tubo se pone de manifiesto por la aparición de turbidez y/o sedimento
en el fondo del mismo.

Con los tubos que en este momento resulten positivos se puede empezar a la realización
de la prueba confirmativa.

9. En caso de no apreciarse crecimiento se llevan a incubación por 24 horas más,

es decir un total de 48 horas (± 3h) después de las cuales se efectúa la lectura
final.
10. Si pasado el período de 48 h no ha habido crecimiento (turbidez y/o sedimento)
en ninguno de los tubos se consideran definitivamente como negativos.

INTERPRETACION:

● Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando

la AUSENCIA en la muestra analizada.

● Todos aquellos tubos POSITIVOS se anotarán convenientemente por orden de

mayor a menor dilución y se procederá a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA
para ENTEROCOCOS.

PRUEBA CONFIRMATORIA PARA ENTEROCOCOS:

1. Se preparan tantos tubos de caldo BHI, como tubos hayan resultado positivos
en la lectura de la prueba presuntiva, rotulando los tubos adecuadamente para
evitar errores en la lectura.

2. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba
presuntiva, agitándolos previamente para homogeneizar, inocular con tres
asadas, tubos conteniendo caldo BHI.

3. Incubar a 37.5 °C (± 1 °C) durante 24 horas (± 3h).

4. Finalizando el período de incubación se hará la lectura final.

INTERPRETACION:

● Si se observa turbidez y/o sedimento: La prueba se considera POSITIVA, debiendo

anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP.

● Si en ninguno de los tubos se observa turbidez y/o sedimento: Se consideran

negativos, estableciéndose el código 0, 0, 0 para el cálculo correspondiente.

RESULTADOS :

 0.1 ml :

 1 ml

 10 ml

CONCLUSIONES :

 Los enterococos fecales carecen de citocromos y hacen fermentación láctica. En

la prueba presuntiva se utiliza Caldo Azida de Sodio, este impide el
funcionamiento de la cadena transportadora de electrones, no inhibe el
crecimiento de los enterococos fecales, pero si inhibe el crecimiento de la flora
Gram negativa. Este tipo de caldo provee péptidos, aminoácidos, nitrógeno,
vitaminas y cofactores lo cual da una fuente nutritiva para el desarrollo
bacteriano
 Después de la incubación hubo presencia de turbidez, es debido al crecimiento
bacteriano que se aprecia mejor si agitamos el tubo y comparamos con otro no
inoculado
 En la prueba de confirmación, la precisión de este método depende del número
de tubos utilizados, que pueden ser tres o cinco, existen otros métodos de
detección (confirmación), prueba de Gram (más rápida), Prueba de presencia –
ausencia, entre otras.
 (NMP) permite conocer la densidad bacteriana de enterococos en la muestra y
se interpreta de manera similar a la técnica de número más probable para
bacterias coliformes
 En la etapa confirmativa presentamos ausencia de material (4 tubos), es por esto
que los resultados no fueron del todo valido aun cuando nos salieron con turbidez
en los 5 tubos, concluyendo la presencia de enterococos, cabe la duda de
confirmar este resultado.
 INVESTIGACION DE CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTORES EN
MUESTRAS DE AGUA

INTRODUCCION :

Los microorgnismos anaerobios obligados (Bacillus, Clostridium...) sólo pueden crecer

a bajos potenciales redox, y algunos únicamente crecerán en ausencia de oxígeno.
Suelen encontrarse en la parte interna de los alimentos no procesados y juntamente con
los anaerobios facultativos constituyen los principales microorganismos de la alteración.
Su valoración en los alimentos nos sirve como indicador de contaminación telúrica
remota por la presencia de esporas resistentes. El número máximo de esporas, es decir,
el "número total de esporos", se puede determinar usando tratamientos térmicos de la
muestra del orden de los 70-80°C durante 10-15 minutos, con lo que conseguimos
destruir las formas vegetativas y revivificar tan solo los esporos. Al hacer recuento hay
que partir del principio de que una espora da lugar a una colonia en el medio de cultivo

METODOLOGÍA:

Todas las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones de asepsia.

 Medio de cultivo:

 Preparar 4 tubos con Agar TSN y colocar los tubos en baño de María para
desgelificar.

 Dejar enfriar hasta estar a una temperatura templada de 50 a 60°C (temperatura

que soporte la mano).

 Etiquetar los tubos, dos con 3 ml y dos con 1 ml, respectivamente.

 Agua de estudio:
1. Agitar vigorosamente la muestra de agua (Rio Caplina) por lo menos 20 veces
antes de tomar el volumen que se va a extraer, a efecto de homogeneizar.

2. Antes y después de realizar la extracción, la boca del frasco de la muestra deberá

ser flameada con objeto de evitar contaminación.

3. Inocular con una pipeta de 10 ml para 10 ml de muestra en un tubo vacío estéril.

4. Colocar el tubo en baño de María a 80°C durante 5 min. Dejar enfriar

rápidamente en agua corriente, hasta quedar a una temperatura templada de 50
a 60°C (temperatura que soporte la mano).

 Siembra:

5. Recolectar el agua de estudio e inocular con una pipeta de 5 ml para 3ml de

muestra en un tubo con agar TSN y con otra pipeta de 1 ml para 1 ml de muestra
en otro tubo con agar TSN.

Nota: Inocular (cuando aún está el agar en fase líquido) mediante siembra en
profundidad (introducir la pipeta hasta la mitad de lo que es el volumen de
agar) sin formar burbujas (porque pueden dar un falso negativo en la lectura).

6. Igualmente, con la misma pipeta podrá inocularse los otros 2 tubos con 3 ml y 1
ml de muestra (Agua estancada).

7. Mezclar suavemente (sin formar burbujas) y dejar solidificar los 4 tubos.

8. Sellar los tubos (adicionar una segunda capa de medio) con Agar Agua. Dejar
solidificar.

9. Incubar los 4 tubos a una temperatura de 37.5 °C (± 1 °C) durante 24 - 48 h.

Lectura:

10. Después de 24 h de incubación, hacer una primera lectura. La reacción positiva

de algún tubo se pone de manifiesto por la aparición de colonias negras.
 11. En caso de no apreciarse crecimiento se llevan a incubación por 24 horas más,
es decir un total de 48 horas (± 3h) después de las cuales se efectúa la lectura
final.

INTERPRETACION:

El recuento se realiza por UFC (Unidades Formadoras de Colonias):

 Si se observa colonias: La prueba se considera POSITIVA, debiendose

anotar el número de colonias por tubo.

 Si en ninguno de los tubos se observa colonias: Se consideran

definitivamente como negativos

RESULTADOS :

SATURADOS
CONCLUSIONES:

 Se pudo lograr detectar la presencia de colonias en la muestra de agua del rio

caplina, gracias al agar TSI por los componentes que presentan como:
 La polimixina y los sulfatos de neomicina que inhiben el crecimiento de la
mayoría de Enterobacterias y Clostridium.

 El citrato férrico y el sulfito de sodio son indicadores de H2S.

 Clostridium reduce el Sulfito a sulfuro que reacciona con el hierro y forma un
precipitado de sulfuro de hierro negro visto como colonias negras. Esto se debe
que son sulfito reductores por su capacidad de reducir los sulfitos a sulfuros a
partir de estos aminoácidos y compuestos azufrados lo caracteriza como
indicador de contaminación de agua de alto riesgo
 DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE PSEUDOMONAS

INTRODUCCION :

El grupo Pseudomonas, está constituido por bacilos aerobios gramnegativos y móviles,

algunos de los cuales producen pigmentos solubles en agua. Las especies del género
Pseudomonas se identifican sobre la base de varias características fisiológicas. Una de
las propiedades más notables de Pseudomonas es la gran variedad de compuestos
orgánicos que utilizan como fuentes de carbono y energía (ONTIVEROS, 1983). Se ha
demostrado que Pseudomonas aeruginosa es capaz de sobrevivir y multiplicarse en
aguas tratadas, esto debido a una densa capa polisacárido la cual establece una barrera
no solo física sino química capaz de proteger a la bacteria de las moléculas e iones de
Cloro libre residual (REILLY, 2000). En el Perú, Torres (1991), efectuó estudios para
evaluar la resistencia de Pseudomonas aeruginosa al Cloro libre residual obteniendo
resultados que demuestran que el tiempo de reducción del 99% de bacterias a la
concentración de 1 mg/l de Cloro libre residual a pH 9 es aproximadamente dos veces
menos efectivo que a pH 7, siendo de 100 y 35 minutos respectivamente. Por lo que
concluye que la presencia de Pseudomonas aeruginosa en el agua potable es de alto
riesgo para la salud, en especial de los neonatos, pacientes hospitalizados e
inmunodeficientes; debiendo ser considerado como un indicador de eficiencia de la
desinfección, y ser incluida su detección y cuantificación en los análisis de rutina. En
resumen, la presencia de este microorganismo es un indicador de la calidad del agua
ya que su resistencia al cloro es superior a la de otros microorganismos aislados del
agua

OBJETIVOS :

 Deteccion presuntiva de pseudomonas en muestra de agua de rio caplina o

agua estancada
 Realizar la prueba confirmativa de la presencia de pseudomonas
METODOLOGÍA:

 Agua de estudio: Agua de Rio Caplina

1. Tomar 1ml, 0.1ml y 0.01ml del agua de estudio.

2. Para cada inoculo, sembrar por dispersión con una espátula de Drigalsky, en 3
placas con medio de cultivo sólido, Agar Pseudomona.

3. Incubar a 37°C por 48 horas en una cámara de anaerobiosis con luz UV de onda
larga de 365 -395 nm.

4. En la lectura contabilizar las colonias fluorescentes verdes por medio de las UFC
(Unidades formadoras de colonias).

 Agua de estudio: Agua estancada

1. Preparar 6 tubos con Agua Peptonada y etiquetar los tubos (𝟏𝟎−𝟏 - 𝟏𝟎−𝟔 )

2. Hacer diluciones sucesivas decimales en los 6 tubos con Agua Peptonada,

agregando al primer tubo una alícuota de 1ml del agua de estudio
Nota: En cada tubo de las diluciones, homogenizar.

3. De las 3 últimas diluciones: con ayuda de una pipeta extraer 1ml de medio y
sembrar por dispersión con una espátula de Drigalsky en medio de cultivo sólido,
Agar Pseudomona.

4. Incubar a 37°C por 48 horas en una cámara de anaerobiosis con luz UV de onda
larga de 365 -395 nm.

5. En la lectura contabilizar las colonias fluorescentes verdes por medio de las UFC
(Unidades formadoras de colonias).

El método de las diluciones nos permite determinar las UFC/mL, presentes en la

muestra por analizada.
CONCLUSIONES :

 Pseudomonas aeruginosa produce dos pigmentos útiles como son la piocina,

que puede colorear de azul-verdoso y la pioverdina(fluorescencia), pigmento
amarillo verdoso que presenta fluorescencia bajo la luz ultravioleta, propiedad
que puede usarse en la identificación temprana de dicho microorganismo, Es por
eso que en el medio de cultivo usado se observò la fluorescencia de
Pseudomonas.
 El grupo de bacterias coliformes se aplica como indicador general de monitoreo
de calidad del agua; pero también se han propuesto otros microorganismos para
ser usados como indicadores complementarios, tal es el caso Pseudomonas
aeruginosa. No todas las normas de calidad de agua potable en los países de
Sudamérica contemplan esta bacteria dentro de sus parámetros a evaluar.
 Debido a que no fermentan la glucosa, se les conoce como no fermentadores, al
contrario de las enterobacterias que si lo fermentan. Pseudomonas puede
multiplicarse en aguas que contengan tan solo cantidades mínimas de
nutrientes, y son capaces de utilizar una amplia variedad de fuentes de carbono
y nitrógeno para crecer en diversos ambientes.