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Mémoire de MAGISTER
en Biotechnologie
Option : Ecosystèmes microbiens complexes
Présenté par
Mlle Halima DJELIL
Intitulé
Devant le Jury :
Soutenu le : / / 2010
REMERCIEMENTS
Merci au bon dieu qui m’a prêté force, courage et patience lors de la réalisation de ce travail.
J’adresse mes sincères remerciements a l’équipe du LBMB je citerai Madame ROUDJ.S qui
m’a beaucoup apporté par sa gentillesse ses conseils et sa disponibilité « merci maman ». A
monsieur HASSAINE.O pour ses précieux conseils et orientations qu’ainsi Un grand merci
aux techniciens pour leur gentillesse et leur dévouement.
Je voudrais également remercier madame et monsieur KAHIA TANI ainsi que le personnel
du laboratoire KAHIA TANI pour leur gentillesse leur sympathie et leur soutien moral.
J’adresse aussi un vif remerciement a tout ceux qui ont été a mes cotés durant ces années
d’étude, mes amis(es) et mes proches.
Merci
DÉDICACES
A mes très chers parents pour leur affection, prières je les remercie d’avoir
réussi à faire de moi l’être que je suis, d’avoir conforté mon âme et mon
esprit, veillé sur mon confort nuits et jours je prie dieu de les garder et de les
protéger pour qu’ils soient témoin de mes futures réussites. Papa, Maman
MERCI.
A mes amis(es).
SOMMAIRE
Liste des tableaux i
Liste des figures ii
Liste des abréviations iii
1. INTRODUCTION 1
2. MATERIEL ET METHODES
3. RESULTATS ET DISCUSSIONS
CONCLUSION 65
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 67
LISTE DES FIGURES
Introduction
Les levains lactiques les plus utilisés en industrie laitière sont les lactocoques ; leur
rôle technologique principal réside dans l’acidification du milieu produisant de l’acide
lactique, ils peuvent également produire de petites quantités de composés secondaires qui
contribuent à la formation de la flaveur et au goût du fromage, leur présence a aussi un effet
sur la texture finale grâce à leur activité protéolytique et acidifiante (Desmazeaud, 1996).
C’est dans ce contexte que notre laboratoire s’intéresse à l’étude des mécanismes de
résistance et de réponse au stress salin chez les lactocoques en particulier (Lactococcus
lactis) ; ce genre de stress est exercé lors de la salaison et de l’affinage. Un des enjeux de la
recherche actuelle pour les industries agroalimentaires consiste à mieux comprendre et
favoriser la capacité de réponse et d’adaptation des bactéries lactiques à ces variations afin de
conditionner la survie et la vitalité ultérieure des souches.
1
Introduction
différents échantillons de lait, produits dérivés, d’huile d’olive, et plantes désertiques. Ce
souchier est composé de plus de 200 souches, essentiellement de Lactococcus et
Lactobacillus.
Après confirmation de la pureté des souches, nous avons étudié leur croissance à
différentes concentrations de NaCl afin de déterminer la concentration minimale inhibitrice ou
CMI ; la détermination de la concentration optimale de proline et de glycine bétaïne
permettant de lever l’inhibition de croissance exercée par le sel à la CMI est réalisée suite à
une culture sur milieu M17 additionné des deux substances osmoprotectrices à différentes
concentrations.
Dans un seconde étape, nous avons réalisé une étude cinétique de croissance en
absence et en présence de différentes concentrations en NaCl ainsi qu’en présence de proline
ou de glycine bétaïne. Nous avons aussi testé l’activité acidifiante et protéolytique des
souches en présence et en absence de sel ainsi que la corrélation entre ces deux caractères
technologiques.
Puis nous avons essayé une approche nouvelle qui porte sur les modalités
d’application du stress effet intensité/durée.
Ensuite, l’étude est complétée par une électrophorèse SDS-PAGE des protéines totales et
d’une chromatographie de partage sur papier Whatman du contenu cellulaire en absence et en
présence de stress hyper-osmotique.
2
1. Introduction
3
1. Introduction
Ainsi, les bactéries lactiques sont divisées en deux groupes principaux d’espèces
homo- ou hétérofermentaires selon la nature et la concentration des produits terminaux issus
de la fermentation du glucose.
Le principal atout de ces bactéries réside donc dans leur capacité à acidifier les
produits alimentaires. L’acide lactique mais aussi d’autres acides organiques (acide acétique,
acide formique.) sont les produits du métabolisme fermentaire et jouent un rôle majeur dans la
conservation des aliments puisqu’ils inhibent fortement la croissance des bactéries pathogènes
à bas pH (Stiles, 1996). L’acide lactique a également un rôle direct dans l’industrie laitière
puisqu’il permet la formation du caillé.
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1. Introduction
l’arginine (Motlagh et al., 1991). Toutefois, le diacétyle est rarement présent dans l’aliment
en quantité suffisante pour y exercer une activité antimicrobienne importante (Caplice et
Fitzgerald, 1999).
Les bactéries lactiques sont également impliquées dans de nouveaux types de produits
dits «probiotiques». Il s’agit de micro-organismes vivants qui, une fois ingérés, vont conférer
un effet physiologique bénéfique à leur hôte animal grâce à leurs propriétés microbiennes
(Fuller, 1992). Les genres Lactobacillus, Bifidobacterium et Enterococcus abritent des
espèces considérées comme probiotiques (Fuller, 1991; Gordin et Gorbach, 1992). D’autres
bactéries, qui ne colonisent pas naturellement le tractus digestif des mammifères, mais sont
utilisées comme starters dans l’industrie laitière sont également considérées comme des
probiotiques, Lactobacillus bulgaricus et Streptococus thermophilus.
Leur classification dans les probiotiques ainsi que parmi les microorganismes GRAS,
fait de ces bactéries des acteurs potentiellement importants dans les domaines de la médecine
et de la santé : amélioration de la digestion du lactose, stimulation du système immunitaire,
vecteurs de molécules à effets thérapeutiques.
5
1. Introduction
1.2 Lactococcus
Les bactéries du genre Lactococcus sont des bactéries en forme de coques, regroupées
ou non en chaînettes de longueurs variables. Elles présentent un métabolisme homolactique,
sont mésophiles puisque leur température optimale de croissance est proche de 30°C, elles
n’ont aucune activité α-hémolytique.
Ce sont les études de Schleifer et al. (1985) qui ont justifié la création de ce nouveau
genre bactérien regroupant la quasi-totalité des streptocoques du groupe N de la classification
de Lancefield.
Lactococcus lactis est l’une des bactéries lactiques les plus étudiées. Son importance
cruciale dans les procédés de fermentations alimentaires, ainsi que la disponibilité de ses
séquences génomique et plasmidiques font de ce micro-organisme un modèle pour l’étude du
métabolisme des bactéries lactiques ainsi que de leur comportement face à différents stress.
Était autrefois apparenté aux streptocoques (Schleifer et al., 1985). Il est parmi les micro-
organismes les plus importants pour l’industrie laitière, faisant partie des levains utilisés dans
la plupart des fabrications fromagères.
Lactococcus lactis est une bactérie hétérotrophe à Gram positif, anaérobie facultative,
catalase négative, non sporulante, non mobile, formant des cellules sphériques ou ovoïdes,
isolées ou en courtes chaînettes de longueur variable mesurant 0,5 par 1,5 µ, mésophile
possédant une température optimale de croissance d’environ 30°C, et neutrophile puisque sa
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1. Introduction
gamme de pH optimale varie de 6,3 à 6,9 (Hutkins et Nannen, 1993). Cette espèce est
homofermentaire.
Les habitats les plus importants des lactocoques demeurent le lait, les laits fermentés
ainsi que les fromages où ils constituent la flore dominante. Cependant, on peut également les
isoler des plantes (Sandine et al., 1972) ainsi que de la peau de certains animaux, et il semble
que la contamination qui a lieu au cours de la traite aie pour origine principale le fourrage. Le
milieu d’isolement de Lc. cremoris semble être limité qu’aux produits laitiers (Mofredj et al.,
2007).
Les besoins nutritionnels varient beaucoup d’un groupe bactérien à un autre. Les
bactéries lactiques sont hétérotrophes et nécessitent donc pour leur croissance l’apport de
certaines substances organiques exogènes. Elles se caractérisent par des besoins nutritionnels
particulièrement complexes car en plus d’un sucre fermentescible, elles nécessitent la
présence de plusieurs acides aminés essentiels qu’elles ne peuvent synthétiser à partir d’une
source azotée plus simple.
Les lactocoques ont généralement besoin d’un apport d’acide glutamique, d’histidine,
d’isoleucine, de leucine, de méthionine et de valine pour se développer, et plus rarement
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1. Introduction
Dans le lait, la croissance des lactocoques est fortement dépendante de l’hydrolyse des
caséines qui constituent la principale source d’azote (Mills et Thomas, 1981; Juillard et al.,
1995).
Lactococcus lactis produit une sérine-protéase (Cell Envelope Proteinase) localisée au
niveau de la paroi cellulaire, pivot de la protéolyse des caséines (Smid et al., 1991). Il s’agit
d’une enzyme clé essentielle pour une croissance rapide des souches de lactocoques dans le
lait puisqu’elle scinde les caséines en peptides. Bruinenberg et al. (1992) ont observé que la
synthèse des protéases est régulée par la composition du milieu ; les niveaux les plus élevés
sont obtenus en lait.
Deux types de protéases, -PI et -PIII sont distinguables par leur spécificité
d’hydrolyse, puisque les protéases de type-PI clivent préférentiellement la caséine β, la
caséine κ avec moins d’efficacité et presque pas la caséine αS1, alors que la protéase de type-
PIII clive les trois types de caséines avec la même efficacité (Visser et al., 1986 ; Reid et al.,
1991a et b; Reid et al., 1994). Ainsi le type de protéase de paroi exprimée va fortement
influencer la croissance de Lc. lactis (Exterkate et de Veer, 1987; Flambard et al., 1997;
Helinck et al., 1997; Flambard et al., 1998).
Chez Lactococcus lactis la croissance en lait est diauxique, elle est scindée en deux
phases exponentielles successives séparées par une phase au cours de laquelle la synthèse des
protéases de paroi est réalisée (Juillard et al., 1995; Letort et al., 2002). Au cours de la
première phase les bactéries consomment les acides aminés et peptides libres du milieu, tandis
qu’au cours de la seconde elles utilisent les caséines comme source d’acides aminés.
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1. Introduction
Chez les lactocoques le transport des acides aminés est considérablement augmenté en
présence de glucose ou de lactose et stoppé par les inhibiteurs de la glycolyse ou les enzymes
hydrolysant l’ATP (Monnet et Gripon, 1994). Divers mécanismes de transport sont
impliqués selon les acides aminés, soit couplé à la force protomotrice, soit à l’ATP ou à
d’autres molécules possédant des liaisons phosphate riches en énergie, soit des systèmes
antiports impliquant les gradients de concentration des acides transportés.
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1. Introduction
On distingue généralement les «salaisons vraies» dans lesquelles le sel est réparti
uniformément dans la viande à un taux supérieur à 5%, assurant ainsi une conservation de
plusieurs mois, des «produits salés» dans lesquels le sel est réparti parfois de façon hétérogène
10
1. Introduction
Le sel est aussi largement utilisé dans les produits marinés très populaires en Europe
du Nord. Les marinades sont typiquement des émulsions d’eau et d’huile contenant du sel, du
sucre et des acides. Le double effet du sel et du pH acide agit alors comme un exhausteur de
goût en même temps qu’un agent antimicrobien. (Lefebvre, 2005).
Dans l’industrie de la conserve, le sel agit par osmose, c’est à dire qu’il pénètre dans
les aliments au fur et à mesure que ceux-ci se vident de leur eau de constitution. Par ailleurs,
alors qu’il pénètre peu à peu à l’intérieur des aliments, le sel inhibe la croissance des micro-
organismes qu’ils contiennent, retardant leur décomposition. Le sel se retrouve généralement
à un taux de 2% dans les conserves de légumes (Lozach, 2001).
La concentration moyenne en sel dans le fromage est de l’ordre de 1 à 2%. Dans les
fromages bleus et dans certains fromages de chèvre, elle peut toutefois atteindre 3 à 4%. Dans
le cycle de fabrication des fromages, le salage s’effectue après l’égouttage et avant l’affinage.
Il sert à protéger les fromages contre les micro-organismes indésirables (protection d’autant
plus nécessaire que le fromage est humide), mais aussi à sélectionner des micro-organismes
spécifiques nécessaires à la maturation du produit (développement du goût et de la fleur du
fromage).
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1. Introduction
rouge des munsters et des pont-l’évêque. En ce qui concerne le beurre, le taux de sel n’excède
pas 5% du poids total du beurre demi-sel et 10% du beurre salé, en respect des normes
françaises. Le salage permet d’inhiber partiellement le développement microbien, notamment
celui des ferments lactiques (Lozach, 2001).
Outre les stress acide et hypothermique, les lactocoques sont soumis à d’autres stress
physico-chimiques au cours des procédés fromagers. Ils sont soumis à de brusques variations
de l’osmolarité environnante lors par exemple de l’égouttage/pressage ou du salage des
produits. Le stress osmotique correspond à une diminution ou une augmentation de
l’osmolarité de l’environnement de la bactérie (Csonka, 1989) qui, en modifiant la
disponibilité de l’eau de la cellule, affecte sa survie et/ou sa croissance (Potts, 1994).
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1. Introduction
Ce transfert spontané ne nécessite aucune dépense d’énergie et joue un rôle essentiel dans
l’activité des cellules. Par osmose, les cellules vivantes peuvent, par exemple, capter des
nutriments dont elles ont besoin et rejeter leurs déchets.
Milieu extérieur
Equilibre osmotique
Milieu extérieur
Choc hyper osmotique
Milieu extérieur
Choc hypo osmotique
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1. Introduction
1995). Au contraire, le raccourcissement cellulaire est observé chez Lb. sakei en présence
d’un stress hypo-thermique ou hyper-osmotique (Marceau et al., 2003).
L’association de ces deux stress a pour conséquence de lisser la surface externe des
cellules de Lb. sakei (Marceau et al., 2003). Le stress peut également provoquer un
événement d’agrégation cellulaire, comme c’est le cas chez Lb. alimentarius en présence d’un
stress hyper-osmotique (Lemay et al., 2000).
a) Environnement hypo-osmotique :
Une diminution rapide de l’osmolarité du milieu extérieur (choc hypo-osmotique)
provoque un afflux d’eau dans la cellule et par conséquent une augmentation du volume
cellulaire et de la pression de turgescence. Etant donné que la rigidité de la paroi bactérienne
permet à la cellule de supporter des pressions élevées [jusqu’à 100 atm chez les bactéries à
Gram négatif (Carpita, 1985)], un choc hypo-osmotique ne provoque, en général, qu’une
faible augmentation du volume cellulaire.
b) Environnement hyper-osmotique :
Une augmentation brusque de l’osmolarité du milieu extérieur (choc hyper-osmotique)
entraîne un rapide flux d’eau vers l’extérieur de la cellule ; le volume du cytoplasme diminue.
Ce phénomène de plasmolyse peut être détecté instantanément par une augmentation de la
turbidité du milieu (Koch, 1984).
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1. Introduction
Les solutés impliqués dans ces phénomènes sont dits compatibles car leur
accumulation dans le cytoplasme bactérien n’a aucun effet sur les processus cellulaires vitaux.
Parmi eux, on trouve des ions (K+), des acides aminés (proline, glutamate, glutamine), des
polyols, des sucres (sucrose, tréhalose) ainsi que des composés ammoniums quaternaires
(glycine bétaïne et carnitine).
Certains de ces composés sont dits osmoprotectants car en plus d’être compatibles
avec la physiologie cellulaire, ils sont capables de lever les différentes inhibitions de
croissance imposées par le stress osmotique.
Les osmoprotectants les plus importants sont la proline et surtout la glycine bétaïne
qui en plus de modifier l’osmolarité cellulaire est capable de se lier aux protéines et de les
stabiliser. Ces solutés peuvent être accumulés dans la cellule grâce à un transport actif ou dans
certains cas grâce à une synthèse de novo induite par le stress (Glaasker et al., 1998;
Poolman et Glaasker, 1998).
15
1. Introduction
Chez Bacillus subtilis, un tel choc induit également l’accumulation d’ions K+ dans le
cytoplasme puis une augmentation soit de la bétaïne soit de la proline intracellulaire par
transport ou synthèse de novo. Il existe trois systèmes de transport osmorégulés chez B.
subtilis, OpuA qui est de la famille des transporteurs ABC (homologue à ProU d’E. coli),
OpuC (ProP), et OpuD qui est un homologue de BetT, transporteur de haute affinité pour la
choline indispensable à la néo-synthèse de glycine-bétaïne chez E. coli (Kappes et al., 1996).
Contrairement aux lactocoques, B. subtilis est capable comme E. coli de synthétiser de la
glycine-bétaïne (Boch et al., 1996) lorsque la choline (précurseur) se trouve dans le milieu,
par le biais d’enzymes analogues à celles trouvées chez E. coli qui sont ici codées par
l’opéron plasmidique gbsAB.
16
1. Introduction
BusAB présente des homologies avec OpuAC et ProV bien que les sous-domaines se trouvent
inversés. L’opéron busAB semble sous contrôle osmotique, et outre la glycine-bétaïne, ce
transporteur peut également utiliser la proline mais avec une affinité moindre.
Van der Heide et Poolman (2000) nomment ce système de transport OpuABC. Pour eux, la
régulation de l’entrée de la glycine-bétaïne s’effectue au niveau de l’expression et de l’activité
du transporteur chez Lc. lactis, alors que chez Lb. plantarum, seule une régulation de son
activité est impliquée.
En effet, il a été mis en évidence chez Lc. lactis l’existence d’une protéine OpuR impliquée
dans la régulation osmotique du gène opuA (Romeo et al., 2001).
L’opéron opuA ou busA semble être induit par des changements de gradient osmotique
transmembranaire ou de pression de turgescence qui seraient transmis au système via des
distorsions de la bicouche lipidique induisant des modifications physiques du statut lipidique
membranaire (plus d’acides gras insaturés et cycliques) ressenties via des interactions
lipide/protéine (Guillot et al., 2000; van der Heide et Poolman, 2000).
Comme c’est le cas pour les deux stress physico-chimiques précédents, il semble
clairement que le stress hyper-osmotique induit des réponses croisées avec d’autres stress. La
réponse à l’hypo-osmolarité du milieu passe par l’efflux de solutés compatibles afin d’éviter
17
1. Introduction
le gonflement cellulaire. Cette réponse a essentiellement été étudiée chez les bactéries à Gram
négatif, et deux systèmes d’efflux ont été identifiés à ce jour, les canaux mécano-sensibles et
les porines.
Les canaux mécano-sensibles ont été étudiés chez E. coli (Blount et Moe, 1999;
Sukharev, 1999), trois canaux ont été mis en évidence en fonction de leur conductance :
MscL (large conductance), MscS (small) et MscM (mini), il semble que MscL et S jouent un
rôle important et redondant dans l’osmorégulation.
Il semble que ces canaux soient activés soit par la tension exercée au niveau de la membrane
soit par un état d’hydratation des protéines tel que la conformation ouverte du canal est
favorisée (Poolman et al., 2002). Chez Lactococcus lactis les gènes yncB et mscL codent pour
des protéines homologues à MscS et MscL. Seule l’activité de MscL est identifiée chez Lc.
lactis qui utilise ce type de canal pour l’efflux de solutés compatibles et la protection
cellulaire dans des conditions d’hypo-osmolarité (Folgering et al., 2005).
Les porines n’existent que chez les bactéries à Gram négatif car elles sont enchâssées
dans la membrane externe. L’expression des porines OmpF et C en réponse à l’osmolarité
extracellulaire est régulée par un système à deux composants dont la protéine membranaire
EnvZ est le senseur et OmpR l’activateur transcriptionnel (Csonka, 1989).
En réponse à un stress osmotique, une perte d’eau est constatée dans la cellule pour
maintenir une pression de turgescence constante. Ceci conduit à une modification du volume
cellulaire et des concentrations des solutés. Pour remédier à ces effets, la cellule accumule des
solutés compatibles, physiologiquement inactifs, qui permettent de rétablir la balance
osmotique.
Les solutés compatibles sont des molécules organiques très hydrosolubles qui possèdent une
charge nette nulle au pH physiologique, n’interagissent pas avec les protéines, n’interfèrent
pas, même à forte concentration (>1 M), avec les fonctions cellulaires vitales (Sleator et Hill,
2002).
18
1. Introduction
Bien que les solutés compatibles aient été décrits comme «inertes» vis-à-vis des
macromolécules biologiques, des études réalisées in vitro montrent qu’ils stabilisent
indirectement les enzymes contre les effets d’agents dénaturants comme le sel, la température
ou la dessiccation (Lipper et Galinski, 1992; Timasheff, 1993). Ces composés agiraient
comme des chaperonnes chimiques en aidant les protéines cytoplasmiques à conserver leur
état de compaction (Tatzelt et al., 1996; Bourot et al., 2000).
• Glycine bétaïne
1. Introduction
osmoprotecteur qui stimule la croissance des bactéries lactiques à pression osmotique élevée
(Csonka, 1989). Chez les entérobacteriacées et les Rhizobiacées, la glycine bétaïne joue un
rôle majeur dans l’osmorégulation (Perroud et Le Rudulier, 1985) ; la synthèse de la glycine
bétaïne dépend de la présence d’un précurseur immédiat, la choline ou la glycine bétaïne
aldéhyde (Smith et al., 1998).
Les entérobactéries et Bacillus subtilis ne peuvent pas synthétiser les solutés compatibles.
Elles les accumulent dans le milieu intracellulaire lors d’un choc osmotique grâce aux
mécanismes de transport (Glaasker et al., 1998 ; Romeo et al., 2001). Parfois l’accumulation
intracellulaire de la glycine bétaïne dépend d’un transport stimulé par un stress osmotique (Le
Rudulier, 1993).
• La proline
Les bactéries Gram – sont entièrement dépendantes de la présence de proline exogène pour
l’accumuler sous stress osmotique (Le Rudulier et Bouillard, 1993 ; Csonka, 1989).
• Le glutamate
Le taux de glutamate dans le cytoplasme augmente chez les procaryotes après exposition à
une forte osmolarité (Fujihama et Yaneyama, 1994) ; l’augmentation relative du glutamate
est moins importante chez les bactéries à Gram positif que chez les bactéries à Gram négatif
(Killham et Firestone, 1984). La teneur intracellulaire en glutamate augmente aussi lors
d’une élévation de l’osmolarité du cytoplasme (Le Rudulier, 1993) afin de maintenir
l’électroneutralité du milieu intracellulaire chez les bactéries à Gram négatif le glutamate est
important dans la maintenance de la pression de turgescence de la cellule (Neidhardt et al .,
1994)
20
1. Introduction
• Les polyols
Les polyols (les glucides et leurs dérivés polyalcools) sont les principaux solutés
compatibles, le glycérol est le prédominant (Brown et Edgley, 1980).
Chez les bactéries, les plantes et les animaux, les acides aminés et leurs dérivés sont
prédominants (Csonka, 1989 ; Kinne, 1993). Chez Pseudomonas neudocina, le glycérol est
important (Picard et al., 1994). Chez les algues et les champignons, les polyols sont limités, à
l’exception du sorbitol chez Zymomonas mobilis et du mannitol chez Pseudomonas putida
(Kets et al., 1996).
• Les sucres
Les sucres sont des solutés moins compatibles, utilisés dans l’adaptation osmotique chez
les organismes halotolérants limités. Dans la croissance normale, l’addition des sucres
provoque des altérations physiologiques et structurelles.
Ces composés ont une structure analogue à celle des ammoniums quaternaires (N est
substitué par S) : le diméthylsulfoniacétate (DMSA) est une molécule osmoprotectrice aussi
efficace que la glycine bétaïne chez les bactéries (Chambers et al., 1987).
21
1. Introduction
Les cellules peuvent être soumises à des stress dits mineurs, modérés ou létaux et elles
réagissent différemment à ces conditions. Par exemple, les cellules exposées à un stress
mineur, vont réduire leur taux de croissance mais vont être capables de s’adapter au nouvel
environnement. Quand le stress devient un peu plus intense (stress modéré), la croissance peut
être drastiquement réduite et les cellules adaptent leur métabolisme énergétique avec l’objectif
de survivre. Enfin, dans une situation de stress létal, une grande mortalité cellulaire est
observée. Dans ce cas, les bactéries survivantes développent des mécanismes leur permettant
de retrouver un état cellulaire actif. Lorsqu’elles sont, par la suite, exposées à des conditions
environnementales plus favorables (Nikolaev et al., 2006)
L’intensité du stress perçu par les cellules comprend aussi la notion de cinétique
d’application du stress. Par exemple, un changement brusque dans l’environnement, même si
l’intensité de ce changement est faible, peut être ressenti par les cellules comme un stress fort,
car elles n’ont pas eu le temps de s’adapter. Par contre, un changement lent et progressif avec
une intensité forte, peut donner aux cellules l’opportunité de développer des mécanismes
d’adaptation et, donc, de mieux résister (Avinash et al., 2008).
Les bactéries préviennent les dommages plutôt que de les réparer (Hengge-Aronis,
2002) aussi une bactérie dispose de différents systèmes protégeant la cellule des contraintes
extérieures dont les activités seront modulées par les variations des paramètres
environnementaux.
22
1. Introduction
Les régulateurs potentiels de la réponse au stress chez les bactéries sont nombreux. Il
en existe par exemple 138 chez Lc. lactis (par homologie avec des familles connues de
régulateurs) (Guédon et al., 2001). Deux types de régulateurs jouent un rôle important chez
les bactéries. Il s’agit des facteurs de transcription et des systèmes à deux composants.
Ils comprennent une protéine Histidine Kinase senseur (HK) et une protéine régulatrice de
réponse (RR). Les protéines senseurs intégrées dans la membrane s’autophosphorylent au
niveau de résidus histidine lorsqu’elles perçoivent un signal de type stress.
Elles sont alors capables d’activer les protéines régulatrices par phosphorylation. Ceci
s’effectue au niveau d’un résidu aspartate de la protéine RR. Sous leur état phosphorylé, ces
protéines RR activent une réponse cellulaire appropriée, souvent par induction
transcriptionnelle (les RR sont pour la plupart des protéines de liaison à l’ADN).
23
1. Introduction
Tableau 01: Fonction des systèmes à deux composantes chez Lactococcus lactis
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1. Introduction
La régulation de la réponse générale au stress est également contrôlée par des facteurs
de transcription (facteurs sigma) qui, en se fixant à l’ARN polymérase, lui confèrent une
spécificité de reconnaissance vis-à-vis de certains promoteurs (Haldenwang, 1995)
Les nombreux facteurs sigma bactériens ont été regroupés dans deux familles d’après leurs
similarités protéiques : la famille δ70, facteur végétatif nommé ainsi d’après le facteur δ d’E.
coli de 70 kDa) et la famille δ 54 (nommée ainsi d’après le facteur δ d’E. coli de 54 kDa)
(Wosten, 1998).
La famille δ70 est elle-même divisée en trois groupes: le premier comprend les
facteurs sigma responsables de la transcription de la plupart des gènes exprimés durant la
phase exponentielle de croissance bactérienne; le second est composé des facteurs sigma non
essentiels à la croissance bactérienne; le dernier est celui des facteurs sigma dits «alternatifs»
contrôlant la transcription des régulons spécifiques durant des conditions physiologiques
particulières (production de flagelles, sporulation), et en réponse à des stress
environnementaux (Gruber et Bryant, 1997; Wosten, 1998).
Les facteurs sigma intervenant dans la réponse au stress se répartissent dans les groupes 2 et
3. Ils sont impliqués dans la réponse aux stress cytoplasmiques ou bien extracytoplasmiques.
25
1. Introduction
le sol ou lors de la fabrication de fromages tels que le cheddar, pour lequel la température
monte jusqu’à 40°C. A l’inverse, la température est beaucoup plus faible pendant l’affinage
(8-16°C) ou le stockage du fromage. De même, la production de lactate dans les levains
provoque, quant à elle, une acidification croissante du milieu (lait). Dans ce cas, les bactéries
sont elles-mêmes à l’origine du stress acide. La pression osmotique est également susceptible
de varier significativement, notamment lors du pressage. Cette étape peut également conduire
à une limitation carbonée par l’élimination du lactose dans le lactosérum (Stuart et al., 1999).
Les mécanismes de perception du stress, essentiels pour que la cellule puisse se protéger
avant que les effets de ce stress ne soient irréversibles, sont encore peu connus chez
Lactococcus lactis, mais semblent se faire chez les autres bactéries, soit au niveau
membranaire, soit au niveau du cytoplasme (Rallu, 1999). Les effets du stress peuvent être
visualisés à plusieurs niveaux : modification du catabolisme, de l’anabolisme, de l’état
énergétique, des constituants cellulaires. Face aux différents effets du stress, les bactéries
disposent de plusieurs types de réactions qui se répartissent en trois catégories (Rallu, 1999).
• La fuite consiste, pour les bactéries capables de motilité, à rechercher des conditions
plus favorables à la croissance, mais Lactococcus lactis qui est dépourvu de flagelle ne
peut pas utiliser cette tactique.
• Le refus a pour but de diminuer l’intensité du stress, par exemple en utilisant une autre
source de nutriment lorsqu’elle est épuisée.
• La résistance devient nécessaire lorsque le stress est persistant et/ou dommageable
pour les constituants cellulaires. Elle peut être acquise soit par une modification
irréversible du matériel génétique (mutation, remaniement) conduisant à une meilleure
tolérance aux conditions environnementales, soit par l’induction de systèmes de
protection et de lutte contre le stress ou de réparation contre les dommages causés.
26
1. Introduction
Chez Lc. lactis, bien que la participation d’un mécanisme de réponse générale au stress
reste entièrement hypothétique, de nombreuses réponses au stress ont été identifiées, dont
certaines apparaissent communes à différentes conditions. Ainsi, plutôt que de décrire les
réponses mises en œuvre pour chaque type de stress que peut rencontrer Lc. lactis, celles-ci
seront décrites dans la section suivante selon leur rôle dans la cellule. Les mécanismes de lutte
contre les effets du stress sur les constituants cellulaires, l’homéostasie du cytoplasme ou
l’énergétique cellulaire seront ainsi présentés, de même que la réponse stringente induite dans
diverses conditions de stress dont la carence en acides aminés.
Ces protéines, très conservées parmi les différentes espèces bactériennes, assurent le
repliement correct des protéines nouvellement synthétisées ou endommagées et préviennent
l’agrégation des protéines altérées. Les chaperonnes initialement identifiées lors du choc
thermique sont également impliquées dans la majorité des stress chez la plupart des micro-
organismes. Chez Lc. lactis, elles sont induites en stress hyperthermique, acide et osmotique
(Whitaker et Batt, 1991; Kim et Batt, 1993; Arnau et al., 1996; Hartke et al., 1997;
Kilstrup et al., 1997; Frees et al., 2003). Le mécanisme le mieux caractérisé est l’induction
des chaperonnes DnaK, GroEL et GroES. Les chaperonnes DnaJ et GrpE ont à ce jour été
identifiées en stress hyperthermique et acide uniquement (Duwat et al., 1995; Arnau et al.,
1996; Frees et al., 2003). En revanche, l’implication des chaperonnes dans les réponses à la
carence en carbone ou en azote ou lors du stress hypothermique n’a pas été mise en évidence
chez L. lactis (Kunji et al., 1993; Hartke et al., 1994) ni chez B. subtilis (Eymann et al.,
2002; Bernhardt et al., 2003). Ceci peut certainement s’expliquer par le fait que ces
conditions ne causent pas de dommages majeurs aux protéines.
27
1. Introduction
Chez B. subtilis, les gènes codant pour les chaperonnes (opérons dnaK et groE) sont
régulés par le répresseur HrcA (Schulz et Schumann, 1996). Celui-ci réprime l’expression
des chaperonnes en se fixant sur les séquences CIRCE (Controlling Inverted Repeat
Chaperone Expression) présentes en amont des gènes (Zuber et Schumann, 1994; Hecker et
al., 1996). Ces séquences inversées répétées de 9bp sont retrouvées chez plus de 27 espèces
bactériennes (Hecker et al., 1996). L’activité du répresseur HrcA est contrôlée chez B.
subtilis par les chaperonnes GroES/EL (Mogk et al., 1997; Mogk et al., 1998).
Chez Lc. lactis, 3 unités de transcription codant pour les chaperonnes ont été
identifiées, révélant une organisation génétique particulière: l’opéron hrcA-grpE-dnaK
(Eaton et al., 1993), l’opéron groESL (Kim et Batt, 1993) et dnaJ (Van Asseldonk et al.,
1993). Leur régulation n’a pas été formellement mise en évidence, cependant elle semble
impliquer HrcA, comme chez B. subtilis. En effet, le gène codant pour ce régulateur a été
identifié (Kilstrup et al., 1997) et les 3 opérons codant pour les chaperonnes présentent une
séquence CIRCE en amont de leurs séquences codantes (Guedon et al., 2002). Il est
28
1. Intrroduction
L protéases
1.9.1.2 Les
D
Différentes protéases sont impliiquées dan
ns les réponses au sttress. Leur activité
protéolyytique a unn rôle préppondérant pour
p dégrad
der les prootéines altérrées, limitaant ainsi
l’accum
mulation de protéines anormales
a d
dans la celllule, ou pouur assurer ddes phénom
mènes de
régulation spécifiqques. 3 typees de protéaases particip
pent aux méécanismes m
majeurs de réponse
au stress: les protéaases Clp, HttrA et HflB.
Les prootéases Clp sont les pluus répanduees et les miieux caractéérisées. 4 gèènes ont étéé mis en
évidencce chez Lc. lactis
l : clpP
P qui code pour
p une sérrine protéasee (Frees et Ingmer, 19
999) et 3
gènes coodant pour des ATPasees Clp-dépeendantes, clp
lpB, clpC ett clpE. Ces ATPases seeules ont
un rôle de chaperoonnes. Leurr associatioon à ClpP confère
c unee activité prrotéolytiquee à cette
protéasee et définit sa spécificiité de substtrat (Ingmer et al., 19999). Le com
mplexe Clp dégrade
les prottéines dénatturées qui ne
n peuvent pas être rep
pliées par lees chaperonnnes, ce qui permet
d’éviterr l’accumulaation de prootéines anorrmales (Frees et Ingmeer, 1999). C
ClpP est nottamment
induite à bas pH et en stress thhermique ouu osmotiquee.
29
1. Intrroduction
1.9.1.3 Réparation
R n de l’ADN
N
D
Diverses coonditions dee stress connduisent à une
u altératioon de l’ADN
N qui est fo
ortement
dommaggeable pourr le développpement de la cellule. RecA
R est laa principale protéine im
mpliquée
N par ses propriétés reecombinantes et sa caapacité à in
dans la réparation de l’ADN nduire la
réponsee SOS. Chezz Lc. lactis,, recA est im
mpliqué dan
ns les réponnses aux ageents endommageant
l’ADN (Duwat et al.,
a 1995).
30
2. Matériel & méthodes
2.1 Matériel biologique
Lait de chamelle de
CHT2 Enterococcus faecalis Timimoune (Zadi-
CHT4 Enterococcus faecalis Karam, 1998)
GHB1 Enterococcus sp
GHB2 Enterococcus sp
GHB3 Enterococcus sp Ghars (pâte de dattes) de
GHB4 Enterococcus sp Biskra (Benmouna, 2008)
GHB5 Enterococcus sp
GHB6 Enterococcus sp
GHB7 Enterococcus sp
GHB8 Lactococcus lactis ssp diacetylactis
GHB9 Enterococcus sp
GHB10 Enterococcus sp
GHB11 Lactococcus lactis ssp diacetylactis
GHB12 Enterococcus sp
GHB13 Enterococcus sp
GHB14 Enterococcus sp
GHB15 Lactococcus lactis ssp diacetylactis
GHB16 Enterococcus sp
GHB17 Lactococcus lactis ssp diacetylactis
GHB18 Enterococcus sp
GHB19 Enterococcus sp
GHB20 Enterococcus sp
GHB21 Enterococcus sp
GHB22 Enterococcus sp
GHB23 Enterococcus sp
GHB24 Lactococcus lactis ssp diacetylactis
GHB25 Enterococcus sp
31
2. Matériel & méthodes
32
2. Matériel & méthodes
2.4 Vérification de la pureté des souches
Les souches sont ensemencées par stries sur milieu M17. Après incubation à 30°C, on
prélève une colonie isolée afin d’effectuer une coloration de Gram et une recherche de
l’enzyme catalase.
La pureté des souches est confirmée par l’étude des caractères macroscopiques et
microscopiques après coloration de Gram.
L’activité catalasique est recherchée par émulsion d’une colonie bactérienne dans
quelques gouttes d’eau oxygénée (10V). La présence de la catalase se manifeste par
l’apparition de bulles gazeuses.
Les souches sont ensemencées dans 5ml de milieu M17 liquide en absence ou en
présence de différentes concentrations de NaCl : 0.42M, 0.77M, 1.1M, 1.3M, 1.45M, 1.65M
et 1.7M. La croissance cellulaire est estimée par mesure de la densité optique par
spectrophotométrie à une longueur d’onde de 600nm.
Ce test permet de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) de NaCl ; elle
correspond à la plus faible concentration en NaCl empêchant la croissance bactérienne.
La croissance des souches est inhibée aux CMI de NaCl et elle est rétablie par
l’addition de substances osmoprotectrices au milieu de culture (Le Marrec et al., 2006).
33
2. Matériel & méthodes
On a testé la croissance des souches en milieu M17 liquide en présence de la
concentration minimale inhibitrice de NaCl et de différentes concentrations de glycine betaine
ou de proline (de 5mM à 100mM). Après incubation à 30°C pendant 72h, la croissance se
traduit par l’apparition d’un trouble bactérien.
La densité optique est mesurée à DO600nm ce qui permet de déterminer la concentration
optimale d’osmoprotecteurs assurant la meilleure croissance bactérienne.
Après avoir déterminé les concentrations optimales de proline et de glycine betaine qui
permettent de lever l’inhibition exercée par le sel, nous avons réalisé des cinétiques de
croissance en absence ou en présence de différentes concentrations de NaCl et de proline ou
glycine bétaine.
Les essais sont réalisés dans 100 ml de milieu M17 additionné de différentes
concentrations de NaCl et d’osmoprotecteurs. L’ensemencement est effectué à raison de 1%
(v/v) à partir de bactéries issues d’une pré-culture d’une nuit. L’incubation est faite à 30°C.
La croissance est estimée par mesure de la densité optique à 600 nm sur des
prélèvements effectués toutes les deux heures.
• Choc létal :
Les culots cellulaires sont repris dans 1ml de milieu M17 additionné de la CMI de NaCl
de chaque souche.
La viabilité est mesurée par étalement sur boites de milieu M17, immédiatement (T0) et
30min après le transfert dans le milieu salin (T30) (Eng Mong Lim et al., 2001).
34
2. Matériel & méthodes
• Choc adaptatif :
Les mêmes étapes du choc létal sont reprises, mais cette fois-ci le test est réalisé avec des
cellules en phase de croissance exponentielle adaptées à 0.7M NaCl pour la souche CHM7 et
à 1.2M de NaCl pour les souches OV5 et CHM6, puis repris dans 1ml de milieu M17
additionné de la CMI de NaCl de chaque souche.
Le taux de survie est égal au nombre d’unités formant des colonies (UFC) à T30 rapporté
au nombre d’UFC à T0. (Marceau et al., 2003. O’Sullivan et Condon, 1997, Eng Mong Lim
et al, 2001). Pour cela un dénombrement des cellules viables a été réalisé sur gélose M17.
Le facteur de tolérance induit par l’adaptation est déduit en calculant le rapport du taux de
survie des cellules adaptées (choc adaptatif) / cellules non adaptées (choc létal) (Flahauta et
al., 1996).
Ce test a été réalisé avec cinq souches sélectionnées (LCL, CHM7, OV5, CHM6, V13-
1). Cette activité est recherchée sur milieu solide M17 tamponné à pH=7 à l’aide d’un tampon
phosphate (KH2PO4/NaHPO4) 0,01M, additionné de 1% de lait écrémé stérile reconstitué à
10% selon la méthode décrite par Van den Berg et al. (1993) adaptée au laboratoire
(Hassaine et Beloufa, 1998 ; Zadi-Karam, 1998) et aussi en présence et en absence de
NaCl.
Le milieu est ensemencé par touche avec des cultures jeunes (18h) après incubation à
30°C pendant 48h l’activité protéolytique est révélée par l’apparition d’un halo clair autour de
chaque touche déposée, la dimension de cet halo est mesurée. Les résultats sont exprimés par
le rapport « diamètre du halo clair/diamètre de la colonie ».
35
2. Matériel & méthodes
A partir de chaque flacon nous avons prélevé 30ml du milieu que l’on réparti après
homogénéisation dans trois béchers à raison de 10ml chacun (3 essais par mesure). Sous
agitation et en mesurant le pH on ajoute goutte à goutte de la soude Dornic (N/9) jusqu'à ce
que le pH initial soit atteint.
Le volume de soude est relevé puis les résultats sont exprimés en degrés Dornic selon
la loi suivante : acidité (D°)= n x 10 (Accolas et al., 1977)
Avec : n= volume moyen (trois tests) de soude ajoutée jusqu'à l’atteinte du pH initial,
1°D= 0,1g/l d’acide lactique
Afin d’optimiser une technique de lyse cellulaire qui permettra de casser (lyser) les
cellules bactériennes nous avons procédé de différentes manières :
36
2. Matériel & méthodes
b) Lyse par des microbilles en verres :
Les cellules sont resuspendues dans de l’eau physiologique puis 250µl de suspension
bactérienne sont additionnés à 150µl de tampon d’échantillon – voir composition en annexe.
Le broyage est réalisé au fond d’un tube Eppendorf à l’aide de 100mg de billes de verre (425-
600µm Sigma Aldrich Membrane PVDF Hybond Bio-rad) sous agitation à l’aide du vortex
pendant 3x3min, avec un temps de repos dans la glace après chaque cycle.
On centrifuge le broyat pendant 15min à 10000g ; les surnageants protéiques sont récupérés
(Redon, 2005).
Les concentrations en protéines dans les extraits cellulaires sont déterminées par un
dosage de Bradford (1976) ; une gamme étalon est établie avec une solution d’albumine
bovine ou BSA (1mg/ml) préparée dans de l’eau distillée.
Une série de six tubes en triples exemplaires est préparée comme présenté dans le tableau 3 :
Tubes 1 2 3 4 5 6
Solution de BSA (µl) 0 10 20 30 40 50
Eau distillée (µl) 50 40 30 20 10 0
Réactif de Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2
Après homogénéisation, les tubes sont incubés à l’obscurité à température ambiante pendant
deux minutes. La lecture de l’absorbance est ensuite effectuée à 595 nm.
37
2. Matériel & méthodes
Les résultats permettent d’établir une courbe étalon (densité optique en fonction de la
concentration protéique).
On détermine graphiquement la concentration des protéines de l’échantillon à l’aide de la
courbe étalon par extrapolation.
38
2. Matériel & méthodes
Dés la polymérisation complète du gel, on élimine l’eau distillée et on place le peigne
afin de créer des poches puis on prépare le deuxième gel « gel de concentration » qu’on verse
par la suite au dessus du gel inferieur.
Après la polymérisation du gel de séparation, on enlève le peigne, les cuves inférieure et
supérieure sont remplies de tampon de migration (voir composition en annexe).
Le gel est prêt pour la séparation des protéines.
• Migration
La migration est réalisée en appliquant un courant continu de 50mA jusqu'à ce que le bleu
de bromophénol atteigne le bas du gel de séparation.
• Révélation
Après démoulage, le gel de concentration est éliminé et le gel de concentration est coloré
pendant une heure dans une solution de bleu de Coomasie R250 (Merck) 0.5% (voir
composition en annexe).
La décoloration est réalisée par trempage du gel dans une solution de décoloration (voir
composition en annexe).
2.14.1 Principe :
La chromatographie sur papier est une méthode de séparation dont le principe repose
surtout sur des phénomènes de partage. La phase mobile est le plus souvent un solvant
39
2. Matériel & méthodes
organique et l'eau; la phase stationnaire est constituée par l'eau elle même, adsorbée par la
cellulose du papier ou liée chimiquement à elle. Comme en chromatographie sur couche
mince, l'échantillon, mis en solution, est déposé en un point repère du papier et le solvant qui
se déplace par capillarité fait migrer les composants de l'échantillon à des vitesses variables
selon leur solubilité. Généralement, les composés les plus solubles dans l'eau ou ceux qui
forment facilement des associations par liaisons hydrogène sont fortement retenus par la
phase stationnaire et migrent donc lentement.
Lorsque l'eau est un des solvants de la phase mobile, le ou les solvants organiques doivent y
être assez solubles. C'est pourquoi, des produits comme l'acide éthanoïque, le propanol, le
phénol, ou la pyridine sont les solvants les plus fréquemment mélangés avec l'eau pour
développer un chromatogramme.
40
2. Matériel & méthodes
La feuille est mise à 60°C dans une étuve pendant 10min ; ceci permet l’apparition des
taches sur le chromatogramme révélant la présence des acides aminés.
On mesure les distances h de migration des différentes taches puis on calcule les
rapports frontaux grâce à la relation Rf = h / H, où H est la distance de migration du solvant.
41
3. Résultats et discussions
• Observation macroscopique
En milieu solide, les souches forment de petites colonies blanchâtres, rondes à contour
régulier, lisses et légèrement bombées (Figure 7).
CHM7 V13-1
Figure 7. Aspect macroscopique des cultures en milieu solide
On remarque aussi que sur milieu M17 solide les colonies de certaines souches sont plus
grandes que d’autres.
• Examen microscopique
Sous microscope, les cellules se présentent sous forme de coques isolés ou regroupés en
paires ou en petites chainettes, colorés positivement à la coloration de Gram (Figure 8). On
observe une différence de taille des cellules selon leurs origines : ainsi les cellules de CHT2 et
celles des souches isolées de Ghars sont plus grandes que celles de LCL, des CHM et des
souches isolées de viande bovine fraiche.
42
3. Résultats et discussions
LCL CHM6
La figure 9 montre l’exemple de CHM6 qui résiste à 1.1M de NaCl alors que V13-1 y est
sensible.
43
3. Résultats et discussions
1 2 3 4 5
La figure 10 et le tableau 3 regroupent les résultats obtenus pour toutes les autres souches.
Figure 10. Répartition des souches selon leur comportement en présence de 1.1M de NaCl
44
3. Résultats et discussions
45
3. Résultats et discussions
Des exemples de résultats sont montrés dans les figures 12 et 13 pour la croissance de V13-1
en milieu solide et pour CHT2 en milieu liquide.
46
3. Résultats et discussions
T : tube témoin ; 1 : CHT2 + 0M NaCl ; 2 : CHT2 + 1.1M NaCl ; 3 : CHT2 + 1.3M NaCl ;
4 : CHT2 + 1.42M NaCl ; 5 : CHT2 + 1.7M NaCl.
Le nombre de cellules est réduit d’environ 60% à 1.7M de NaCl : ceci est significatif car lors
d’un choc hyper osmotique la cellule à tendance à réduire ses activités métaboliques (Redon,
2005).
L’ensemble de ces observations nous a permis de retenir 6 souches, selon leurs aptitudes à
croitre en milieu salé et aussi selon leurs origines, pour la suite du travail.
47
3. Résultats et discussions
T : tube témoin,
1: CHM6 + 0M NaCl,
2: CHM6 + 1.1M NaCl,
3: CHM6 + 1.3M NaCl
4: CHM6 + 1.42M NaCl+Proline,
5 : CHM6 + 1.7M NaCl+Glycine Bétaïne
Figure 15. Croissance en présence de sel et d’osmoprotecteurs
La figure 16 regroupe les résultats obtenus pour les différentes souches bactériennes en
utilisant la proline ou la glycine bétaine comme osmoprotecteur.
DO 600nm DO 600nm
48
3. Résultats et discussions
Le rôle osmoprotecteur de la proline et de la glycine bétaïne a été rapporté par Britten (1962)
Csonka (1981, 1989) et Glaasker et al (1993).
Bouras-Boublenza (2003) a étudié l’effet protecteur de la glycine bétaïne et la proline chez
certaines souches CHT et a montré que ce sont les osmoprotecteurs les plus efficaces. Ceci a
été confirmé par Tahri (2000) et Delileche (2005). Toutes ces observations sont en accord
avec celles de Romeo et al. (2001) qui ont remarqué que la proline et la glycine bétaïne
assuraient une bonne osmoprotection chez les lactocoques.
Ces observations sont à relier au fait que le lait de chamelle, bien qu’assez salé, abrite des
lactocoques car il contient des quantités importantes (11%) de proline pouvant assurer une
osmprotection (Knoess et al., 1986).
Après avoir déterminé les concentrations optimales de proline et de glycine bétaïne qui
permettent de lever l’inhibition exercée par le sel, nous avons sélectionné six souches (LCL,
CHM7, V13-1, CHM6, OV5 et CHT2) pour lesquelles les concentrations optimales de proline
et de glycine bétaïne sont montrées dans les tableaux 4 et 5 suivants :
49
3. Résultats et discussions
50
3. Résultats et discussions
51
3. Résultats et discussions
52
3. Résultats et discussions
Taux de
1 0.5 0.5 0.16 0.2 0.66 0.5 0.5 0.25 0.16 0.5 0.4 0.3 0.22 0.28
croissance (h-1)
1 : 0M , 2 : 1.1M , 3 : 1.3M , 4 : 1.45M+ Proline, 5 :1.45M+Glycine Bétaïne
Ces résultats indiquent que le sel affecte la survie et/ou la croissance des cellules comme cela
a été rapporté (Csonka, 1989 ; Potts, 1994): dans le cas d’un choc hyper-osmotique,
la diminution de l’activité de l’eau du cytoplasme inhibe certaines fonctions cellulaires
comme l’adsorption de nutriments, la réplication de l’ADN et la biosynthèse des
macromolécules.
La tolérance au stress salin des bactéries est évaluée par leur taux de survie à un choc
osmotique.
Le phénomène d’adaptation au stress osmotique a déjà été observé chez plusieurs bactéries.
(Bearson et al., 1997. Eng Mong Lim et al., 2001) ont rapporté qu’une incubation à une
concentration osmotique élevée ou à un pH acide non létal permettait aux cellules de
développer une tolérance à un stress létal.
Nous avons appliqué ce type de test à trois souches en mesurant le taux de survie au
stress osmotique de type létal pendant 30min à (1.1M NaCl pour CHM7 ; 1.45M pour OV5 et
CHM6).
Dans une première étape, les cellules en phase exponentielle étaient cultivées
préalablement en absence de sel avant d’être exposées à un stress osmotique de type létal.
Le taux de survie est calculé pour les trois souches ; il est de 1.65x10-5 pour OV5, de 3x10-4
pour CHM6 et de 1x10-4 pour CHM7.
Dans une seconde étape le même test de survie était effectué mais avec des cellules en
phase exponentielle de croissance adaptées à un stress non létal (exposition pendant 30min à
une concentration en sel de 0.7M pour CHM7 ; 1.3 M pour OV5 et CHM6).
On peut alors remarquer que le taux de survie est supérieur à celui enregistré lors du
premier test. Les taux de survie sont les suivants : 1.55x10-3 pour OV5, 4.5x10-3 pour CHM6,
enfin celui de CHM7 est de 1x10-2.
53
3. Résultats et discussions
Les résultats de ces différents tests sont regroupés dans la figure 18.
Figure 18. Test de survie des souches étudiées
On constate donc que les bactéries adaptées sont plus tolérantes au stress osmotique
que les bactéries non adaptées ; la souche CHM7 adaptée devient 100 fois plus tolérante que
lorsqu’on lui applique un stress létal sans adaptation. La même constatation est faite pour les
deux autres souches ; on relève que les souches OV5 et CHM6 sont 94 fois et 15 fois
respectivement plus tolérantes que lorsqu’on les cultive préalablement dans un milieu
contenant une concentration de NaCl non létale.
Ces résultats rejoignent ceux observés par Eng Mong Lim et al (2001) et ceux de
Karam et Zadi-Karam (2005) qui suggèrent fortement que lorsque les bactéries sont
adaptées à des stress non létaux, des synthèses protéiques sont induites et sont responsables
d’une augmentation significative de la tolérance au stress.
54
3. Résultats et discussions
1 2
1 2
5 5
4 3 4 3
a b
Ces résultats montrent qu’à 0M de NaCl, à l’exception de CHM6, toutes les souches
testées présentent une activité protéolytique se manifestant par un halo clair autour de la
colonie bactérienne. Ce type de résultats a été observé pour d’autres souches de la collection
(Zadi-Karam, 1998 ; Hassaine et Beloufa, 1998 ; Belkheir, 2004 ; Roudj et al., 2009).
On peut donc dire que ces souches disposent de protéases et que l’activité protéolytique varie
d’une souche à une autre.
55
3. Résultats et discussions
56
3. Résultats et discussions
Nos observations nous conduisent à suggérer que ces bactéries utilisent les produits de la
protéolyse (dégradation de la caséine) afin de mieux résister au stress exercé par le sel et que
l’activité protéolytique est sous l’influence de la concentration en sel dans le milieu.
Les résultats montrent que lorsque CHM6 est ensemencée dans un milieu qui ne
contient pas de sel, elle est légèrement plus acidifiante que lorsqu’elle est en présence de
NaCl. On note qu’à 8h d’incubation (phase exponentielle), le pH est presque le même en
présence ou en absence de sel et reste compris entre pH 6.4 et pH 6.8.
Le pH continu de baisser tout au long du test, suite à la production d’acide lactique, pour
atteindre pH 3.7 en absence de sel, et pH 4 en présence de la CMI de NaCl et proline.
57
3. Résultats et discussions
Les résultats obtenus pour les échantillons issus de différents traitements de lyse de la souche
CHM6 cultivée en présence ou absence de NaCl avec ou sans osmoprotecteur sont regroupés
dans le tableau 7.
58
3. Résultats et discussions
On peut déduire à partir de ces résultats que la technique de lyse la plus adéquate pour
casser les cellules de la souche CHM6 est obtenue en utilisant des microbilles en verre, suivie
par celle utilisant la congélation/ décongélation.
Les résultats obtenus par électrophorèse SDS-PAGE des échantillons sont présentés
dans la figure 24.
On note que la synthèse protéique la plus importante est obtenue à 1.3M de NaCl et ceci
quelle que soit la technique de lyse utilisée.
59
3. Résultats et discussions
Figure 24. Profils protéiques de lysats obtenus avec différents traitements de lyse de la
souche CHM6 cultivée en absence de sel.
La figure 25 présente les profils protéiques obtenus pour la souche CHM6 cultivée à 30°C en
absence ou en présence de NaCl (1.1M, 1.3M, 1.42M+ Proline, 1.42M+Glycine Bétaïne) et à
deux temps d’incubation (18h et 48h).
60
3. Résultats et discussions
Figure 25. Protéines totales de la souche CHM6 cultivées dans différentes conditions
Piste 1 : absence de NaCl Piste 7 : absence de NaCl
Piste 2 : 0M de NaCl Piste 8 : 1.1M de NaCl
Piste 3 : 1.1M de NaCl 18h d’incubation Piste 9 : 1.33M de NaCl 48h d’incubation
Piste 4 : 1.33M de NaCl Piste 10: 1.45M de NaCl+ P
Piste 11 : 1.45M de NaCl+ GB
Piste 5 : 1.45M de NaCl+ P
Piste 6 : 1.45M de NaCl+ GB
61
3. Résultats et discussions
Ceci suggère que des protéines de stress sont synthétisées et que d’autres sont catabolisées ou
inhibées lorsque la souche est soumise à de fortes osmolarités
Plusieurs auteurs ont expliqué que les protéines synthétisées lors d’un choc osmotique sont les
mêmes que celles synthétisées durant un choc thermique (Heat Shock Protein) (Elmanasser,
2006) suggérant que lors d’un choc thermique les bactéries adaptées à ce genre d’agression
développent aussi une tolérance au stress osmotique (protection croisée).
62
3. Résultats et discussions
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figure 26. Chromatogramme des contenus cellulaires de la souche CHM6 cultivé en absence
et en présence de sel et d’osmoprotecteurs
Piste 1 : absence de NaCl
Piste 7 : absence de NaCl
Piste 2 : 1.1M de NaCl 18h d’incubation
Piste 8 : 1.1M de NaCl
Piste 3 : 1.33M de NaCl
Piste 9 : 1.33M de NaCl 48h d’incubation
Piste 4 : 1.45M de NaCl+ P
Piste 10: 1.45M de NaCl+ P
Piste 5 : 1.45M de NaCl+ GB
Piste 11 : 1.45M de NaCl+ GB
63
3. Résultats et discussions
Cette technique nous a permis de montrer l’accumulation de proline et de glycine betaine dans
les cellules bactériennes ; on remarque aussi que l’intensité des spots est fonction du stress
osmotique.
La glycine betaine est d’une grande intensité chez la souche CHM6 cultivée à des
concentrations en NaCl élevées plutôt que dans les cellules cultivées dans un milieu exempte
de NaCl cette intensité est due à l’accumulation de cette substance dans le milieu
intracellulaire dans des conditions d’hyper salinité.
La proline (Rf = 0.52) a été mise en évidence mais son intensité est moindre par rapport a
l’intensité de la glycine bétaïne (Rf = 0.83). La présence de proline à 0M de NaCl est liée au
métabolisme des lactocoques qui sont dotés de peptidases spécifiques des prolines, pour la
libérer des peptides (Monnet, 1993).
64
Conclusion
L’étude des mécanismes de résistance au sel chez les bactéries lactiques est importante pour
la sélection des ferments lactiques utilisés en milieu salin dans les procédés industriels
Ce travail a permis d’explorer les mécanismes engendrés dans la résistance au sel et d’évaluer
puis comparer cette résistance chez les lactocoques et entérocoques du Laboratoire de
Biologie des Microorganismes et Biotechnologie
En effet après confirmation des caractéristiques des souches utilisées dans ce travail nous
avons noté qu’il existe un groupe de bactéries qui à la faculté de croitre à 1.1M NaCl.
De plus ce travail permet de confirmer que la résistance au sel est liée à l’accumulation
d’osmoprotecteurs dans le cytoplasme ; les résultats ont montré que la glycine bétaïne et la
proline ont un effet osmoprotecteur efficace sur les souches étudiées. La recherche de la
concentration optimale d’osmoprotecteur a montré que c’est la glycine bétaïne qui permet la
croissance la plus élevée en présence de sel pour toutes les souches, à l’exception de CHM7
pour qui l’osmoprotecteur le plus efficace est la proline.
La comparaison des cinétiques de croissance des bactéries cultivées dans un milieu hyper salé
montre des phases de latence beaucoup plus prononcées, et aussi que les concentrations
élevées en NaCl n’ont aucun effet sur l’activité acidifiante des souches. Si la production de
l’acide lactique est associée à la croissance bactérienne, l’activité protéolytique est stimulée
en présence de NaCl.
Ce travail permet également de confirmer que la tolérance au stress salin, évaluée par le taux
de survie, est plus importante lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu sub-optimal.
Le facteur de tolérance au stress est 100 fois plus élevé dans ces mêmes conditions.
Enfin, l’étude par la chromatographie de partage du contenu cellulaire en absence ainsi qu’en
présence de différentes concentrations de sel et à différents temps d’incubation a montré qu’il
y’avait une accumulation des deux substances osmoprotectrices à l’intérieur des cellules
stressées, ceci confirme le rôle osmoprotecteur important que joue la glycine bétaïne et la
proline pour lever l’inhibition de croissance exercée par les fortes concentrations de sel.
Nos résultats montrent qu’il serait intéressant d’approfondir cette étude de la résistance au sel
des bactéries lactiques au vu de leur importance actuelle en industrie agroalimentaire.
65
Conclusion
66
ANNEXE
Milieux de culture
Na-β-glycérophosphate 19.0 g
• Lait écrémé :
Lait écrémé 10 g
‐ Na2HPO4, 12H2O : le poids moléculaire égal à 71.63 g/l d’eau distillée correspond à
0.2M
Préparation du tampon :
Tris 3.3 g
SDS 14.4 g
Glycérol 1g
Eau distillée 1000 ml
qsp
• Tampon d’échantillon
Tris 0.15 g
SDS 0.4 g
Glycérol 2g
Bleu de bromophenol 0.01g
Β-mercaptoéthanol 0.05 ml
Eau distillée 100 ml
qsp
Tris 50Mm
EDTA 5mM
Tris-HCl 0.09mM
EDTA 2.80mM
Acide Borique 0.09mM
• Tampon de charge
Glycérol 40%
Réactifs
• Réactif de bradford
Solutions
11% 5%
TEMED (N,N,N-tétraméthyléne 18 60
diamine) solution commerciale
(Kodak) (µl)
‐ Acrylamide Mix 30% : 29% Acrylamide + 1% N,N méthyléne bisacrylamide.
‐ Solution de coloration
Acide acétique 10 ml
‐ Solution de décoloration
Acide acétique 1
Eau 1
¾ Système de migration N°3
Ethanol 60
Acide acétique 20
Eau 20
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RESUME
55 coques lactiques sont mis en présence de concentrations croissantes de sel afin de déterminer la CMI de NaCl pour
chacune des souches, les résultats ont montré qu’il existe des souches dont la croissance est inhibée à 1.1M NaCl,
d’autres qui ont la faculté de croitre au delà de cette concentration et que la CMI varie d’une souche à une autre et
atteint 1.65M pour CHT2 ; aucune croissance n’est enregistrée à 1.7M.
Ceci nous a conduit à étudier l’osmoprotection par ajout de proline ou glycine bétaïne à différentes concentrations au
milieu hyper salé ; les résultats montrent que ces deux substances ont un effet osmoprotecteur efficace sur nos souches
dans ces situations de contraintes hyper-osmotiques.
Nous avons ensuite étudié l’effet du NaCl sur la croissance des bactéries. Les résultats montrent que les phases de
latence sont prolongées en fonction des concentrations de NaCl, et aussi qu’il n’a aucun effet sur l’activité acidifiante
des souches. La production de l’acide lactique est associée à la croissance bactérienne. La présence de NaCl stimule
l’activité protéolytique ; le taux de survie est plus important lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu sub-
optimal ; le facteur de tolérance au stress est 100 fois plus élevé dans ces mêmes conditions.
L’analyse des protéines totales de la souche CHM6 par SDS-PAGE en présence et en absence d’un stress salin montre
l’apparition et/ou la disparition de quelques protéines
L’estimation qualitative de l’accumulation de la proline ainsi que de la glycine bétaïne par chromatographie de partage
montre qu’il y a passage des deux substances du milieu extracellulaire vers l’intérieur des cellules de la CHM6 cultivées
en présence de NaCl.
Mots clés : bactéries lactiques, croissance, NaCl, osmoprotecteurs, acidification, protéolyse, taux de croissance, facteur
de tolérance, SDS-PAGE, chromatographie de partage, stress osmotique.
SUMMARY
The MIC of NaCl of 55 lactic coccis were determined in M17 medium with several salt concentrations, the results
showed that there exist strains whose growth is inhibited by 1.1M of salt while others grew beyond this concentration
and that the MIC varies from a strain to another for example CHT2 was inhibited by 1.65M of NaCl, no growth was
recorded in 1.7M.
This led us to study the osmoprotection by the addition of proline or glycine betain with various concentrations in the
M17 hyper-salted medium, the results showed that these two substances have an osmoprotector effect on our strains in
these situations of hyper-osmotic stress.
Then we studied the effect of salt on the growth of the bacteria, the results reveal that the latency phases are prolonged
according to the NaCl concentrations, also it has no effect on the acidifying activity of the strains, the production of the
lactic acid is associated to the bacterial growth but that it has a capacity to stimulate the proteolytic activity, the survival
rate is more important when the cells are cultivated in an sub-optimal medium and that the tolerance factor to the salt
stress is 100 times higher under these same conditions. The analysis of total proteins contents of CHM6 by SDS-PAGE
in the presence and the absence of salt stress, evidenced by the appearance and/or the disappearance of some proteins
The accumulation of the proline as of the glycine betain by qualitative chromatography reveal that these two substances
are accumulated in the bacterial cells CHM6 cultivated in the presence of salt stress.
Key words : lactic acid bacteria, growth, NaCl, osmoprotectant, acidification, proteolysis, survival rate, tolerance
factor, SDS-PAGE, chromatography of division, osmotical stress
اﻟﻤﻠﺨﺺ
ﺳﻼﻟﺔ ﻣﻦ ﺑﻜﺘﻴﺮﻳﺎ اﻟﻠﺒﻦ وﺿﻌﺖ ﻓﻲ وﺳﻂ ﻏﺬاﺋﻲ ﻳﺤﺘﻮي ﻋﻠﻰ ﻧﺴﺒﺔ ﻋﺎﻟﻴﺔ ﻣﻦ اﻟﻤﻠﺢ ﺑﺘﺮاآﻴﺰ ﻣﺘﺰاﻳﺪة ﻗﺼﺪ ﺗﺤﺪﻳﺪ اﻟﺘﺮآﻴﺰ اﻟﻤﻠﺤﻲ اﻷدﻧﻰ اﻟﻤﺜﺒﻂ ﻟﻠﻨﻤﻮ55
وﺑﺎﻟﺘﺎﻟﻲ،وﻣﺠﻤﻮﻋﺔ أﺧﺮى ﻟﻬﺎ اﻟﻘﺪرة ﻋﻠﻰ اﻟﻨﻤﻮ ﻋﻨﺪ ﺗﺮاآﻴﺰ ﻋﻠﻴﺎ1.1M اﻟﻨﺘﺎﺋﺞ أﻇﻬﺮت أن ﻣﺠﻤﻮﻋﺔ ﻣﻦ اﻟﺴﻼﻻت ﻻ ﺗﻨﻤﻮ ﻋﻨﺪ،اﻟﺨﺎص ﺑﻜﻞ ﺳﻼﻟﺔ
. اﻟﻤﻠﺢ1.7 M ﻟﻢ ﻧﺴﺠﻞ ﻧﻤﻮا ﻋﻨﺪ اﻟﺘﺮآﻴﺰ.ﻓﺎﻟﺘﺮآﻴﺰ اﻟﻤﻠﺤﻲ اﻟﻤﺜﺒﻂ ﻟﻠﻨﻤﻮ ﻳﺨﺘﻠﻒ ﻣﻦ ﺳﻼﻟﺔ ﻷﺧﺮى
دراﺳﺔ اﻟﺤﻤﺎﻳﺔ اﻷﺳﻤﻮزﻳﺔ ﻋﻦ ﻃﺮﻳﻖ اﻟﺒﺮوﻟﻴﻦ واﻟﻘﻠﻴﺴﻴﻦ ﺑﻴﺘﻴﻴﻦ ﺑﺘﺮاآﻴﺰ ﻣﺨﺘﻠﻔﺔ ﻓﻲ اﻟﻮﺳﻂ اﻟﻐﺬاﺋﻲ اﻟﻌﺎﻟﻲ اﻟﻤﻠﻮﺣﺔ أﻇﻬﺮت أن ﻟﻠﻤﺎدﺗﺎن ﺗﺄﺛﻴﺮ إﻳﺠﺎﺑﻲ
ﻓﻌﺎل آﻤﺤﺎﻓﻆ أﺳﻤﻮزي ﻋﻨﺪ اﻟﺴﻼﻻت
ﻟﻪ ﺗﺄﺛﻴﺮ إﻳﺠﺎﺑﻲ ﻋﻠﻰ اﻟﺘﺤﻠﻞ, ﺗﻢ ﻗﻤﻨﺎ ﺑﺪراﺳﺔ ﺗﺄﺛﻴﺮ اﻟﻤﻠﺢ ﻋﻠﻰ ﻣﺮاﺣﻞ ﻧﻤﻮ اﻟﺒﻜﺘﻴﺮﻳﺎ ﻓﺎﺳﺘﻨﺘﺠﻨﺎ ﺗﺰاﻳﺪ ﻓﻲ ﻣﺪة ﻣﺮﺣﻠﺔ اﻟﺘﺄﻗﻠﻢ ﻋﺪم ﺗﺎﺗﺮاﻟﻤﻔﻌﻮل أﻟﺘﺤﻤﻴﻀﻲ
.أﻟﺒﺮوﺗﻴﻨﻲ
( ﺑﻮاﺳﻄﺔ اﻟﺮﺣﻼن اﻟﻜﻬﺮﺑﺎﺋﻲ ﻓﻲ وﺟﻮد أو ﻋﺪم وﺟﻮد ﺗﻮﺗﺮ ﻣﻠﺤﻲ ﺑﻴﻦ ﻇﻬﻮر أو واﺧﺘﻔﺎء ﺑﻌﺾCHM6) إن ﻓﺤﺺ اﻟﺒﺮوﺗﻴﻨﺎت اﻟﺨﻠﻮﻳﺔ ﻟﻠﺴﻼﻟﺔ
.اﻟﺒﺮوﺗﻴﻨﺎت
اﻟﺘﻘﻴﻴﻢ اﻟﻨﻮﻋﻲ ﻟﺘﺮاآﻢ اﻟﺒﺮوﻟﻴﻦ واﻟﻐﻠﺴﻴﻦ ﺑﻴﺘﺎﺑﻴﻦ ﻋﻦ ﻃﺮﻳﻖ اﻟﻜﺮوﻣﺎﺗﻮﻏﺮاﻓﻴﺎ ﻋﻠﻰ اﻟﻮرق ﺑﻴﻦ أﻧﻪ ﻳﻮﺟﺪ اﻧﺘﻘﺎل ﻟﻠﻤﺎدﺗﻴﻦ ﻣﻦ اﻟﻮﺳﻂ اﻟﺨﺎرج ﺧﻠﻮي إﻟﻰ
. ﻓﻲ ﺷﺮوط اﻟﺘﻮﺗﺮ اﻟﻤﻠﺤﻲCHM6 داﺧﻞ ﺧﻼﻳﺎ اﻟﺴﻼﻟﺔ
: اﻟﻜﻠﻤـــــﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎﺣﻴﺔ
- آﺮوﻣﺎﺗﻮﻏﺮاﻓﻴﺎ ﻋﻠﻰ اﻟﻮرق – ﺗﻮﺗﺮ ﻣﻠﺤﻲ- ﻋﺎﻣﻞ اﻟﺘﻘﺒﻞ- ﻧﺴﺒﺔ اﻟﻨﻤﻮ- اﻟﺘﺤﻠﻞ اﻟﺒﺮوﺗﻴﻨﻲ- اﻟﺘﺤﻤﻴﺾ- – ﺣﻤﺎﻳﺔ اﺳﻤﻮزﻳﺔNaCl - اﻟﺒﻴﻜﺘﻴﺮﻳﺎ اﻟﺒﻨﻴﺔ –اﻟﻨﻤﻮ
.SDS-PAGE