Las Biomoléculas

“La participación del agua”

El nombre de biomoléculas se les da a aquellas moléculas que existen en los organismos vivos.
Si se estudian las biomoléculas y se analizan qué tipo de elementos químicos contienen, se
encuentra lo siguiente:
 Elementos que son mayoritarios y que forman la mayor cantidad de la masa en una célula.
Son los elementos que forman parte de los compuestos orgánicos: H, Na (como ión
monovalente), K, Ca (como ión bivalente), C, N, O, P, S, Cl.
 Elementos traza: algunos los usan todos los organismos vivos (por ejemplo, Mg+2), en
cambio otros son menos comunes (por ejemplo Mo y V).
 Elementos químicos que existen, pero que ningún organismo vivo los usa porque tienen
características químicas que no sirven.

Grupos funcionales:
¿Cuál es la importancia de los grupos funcionales en una molécula? Aumentan la reactividad y
además, le entregan a la molécula las características de solubilidad, al asociarse, etc.
¿Cuáles son los grupos funcionales?
 Hidroxilo.
 Aldehído: está formado por un grupo carbonilo y un hidrógeno unido al carbono.
 Cetona: grupo carbonilo entre dos carbonos.
 Carboxilo: también llamado carboxilato cuando está como anión; formado por un grupo
ácido carboxílico. En ambiente acuoso se desprotona, lo que aumenta la concentración de
protones en el agua, generándose un pH ácido.
  Amino: es un grupo básico, porque el nitrógeno tiene electrones no enlazantes, por lo que
puede aceptar protones del agua (se protona), bajando la concentración de protones
libres (pH alcalino). Son grupos que pueden generar cargas positivas en una biomolécula
 Amida: no es básica y es el grupo de los enlaces peptídicos de las proteínas. Cuando se
hidroliza una amida, se forma una amina y un ácido carboxílico.
 Éster: cuando se hidroliza se forman un alcohol y un ácido carboxílico (cuando se adiciona
agua).
 Éter: formado por un oxígeno entre dos carbonos.
 Thioester: el término “thio” dice que el compuesto contiene azufre. Es similar al éster,
pero en una posición, en vez de oxígeno, contiene azufre.
 Sulfhidrilo: es parecido a un hidroxilo, pero tiene azufre en vez de oxígeno. También se
conoce como “tiol” y es importante en proteínas.
 Disulfuro: se forma cuando reaccionan dos grupos sulfhidrilo reaccionan entre sí.
 Anhídrido: se forma cuando dos grupos funcionales de ácido reaccionan entre sí y se
elimina agua.

Grupos funcionales de una biomolécula:

La coenzima A es un portador de grupos acilo (acetilo: ácido acético con su grupo carbonilo).
En la imagen se puede ver la estructura tridimensional de la biomolécula, destacándose en color
amarillo el azufre.
 Una misma biomolécula, puede estar constituida por diferentes grupos funcionales. Esta es
una característica muy importante y se puede apreciar en la imagen: thioester, amida, hidroxilo,
anhídrido de ácido fosfórico, amina.

La importancia de la estereoquímica:
Se habla de estereoquímica cuando hay una situación de asimetría. En la imagen, la asimetría
se observa en el carbono destacado con rojo, porque tiene unidos cuatro grupos diferentes entre
sí; por lo tanto, un carbono asimétrico puede existir en dos diferentes configuraciones.
En el esquema se muestra el aspartano (edulcorante) con sus dos configuraciones. En la
primera contiene L-fenilalanina (dulce), mientras que la otra tiene D-fenilalanina (amargo).
 El (S)-Citalopram tiene un efecto terapéutico como antidepresivo, el otro estereoisómero, (R) -
Citalopram, no tiene el mismo efecto.

Clasificación de las biomoléculas:

 Agua.
 Proteínas (muy a menudo son las biomoléculas más abundantes).
 Ácido nucleicos (DNA y RNA).
 Polisacáridos. Lo que predomina en una célula son macromoléculas.
 Lípidos.
 Subunidades monoméricas e intermediarios.
 Iones inorgánicos.

Organización de las moléculas en una célula:

En una célula las macromoléculas están asociadas entre sí y hay una organización.
  Núcleo: existen complejos supramoleculares (asociación de diferentes tipos de moléculas),
que corresponden a los cromosomas. Éstos están formados por DNA asociado con
proteínas (histonas).
 Membrana plasmática: bicapa lipídica, es decir, formada por lípidos asociados entre sí en
forma ordenada y proteínas.
 Pared celular: formada por la asociación de moléculas de celulosa (formada sólo por
glucosa).

Componentes de las biomoléculas:

Los ácidos nucleicos están formados por bases nitrogenadas (uracilo, timina, citosina, adenina
y guanina), además de monosacáridos (ribosa y deoxiribosa) y ácido fosfórico. En el caso de los
lípidos, la diversidad estructural que existe es muy grande, pero muchos de ellos contienen ácidos
grasos (por ejemplo, ácido oleico y ácido pamítico. Ambos son ácidos carboxílicos de cadena
larga), glicerol, colina (amino-alcohol) y ácido fosfórico.

LÍPIDOS.

Triacilgliceroles (conocidos como triglicéridos por los médicos),

son ésteres de glicerol con ácidos grasos. Son los lípidos más
abundantes y mayoritarios de grasas y aceites.
Dentro de los grupos importantes de lípidos se destacan:
 Lípidos de reserva: triacligliceroles.
 Lípidos de membrana: forman la bicapa lipídica.

CARBOHIDRATOS.
Clasificación:
 Monosacáridos.
  Oligosacáridos: disacáridos, oligosacáridos, tetrasacáridos, etc. El término “oligo” se usa
para hacer referencia a una molécula que tiene más de una unidad, sin precisar cuántas
son. Es importante saber que sólo disacáridos son abundantes en forma libre.
 Polisacáridos: contienen más de 20 unidades.

Para los monosacáridos hay dos familias, que son: aldosas y cetosas.
 Aldosas: tienen el grupo funcional aldehído
 Cetosas: tienen un grupo funcional carbonilo de cetona y, además, muchos hidroxilos.

En la primera imagen, aparece una D-glucosa (aldohexosa) y una D-fructosa (cetohexosa).

En la segunda, se observan las pentosas contenidas en el DNA y RNA: ribosa (aldopentosa) y 2-
deoxiribosa (aldopentosa).

Formas cíclicas de la glucosa:

Los monosacáridos ciclizan en

ambiente acuoso. En la imagen se
observa la estructura no cíclica de
la glucosa, que corresponde a su
estado sólido; sin embargo, al ser
disuelta en agua se produce una
reacción entre el hidroxilo y el
grupo funcional aldehído,
formándose un grupo funcional
llamado hemiacetal (estructura
cíclica).
En relación al carbono, pueden
existir dos situaciones diferentes
(el hidroxilo del carbono puede
esta hacia abajo y el protón hacia
arriba o viceversa  son dos
formas isoméricas); se habla entonces de los anómeros.
Si tenemos un disacárido y se hidroliza, en la hidrólisis se forma directamente uno de los dos
produciéndose en la solución un fenómeno conocido como la mutarotación (interconversión de
los dos anómeros entre sí), formándose rápidamente el otro anómero.
Si se estudia la glucosa en solución, los resultados arrojan lo siguiente:
 Anómero α: 37% (α-D-Glucopiranosa).
 Anómero β: 63% (β-D-Glucopiranosa).

Cuando la forma cíclica de un monosacárido tiene un ciclo de 6 miembros, se habla de una

piranosa, mientras que un ciclo de 5 miembros corresponde a una furanosa (son más estables).

GLUCOPIRANOSA: grupo funcional hemiacetal en C-1.

FRUCTOFURANOSA: grupo funcional hemicetal en C-2.

Abreviaturas para monosacáridos:

Formación de un enlace glicosídico:
Los monosacáridos se unen entre sí a
través de enlaces glicosídicos,
formándose oligosacáridos y
polisacáridos. Durante la formación del
enlace, en la molécula de glucosa
reacciona el carbono anomérico con su
hidroxilo. Al unirse las dos moléculas de
glucosa se forma el enlace glicosídico,
gracias a un fenómeno conocido como
condensación y que implica la liberación
de una molécula pequeña; casi siempre
es agua. En la imagen, donde se observa
el grupo hemiacetal después de la
formación del enlace, se puede seguir
produciendo mutarotación. El enlace no
siempre es entre los carbonos 1 y 4.
Polisacáridos:

HOMOPOLISACÁRIDO: formados por el

mismo monosacárido.
 Ramificado: glicógeno.
 No ramificado: celulosa.

HETEROPOLISACÁRIDO: formados por

distintos monosacáridos.

Interacciones entre las biomoléculas:

El término interacción se refiere a qué moléculas se pueden asociar, cuando se forman los
complejos supramoleculares (hay atracción); no se produce una reacción química, por lo que no se
forman enlaces covalentes.
La interacción es muy importante porque permite que las moléculas se ordenen y se unan entre sí
en los diferentes procesos que ocurren en la célula.
AGUA.
El agua es una molécula dipolar, porque el oxígeno es
mucho más electronegativo que el hidrógeno; se generan
cargas parciales positivas sobre el hidrógeno, mientras que
en el oxígeno las cargas parciales son negativas.
La formación de los enlaces de hidrógeno, se produce por
una atracción electrostática (atracción entre cargas
opuestas). Los puentes de hidrógeno tienen una distancia
mayor, a diferencia de lo que ocurre en el enlace covalente
que une cada hidrógeno al oxígeno central, por lo tanto, los
enlaces de hidrógeno son
más débiles que los
covalentes.

En estado sólido (forma cristalina), las moléculas de agua

adoptan una forma diferente. Se puede ver en la imagen,
que en la red cristalina las moléculas se ordenan de
forma simétrica, donde cada molécula de agua tiene
cuatro puentes de hidrógeno.
En estado líquido, a pesar de que las moléculas se
mueven, igual tienen gran cantidad de puentes de
hidrógeno. Por molécula de agua líquida el promedio de
estos enlaces es de 3,4.
Producto de la presencia de los puentes de hidrógeno, el
agua tiene un alto punto de ebullición.

Según el tipo de enlace y cargas que presenten, las biomoléculas se pueden clasificar en:
 Polar: (hidrofílico) para que una molécula sea polar basta que tenga cargas parciales, no
necesariamente que forme un dipolo. Son solubles en agua. Por ejemplo: glucosa.
 Apolar: (hidrofóbico) son insolubles en agua (las moléculas del solvente son incapaces de
interaccionar con las moléculas del soluto).
 Anfipáticas: el término “anfi” siempre se utiliza cuando hay algo dual, por lo tanto, las
moléculas anfipáticas tienen una región polar y otra apolar.

Disolución de cloruro de sodio cristalino por agua:

Los iones están ordenados en la red cristalina.

En la imagen se observa cómo las moléculas
de agua rodean los iones Cl- y los solvatan.
Tanto los cationes Na+ como los aniones Cl- son
rodeados por las moléculas de agua de una
manera diferente, debido a la carga.
Puentes de hidrógeno:

Existen diferentes posibilidades en la

formación de los puentes de hidrógeno. No
necesariamente tiene que ser siempre entre
oxígeno e hidrógeno.
El hidrógeno está unido covalentemente a
un átomo electronegativo (O ó N) en el
grupo dador y es atraído por otro átomo electronegativo (O ó N) que es el aceptor.

En los puentes de hidrógeno existe

direccionalidad, entonces para que un
puente sea fuerte tiene que estar alineado:
el átomo al cual está unido el hidrógeno que
hace el puente y el átomo que lo atrae. En
cambio, si existe una orientación diferente,
el puente de hidrógeno se vuelve débil, pues los tres átomos no se alinearon en una recta.

Los enlaces covalentes son mucho más fuertes que las interacciones no
covalentes. En cuanto a la energía de disociación:
 Enlace covalente C-C: 348 kJ/mol
 Puente de H entre moléculas de agua líquida: 20 kJ/mol
 Enlace de Van der Waals típico: 4 kJ/mol

Interacciones entre biomoléculas en solvente acuoso:

 Puentes de hidrógeno.
 Interacciones iónicas: se atraen cargas positivas y negativas (enlace iónico).
 Interacciones hidrofóbicas: grupos que no pueden interaccionar con el agua se agrupan.
 Interacciones de Van der Waals: se forma por cercanía entre átomos.

Formación de micelas:
Los lípidos corresponden a aniones de ácidos grasos. Están constituidos por una cabeza
(hidrofílica) de ácido carboxílico y una cola (hidrofóbica) sólo con CH2 y un grupo metilo final.
Si los lípidos permanecen en el agua de manera individual, la situación se vuelve inestable.
Por esta razón se agrupan, uniéndose todas las colas apolares entre sí para formar las micelas.
 En la imagen se observa cómo una
molécula de substrato, que es un
compuesto químico, cuya reacción cataliza
la enzima se une a ésta última. Esta unión
ocurre por interacciones débiles y, en
general, cuando interaccionan las
biomoléculas hay una suma de
interacciones débiles y eso estabiliza al
complejo enzima-sustrato.

AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS

Las proteínas son un grupo de biomoléculas muy importantes. Ya vimos en la clase pasada que
muy a menudo el peso seco mayoritario de la célula son proteínas. Además las proteínas son
importantes porque cumplen múltiples funciones, son muy versátiles y nosotros podemos
clasificar a las proteínas según su función en:
1. Enzimas: proteínas que tienen por función catalizar reacciones.
2. Proteínas de Transporte: Transporte en la sangre. Hemoglobina (transporte de oxígeno) y
Albúmina (transporta ácidos grasos, metabolitos, drogas, medicamentos, etc.) También las
proteínas de transporte en membrana que permiten el paso de sustancias.
3. Proteínas de Almacenamiento o reserva: proteínas de semillas: algunas semillas son ricas
en proteínas y cuando brota la semilla la proteína es degradada en aminoácidos. Ej.
Leguminosa. La proteína del huevo, ovoalbúmina, que se encuentra en la clara del huevo.
4. Proteínas Contráctiles o motrices: El movimiento en gral de un animal o bacteria se
genera por contracción. En el músculo están la actina y miosina que son proteínas
contráctiles.
5. Proteínas Estructurales: colágeno en los huesos (matriz de colágeno con sales de calcio) y
en la piel; elastina en ligamentos; y alfa-queratina en el pelo.
6. Proteínas de defensa: anticuerpos
7. Proteínas regulatorias: Como hormonas: insulina, hormona de crecimiento; y proteínas
represoras de la transcripción.
LOS AMINOÁCIDOS
Las proteínas están formadas por aminoácidos. El nombre
aminoácido indica que este compuesto tiene un grupo funcional
amino y un grupo funcional ácido carboxílico. Los aminoácidos que
forman las proteínas son alfa-aminoácidos. Existe una
nomenclatura en relación a los ácidos carboxílicos y compuestos
relacionados en que el carbono continuo al grupo funcional es el
carbono alfa o carbono asimétrico (que está en medio del grupo
amino). Este carbono está unido a un Hidrógeno y además tiene un
grupo R o cadena lateral que es la variable, lo demás es igual para
todos. Se le llama carbono asimétrico porque es asimétrico
siempre cuando R no sea igual a un protón, porque existe un
aminoácido que se llama Glicina y que el grupo R corresponde a un
protón; entonces aquí no es carbono asimétrico.
Hay diferentes formas de escribir compuestos
orgánicos: está la forma zwitterionic y la forma no
iónica; pero los aminoácidos en solución acuosa
están mayoritariamente en forma iónica, en que
el ácido carboxílico se desprotonó y el grupo alfa
amino protonado (que es característica básica del
grupo amino). Esta forma se denomina
zwitterionic o bipolar porque hay 2 cargas puestas
en la misma estructura. Está correcto escribirlo de
cualquiera de las dos formas, pero si se
trata de solución acuosa debería
escribirse en forma zwitterionic.
ESTEREOQUÍMICA.
La Alanina es un aminoácido muy común
y tiene un grupo metilo. Para el carbono
asimétrico hay dos configuraciones
posibles: L-Alanina y D-Alanina, pero en
proteínas sólo se encuentra el isómero
“L” de los diferentes aminoácidos, nunca
isómero “D”. El carbono tetraédrico del
aminoácido tiene dos enlaces hacia adelante
(amina y H) y dos enlaces hacia atrás (ác.
Carboxílico y grupo R).
Cuando el grupo amino está hacia la derecha es
isómero D y cuando está hacia la izquierda es
isómero “L”. Por convención, los enlaces
verticales indican que la molécula va hacia adelante y los horizontales que la molécula va hacia
atrás (Proyecciones de Fisher).

ABREVIATURAS
Existen abreviaturas de 3 letras para nombrar los aminoácidos. Ej. Alanina = Ala; pero además
existen símbolos de 1 sola letra para escribir de forma más compacta. Ej. Alanina = A; Glicina = G,
etc.

AMINOÁCIDOS COMUNES O ESTÁNDAR

Existen 20 aminoácidos diferentes que usan todos los organismos vivos para construir sus
diferentes proteínas, y para cada uno de ellos existe un código y se clasifican según las
características del grupo R o cadena lateral, que veremos a continuación:
1. AMINOÁCIDOS CON GRUPO R APOLAR Y ALIFÁTICO.

Estos son no aromáticos.

Lo rosado es la cadena
lateral o grupo R y lo que
está sin color
corresponde a la
estructura común de
todos los aminoácidos.
¿Cómo podemos saber
que son apolares?
ODONTO: Porque no
tienen carga ni grupos
funcionales. PROFE: sí…
pero más preciso.
ODONTO: los
heteroátomos. PROFE:
exactamente,
heteroátomos como
oxígeno, hidrógeno. Si hubiera un OH eso sería un indicio de polaridad, porque aunque no es
una carga propiamente tal, sí es una carga parcial: que no se escribe, pero existe.

 Glicina: evidentemente aquí no hay nada de carga parcial.

 Alanina: Tampoco tiene carga parcial y su grupo R es un metilo.
 Prolina: es un aa bien importante porque es el único que tiene el grupo alfa-amino unido a
la cadena lateral (por lo tanto, forma un ciclo). Eso es importante porque habiendo un
ciclo se pierde la posibilidad de rotación, es más rígido este enlace.
 Valina: la cadena lateral tiene 3 carbonos.
 Leucina: cadena lateral de 4 carbonos.
  Isoleucina: tiene una cadena lateral isomérica. Al igual que la Leucina tiene 4 carbonos,
pero la ramificación se encuentra en otro carbono (Leucina en tercer carbono; isoleucina
en el segundo carbono).
 Metionina: es el único de este grupo que tiene un heteroátomo: azufre. Pero este es un
grupo funcional llamado THIOETER.

Además, estas cadenas apolares en el ambiente de la célula (ambiente acuoso) tienen un

comportamiento hidrofóbico. Y a menudo existe una pregunta frecuente: ¿cuál es el aminoácido
más apolar? Al principio esta pregunta es un poco “rara” porque todos son apolares, pero en
realidad son diferentes respecto al efecto hidrofóbico. Sólo un grupo grande tiene un efecto
hidrofóbico pronunciado. Entonces Leucina e Isoleucina serían los indicados tienen las cargas más
grandes, más voluminosas (no entendí si son o no los aa más apolares de este grupo :S).

2. AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS.
 Fenilalanina: tiene grupo un grupo fenilo
sobre un metilo.
 Tirosina: Tiene unido un anillo fenolico.
 Triptófano: es el aa más grande de todos los
aa comunes porque tiene mayor peso molecular.
En las características son diferentes. Fenilalanina es
de cadena lateral apolar y Tirosina no porque
interacciona con el agua. Tirosina, interesantemente,
puede perder el protón del grupo OH, es levemente
ácido este protón, porque cuando se desprende el protón la carga negativa queda como
deslocalizada. Entonces tirosina es hidrofílica. Triptófano tiene una región más apolar pero
puede formar puentes de hidrógeno. Lo interesante del Tiptófano es que es el aminoácido
que absorbe más fuertemente la luz UV. Todos estos aa absorben luz UV a través de su
cadena lateral, pero Triptófano absorbe mayor longitud de onda de luz UV.
3. AMINOÁCIDOS DE GRUPO R POLAR, NO CARGADO.

 Serina y Treonina: siempre se nombran juntos

porque tienen características muy parecidas. Contienen
hidroxilo.
 Cisteína: Tiene un grupo Sulfhidrilo. Existen 2
que tienen azufre: treonina y cisteína. La cisteína además
es súper importante porque puede formar enlaces
covalentes. **Este aa uno debería conocerlo por el
nombre. No se tiene que aprender toda la estructura de
los aa, pero de la cisteína sí.
 Asparagina y Glutamina: tienen grupo funcional
amida en su cadena lateral.
 En general, como estos aa tienen grupos polares, son hidrofílicos y van a formar puentes
de hidrógeno con el agua. En una proteína van a permitir que las proteínas puedan
interaccionar con el solvente agua. Además, hay algo súper importante: serina, treonina y
tirosina (que está en el grupo anterior) pueden estar fosforiladas, tener grupos fosfatos
unidos a proteínas. Además, serina, treonina y asparagina, la cadena lateral pueden
formar enlaces covalentes a carbohidratos (azúcares).
4. AMINOÁCIDOS BÁSICOS.
Tienen una carga positiva en la cadena lateral o
grupo R. Esto es a PH 7.
 Lisina: tiene un grupo amino en la cadena
lateral que está unido a un carbono épsilon.
Entonces, a PH 7 tiene dos cargas positivas locales
y una carga negativa.
 Arginina: en la cadena lateral no tiene
hidróxidos, es un grupo de tito guanidinia y a pH 7
tiene carga positiva.
 Histidina: No se ve la carga en la imagen,
pero esto no es un error, sino que así es como está
es la forma mayoritaria a pH 7. Si el pH fuera un
poco más ácido aparecería la carga, porque este grupo puede aceptar protones pero no es tan
básico como los otros, pero sí tiene capacidad de protonarse.
5. AMINOÁCIDOS ÁCIDOS

Tienen una carga negativa en la cadena lateral.

 Aspartato: o ácido aspártico.

 Glutamato: o ácido glutámino.

Estos dos tienen un parecido con la asparagina y la

glutamina. La diferencia entre glutamina y glutamato
es que la glutamina tiene un grupo NH2 (amida)
unido al ácido carboxílico que le permite reaccionar
con amoníaco (¿?)
FORMACIÓN DE UN PUENTE DISULFURO
Volviendo al tema de la
cisteína, aquí vemos que
las cadenas laterales de las
cisteínas forman puentes
disulfuros (entre los dos
azufres). Cuando dos
sulfhidrilos de cisteínas
reaccionan entre sí y
forman un puente
disulfuro, esto es una
reacción de óxido
reducción, pero los
electrones no pueden
quedar flotando. Entonces,
estas cadenas laterales se está oxidando o reduciendo?, ¿qué es una reacción redox en general?
ODONTO: Reacción en la que hay un intercambio de electrones. PROFE: sí, y también se habla de
un agente oxidante y un agente reductor: uno se oxida y el otro se reduce. Entonces, cuando un
compuesto se oxida ¿qué pasa con los electrones para ese compuesto? Cede electrones y cuando
se reduce acepta electrones del otro compuesto. Entonces, en este sentido, a los grupos
sulfhídricos ¿qué les pasa? Se oxidan. Esto es un proceso de oxidación de las cadenas laterales
(están entregando electrones), por lo que debe haber algún compuesto químico que capta los
electrones que puede ser el oxígeno gaseoso o molecular que es un agente oxidante bastante
bueno; y el azufre pasa a tener otro estado de oxidación. En cambio, se necesita un agente de tipo
reductor para romper un puente disulfuro, que es un enlace covalente en las cadenas laterales de
aa comunes. Es el único tipo de enlace de tipo covalente que se puede formar en las cadenas
laterales de aa comunes. Por eso es importante la cisteína porque es la única de los aa comunes
puede formar enlaces covalentes. Existen otros aa que también pueden formar enlaces covalentes
pero no son aa comunes.
“Estos enlaces desempeñan un papel importante en la estructura de muchas proteínas puesto que
forman uniones covalentes entre partes de una molécula de proteína o entre dos cadenas proteicas
diferentes.” (Libro Lehninger).

AMINOÁCIDOS NO ESTÁNDAR O MODIFICADOS

Existen también en proteínas aminoácidos no estándar o no comunes y su nombre es aminoácidos
modificados. Uno de ellos es la 4-Hidroxiprolina.
  4-Hidroxiprolina: Se destaca en rojo el Hidroxilo porque dentro de los aminoácidos
comunes existe uno que se llama prolina, recuerdan? Entonces este aa es igual que la
prolina pero tiene un hidroxilo en el carbono 4.
 5-hidroxi lisina: Igual que la lisina pero en el carbono 5 tiene un hidroxilo.
 6-N-Metil lisina: Otro derivado de la lisina, pero en éste el Nitrógeno del grupo amino está
sobre el carbono y en el carbono 6 hay un metilo.
 Gamma-Carboxyglutamato: es un aa que tiene 3 grupos funcionales de ácido carboxílico.
Para estos 4 de arriba, ¿cuál es la diferencia entre los aa comunes y los estándar? La
diferencia es que para los aa no estándar no existe un código en el código genético, no
están codificados, sino que la proteína que contiene uno de estos aa primero se sintetiza
la cadena polipeptídica con uno de los aa comunes y después de sintetizada la cadena
polipeptídica se hace una modificación post-traduccional en la que una enzima cataliza la
introducción del hidroxilo en este carbono. Así entonces se da origen al aa modificado.
**Un ejemplo interesante es el colágeno que es rico en aa modificados**

PROPIEDADES ÁCIDO-BASE DE LOS AMINOÁCIDOS.

Ya vimos que los aa se pueden escribir de dos formas, pero la zwitterionic es la forma mayoritaria
a pH 7. Hay que recordar que el pH describe la concentración de protones libres en solución y que
el pH 7 es la concentración de protones libres X-7 molar. Los pH bajos son los pH ácidos.
El grupo Ac. Carboxílico es ácido y el grupo alfa amino es básico. Hay que recordar que existen
constantes que definen que tan ácido o que tan básico es un grupo de un ácido débil. Los ácidos
fuertes son aquellos que se disocian completamente en solución acuosa, como el ac. Clorhídrico,
uno nunca encuentra una molécula (de ácido?) unida al Cl en la solución, hay sólo protones a nivel
del cloruro. El ácido acético es el ejemplo clásico de un ácido débil, esto significa que hay un
equilibrio químico en solución acuosa, en que coexiste el ac. Acético con el ión acetato y el protón
ácido, obviamente los otros protones no son para nada ácidos.
¿Cuán débil es un acido débil? Eso se describe a través de su constante de acidez, que se define
como: el Ka de un acido débil es la concentración de protones por la concentración de acetato,
dividido por la concentración de
la especie protonada.
Entonces cada acido débil tiene
una constante de acidez para su
protón acídico. Esta constante de
acidez debe ser alta para que el acido sea más fuerte dentro de lo débil, porque predominan el
anión y los protones libres frente a la concentración de lo que no se desprotonó.
También se utiliza el pka, en donde uno toma el logaritmo a la constante de acidez y le cambia el
signo, entonces si la constante de acidez es 10 -8, el pka sería 8.
ECUACIÓN DE HENDERSON HASSELBACH
En esta ecuación figura el pKa, se utiliza
para calcular el pH de soluciones buffer.
A menor pKa (o sea a mayor Ka) indica
mayor acidez (acido mas fuerte).
Esta ecuación permite visualizar algo
muy interesante, si uno se imagina que
tiene una cadena lateral de una
proteína, y esa proteína está en un
ambiente dentro de la célula con
determinado pH, y este pH fuera igual al
pKa de un grupo acido débil, que está en
la cadena, ¿entonces qué pasaría? ¿si el
pH es igual a pKa? El log [A-]/[HA] tiene
que ser 0, y para que sea 0, el numerador y el denominador deben ser iguales ([A-] y [HA]).
Si el pH es igual pKa de un grupo funcional de características ácidas, indica que la mitad de las
moléculas estarán protonadas y la otra mitad estarán como anión.
Conocer el pKa nos permite conocer el estado de desprotonación. Si el pH es mayor que el pKa,
por ejemplo, si el pH es 7 y el pKa es 6, el log [A-]/[HA] debe aporta 1, y ¿log de qué da 1? 10,
entonces en estas condiciones hay 10 veces más concentración del anión que esta otra especie
protonada. Si el pH es 2 unidades mayor que el pKa va a haber 100 veces más de la especie no
protonada que de la protonada.
Si el pH es más bajo (mayor concentración de protones) que el pKa, predomina la especie
protonada.
EJEMPLOS DE PKA
Aquí hay ejemplos de diferentes ácidos y tenemos una escala de pH.
El acido
acético
tiene un
pKa de
4,76, en la
figura está
sobre el
pH 4,76
para
simbolizar
a que en el
pH 4,76 la
mitad del
acido
acético,
está como
ac. Acético
y la otra mitad como ion acetato. En cambio para ac. Carbónico (H2CO3), el pKa es 3,77, es más
ácido, entonces ya a pH 3,77 este equilibrio químico del primer protón está a mitad de camino,
entonces ahí se forma bicarbonato.
(Cote pregunta: Ahí se toma el pKa igual que pH? No, el pKa es una característica del compuesto
químico, y si el compuesto químico tiene diferentes grupos, tiene características en particular,
entonces un pKa es característico del compuesto y del grupo en particular, mientras que el pH es
lo que tiene el medio acuoso.)
En el caso del amoniaco (NH3)
es una base, pero aquí lo que
se da es la constante de acidez
(Ka) del amonio (NH4), y el pKa
correspondientes es 9,25, y ahí
tenemos el equilibrio químico.
Para el acido fosfórico el
primer protón es bastante
fuerte con un pKa de 2,14, el
segundo protón tiene un pKa
parecido a 7, es por eso se
usan tampones fosfatos para
generar pH 7 y el tercer protón
es mucho más débil con un pKa
de 12,4.
En la glicina, este aa. es el único que no tiene un carbono asimétrico, primero vemos que hay 3
diferentes especies iónicas de la glicina, y dependiendo del pH es que hay más de una y menos de
otra. La primera especie va a ser mayoritaria a un pH muy ácido, porque tiene el grupo acido
carboxílico protonado, y también el grupo alfa amino protonado.
Cuando el pH no es tan acido, aparece la especie zwitterionic, de ion bipolar, la mayoritaria a pH 7.
Cuando el pH es más básico aparece la tercera especie, en que está desprotonado el ac.
Carboxílico y también desprotonado el grupo alfa amino.

Para cada especie, se puede calcular la carga neta, que es la resultante de la sumatoria de las
cargas parciales. La carga neta de la primera especie (la más acida) sería de 1, en la segunda 0 y en
la tercera -1.

¿Cuál será el pH al cual predomina la especie

de carga neta y además la concentración de la
especie de carga neta +1 sea igual a la
concentración de la especie de carga neta -1?
Entonces si uno hace una sumatoria,
multiplicando las concentraciones por las cargas, restando y sumando llegaría a una carga igual a
0.
PUNTO ISOELÉCTRICO
Definición: PH al cual la carga
neta de un aa. es 0. También el
punto isoeléctrico está definido
para péptidos y proteínas,
siendo la especie mayoritaria
quien tiene la carga igual a 0.
Curva de titulación de glicina
Aquí se muestra que es lo que
pasa al ir titulando o sea
agregando de a poco una base
fuerte, que puede ser hidróxido
de sodio, se parte con glicina a
un pH muy acido, y después se
va agregando el hidróxido de
sodio y se va midiendo el pH, en
eso consiste el experimento.
Hay zonas en que a pesar de que se está agregando buffer, el pH cambia poco, entonces en esas
zonas nos encontramos con una solución tampón, y cuando se agregó mas hidróxido de sodio se
disparó, o sea el pH cambio mucho, pero en esta otra región nos encontramos con otra zona
tamponante, y cada zona tampón está centrada en la constante de acidez del grupo
correspondiente, aquí en el fondo lo que pasa es que el grupo acídico, el acido carboxílico se
transformando otro grupo y eso es lo que está tamponando el paso de NH3 a NH2.
El punto isoeléctrico en este caso, si uno tiene las 2 constantes, el pK1, la constante de acidez del
ac. Carboxílico, el pk2, la constante de acidez del alfa amino, uno puede calcula el punto
isoeléctrico, ¿Cómo se calcula? En este caso que solo hay 2 constantes involucradas, el pk1, es el
pka1 y esto se usa para la constante de acidez del grupo funcional acido carboxílico del carbono 1,
y el pk2 del aa es el pka del grupo alfa amino protonar, este grupo tiene una Z constante de acidez,
que se está desprotonando, por eso ponen aquí el pk2.
Un grupo amino es un grupo básico, pero no se usan los pKb, que serian – log de una constante de
basicidad, sino que se usan las constantes de acidez del acido conjugado de la base débil. El acido
conjugado es lo que se forma cuando la base débil acepta el protón, NH3 es el acido conjugado del
NH2.
Como se calculó el pI=5,97?, es el promedio entre pK1 y el pK2, se compensan.

Cada proteína tiene un punto isoeléctrico, que es una constante para cada proteína y para cada
péptido. En general tienen punto isoeléctrico las moléculas que tienen características anfotéricas
es decir que pueden tener carga positiva o negativa, de este modo un acido común como el acido
acético no posee punto isoeléctrico pues nunca puede tener carga positiva. El punto isoeléctrico
se puede calcular en algunos casos como el promedio de los pK. Para todos los aminoácidos pK 1
corresponde a la constante de acidez del grupo funcional acido carboxílico y pK2 es la constante de
acidez del grupo alfa-amino protonado.
Curva de titulación del acido glutámico. (á.á
ácido)
Se observa en la imagen que el acido glutámico
presenta cuatro variedades iónicas. La más
protonada es la que tiene en los dos ácidos
carboxílicos el protón puesto y el grupo alfa-
amino esta protonado también (1). Luego
ocurre un primer equilibrio a una constante de
acidez pK1= 2,19, en que se pierde el protón del
grupo acido carboxílico (COOH) del carbono 1,
resultando la segunda especie más acida (2).
Un segundo equilibrio ocurre a un pK=4,25 y se
denomina PkR ya que se desprotona la cadena
lateral o grupo R. Este pK=4,25 es más o menos
cercano al pK del acido acético, ya que el grupo
COOH corresponde a una cadena normal, sin
embargo el COOH del carbono 1 es mucho mas acida (según el pK, a mayor concentración de
protones mas acido).
Es más acido este grupo funcional porque el anión que se forma se estabiliza, con la carga positiva
que es muy cercana (del NH3). La carga positiva y negativa se estabiliza entre ellas haciendo al
grupo funcional más estable. La última desprotonación ocurre en el grupo alfa-amino y se forma la
variante iónica (4).
¿Cómo se calcula el punto isoeléctrico? ¿En qué debemos fijarnos?
Para partir se debe recordar la definición de punto isoeléctrico: es el pH para el cual la carga neta
de un aminoácido es cero. Esta definición se aplica en aminoácidos, péptidos y proteínas. Se habla
de punto isoeléctrico en anfolitos que tienen tanto carga positiva como negativa. Entonces para
calcular el P.I. de un áá debemos poner atención en su carga neta, de este modo la segunda
variante es la que posee carga neta = 0. Entonces cuando el pH es igual a pk 1 la mitad de las
moléculas están como (1) y la otra mitad están desprotonadas (2), del mismo modo cuando el pH
es igual a PkR la mitad de moléculas se encuentra como (2) y la otra mitad como (3), es asi como el
punto isoeléctrico se calcula promediando Pk1 y PkR, despreciando a la 4° especie, ya que a este
pH predomina la especia con carga neta cero (2), sin embargo también habrán especies con carga
neta -1 (1) y +1 (3), pero es prácticamente inexistente la especie (4) ya que la diferencia de
concentración de protones es muy grande para esta especie (cercana al pH 9). Al calcular el punto
isoeléctrico promediando Pk1 y PkR obtenemos un P.I. bajo, esto debido a que es un aminoácido
acido.
“El punto isoeléctrico para un aminoácido ácido es bajo, y para uno básico es alto”

Curva de titulación de Histidina. (Aminoácido básico)

El cálculo del punto isoeléctrico en este 1) 2) 3) 4)

aminoácido, es similar al anterior pero

esta vez se promediará pKR y pK2 ya que la
especie con carga neta cero es la (3), por
lo tanto es esta la que predominara,
equilibrándose con las especies (2) y (4),
esta vez la especie (1) se desprecia por
ser prácticamente inexistente a este pH.
El punto isoeléctrico para un aminoácido
básico (como lisina, arginina e histidina)
se obtiene calculando el promedio de los
dos pK más altos (de los tres pK que se
dan en la ecuación).El punto isoelectrico
para un aminoácido ácido se obtiene
calculando el promedio de los dos pK más
bajos (de los tres pK que se dan en la
ecuación)

Propiedades y convenciones asociadas con los aminoácidos estándar.

En la tabla de más abajo se observan los aminoácidos estándar en sus respectivos grupos, sus
abreviaturas, sus símbolos de una letra, el peso molecular (Glicina el más pequeño, y triptófano el
más grande). Además se presenta el valor de sus respectivos pK. El pK1 es por convención el pK
del acido carboxílico del carbono 1, en general estos valores de pK1 son un poco menores o
mayores a 2, pero siempre muy cercanos a 2. El pK2 que es del grupo alfa amino protonado,
siempre es muy cercano a 9.
Además existe pKR , sin embargo no todos los aminoácidos lo presentan, ya que muchos no tienen
un grupo funcional en la cadena lateral con características acido o base débil, desde este punto los
importantes son los de la parte baja de la tabla: los aminoácidos básicos: Lisina, Histidina (el
menos básico del grupo) y Arginina; los aminoácidos ácidos: Glutamato y Aspartato. Además la
tirosina, que es un aminoácido aromático presenta pKR, ya que posee un grupo fenol cuyo
hidroxilo puede perder su protón, pero es muy débil por eso es un pK mas bien alto. Otro ejemplo
es la cisteína en la cual también puede desprotonarse su grupo R.
También se encuentran todos los puntos isoeléctricos de los aminoácidos junto con el índice de
hidropatía, este último indica cuan hidrofílico o hidrofóbico es el grupo R del aminoácido, es decir
una escala para los grupos R.

¿Qué tipo de
índice de
hidropatía
indica que un
aminoácido
tiene un R
apolar?
Fijándonos en la tabla, nos podemos dar cuenta que los aminoácidos apolares poseen un H.I. en
general positivo, de este modo a mayor valor de H.I mas apolar es el aminoácido, en este caso el
mas apolar del grupo es la isoleucina. Por otro lado son polares todas las cadenas laterales de los
aminoácidos básicos, ácidos y también cuando existen hidroxilos, fenoles, etc. en la cadena lateral.
Por último la columna final de la tabla indica la ocurrencia de los aminoácidos en las proteínas, es
decir que tan abundante son los aminoácidos en las proteínas, siendo el más abundante la
tirosina, y el menos abundante o frecuente el triptófano.
Enlace peptídico .
En las proteínas los aminoácidos se unen entre sí a
través de enlaces peptídicos, en la imagen se
observa la formación de este enlace, mediante la
unión del grupo funcional COOH del carbono 1
con el grupo alfa-amino (unido al carbono
asimétrico), los cuales reaccionan eliminando
agua, y formando el grupo funcional destacado en
gris correspondiente a una amida. Para romper
este enlace se necesita una molécula de agua, es decir mediante hidrólisis, se vuelven a formar los
grupos funcionales COOH y alfa-amino correspondientes a cada aminoácido. Este proceso de
hidrólisis (hacia arriba) es lo que ocurre in vivo, sin embargo el proceso inverso no ocurre de ese
modo, sino que es un RNA el que interviene en la síntesis, entonces uno de los grupos esta unido a
este RNA y no está libre, pero químicamente se representa como en la imagen.
Algo importante del enlace peptídico es que hay una deslocalización del electrón, en la imagen se
observa un enlace peptídico (con su grupo amida) dentro de la cadena unidos a ambos carbonos
alfa (a cada lado). En esta estructura puede uno de los dos pares de electrones de C y O localizarse
sobre el oxigeno formándose asi un enlace simple, entonces este carbono queda con defecto de
electrones y por lo tanto un par de electrones no enlazantes que tiene el N pasan a formar un
enlace doble entre C y N, y el nitrógeno queda con carga positiva formándose la tercera estructura
(derecha), todo esto puede ocurrir luego de manera inversa volviendo a la primera estructura
(izquierda). Se puede concluir que los electrones se encuentran repartidos entre el O y el N y de
esta manera otorgan la característica de parcialidad de doble enlace, ya que no es un enlace
netamente simple o doble. La deslocalización se
explica químicamente
ya que el O al ser mas
E.N. atrae el par de
electrones, dejando al
C con déficit de
electrones, para lo cual
obtiene los electrones
no enlazantes del N.
Esta parcialidad de doble enlace (deslocalización) se explica experimentalmente mediante el
estudio de las distancias en los enlaces, ya que los enlaces dobles generan mayor cercanía entre
los átomos que los enlaces simples, sin embargo en este enlace parcialmente doble, la distancia es
intermedia. Este grupo amida del enlace peptídico nunca se protona, los protones del medio
acuoso nunca se unen ya que en la amida no existen electrones disponibles, ya que son parte del
enlace. El enlace peptídico debido a su hibridación adquiere una arquitectura planar, es decir
todos los átomos alrededor del doble enlace se encuentran en un mismo plano, y no hay libre
rotación alrededor del doble enlace. Es interesante dejar claro que la mayoría de los enlaces
peptídico en las proteínas adquieren una isomería trans, y no cis evitando que la cadena quede
demasiado junta.
Un péptido.
Se define como péptido, una molécula
compuesta por varios aminoácidos
enlazados entre si mediante enlace
peptídico. En los péptidos existe la misma
nomenclatura que los azucares, y así nos
referimos como dipéptido, tripéptido, etc.
Se habla de residuo de un aminoácido a la
parte de este que finalmente conforma la
cadena.En la imagen se puede observar
(de izquierda a derecha) un residuo de
glicina, de tirosina, de leucina, y de alanina. Se habla de residuo, ya que no es el aminoácido
completa, si evaluamos el peso molecular de estos residuos difieren en 18 gramos del aminoácido
completo, por la molécula de agua que se elimina en la formación.
Un péptido tiene dos extremos que no son equivalentes, en la imagen se ve un extremo amino
terminal con su residuo amino-terminal, y el otro extremo es carboxilo terminal con su residuo
carboxilo-terminal. Para el primer extremo (amino terminal) reacciono su grupo acido carboxílico
para formar el enlace peptídico y no reacciono su grupo alfa-amino, en el otro extremo (carboxilo-
terminal) reacciono su extremo alfa-amino dejando libre su grupo acido carboxílico.
Por convención se dice que un péptido o una proteína empiezan con el extremo amino terminal,
y terminan con el extremo carboxilo terminal.
Existe el concepto de secuencia el cual indica en que orden y que residuos están en el péptido o la
proteína, lo cual va mas allá de la composición aminoacídica, ya que existen péptidos con la misma
composición de aminoácidos pero con diferente secuencia, de esta forma se puede calcular
cuantas secuencias distintas se pueden obtener con cierto número de aminoácidos, este cálculo se
realiza de manera factorial (para 2 áa: 2 secuencias distintas, para 3 áa: 6 secuencias, para 4 áa: 24
secuencias, etc.)
De este modo al calcular con factorial el numero de cadenas posibles con los 20 áa esenciales,
llegamos a un numero inmenso, y esto es más aun pensando en las proteínas ya que estas cadenas
poliméricas están constituidas por más que 20 aminoácidos. Además esta regla factorial solo es
válida cuando los áa no se repiten.
Carga neta del péptido.
Los péptidos al igual que los aminoácidos, cambian las cargas locales y netas con el pH. Para este
péptido de la imagen se ha considerado la estructura iónica mayoritaria a pH 7.
Al observar la secuencia el primer residuo (amino
terminal) se encuentra protonado, luego el residuo de
acido glutámico se encuentra desprotonado a pH 7, el
residuo de glicina no tiene en su cadena lateral algo que
se protone o desprotone y finalmente el residuo de
lisina tiene su cadena lateral protonada y su grupo acido
carboxílico desprotonado. Estas son las cargas locales y
la carga neta de la estructura total es cero. Esto no
significa que el P.I. sea 7, ya que puede ser 6,8 o cercano
a 7.

Para péptidos y proteínas el punto isoeléctrico ya no se calcula, mas bien se determina

experimentalmente, se usa un método en el que se somete a un campo eléctrico a la proteína con
soluciones de diferente pH.
Si este péptido estuviese en un tampón de pH 2 ¿Qué carga neta tendría? Primero podemos
decir que a pH 2 el grupo amino terminal estará siempre protonado, el grupo R del Glu estará
mayoritariamente protonado pues el pK del glutamato es cercano a 4 entonces a pH 2 está
mayoritariamente protonado, el grupo R de la lisina continua protonado, y el grupo COOH
también se encuentra mayoritariamente protonado (aunque a pH 1 nos aseguramos de que esto
ocurra). Finalmente lo grupos COOH de glutamato y lisina no tendrían carga por lo tanto la carga
neta a pH 2 seria +2.
Péptidos que intervienen en el metabolismo. En la imagen se ve la oxitocina y
vasopresina de humanos, ambas son
hormonas peptídicas, se remarca de
color rosado algunos residuos que
denotan la pequeña diferencia
secuencial de ambas hormonas, sin
embargo su función hormonal es
muy diferente. Además se aprecia el
glutathion (antioxidante), en su
nombre completo “” proviene de
que se formo el enlace con
participación del grupo COOH de la
cadena lateral del acido glutámico, lo
cual es raro en proteínas
¿En qué otras partes de un animal superior deberían en ciertas circunstancias deberían empezar
a abundar los péptidos?
En el intestino delgado, pues ahí se comienzan a digerir los alimentos ricos en proteínas que son
consumidos y ahí se forman péptidos. También en la célula se degradan proteínas pero ahí
rápidamente se degradan a aminoácidos libres, es decir se hidrolizan todos los enlaces peptídicos.
Si bien existen muchos péptidos son más numerosos las proteínas en organismos vivos.
Las proteínas.
Son polipéptidos de alto peso molecular. Polipéptido es el nombre utilizado para designar
un péptido de tamaño suficientemente grande; como orientación, se puede hablar de más de
10 aminoácidos. Cuando el polipéptido es suficientemente grande y, en particular, cuando tiene
una estructura tridimensional única y estable, se habla de una proteína. Para calcular el número
de aminoácidos de una proteína se hace el cálculo considerando el peso molecular de esta, y el
peso aproximado de cada residuo. Como referencia se habla de proteína a partir de una secuencia
de 50 áá, como por ejemplo la insulina cuyo número de aminoácidos es 51 y posee un peso
cercano a 5600 ya se puede hablar de proteína.
En la tabla se aprecian algunas
proteínas ordenadas según peso
molecular y n° de residuos, la 1°
proteína corresponde al citocromo c
humano, cuyo peso es de 13.000, n°
de residuos 104 y posee una sola
cadena polipeptídica. En otro
ejemplo como la glutamina sintetasa
se observa 5.628 residuos, pero a su
vez 12 cadenas polieptidicas. Lo que
no informa la tabla es si en caso de
ser mas de una cadena estas son
distintas o no.
No solo el peso molecular de las proteínas es importante, en las siguientes tablas primero se
puede observar la composición de aminoácidos de dos proteínas, se presenta la comparación
entre el citocromo c y el cimotripsinógeno bovino, en donde se observa que ambas proteínas
poseen los mismos aminoácidos ya que son constituidas por todos los aminoácidos esenciales, sin
embargo el numero de cada áa difiere en ambas, teniendo la primera un total de 104 aminoácidos,
mientras que la segunda 245 áá.
El valor nutricional de una proteína estará dado no tan solo por el numero de de áá sino mas bien
por qué áá este constituida la proteína, existiendo así los aminoácidos esenciales cuya presencia
sin duda aportara al valor nutricional de la proteína.

Existen proteínas tanto simples como complejas o conjugadas, en la tabla de la derecha se

pueden apreciar ejemplos de diferentes grupos de proteínas complejas.
Estas proteínas conjugadas además de su
constitución de áá poseen otros grupos cuyo origen
no es aminoacídico, conocidos como grupos
prostéticos, de este modo existen lipoproteínas que
poseen lípidos en su estructura, o glicoproteínas que
poseen carbohidratos en su estructura, u otros que
incorporan minerales o grupos metálicos.

Sin duda el grupo prostético de estas proteínas poseen un importante valor funcional en la
proteína como por ejemplo lo es el grupo hemo de la hemoglobina que transporta el oxigeno en la
sangre, o la caseína de la leche que actúa como reserva de fosfato además de unir calcio al grupo
fosfato o los lípidos de las lipoproteínas de la sangre son una forma de transportar lípidos en la
sangre.
Métodos utilizados para purificación y análisis de proteínas
Cómo se logra obtener una proteína pura para después poder estudiar su estructura. En general
para separar proteínas diferentes entre sí, se aprovechan las características que las diferencian.
¿Qué tipo de características podrían diferenciar una proteína de otra?  Se pueden diferenciar, a
través del peso molecular, hay proteínas más pequeñas, más grandes… etc.
 Esta tabla, es sobre otra propiedad, que
igual influye en la clasificación de
proteínas, la carga.
Aquí se muestran ejemplos de puntos
isoeléctricos (PI) de diferentes
proteínas.
Se puede ver que para las proteínas que
están en la tabla los PI varían mucho,
por ejemplo: pepsina tiene un PI muy
bajo cercano a 1, ovoalbúmina 4, 6,
ureasa 5,0.
Por debajo del 7,0 se dice que es una
proteína acida, como por ejemplo la
ovoalbúmina, la seroalbumina.

¿Qué significa que el PI de la ovoalbúmina sea 4,6? (por definición)

 Significa que a pH 4.6 tiene carga neta = 0 y a pH un poquito más alto como 5.0 tendrá
carga negativa.
Como se puede generar en una proteína una carga neta negativa? Mediante cargas locales
negativas más algo que no se escucha ,pero creo que hablan sobre las cargas parciales.
Y estas cargas negativas provienen de aminoácidos que contienen en su estructura el grupo
funcional acido carboxílico, el cual generará estas cargas negativas locales.
Los ácidos carboxílicos se relacionan entonces con el grupo funcional amino para lograr una carga
neta cero. (NH3 o NH2 , depende si es con arginina, el nitrógeno es el que tiene la carga positiva).
Entonces sin duda para que a pH 5.0 la carga neta se negativa, cual tiene que ser la idea en la
composición aminoacidica de la proteína? Tiene que tener más aminoácidos ácidos que
aminoácidos básicos , entonces va a ser una proteína acida porque predominan los residuos de
acido glutamico y acido aspartico y no hay tanto de lisina ,arginina e histidina entonces ahí será
una proteína acida con un punto isoeléctrico bajo y para las proteínas básicas es al . Entonces a si
una obtiene un pH 7.0 va a tener un número de proteínas que van a tener un punto isoeléctrico de
un tipo y otras de otro tipo y cuando uno tenga el punto isoeléctrico 7.0 como la mioglobina van a
tener carga neta cero.
Eso se usa en un tipo de cromatografía en columna que se llama
Cromatografía de intercambio iónico

El termino cromatografía se usa para definir una técnica en la cual hay una fase inmóvil y una fase
móvil.
Y las moléculas que se quieren separar, es decir los compuestos, interaccionan de forma diferente
con la fase móvil que con la fase inmóvil. Entonces así se separa el compuesto.
En una cromatografía en columna (tubo con una llave abajo, que puede ser de plástico o vidrio)en
el interior del tubo se coloca el material, que va a ser la fase inmóvil y en el caso de la
cromatografía de intercambio iónico es un intercambiador de iones, en este caso cationes.
Un intercambiador de iones es un polímero que está en forma de esferitas o granitos y a este
polímero esta unido un grupo que adopta una carga, entonces cuando se trata de intercambiador
de cationes las cargas son las negativas y por lo tanto las proteínas que se unen a estos son
cationes es decir de carga positiva, es todo lo contrario cuando se habla de intercambiador de
aniones (puntito *).
Se utiliza como intercambiador de iones un derivado del agar, la agarosa y con grupos
carboximetilo ( CH2-COO) y eso justamente a un pH neutro tiene carga negativa , también
hay intercambiador de iones con celulosa , carboximetil celulosa,carboximetil agarosa o
carboximetil sefarosa. A él polímero que se utilice se le agrega un tampón tenemos un vaso
precipitado con una mezcla de proteínas ( se muestra la diferencia en colores) y cuando se agrega
esta mezcla de proteínas (muestra)en la columna ,una tiene que abrir la llave para que por
gravedad pueda penetrar la muestra en la columna y abajo sale el tampón puro, la muestra una la
tiene que tener en el mismo tampón ( al mismo pH que la columna)hay que dejar que penetre y
las proteínas, que al pH que se está usando tengan carga neta positiva (en relación a estos grupos
carboximetilos que tiene el polímero en la columna),se van a adherir al polímero que esta inmóvil
en la columna por enlace iónico , porque las cargas opuestas se atraen.
En cambio las proteínas que tengan carga neta negativa no se van a unir, entonces se siguen
movilizando por la columna y las que tengan casualmente carga neta cero tampoco se unirán. Al
abrir la llave lo primero que saldrá son esas proteínas no retenidas y después no debería salir nada
más porque el resto está retenido.
 * Para intercambiador de aniones se usan los grupos que se llaman D.A.E (dietil amino
etilo) tiene carga positiva, por el amino.
Error de diapositiva sobre cromatografía de intercambio iónico: los símbolos que se encuentran
ahí que se refieren a cargas negativas y salen de diferentes tamaños con símbolos de diferente
color están errados porque no se conoce esa información porque no son retenidas y no se van a
separar entre sí. (Entendí que por eso era errado)
En la cromatografía de intercambio iónico, dentro de las proteínas que quedan retenidas hay
algunas que quedan retenidas más firmemente, entonces para que se desprendan de la columna,
para recuperarlas y tenerlas puras hay que hacer un cambio en el líquido que va pasando. Lo que
hacemos es agregar iones, también se puede cambiar el pH, pero eso es más complicado (uso de
diferentes tampones), por lo tanto, utilizamos el método de agregar sal, la más utilizada es el NaCl
y se va aumentando la concentración de sal gradualmente (gradiente escalonada) mientras se le
adiciona al tampón. En solución serán cationes Na y aniones Cl y va a haber una competencia por
esos sitios de carga negativa entre la proteína que ya está unida y los cationes, Na que tienden a
unirse también a los sitios negativos y ahí se produce un intercambio se sueltan las proteínas
(positivas, se les “quitó el puesto”) y se une el Na, por eso se habla de cromatografía de
intercambio iónico y las proteínas que se desprenden primero son las que están unidas menos
firmemente. (Por la gradiente escalonada, también hay gradiente lineal).
Si tenemos pH 7.0 cuales se van a haber quedado en la columna:
Por ejemplo:
*La ureasa tiene PI 5.0, eso significa que para pH 5.0 tiene carga neta cero y para pH mayor que
5.0 tiene carga negativa. Entonces a pH 7.0 la ureasa tiene carga negativa y no se unió .Por lo que
sabemos que: que cualquier proteína con PI mayor que 7.0 a pH 7.0, tiene carga neta positiva, por
lo tanto, se quedaron las proteínas básicas, si es que se usó un tampón de pH 7.0.
*Si hubiese una proteína de PI 7.2 no quedará firmemente retenida, porque está casi en su punto
isoeléctrico, tiene una pequeña carga. En cambio otras que tienen un PI más diferente del pH que
se está usando esas si tienen una carga neta mayor.
Las proteínas básicas son las más firmemente unidas.
Término de cromatografía
 Eluyente  solvente que se va pasando por el tubo.
-“Eluyente” estará eluyendo con el tampón.
-Cuando las proteínas salen de las columnas se dice que “eluyeron”.
 Gradiente escalonado  concentración inicial, luego baja , luego concentración vuelve a
inicial
 Gradiente lineal  concentración de sal constante, pero para esto se usa un mezclador.
Después de todo el procedimiento de separación, las proteínas van saliendo (puras) y todo es
recogido en tubos de ensayo un colector de fracciones es un equipo que cuenta las gotas del
liquido que va saliendo es un sistema de mangueritas unidas a la columna y que van hasta el
colector y ahí el colector cuenta las gotas según la programación que se le haya dado para tener
todos los tubos de ensayo con igual volumen ( por ejemplo: programamos 50 gotas y serán
repartidas 50 en cada tubo de ensayo).
Lo siguiente es determinar en cuál de las siguientes fracciones que se colectaron están las
diferentes proteínas o primero ¿dónde hay proteínas?, entonces lo más fácil es medir con un
espectrofotómetro
Si absorbe luz ultravioleta (UV), porque las proteínas típicamente absorben luz UV por los
aminoácidos aromáticos que tienen.

Aquí se muestra el espectro

de absorción: La absorbancia
en función de longitud de
onda y se muestra que la
tirosina absorbe menos que
el triptófano, ahí se mide la
longitud de onda, pero esto
será visto con mayor detalle
en el taller de
espectrofotometría.

Además se requiere de un método para reconocer a la proteína que se está buscando, porque por
ejemplo:
 Si se quiere purificar una enzima, una exoquinasa de hígado de ratón ,entonces se hace un
ensayo de actividad catalítica para exoquinasa 25:04… no escucho bien  …….25:08ahí
está la exoquinasa.
En este caso con una cromatografía de intercambio iónico se diluyó con una gradiente de escala?
25:22 entonces una obtiene las fracciones de la proteína con sal, las disueltas en tampón y
disueltas en NaCl, ahora para sacarle el NaCl lo que más se usa es el procedimiento que se llama
diálisis.
Una diálisis permite separar sales de proteínas o también otros compuestos pequeños de
macromoléculas. Cuando se hace una diálisis se usa una membrana de diálisis , la cual tiene poros
de un tamaño tal que puedan pasar los iones y las moléculas pequeñas por los poros, pero las
proteínas no , porque son macromoléculas.
¿Y cómo se realiza el procedimiento?

La membrana de diálisis cuando una la compra

viene como un tubo ,seca, aplastada en forma
de rollo y se corta un trozo del tubo de diálisis
se remoja en el tampón que se esté usando y
ahí se pone más flexible y se puede hacer un
nudito al comienzo entonces ahí se le coloca las
solución de las proteínas con sal y después se
hace otro nudito y se tiene la solución metida en la membrana y eso se coloca en un vaso de pp
grande con tampón y aquí va a estar la proteína y esto se coloca sobre un agitador magnético, el
cual agita la solución ( se deja 3 o 4 horas agitándose , en frio todo para que la proteína no se
desnature) entonces por los poros de la membrana los iones de la sal van a salir, en cambio la
proteína se va a quedar , hasta que llega al equilibrio queda igual concentración dentro de la
membrana que afuera y entonces hay que cambiar el tampón que hay en el vaso y se cambia por
tampón fresco(sin sal) nuevamente se espera ,unas 3 o 4 horas y nuevamente sale sal, y después
con un tercer cambio siendo que el volumen de afuera es mucho mayor que lo que tiene dentro
de la membrana, en realidad la concentración de sal en las proteínas bajo mucho hasta un punto
en el que ya no es importante, así se eliminan sales.
 Este es el mismo principio que se realiza en los enfermos renales la sangre del enfermo se
dializa contra una solución que no contiene todos los compuestos tóxicos, que se van
generando en el metabolismo y se van acumulando en la sangre cuando el riñón no
funciona bien entonces se eliminan por la membrana.
La diálisis se realiza después de una cromatografía de intercambio iónico, también se usa después
de que se hizo por ejemplo, una precipitación de proteínas con sal.
Cromatografía de exclusión molecular
En este procedimiento la separación se realiza por tamaño (PM), una muestra que tiene proteínas
de diferentes tamaños, en la imagen se muestra el material en aumento ( pelotitas en amarillo),
ese material es un polímero, puede ser un polisacárido, polímero natural o polímero sintético este
polímero tiende a entrecruzarse y quedan agujeros entremedio de las cadenas, por lo tanto, los
granos son porosos.

Las proteínas que son

muy grandes no
caben en esos poros,
entonces en vez de
entrar a los poros
pasan por fuera de los
diferentes granos y
van pasando por la
columna, por efecto
del a gravedad, al
abrir la llave va
pasando la solución
en cambio las
proteínas que son un
poquito más
pequeñas, entran en
los poros
relativamente más
grandes, entran y
vuelven a salir y así se
demoran más en
pasar la columna que los grandes y cuanto más pequeñas sean las proteínas el número de poros a
los cuales tienen acceso es mayor , entonces el camino que recorren al pasar por la columna es
mayor y por eso salen después.
Finalmente así es como se separan las proteínas por tamaño saliendo primero las grandes y
después las pequeñas.
Existen diferentes tipos de materiales para cromatografía de exclusión molecular, el que se escoge
según el tamaño de la proteína que se quiera separar, las proteínas que se separar de los poros
porque su tamaño es mayor al de ellos, se dice que son excluidas y salen todas juntas.
Hay un tipo de cromatografía de exclusión molecular, que se usa mucho, que se llama exclusión
en gel, porque el material con el cual se llena la columna es gel que puede ser de sefarex ( que se
hace con dextrano polímeros de bacterias),de sefarosa son polímeros (cada gel tiene indicado
cual es su tamaño de exclusión).
Existe otro método más en cromatografía de columna, que es más específico…
Cromatografía de Afinidad

Proteína de
interés.
Ligando.
Ligando unido a
polímero.

En una cromatografía de afinidad a algún polímero se le agregan grupos que en este caso aquí se
representa con esta bolita y esto grande es el material de la matriz de la columna y estos grupos
son grupos con los cuales la proteína que uno quiere purificar, esa proteína los une, que tiene
algún sitio para unir ese tipo de ¿??..Entonces se muestra acá que tenemos la columna, los granos
con esos grupos unidos covalentemente y la mezcla de proteínas, entonces solamente la proteína
de interés (medialuna) tiene un sitio de unión para ese tipo de grupo, entonces uno ve que
solamente las proteínas rojas se unen al material de la columna y todas las otras proteínas son
eluídas y después uno tiene la proteína en la columna y para despegarla se puede usar una
solución del compuesto libre en el tampón entonces ahora se va a producir una competencia por
los sitios de la proteína, y la solución del compuesto libre si esta en concentración suficiente gana,
entonces ahí se va desprendiendo y salen las proteínas. Entonces vemos que este método es más
específico porque de todas las proteínas que están en la mezcla, con un poquito de suerte
solamente la proteína que uno está buscando une a ese compuesto o un pequeño número de esa
proteína, por ejemplo en nuestro laboratorio siempre hemos trabajado con una proteína que es
una enzima llamada ¿? y que tiene como inhibidor Amp, adenosina monofosfato, que es un
nucleótido, y hay un material que se puede comprar llamado sefarosa agarosa?? que es sefarosa la
cual es un polímero polisacárido pero que tiene un compuesto de color azul unido covalentemente
el cual es estructuralmente parecido al Amp, al inhibidor de la enzima, y la enzima tiene un sitio
específico para el amp, entonces con este sitio se agarra a la sefarosa azul y queda retenida en la
columna y si uno la quiere sacar de la columna para tenerla, se agrega en el tampón: Amp o
cloruro de sodio. La cromatografía de afinidad es un excelente método porque es específico, por
ejemplo si uno quiere separar una proteína por peso molecular, muy seguramente habrán otras de
peso parecido entonces en una sola de estas cromatografías no se obtiene algo muy puro, al
separar por cargas pasa lo mismo, en cambio en una de afinidad, con un poco de suerte también,
se puede tener una proteína pura en un solo paso. Pero uno no siempre tiene un material para
poner en la columna que tenga un sitio específico para la proteína que uno busca, eso es relativo.

Entonces aquí ya tenemos

lo que se llama una tabla
de purificación y aquí se
da el caso para una enzima
hipotética, y aquí se
muestra que trataron de
dejar totalmente pura a la
enzima y para esto se
usaron 5 diferentes etapas
sucesivas, ya que se
necesitan varias etapas
para dejar pura a una
proteína. Lo primero que
hicieron fue obtuvieron un
extracto celular crudo, o
sea el tejido en el cual se
supone que esta la enzima
con un poquito de tampón se muele en juguera?, esto a baja temperatura para evitar que las
proteínas se desnaturen y se eliminó todo lo que no estaba soluble ya que eso no sirve, porque se
necesita a la proteína en solución para poder hacer cualquier procedimiento posterior, y ese
volumen del sobrenadante (lo no soluble) era de 1,4 litros, un numero bastante grande, y ahí se
determina cuanta proteína hay. Hay métodos específicos para determinar concentración de
proteínas, que son métodos químicos, y con una muestrecita se determina la concentración de
proteína que tiene la solución, por ejemplo 5mg de proteínas por ml de solución y se tiene la
concentración, y si se multiplica eso por el volumen, uno calcula cuanta es la proteína total que
uno tiene en esa solución. Y además se hizo lo que se llama un ensayo de actividad catalítica de la
enzima para ver cuanta enzima hay, y ahí se obtuvo la actividad, eso se mide actividad catalítica en
unidades de actividad enzimática, y también con el ensayo en que se obtuvo, cuántas unidades
por ml hay, multiplicando por los 1400 ml se obtiene cuantas unidades totales hay, eso es lo que
representa a la enzima (la actividad catalítica, el hecho que catalice, aumente la velocidad de una
reacción química).
Después, se usó como primer paso para purificar, una precipitación con sulfato de amonio, ahí
prenden el sulfato de amonio en alta concentración, las sales en alta concentración hacen
precipitar proteínas porque resulta que la molécula de agua interacciona con los iones de la sal, y
cuando la sal está en alta concentración, las moléculas de proteína quedan con pocas moléculas
de solvente porque la sal atrapa al solvente agua (vimos en la primera clase como las moléculas de
agua interaccionan con iones de cloruro de sodio), entonces aquí por eso la proteína precipita,
después de cuando uno centrifuga se queda con un precipitado de la proteína y en el solvente hay
otras moléculas o compuestos que no precipitaron. Entonces aquí, después a eso le agregan un
poquito de tampón para disolver a la proteína nuevamente y quedaron con volumen pequeño
(280ml) y determinaron cuanta proteína hay (3000mg) no toda la proteína precipitó, pero
felizmente casi toda la enzima que uno tenía, todavía la tiene.
Después se hizo una cromatografía de intercambio iónico, se quedaron con todas las fracciones
en las cuales había actividad catalítica obviamente, porque uno conecta muchas fracciones y en
muchas no hay proteínas ni actividad catalítica pero lo que uno busca es la actividad catalítica, y
ahí el éxito fue grande porque de las proteínas totales se descartaron muchas, se quedaron con
solo 400mg y de las unidades no se perdió mucho, eran ¿? y quedaron en 80.000.
Después una cromatografía de exclusión molecular y perdieron nuevamente un poco de enzima,
pero se purificó, se descartaron proteínas contaminantes y al final una cromatografía de afinidad y
después de esto quedaron con un volumen pequeño de 6ml, solamente 3ml de proteína de esos
6ml, pero se supone que esta es la enzima que se estaba buscando, probablemente esta pura con
45.000 unidades de actividad enzimática.
Y además está esta columna en la figura, ¿cómo se pueden calcular los datos de esta columna con
los otros datos que están en la figura (tabla)? Se puede calcular con los datos previos, es cosa de
dividir las 100 mil unidades por los 10mg y ahí se obtienen 10 unidades por mg de proteínas
totales, se pueden usar los datos de la tabla o los datos que uno obtiene a través de sus ensayos,
pero en el ensayo de proteínas uno obtiene mg por ml de proteínas totales, y en el ensayo de
actividad catalítica uno obtiene unidades de la enzima por ml de solución, con estos dos datos y si
uno divide esto por esto se simplifican los ml y se obtiene la actividad enzimática específica. Y esta
actividad enzimática específica va a aumentando a medida que se van descartando las proteínas
que acompañan a la enzima pero que no son la enzima, y esto es lo que refleja la ¿?, mire la ¿? de
la enzima que se obtiene después de cada paso. Entonces eso es una tabla de purificación, ahora
que uno tiene su enzima así, está pura, ya no cambia la actividad específica, es un valor
característico de la enzima.
Ahora uno quiere además hacer algún análisis, a
cualquier purificación la sigue este tipo de análisis. El
método analítico por excelencia para analizar pureza de
soluciones de proteínas o la composición en general es
la Electroforesis en geles de poliacrilamida (método
analítico), aquí se muestra que se una cámara de
electroforesis, y aquí se hace migrar a las proteínas a
través de un soporte que en este caso es un gel de
poliacrilamida y se hacen vibrar aplicando un campo
eléctrico. (Pizarra) Aquí se ve que en la cámara
electroforética se insertó lo que se llama un sándwich
con dos placas de vidrio que entre medio tienen al gel
de poliacrilamida, eso se hace antes, se tienen las dos placas de vidrio que tienen esa forma (con
un sacado) son bastante delgadas, de 1mm o menos y que se superponen una detrás de la otra,
para que no queden totalmente juntas se colocan espaciadores de plástico (muy delgados y son
varios), después de colocar los espaciadores en un aparato especial que viene con el equipo, uno
tiene que polimerizar el gel de poliacrilamida, que es un polímero de acrilamida y se usa además
disacrilamida que es otro compuesto parecido y todo eso se mezcla con un agente que inicia la
polimerización, se mezcla todo eso y se coloca en el espacio que quedó por aquí y se inserta lo que
se llama una peineta (de plástico), que cuando uno la coloca en el gel, genera una especie de
hoyos llamados bolsillos o pocillos del gel que es donde se va a aplicar la muestra. Una peineta
puede ser para 10, 20 muestras. Entonces se polimerizó el gel, se colocó en la cámara, después
aquí en la parte de abajo del gel se puede llenar con tampón, entonces el gel queda en contacto
con el tampón en la parte inferior, en la parte superior también hay una parte donde se coloca
tampón y después se conecta esto a una fuente de poder que genera el campo eléctrico, por acá
se conecta el electrodo positivo y por acá el negativo. Y antes de prender la fuente de poder se
colocan las muestras en los diferentes pocillos y después se enciende la fuente de poder
estableciendo la diferencia de potencial y las proteínas migran si tienen carga neta negativa, si
aquí se colocó el electrodo positivo, migran hacia abajo. Esto es el ánodo y esto el cátodo, hacia el
ánodo migran los aniones o proteínas de carga negativa, entonces aquí solo las que tienen carga
neta negativa migrarían y las que tienen carga neta positiva o cero, no lo harían. Entonces una vez
que se hizo la electroforesis, uno espera que pasen las proteínas por el gel y comiencen a salir las
primeras por abajo, eso se ve porque se agrega un colorante azul que migra con el frente, o sea,
muy rápido. Entonces cuando sale el colorante uno corta la corriente y saca el gel y se tiñe, eso se
muestra acá, un trozo del gel con las proteínas ya teñidas, esto por la adición de un colorante que
segrega las proteínas, las divide y aparecen lo que se llaman bandas, que corresponden a
diferentes cadenas polipeptidicas. Aquí se habla de un tipo particular de electroforesis que es la
Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturantes, eso viene del SDS
(desnaturante del proteinas) (=Dodecil Sulfato de Sodio), que tiene grupos fosfato, los cuales
tienen carga negativa, dodecilo es una cadena de CH, hasta que está el sulfato (cadena larga) y
este SDS interacciona mediante la cadenita dodecilo uniéndose a las cadenas polipeptidicas y el
sulfato queda por ahí, entonces todas las cadenas polipeptidicas de proteínas cuando uno agrega
el SDS quedan con carga negativa (recubre las proteínas y quedan todas negativas), esa es la gracia
de esta electroforesis, todas las proteínas son negativas cuando se usa este tipo de electroforesis y
por eso es que migran hacia el ánodo (abajo). Existen otros tipos de electroforesis de proteínas en
que no se agrega el SDS entonces ahí uno tiene que jugar más con el pH, porque migran según el
punto isoeléctrico, en cambio en esta electroforesis con SDS todas tienen carga negativa entonces
el punto isoeléctrico no tiene relevancia. Pero algunas migran más rápidamente que otras, en el
momento en que uno corta la corriente eléctrica se ve que unas avanzan más que otras a pesar de
que todas tienen una carga negativa más o menos igual, esto se explica por el peso molecular
(tamaño) las cadenas polipeptidicas más pequeñas encuentran más poros en este gel de
poliacrilamida por los que pueden pasar, que las cadenas más largas o grandes a las que les cuesta
más encontrar un hueco por donde pasar.

Entonces se produce una selección por efecto cedazo del gel de poliacrilamida (partículas chicas
pasan muy rápido). Entonces estas son las cadenas más cortitas y hacia arriba están las cadenas
polipeptidicas cada vez más largas y además esto es que el SDS es un agente desnaturante,
desnaturacion es un proceso por el cual las proteínas pierden totalmente su estructura normal, se
desarman. Y cuando hay en la molécula de la proteína, más de una cadena polipeptidica, estas
proteinas que tienen dos, tres cadenas polipeptidicas en la misma molecula, eso se separa y
migran como cadenas y no como moléculas de proteinas. Y aquí uno ve que aquí habían muchos
más tipos diferentes de cadenas polipeptidicas de diferente largo que ¿?

Por ejemplo acá, cada banda significa que debería ser un tamaño de cadena polipeptídica, a veces
también se superponen diferentes pero básicamente esa es la idea, entonces a simple vista uno ve
que esta muestra es más compleja que esta y uno puede comparar, uno puede decir, esta bandita
que está acá, está aquí también, en cambio en otra muestra no está. Acá se analizó la composición
de 6 muestras de proteínas por el método de electroforesis en presencia de SDS, se muestra el gel
con las proteínas ya teñidas ya que antes de teñir no se ve nada, y este método es un criterio de
pureza para proteínas, si uno purifica una proteína, después de cada paso realiza una
electroforesis, como este ejemplo del lehninger, que parece que lo que se purificaba era una RNA
Polimerasa, entonces son muestras de las diferentes etapas de purificación y en este último carril
se aplicó lo que es la proteína ya pura, que se obtuvo después del último paso, entonces para una
proteína pura en primera instancia uno pensaría que debería tener una sola banda, pero aquí
afinando la vista puede ver otras pequeñas bandas. ¿Es posible que una proteína totalmente pura
tenga dos diferentes bandas? Sí, porque una proteína puede tener distintos tipos de cadenas
polipeptidicas con distinto tamaño, por ejemplo los dímeros, tetrámeros que están asociados en
las cadenas que me van a ocasionar diferentes bandas, aunque también puede ser que las
pequeñas bandas que se ven ahí sean impurezas, que la proteína no esté totalmente pura, hay
que tener la información de la estructura de la proteína.

Acá tenemos lo que es el SDS (dodecil sulfato de sodio),

acá está el grupo fosfato y acá el dodecil, en solución se
libera el sodio y queda el dodecil con su sulfato.
Esta Electroforesis en geles de poliacrilamida entrega además del estado de pureza de una
proteína, entrega datos del peso molecular de las cadenas. Aquí se hizo la electroforesis y en un
carril se aplicó una mezcla de estándares, proteínas de peso molecular conocido y luego de la
electroforesis se separaron por tamaño, la miosina quedó hacia arriba con un peso de 200.000 y lo
que más migró fue la lisozima con PM 14.000, y en el otro carril se aplicó una muestra de otra
proteína que se estaba analizando, en este esquemita se observa absolutamente pura, tiene una
sola banda, y es una enzima que no tiene más de una cadena polipeptidica en la muestra, bueno,
ahora de qué peso molecular es esa cadena polipeptidica? Aproximadamente entre 45.000 y
31.000 es difícil estimar porque esto no se separa en forma lineal según peso molecular, entonces
para hilar fino se hace este tipo de gráfico, en que se mide la migración de cada uno de acá hacia
acá, cuanto migró cada una de las bandas de los estándares, este dato y se usa el logaritmo del PM
y se hace este gráfico, estas bolitas negras o puntos son los datos de los estándares que dan
aproximadamente una recta en este gráfico y con la migración que se midió de la muestra, se
interpola en la recta y se obtiene por aquí el logaritmo del PM de esta proteína muestra y ahí se
puede calcular el valor y obtener algo más preciso que lo que estaba acá, un valor numérico.
Entonces la electroforesis con geles de poliacrilamida se utiliza muchísimo.
Ahora después de la electroforesis se hace lo
que se llama un análisis de Western o Western-
blot, donde lo que se hace es una electro
transferencia de las proteínas desde el gel de
poliacrilamida a una membrana de
nitrocelulosa que se sobrepone al gel, el gel no
se tiñe, sino que se coloca la membrana y con
este equipo de electro transferencia se logra
que las proteínas del gel se vayan a la
membrana pero en la misma posición relativa o
distribución y después se realiza la
inmunodeteccion de la proteína que uno está
buscando, se utilizan anticuerpos, una solución de anticuerpos contra la proteína buscada,
entonces uno agrega la solución de anticuerpos y estos encuentran a la proteína buscada en la
membrana y ahí se une, donde no está la proteína no se une y después se hacen unos lavados
para eliminar el resto de los anticuerpos y después se usa un segundo anticuerpo que es comercial
y se puede comprar, el primer anticuerpo a menudo es un Ac que uno mismo obtuvo inyectándole
la proteína de interés a un conejo obteniendo IgG de conejo y lo que se compra es un Ac de cabra
contra IgG, que viene con un grupito coloreado o que puede generar un color a través de una
reacción enzimática o de un grupo fluorescente, entonces con eso uno ve ahora en un gel donde
está la proteína, si la muestra tiene la proteína que uno busca porque si no la tiene no aparece ni
un color en el gel o donde está, con varias muestras además uno compara qué se yo, para eso se
usa el western-blot.

Isoelectroenfoque: es una técnica parecida

a lo que es la electroforesis pero aquí se
separa la proteína por punto isoeléctrico. Lo
que uno muestra aquí es que se usaron unos
tubitos de vidrio y ahí se polimerizó un gel
que contenía una solución de un anfolito, y
después cuando uno somete este gel a un
campo eléctrico, esos anfolitos se
distribuyen y generan un gradiente de pH en
el gel, entonces acá arriba tiene pH 9 y acá
abajo tiene pH 3 , generan pH continuo
entre 9 y 3, después se aplica la muestra de
diferentes proteínas y se aplica nuevamente
un campo eléctrico y las proteínas migran
hasta que se encuentran con el pH que
corresponde a su punto isoeléctrico, cuando
llegan a ese pH tienen carga neta cero, les va
cambiando durante la migración y cuando
llegan a carga neta cero ya no se mueven más porque ya no les afecta, entonces así se separan las
proteínas de la muestra según su punto isoeléctrico y esto sirve también para determinar el punto
isoeléctrico de una proteína.
Bueno, entonces se hizo esta electroforesis con una muestra y después se usó otro gel, este es un
gel de poliacrilamida con SDS, el primer gel se coloca aquí encima, se adosó al otro gel y no se usó
peineta entonces la superficie del gel es recta y ahí nuevamente se hace una electroforesis a estas
proteínas que estaban aquí separadas según carga, entonces con el segundo gel se separan según
peso molecular o tamaño, esto se llama una electroforesis bidimensional y las proteínas quedan
separadas, y esto se hace para analizar muestras de proteínas complejas (*Imagen proteínas
totales escherichia coli).
 Acá se muestra un gel en donde la muestra era proteínas totales escherichia coli, cada uno de los
puntitos es una cadena polipeptídica de alguna proteína de la bacteria, este tipo de método se
utiliza en los estudios de Proteom, proteom es una línea, un tipo de estudio de años recientes.
Genomica no sé si lo conocen, estudia cuales son los genes de los distintos seres vivos, se
relaciona con expresión génica. La proteómica estudia cuales son todas las proteínas que tienen
los organismos vivos (cuál es el proteoma de los seres u organismos vivos) y en qué situación se
expresan cada una de estas proteínas que puede tener relación con cierta enfermedad, por
ejemplo hay ciertas enfermedades en donde cierta proteína se expresa más, o hay un defecto
genético en donde esta proteína no está. Cuando uno tiene una muestra de proteínas totales de
algún ser vivo necesita una electroforesis bidimensional, como son tantas proteínas. Se comparan
ciertas proteínas, si están o no en tal y tal ser vivo, etc.