Examen Parcial 1

Porfirio Meléndez Antonio

1) Tienes dos secuencias de DNA A y B (ver abajo). La secuencia B fue amplificada por PCR a partir
de DNA genómico de una cepa mutante de E. coli. Sin embargo, se determinó que la secuencia
amplificada era de mayor tamaño que la secuencia del gen de referencia A obtenida en el NCBI. La
evidencia indica que la secuencia B contiene una o más inserciones no deseadas que aparecieron
en la cepa mutante.

a) ¿Qué aplicación bioinformática utilizarías para identificar la o las inserciones? (10%)

Utilizaría un alineamiento global por pares con gabs para visualizar las secuencias extrañas
en el gen B. En este caso se utilizó “MUSCLE”.

b) ¿En qué región o regiones de la secuencia B se identifican la o las inserciones? Muestra

el alineamiento correspondiente. (10%)

En 364 a 723 pb y en 1386 a 1745 pb como se muestra en la figura 1

Figura 1. Alineamiento global con gabs. Los gabs son los espacios marcados con “-“.

c) ¿De qué tamaño es la o las inserciones? En caso de existir dos o más inserciones, ¿son
iguales o diferentes? (10%) ¿Cómo lo determinaste?

Ambas inserciones tienen un tamaño de 359 pb.

Ambas inserciones tienen la misma secuencia, esto se determinó mediante análisis en

matriz BLOSUM 62 de la secuencia B sobre sí misma con se muestra en la figura 2.
Figura 2. Análisis de la secuencia B en matriz BLOSUM 62.
2) Se desea clonar la secuencia de la glutamato deshidrogenasa de Corynebacterium glutamicum
ATCC 13032 (https://www.genome.jp/dbgetbin/www_bget?cgl:NCgl1999) en el vector pTrc99A. No
interesa emplear el promotor trc del plásmido sino que se desea que la secuencia de la glutamato
deshidrogenasa se exprese bajo el control del promotor de la piruvato formato liasa I (pflB) de E.
coli W3110:
(https://www.genome.jp/dbgetbin/www_bget?ecj:JW0807+ecj:JW0886+ecj:JW3923+ecj:JW5522)
para que se induzca en microaerobiosis/anaerobiosis. Tienes oportunidad de mandar a secuenciar
el promotor, el gen de interés y los sitios de restricción que flanquean la secuencia completa.

a) ¿Cuál es la secuencia que elegirías para abarcar por completo la región promotora de la
piruvato formato liasa (pflB) de E. coli W3110? ¿Cuál es el número de pb? (10%)

La secuencia es:
5´-GTTGACATACTGGGTCATTTACCTGCGTGAAAACGACCACCATTAATGGTTGTCGAAGTA
CGCAGTAAATAAAAAATCCACTTAAGAAGGTAGGTGTTAC-3´
y son 100 pb rio arriba.

b) ¿Cuáles enzimas de restricción le añadirías a la secuencia promotora + Gen de interés

para poderla clonar en el vector pTrc99A? Escribe la secuencia de reconocimiento de la
enzima. ¿es posible llevar a cabo experimentalmente la digestión simultánea? Justifica
esta última respuesta.

Añadiría los sitios de restricción para ECORI y para HindIII

EcoR1 HindIII
Si es posible llevar a cabo la digestión simultánea. Mediante la página
www.thermofisher.com EcoR1 (IVGN0116) Y HindIII (IVGN0166) tienen ambas una
temperatura optima de reacción de 37°C.

c) Escribe la secuencia completa que mandarías sintetizar (sitio restricción 1 + promotor +

secuencia de interés + sitio de restricción 2), identifica por colores cada región y menciona
el número de nucleótidos de segmento. (10%)

d) Realiza la clonación in sillico. (20%)

 d)

Figura 3. Clonación de glutamato deshidrogenasa en vector ptrc99a.

c)
gaattcGTTGACATACTGGGTCATTTACCTGCGTGAAAACGACCACCATTAATGGTTGTCGAAGTACGCAGTAAATAAAA
AATCCACTTAAGAAGGTAGGTGTTACatgacagttgatgagcaggtctctaactattacgacatgcttctgaagcgcaat
gctggcgagcctgaatttcaccaggcagtggcagaggttttggaatctttgaagatcgtcctggaaaaggaccctcatta
cgctgattacggtctcatccagcgcctgtgcgagcctgagcgtcagctcatcttccgtgtgccttgggttgatgaccagg
gccaggtccacgtcaaccgtggtttccgcgtgcagttcaactctgcacttggaccatacaagggcggcctgcgcttccac
ccatctgtaaacctgggcattgtgaagttcctgggctttgagcagatctttaaaaactccctaaccggcctgccaatcgg
tggtggcaagggtggatccgacttcgaccctaagggcaagtccgatctggaaatcatgcgtttctgccagtccttcatga
ccgagctacaccgccacatcggtgagtaccgcgacgttcctgcaggtgacatcggagttggtggccgcgagatcggttac
ctgtttggccactaccgtcgcatggctaaccagcacgagtccggcgttttgaccggtaagggcctgacctggggtggatc
cctggtccgcaccgaggcaactggctacggctgcgtttacttcgtgagtgaaatgatcaaggctaagggcgagagcatca
gcggccagaagatcatcgtttccggttccggcaacgtagcaacctacgcgattgaaaaggctcaggaactcggcgcaacc
gttattggtttctccgattccagcggttgggttcatacccctaacggcgttgacgtggctaagctccgcgaaatcaagga
agttcgtcgcgcacgcgtatccgtgtacgccgacgaagttgaaggcgcaacctaccacaccgacggttccatctgggatc
tcaagtgcgatatcgctcttccttgtgcaactcagaacgagctcaacggcgagaacgctaagactcttgcagacaacggc
tgccgtttcgttgctgaaggcgcgaacatgccttccacccctgaggctgttgaggtcttccgtgagcgcgacatccgctt
cggaccaggcaaggcagctaacgctggtggcgttgcaacctccgctctggagatgcagcagaacgcttcgcgcgattcct
ggagcttcgagtacaccgacgagcgcctccaggtgatcatgaagaacatcttcaagacctgtgcagagaccgcagcagag
tatggacacgagaacgattacgttgtcggcgctaacattgctggcttcaagaaggtagctgacgcgatgctggcacaggg
cgtcatctaaAAGCTT

De rojo el sitio de restricción para ECOR1 (6pb) , de morado la secuencia que

incuye el promotor de pflB (100pb), de verde el gen de glutamato deshidrogenasa
(1344pb) y de azul claro el sitio de restricción para HindIII (6 pb).