Un Enfoque Totalmente Práctico

Michaelis, Inhibición Reversible Simple, Hill y pH

Prof. José Antonio Pliego Garza

 k1 → k →
E+S ES 2 E+P
← k −1 ← k −2
La constante de velocidad k-2 del regreso de productos a complejo ES, es
eliminada tomando las velocidades iniciales de la reacción.

k1 → k2 →
E+S ES E+P
← k −1
Para analizar mas fácilmente la reacción podemos dividirla en 2, asumiendo la
siguiente mentira piadosa

k-1>>>k2

así tendremos una primera parte prácticamente en equilibrio, que nos permitirá
describir [ES] en términos de cosas que podamos medir o controlar.
k →
E+S 1 ES
← k −1
k −1 →
ES E+S
← k1
Primero veamos la reacción como la disociación del complejo ES en S y E

[ E ][S ]
KS =
[ ES ]
K [ ES ]
[E ] = S
[S ]
Así tendremos KS que es la constante de sustrato, para luego resolver para la
concentración de enzima libre [E]

Luego planteamos la ecuación de conservación para la enzima [E]0

[ E ]0 = [ E ] + [ ES ]

Sustituyendo la [E]

K S [ ES ]
[ E ]0 = + [ ES ]
[S ]

Tomamos a [ES] como factor común

 KS
[ E ]0 = [ ES ]( + 1)
[S ]

y despejamos.

[ E ]0
[ ES ] =
KS
+1
[S ]

Multiplicamos todo por [S]

[ E ]0 [ S ]
[ ES ] =
K S + [S ]

De esta manera tenemos [ES] en términos de cosas que podemos medir.

k1 → k →
E+S ES 2 E+P
← k −1

Así que en la segunda parte, tendremos la reacción de velocidad.

k2 →
ES >E+P

v0 = k 2 [ ES ]
[ E ]0 [S ]
v0 = k 2
K S + [S ]

Veamos lo que sucede a muy bajas concentraciones de sustrato, en donde +[S] se

hace despreciable

k 2 [ E ]0
v0 = [S ]
KS
Vo a muy bajas [S]

10.00
8.00
6.00
Vo
Vo

4.00
2.00
0.00
0.00 1.00 2.00 3.00
[S]
 quedando una ecuación lineal o de primer orden para [S]1 .

Por el contrario, a muy altas concentraciones de sustrato la KS es la que se hace

despreciable

v0 = k 2 [ E ]0 [S ]0 = Vm
Vo a m uy elevadas concentraciones de [S]

Vm
100.00
80.00
60.00
Vo
Vo
40.00
20.00
0.00
0.00 50.00 100.0 150.0 200.0
0 0 0
[S]

quedando una ecuación de orden cero para [S]0 , definimos entonces Vm=k2[E]0

la ecuación resulta ser la ecuación de una hipérbola rectangular

Vm[ S ]
v0 =
K S + [S ]

Hipérbola Rectangular

90.00
80.00
70.00
60.00
50.00
Vo

Vo
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
0.00 50.00 100.00 150.00 200.00
[S]
para corregir nuestra mentira piadosa, analizaremos empíricamente el significado
de la KS

Vm Vm[ S ]
=
2 K S + [S ]
2Vm[ S ]
K S + [S ] =
Vm
K S = 2[ S ] − [ S ]
K S = [ S ] = Km

de esta forma, llamaremos Constante de Michaelis Km a la concentración de

sustrato [S] necesaria para alcanzar ½ de la Vm de la reacción

Así tendremos la Ecuación de Michaelis y Menten

Vm[S ]
v0 =
Km + [ S ]

Sin mentiras piadosas

∂[ ES ]
= k1[ E ][S ] − k −1[ ES ] − k 2 [ ES ]
∂t

∂[ ES ]
en Steady State =0
∂t

luego

k1[ E ][S ] = k −1[ ES ] + k 2 [ ES ]

k1[ E ][S ] = (k −1 + k 2 )[ES ]
[ E ][S ] k −1 + k 2
= = Km
[ ES ] k1
 Formas Lineales

Lineweaver & Burk

(Dobles Recíprocas)

Primero le damos la vuelta a la Ec. de Michaelis & Menten

1 Km + [ S ] Km [S ] Km 1
= = + = +
v0 Vm[ S ] Vm[ S ] Vm[ S ] Vm[S ] Vm

luego buscamos y = mx + b

1 Km 1 1
= +
v0 Vm [ S ] Vm

Lineweaver & Burk

0.50

0.40

0.30
1/Vo
1/Vo

0.20
Regresión L&B
0.10

0.00
-1.00 0.00 1.00 2.00
-0.10
1/[S]

−b
Si a =
m

1
−
−1
Entonces a = Vm =
Km Km
Vm

Hanes & Wolf

Para obtener esta forma lineal, solo hay que multiplicar la Ec. de Lineweaver &
Burk por la [S].
 1 Km 1 1
[S]( = + )
v0 Vm [ S ] Vm

[S ] Km[ S ] [ S ] Km [ S ]
= + = +
v0 Vm[S ] Vm Vm Vm

Acomodando para la recta y = mx + b

[S ] 1 Km
= [S ] +
v0 Vm Vm

Hanes & Woolf

1.00

0.80

0.60
[S]/Vo

[S]/Vo
0.40
Regresión H&W
0.20

0.00
-5.00 0.00 5.00 10.00
-0.20
[S]

Km
−
Aquí tendremos que a = Vm = − Km
1
Vm

Eadie & Hofstee

Aquí partiremos de la Ec. de Michaelis

Vm[S ]
v0 =
Km + [ S ]

v0 ( Km + [ S ]) = Vm[S ]
v0 Km + v 0 [S ] = Vm[ S ]

luego dividimos todo sobre [S]

 v0 Km v0 [ S ] Vm[ S ]
+ =
[S ] [S ] [S ]
v0 Km
+ v0 = Vm
[S ]

acomodando términos

v0
v0 = − Km + Vm
[S ]

Eadie & Hofstee

9
8
7
6
5 Vo/[S]
Vo

4 Regresión E&H
3
2
1
0
-4 1 6 11
Vo/[S]

− Vm Vm
a= =
− Km Km

Método Lineal directo de Eisenthal y Cornish-Bowden

Este método consiste en despejar de la Ec. de Eadie & Hofstee las variables como
constantes y las constantes como variables.

v0
v0 = − Km + Vm
[S ]

v0
Vm = Km + v0
[S ]

donde
 − v0
a= = −[ S ]
v0
[S ]

quedando una recta en su forma simétrica

Vm Km
− =1
v0 [ S ]

por lo que al graficar cada punto ([S],Vo) como la abscisa (-Km) y la ordenada (Vo)
al origen de la recta que corta los ejes Vm y Km., tendremos una familia de rectas
que deberían cruzarse en la solución común a todas ellas que sería la Vm y la
Km.
Como esto no sucede por la variación experimental, tendremos una familia de
cruces de la rectas, por lo que se tendrá que calcular la mediana de las posibles
Vm y Km. Se utiliza la mediana, para no sesgar los valores debido a puntos
extremos.
 Inhibición Reversible

E +S ES E+P
+ + x
I I x
Ki KI

EI ESI x

La ecuación general de éste modelo

Vm[ S ]
v0 =
[I ] [I ]
Km(1 + ) + [ S ](1 + )
Ki KI

Inhibición Competitiva, se observa cuando I solo se une a la enzima libre E.

Vm[S ]
v0 =
[I ]
Km(1 + ) + [S ]
Ki

En este tipo de inhibición la Km aumenta, mientras que la Vm no sufre cambio

alguno.

Inhibición Acompetitiva o Incompetitiva, se observa cuando I solo se une al

complejo enzima-sustrato ES.

Vm[ S ]
v0 =
[I ]
Km + [S ](1 + )
KI

En este tipo de inhibición la Km y la Vm disminuyen en la misma proporción.

Inhibición No Competitiva, se observa cuando I se une exactamente de la misma

manera a ambas formas de la enzima.

Vm[ S ]
v0 =
[I ]
( Km + [ S ])(1 + )
K iI

En este tipo de inhibición la Vm disminuye, mientras que la Km no sufre cambio

alguno.
Inhibición Mixta tipo Competitiva, se observa cuando I se une a ambas formas de
la enzima, pero preferentemente a la enzima libre E.

Vm[ S ]
v0 =
[I ] [I ]
Km(1 + ) + [ S ](1 + )
Ki KI

Ki < KI

En este tipo de inhibición la Km aumenta mientras que la Vm disminuye.

Inhibición Mixta tipo Acompetitiva, se observa cuando I se une a ambas formas de

la enzima, pero preferentemente al complejo enzima-sustrato ES.

Vm[ S ]
v0 =
[I ] [I ]
Km(1 + ) + [ S ](1 + )
Ki KI

Ki > KI

En este tipo de inhibición la Km y la Vm disminuyen pero no lo hacen en la misma

proporción.

Inhibidores Reversibles
Inhibición Vm Km Vm/Km Ki KI
Competitiva = aumenta disminuye -
A(In)competitiva disminuye disminuye = -
No competitiva disminuye = disminuye
Mixta Competitiva disminuye aumenta disminuye
Mixta Acompetitiva disminuye disminuye disminuye
I n h i b i c i ón R e v e r s i b l e

10 0 . 0 0

90 .00

80 .00

70 .00
Vo

60 .00 Vcomp

Vacomp
50 .00
Vn ocomp

40 .00 Vmxcomp

Vmxacomp
30 .00

20 .00

10 . 0 0

0 .00

0 50 10 0 15 0 2 00 2 50

[ S]
La mejor manera de distinguir el tipo de Inhibición, es utilizando la Ec. de Eadie &
Hofstee.

Inhibición Competitiva

[ I ] v0
v0 = − Km (1 + ) + Vm
K i [S ]

Inhi b i ci ón C o mp et it iva

140.00

120.00

100.00

80.00 Vcomp
Contr ol
y = -15 x + 10 0 Competiti va

60.00 Contr ol

40.00

y = -3 7 .5 x + 100
20.00

0.00
-1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00

V o/ [ S]
 Inhibición A(In)competitiva

− Km v0 Vm
v0 = +
[I ] [S ] [I ]
(1 + ) (1 + )
KI KI

I nhib ición A ( In) co mp et i t iva

120.00

100.00

y = - 15 x + 10 0
80.00

Vacomp
Contr ol
60.00
Contr ol
Acompetiti va
y = -6 x + 4 0
40.00

20.00

0.00
-2.00 -1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00

V o/ [ S]
 Inhibición No Competitiva

v0 Vm
v0 = − Km +
[S ] [I ]
(1 + )
Ki

I nhib ición N o C o mp et i t iva

120.00

100.00

y = -15 x + 10 0
80.00

Vnocomp/ [S]
Contr ol
60.00
Contr ol
No Competiti va

40.00
y = -15 x + 40

20.00

0.00
-2.00 -1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00

V o/ [ S]
 Inhibición Mixta

[I ]
) (1 +
K i v0 Vm
v0 = − Km +
[I ] [S ] [I ]
(1 + ) (1 + )
KI KI

Mixta Competitiva

I nhib i ci ón M i xt a C o mp et it iva

120.00

100.00

80.00
y = - 15 x + 10 0

Vmxcomp/ [S]
Contr ol
60.00
Contr ol
Mixta Competiti va

40.00

y = - 24 x + 4 0

20.00

0.00
-2.00 -1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00

V o/ [ S]
 Mixta Acompetitiva

Inhib ición M ixt a A co mp et i t i va

120.00

100.00

y = -15x + 10 0
80.00

Vmxacomp/ [S]
Contr ol
60.00
Mixta Acompetiti va
Mixta Acompetiti va

40.00

y = - 9 .3 75 x + 2 5

20.00

0.00
-2.00 -1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00

V o/ [ S]
 Cinética Sigmoide de Algunas Enzimas Alostéricas
El modelo que considerarémos, es el siguiente:

k1 → k →
E + hS ES h 2 E + hP
← k −1
Al igual que con el Modelo de Michaelis, para analizar mas fácilmente la reacción
podemos dividirla en 2, asumiendo la siguiente mentira piadosa

k-1>>>k2

así tendremos una primera parte prácticamente en equilibrio, que nos permitirá
describir [ESh] en términos de cosas que podamos medir o controlar.
k →
E + hS 1 ES h
← k −1
k −1 →
ES h E + hS
← k1
Primero veamos la reacción como la disociación del complejo ESh en S y E

[ E ][S ]h
KS =
[ ES h ]
K S [ ES h ]
[E ] =
[ S ]h

Así tendremos KS que es la constante de sustrato, para luego resolver para la

concentración de enzima libre [E]

Luego planteamos la ecuación de conservación para la enzima [E]0

[ E ]0 = [ E ] + [ ES h ]

Sustituyendo la [E]

K S [ ES h ]
[ E ]0 = + [ ES h ]
[ S ]h

Tomamos a [ESh] como factor común

KS
[ E ]0 = [ ES h ]( + 1)
[ S ]h
 y despejamos.

[ E ]0
[ ES h ] =
KS
+1
[ S ]h

Multiplicamos por [S]h

[ E ]0 [ S ]h
[ ES h ] =
K S + [ S ]h

De esta manera tenemos [ESh] en términos de cosas que podemos medir.

En la segunda parte, tendremos la reacción de velocidad.

k2 →
ES h > E + hP

v0 = k 2 [ ES h ]
[ E ]0 [ S ]h
v0 = k 2
K S + [ S ]h

Veamos lo que sucede a muy bajas concentraciones de sustrato, en donde +[S]h

se hace despreciable.

k 2 [ E ]0
v0 = [S ]h
KS
La curva resultante, es una curva de “potencia” ya que el órden inicial de la
reacción, es diferente a 1,

Cinética Sigmoide

5.0

4.0

3.0
Vo

v
2.0

1.0

0.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
[S]
 quedando una ecuación de orden h para [S]h .

Por el contrario, a muy altas concentraciones de sustrato la KS es la que se hace

despreciable

v0 = k 2 [ E ]0 [S ]0 = Vm

Vo a m uy elevadas concentraciones de [S]

Vm
100.00
80.00
60.00
Vo
Vo

40.00
20.00
0.00
0.00 50.00 100.0 150.0 200.0
0 0 0
[S]

quedando una ecuación de orden cero para [S]0 , definimos entonces Vm=k2[E]0

la ecuación resulta ser la ecuación de una sigmoide

Vm[ S ]h
v0 =
K S + [ S ]h

Sigmoide

90
80
70
60
50
v
V

40
30
20
10
0
0 5 10 15 20
[S]
para corregir nuestra mentira piadosa, analizaremos empíricamente el significado
de la KS

Vm Vm[ S ]h
=
2 K S + [S ]h
2Vm[S ]h
K S + [ S ]h =
Vm
K S = 2[ S ] − [ S ]h
h

K S = [ S ]h = Km

de esta forma, llamaremos Constante de Michaelis Km a la concentración de

sustrato [S] necesaria para alcanzar ½ de la Vm de la reacción

Así tendremos la Ecuación de Michaelis y Menten modificada para cinéticas

iniciales de órden h 1

Vm[ S ]h
v0 =
Km + [S ]h

Sin mentiras piadosas

∂[ ES h ]
= k1[ E ][ S ]h − k −1[ ES h ] − k 2 [ ES h ]
∂t

∂[ ES h ]
en Steady State =0
∂t

luego

k1[ E ][S ]h = k −1[ ES h ] + k 2 [ ES h ]

k1[ E ][S ]h = (k −1 + k 2 )[ ES h ]
[ E ][S ]h k −1 + k 2
= = Km
[ ES h ] k1
Obtención de las Constantes Cinéticas de la Curva Sigmoide

Ecuación de Hill

Partiendo de la ecuación

[ E ][ S ]h
Km =
[ ES h ]

Y considerando que

Tendrémos

[E]
= Km[S ]−h
[ ES h ]
Vm − v
= Km[S ]− h
v
Vm − v
log = −h log[ S ] + log Km
v
 La ecuación de Hill

Vm − v
log = −h log[ S ] + log Km
v

Aquí el problema es que ¿de donde? o ¿cómo obtenemos Vm?

Definitivamente, con la ecuación de Hill es imposible.
Sin embargo, si consideramos la ecuación de Eadie & Hofstee,
v
v = − Km + Vm
[ S ]h
en la que, si se utiliza el valor correcto de h, tendremos una línea recta en la que la
pendiente con signo contrario, será la Km y la ordenada al origen será la Vm.

La manera de hacer esto, según el método propuesto por el autor (Prof. Pliego),
consiste en evaluar las rectas obtenidas por mínimos cuadrados analizando un
rango determinado de valores para h (digamos entre 0.1 y 5 en incrementos de
0.1) y escogiendo la recta que de la mejor correlación estadística evaluada a
2
través del coeficiente de determinación r .
 Efecto del pH

El efecto del pH en la cinética de las enzimas es sumamente complejo debido a

que el pH afecta el estado de ionización de:
a. la enzima, afectando:
1) la concentración de las formas iónicas activas de la enzima (E0)
2) la formación del complejo ES (Km)
3) la velocidad de descomposición del complejo ES hacia productos (k2)
b. los sustratos y cofactores (grupos prostéticos y coenzimas), de los cuales
solo algunas formas iónicas son reconocidas por la enzima
De cualquier manera si podemos calcular la concentración de las especies
iónicas de una molécula poliprotonada a cualquier pH, podremos predecir con
cierta exactitud la actividad enzimática en función del pH.

El número de especies iónicas que puede tener una

molécula poliprotonada, será igual al número de pKa’s
diferentes + 1.
Por ejemplo, si una molécula poliprotonada tiene 3 pKa’s
diferentes, tendrá 4 especies iónicas diferentes.

En base a la ecuación de Henderson y Hasselbalch, se han

desarrollado las siguientes fórmulas:

1.- Para calcular la concentración de la especie iónica totalmente protonada

[I]1 tenemos la primera fórmula.

[ Poliprotonada ]0
[ I ]1 =
1 + anti log( pH − pKa1 )

o lo que es lo mismo

[ Poliprotonada]0
[ I ]1 =
1 + 10 pH − pKa1
donde [Poliprot]o, es la concentración total de la molécula poliprotonada.
2.- Para calcular la concentración de la segunda especie iónica [I]2 y de todas
las que sigan, hasta llegar a la penúltima [I]m-1, necesitamos definir lo
siguiente:
m = número total de especies iónicas = número de pKa’s diferentes + 1
n = número ordinal para los pKa’s, ordenados desde el mas ácido (menos
básico) pKa1, hasta el menos ácido (mas básico) pKam-1.

Así que para calcular [I]n, para n desde n=2 hasta n=m-1.
tendremos

1 1
[ I ]n = [ Poliprotonada ]0 ( − )
1 + anti log( pH − pKa n ) 1 + anti log( pH − pKa n−1 )

o lo que es lo mismo

1 1
[ I ]n = [ Poliprotonada]0 ( − )
1 + 10 pH − pKan 1 + 10 pH − pKan −1
3.- Por último, para calcular la última de las especies iónicas [I]m, usaremos
cualquiera de las siguientes fórmulas.

1
[ I ]m = [ Poliprotonada ]0 (1 − )
1 + anti log( pH − pKa m−1 )

o lo que es lo mismo

1
[ I ]m = [ Poliprotonada]0 (1 − pH − pKam −1
)
1 + 10
o lo que es lo mismo

[ Poliprotonada]0
[ I ]m =
1 + anti log( pKa m −1 − pH )

o lo que es lo mismo

[ Poliprotonada]0
[ I ]m =
1 + 10 pKam −1 − pH
 Especies Iónicas

100
[Ion] %
90 [Ion]1 %
80

70
[Ion]2 %
60

50
[Ion]3 %
40
[Ion]4 %
30
20
[Ion]5 %
10

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
pH

Especies Iónicas

100
[Ion] %
90

80
70

60

50

40
30

20

10

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
pH