PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION PDFT-FC-01

DE FENOLES TOTALES POR EL METODO DE

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1. OBJETIVO

Realizar y validar por medio del R2 (coeficiente de determinación), % E (error

porcentual promedio) y RMSE (raíz cuadrada del error medio cuadrático), una curva de
calibración para fenoles totales por el método de Folin-Ciocalteu (absorbancia Vs. ppm ácido
gálico).

2. ALCANCE

Protocolo adaptado para el Laboratorio de Calidad y Conservación de Alimentos de la

Universidad de Nariño, para la determinación de fenoles totales por el método de Folin-
Ciocalteu.

3. INTRODUCCIÓN

Los compuestos fenólicos son sustancias que se encuentran en compuestos orgánicos, estos
presentan anillos aromáticos sustituidos por grupo hidroxilo y derivados funcionales de esteres,
metilesteres, entre otros. Existe una gran variedad que va desde moléculas simples hasta la
formación de polímeros (Jimenez & Villarreal, 2008).

Los compuestos polifenólicos tienen efectos beneficiosos sobre la salud y sobre la calidad de los
alimentos que los contienen, siendo responsables de algunas propiedades sensoriales como color
y sabor (García, Fernández, & Fuentes, 2015). Las frutas y verduras contienen micronutrientes
esenciales tales como minerales, fibras y vitaminas, estos aportan varios componentes
metabólicos secundarios de naturaleza fenólica llamados polifenoles. Estos presentan gran
capacidad para captar radicales libres causantes del estrés oxidativo, justificando muchos de sus
beneficios previniendo la generación de enfermedades crónicas degenerativas (Kuskoski, Asuero,
& Troncoso, 2005).

Este método se utiliza para medir compuestos fenólicos totales en compuestos vegetales. Se basa
en que los compuestos fenólicos reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu, a pH básico,
determinándola espectrofotométricamente a 765 nm siendo este un máximo de absorción, cuando
se reduce por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso, cuya intensidad
es la que se mide para evaluar el contenido el contenido en polifenoles. Las lecturas de este
ensayo se cuantifican en base a una curva de calibración con un patrón de ácido gálico. (Isaza,
Veloza, Guevara, Ávila, & Díaz, 2005)

Este método puede padecer numerosas variaciones, principalmente en los volúmenes utilizados
de la muestra a analizar, concentración de reactivos y tiempo de reacción.
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Para el ajuste del modelo se obtendrá coeficiente de determinación R2, error porcentual promedio
(%E) y raíz cuadrada del error medio cuadrático (RMSE), utilizaran las siguientes ecuaciones:

Ecuación 1

Ecuación 2

Dónde:

Ccal: valor calculado

Cexp: valor experimental

n: número de determinaciones.

Un buen ajuste es indicado por R2 >85, E % < 10 % y valores pequeños de RMSE indicando que
los valores del pronóstico son muy aproximados a los valores reales, valores grandes significan
que existen grandes errores en el pronóstico. En este estudio se aceptan RSME < 0.3. (Cerón,
Osorio, & Garcés, 2016)
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4. MATERIALES Y MÉTODOS

Tabla 1. Materiales, equipos y reactivos

MATERIALES EQUIPOS REACTIVOS

Beakers de 50 mL
Balón aforado de 25 mL
Balón aforado de 25 mL
Balones aforados de 10 mL
Micropipeta 100-1000 µL
Celdas de vidrio
Fuente: este estudio
Balanza analítica OHAUS Ácido gálico anhidro
Espectrofotómetro Genesis 10
UV-Vis Scanning Thermo Agua destilada
Fisher Scientific
Ultrasonido Fisherbrand ®
Carbonato de sodio 99%
FB11205
Reactivo de Folin-Ciocalteu

5. PROCEDIMIENTO
5.1. Curva de calibración
5.1.1. Preparar los materiales y reactivos que se usaran en la curva de calibración,
nombrados en el ítem 4.
5.1.2. Preparar una solución madre de ácido gálico a una concentración de 1000 ppm
(1 mg/mL), pesando 250 mg de ácido gálico anhidro, diluyendo con una tercera
parte de agua destilada, sonificar (f =37 Hz, P =50% y t =10 min) y finalmente
terminar de aforar en un balón de 250 mL.
5.1.3. Preparar solución de carbonato de sodio (Na2CO3) al 20 % P/V, pesando 5 g y
diluyendo con una tercera parte de agua destilada, sonificar (f = 37 Hz, P = 60% y
t = 20 min) y finalmente terminar de aforar en un balón de 25 mL.
5.1.4. Dejar reposar la solución de carbonato por 5 minutos.
5.1.5. Preparar las diluciones a partir de la solución madre de ácido gálico con la
ecuación 3, obteniendo el volumen para cada concentración de 25, 50, 100, 150, 250
y 500 ppm

= .3
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Donde:

C1= concentración de la solución madre de ácido gálico

V1= volumen que se debe tomar de la solución madre de ácido gálico
C2= concentraciones diluidas de ácido gálico (25, 50, 100, 150, 250 y 500 ppm)
V2= volumen total en el balón aforado de 10 ml
Ejemplo para el desarrollo de la tabla 2:

2 ∗ 2 25[ ] ∗ 10 [ ]
= = = 0,25
1 1000 [ ]

Tabla 2. Calculo de concentraciones diluidas de ácido gálico

C1: Solución madre V1: Volumen a tomar C2: Diluciones de V2: Volumen total en
de ácido gálico [ppm] de ácido gálico (mL) ácido gálico [ppm] el balón aforado (mL)
1000 0,25 25 10
1000 0,5 50 10
1000 1 100 10
1000 1,5 150 10
1000 2,5 250 10
1000 5 500 10
Fuente: este estudio

5.1.6. Agitar las diluciones de ácido gálico.

5.1.7. Preparación de la reacción, tomar los balones de acuerdo a cada concentración y
adicionar en orden 0,1 mL de la solución a analizar (en este caso las diluciones de
ácido gálico); 0,5 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu, 1,5 mL de carbonato de sodio
(Na2CO3) al 20% P/V y aforar con agua destilada en el balón de 10 mL.
5.1.8. Agitar cada una de las soluciones.
5.1.9. Dejar reposar las soluciones por 2 horas en la oscuridad.
5.1.10. Encender el Espectrofotómetro Genesis 10 UV-Vis Scanning Thermo Fisher
Scientific
5.1.11. Para analizar la muestra de debe seleccionar una longitud de onda a 765 nm en el
espectrofotómetro. Verificar que este en absorbancia
5.1.12. Poner agua destilada en la cubeta y celda respectiva, hacer la lectura
correspondiente presionando “Medir blanco”
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5.1.13. Agitar la muestra antes de adicionar a las cubetas

5.1.14. Tomar tres cubetas para la medición de cada muestra y adicionar la cantidad
necesaria, aproximadamente 3 mL
5.1.15. Incorporar las cubetas en cada celda y hacer la lectura respectiva, para cada
concentración a analizar.
5.1.16. Los datos de la curva que se obtuvieron fueron

Tabla 3. Resultados de la prueba de Folin Ciocalteu con patrones de ácido galico

A. Bondad del
gálico Absa 1 Abs 2 Abs 3 Promedio DE b C
CV ajuste
ppm RMSE E%
25 0,048 0,049 0,048 0,048 0 1,194 0,008 7,118
50 0,111 0,108 0,109 0,109 0,001 1,397 0,003 1,223
100 0,158 0,156 0,16 0,158 0,002 1,265 0,003 0,843
150 0,243 0,239 0,24 0,241 0,002 0,864 0,004 0,691
250 0,373 0,369 0,371 0,371 0,002 0,539 0,004 0,449
500 0,667 0,669 0,669 0,668 0,001 0,172 0,007 0,449
a: absorbancia; b: Desviación estándar; c: Coeficiente de variación
Fuente: este estudio
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5.1.17. Se construye una curva de calibración como lo muestra la gráfica 1, para

determinar fenoles totales en celda expresados como mg de ácido gálico/ L de
extracto

Grafica 1. Curva de calibración para la determinación de fenoles totales.

0,800
0,668
0,700

0,600
Absorbancia 765 nm

0,500
0,371
0,400
y = 0,0013x + 0,036
0,300 0,241 R² = 0,9963
0,200 0,158
0,109
0,100 0,048

0,000
0 100 200 300 400 500 600
ppm de ácido gálico

5.1.18. Para calcular la concentración, expresado en ppm de ácido gálico se aplica la

ecuación 4

Y= 0,0013X + 0,036 Ec.4

Donde:

Y= absorbancia de la muestra
m=0,0013 = valor de la pendiente
X= ppm de ácido gálico
b=0,036= valor del intercepto

5.1.19. De la ecuación 2 se despeja X, es decir ppm de ácido gálico:

− 0,036
= .5
0,0013
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Bibliografía
Cerón, A., Osorio, O., & Garcés, L. (2016). Procesamiento de Arvejas (Pisum sativum L.). Parte
2: Cinética de Absorción de Agua en Semillas de Arveja, variedad San Isidro y Sureña.
Información Tecnológica, 81-90.

García, E., Fernández, I., & Fuentes, A. (2015). Determinación de polifenoles totales por el
método de Folin-Ciocalteu. Universidad Politécnica de Valencia , 2-8.

Isaza, J., Veloza, L., Guevara, C., Ávila, Y., & Díaz, O. (2005). Estimación espectrofotométrica
de fenoles totales en especies de la familia melastomataceae. Actualidades Biológicas, 75-
79.

Jimenez, J. P., & Villarreal, J. H. (2008). Estudio quimico de pigmentos tipo antocianina presente
en el fruto del motilon (Hyeronima macrocarpa). Universidad de Nariño, 26-48.

Kuskoski, M., Asuero, A., & Troncoso, A. (2005). Aplicación de diversos métodos quimicos para
determinar actividad antioxidante en pulpa de frutas . Ciencia Tecnologia de Alimentos,
726-732.
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Anexo 1. Procedimiento para la determinación de fenoles totales

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HISTORIA DE CAMBIOS

EDICIÓN FECHA RESUMEN DE CAMBIOS ELABORADO POR

Roxana Benavides G –
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ELABORADO POR REVISADO POR APROBADO POR

Roxana Benavides G - MS.c Andrés Cerón Cárdenas MS.c Diego Fernando Mejía
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