Cromataografía

Definición
La cromatografía es un método que permite separar, identificar o cuantificar los
componentes de mezclas complejas, que por otras técnicas no pueden resolverse, está
asociada en la diferente velocidad de migración que adquieren los componentes de una
mezcla al hacerlos pasar a través de una fase estacionaria, que se fija a una columna o
superficie sólida, bajo la influencia de una fase móvil con la que es inmiscible, aquellos
compuestos que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven
lentamente con el flujo de la fase móvil, mientras que los que se unen débilmente se
mueven con rapidez (Gallego, P., Garcinuño, M., & Morcillo, O., 2013). En todo
proceso cromatográfico la fase móvil es la encargada de transportar los solutos a través
de la fase estacionaria. Ambas fases han de ser elegidas de manera que los componentes
a separar se distribuyan de distinta manera entre ellas (Gismera, M., Quintana, M., &
Da, D., 2012).

Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan

en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa o cuantitativamente,
mediante observación o registro de datos, después de que haya tenido lugar la
separación de los componentes de la mezcla. (Gallego, P., Garcinuño, M., & Morcillo,
O., 2013).

En definitiva, la diferente movilidad o velocidad de migración de los analitos en la fase

móvil a su paso a través de la fase estacionaria, provoca la separación de los
compuestos. (Gismera, M., Quintana, M., & Da, D., 2012).

El biólogo ruso Miguel Tsweet fue el primero en realizar la cromatografía, él consiguió

la separación de los distintos componentes coloreados de un extracto vegetal. Cabe
recalcar que la cromatografía en la actualidad es aplicada también al análisis de
sustancias incoloras (Gismera, M., Quintana, M., & Da, D., 2012).

Clasificación
Existen distintos criterios para clasificar los métodos cromatográficos:
1) Según el soporte donde tiene lugar la separación: Abierto (cromatografía
plana) y Cerrado (cromatografía de columna) (Gallego, P., Garcinuño, M., &
Morcillo, O., 2013).

Cromatografía plana
- Cromatografía en capa fina: La fase estacionaria esta excedida sobre un soporte
solido inerte de vidrio, plástico o aluminio. La muestra para análisis se aplica
por medio de un tubo capilar sobre la superficie de una capa fina adsorbente en
forma de banda o punto.
- Cromatografía en papel: Se denomina de esta forma a la cromatografía plana que
emplea celulosa como fase estacionaria (Gismera, M., Quintana, M., & Da, D.,
2012).

Cromatografía en columna: La fase estacionaria se encuentra empaquetada en

el interior de una columna generalmente fabricada en acero, polímero o vidrio
(cromatografía de gases, líquidos) (Gismera, M., Quintana, M., & Da, D., 2012).

2) Según el estado físico de las fases

- El estado físico de la fase móvil o eluyente (cromatografía de gases, de líquidos,
de fluidos supercríticos) (Gallego, P., Garcinuño, M., & Morcillo, O., 2013).

- El estado físico de la fase estacionaria o lecho (CGL,CGS,CLL,CLS) (Gallego,

P., Garcinuño, M., & Morcillo, O., 2013).
Cromatografía gas- liquido: Este tipo de cromatografía utiliza como fase móvil
un gas y como fase estacionaria un líquido.
Cromatografía gas-solido: Esta modalidad de cromatografía se caracteriza por
tener como fase móvil un gas y como fase estacionaria un sólido
Cromatografía liquido-liquido: En este caso la fase móvil, al igual que la fase
estacionaria, es un líquido.
Cromatografía liquido-solido: En este tipo de cromatografía la fase móvil es un
líquido y la fase estacionaria un sólido (Gismera, M., Quintana, M., & Da, D.,
2012).

3) Según la composición de la fase móvil: (Cromatografía isocratica, de

gradiente) (Gallego, P., Garcinuño, M., & Morcillo, O., 2013).

Cromatografía de elución: Se denomina elución isocratica si durante todo el

proceso cromatográfico se trabaja sin variar la composición de la fase móvil.

2
 Esta técnica cromatográfica consiste en poner una única porción de muestra en
contacto con la fase estacionaria, cuantas más veces tenga lugar la distribución
de moléculas entre la fase móvil y la estacionaria, más eficaz será la separación.
La fase móvil utilizada es comúnmente llamada eluente o eluyente.
- Cromatografía de gradiente: Se denomina elución de gradiente cuando se ha
cambiado la composición del eluente durante el proceso de separación. Es
utilizada cuando hay separaciones difíciles y no se puede conseguir una
composición de fase móvil adecuada que proporcione la resolución deseada.
(Gismera, M., Quintana, M., & Da, D., 2012).

4) Según la polaridad de la fase estacionaria: (cromatografía en fase normal, en

fase de reversa) (Gallego, P., Garcinuño, M., & Morcillo, O., 2013).

- Cromatografía en fase normal: En esta modalidad la fase estacionaria es más

polar que la fase móvil. Normalmente la columna esta rellena con una sílice
enlazada a un resto orgánico que posee un grupo polar (dioles, aminos). La
polaridad de este grupo controla la selectividad de la fase estacionaria. La
elución de lleva a cabo con disolventes o mezcla de disolventes de polaridad
inferior a la fase estacionaria (dietiléter, cloroformo).
- Cromatografía en fase inversa: En este caso la fase estacionaria es menos polar
que la fase móvil. Debido a su versatilidad, la cromatografía en fase inversa es la
habitualmente utilizada en la mayoría de aplicaciones. Como relleno para la fase
estacionaria se emplean cadenas hidrocarbonadas de distinta longitud, tal como
C8 o C18, químicamente unidas a una base de sílice. La fase móvil suele estar
constituida por un disolvente o mezcla de disolventes de elevada polaridad. El
papel de la fase móvil en este tipo de cromatografía es de gran importancia, ya
que con solo uno o dos tipos de fases estacionarias y modificando la naturaleza y
composición de la fase móvil, pueden obtenerse separaciones que van desde
hidrocarburos alifáticos hasta separaciones de enantiómeros (Gismera, M.,
Quintana, M., & Da, D., 2012).

5) Según el mecanismo de separación: (Cromatografía de adsorción, reparto,

intercambio iónico, afinidad, filtración en gel o de exclusión molecular)
(Gallego, P., Garcinuño, M., & Morcillo, O., 2013).

- Cromatografía de adsorción: Los componentes de la muestra son retenidos

mediante adsorción selectiva en la superficie de un sólido que constituye la fase
3
 estacionaria. Las moléculas de soluto y disolvente (fase móvil) compiten por las
posiciones en el adsorbente. Este mecanismo es el más habitual en cromatografía
liquido -sólido.
- Cromatografía de reparto: La fase estacionaria es un líquido que se encuentra
impregnado en un soporte sólido. El soluto se reparte entre la fase estacionaria
liquida y la fase móvil de acuerdo con su solubilidad en cada una de ellas.
- Cromatografía de intercambio iónico: La fase estacionaria es un sólido que
contiene grupos cargados positiva y negativamente, teniendo la capacidad de
separar especies iónicas. Los solutos de carga opuesta a la fase estacionaria son
atraídos por esta mediante fuerzas electrostáticas.
- Cromatografía de exclusión molecular: Este tipo de separación cromatográfica,
es también llamada de filtración o de permeación en gel, la fase estacionaria está
constituida por un polímero entrecruzado de tamaño de poro definido. Las
moléculas grandes, no compatibles con el tamaño de poro, siguen su avance,
mientras que las más pequeñas quedan retenidas en los intersticios del gel. Esta
modalidad cromatográfica es útil para especies neutras de alto peso molecular
realizándose la separación en función de su tamaño.
- Cromatografía de afinidad: Permite la separación de mezclas por su interacción
especifica con un determinado ligando de actividad; enzima- sustrato, antígeno
-anticuerpo (Gismera, M., Quintana, M., & Da, D., 2012).

También la cromatografía puede ser empleada con fines preparatorios o analíticos,

mediante la cromatografía preparatoria se pueden separar los componentes de una
mezcla para posteriormente ser utilizados, constituyendo así un método de
identificación y determinación de la pureza de compuestos, la cromatografía analítica
funciona con cantidades mas pequeñas de material e intenta normalmente determinar las
proporciones relativas de analitos presentes en una mezcla ( identificación y
cuantificación ) (Gallego, P., Garcinuño, M., & Morcillo, O., 2013).

Adsorbentes y disolventes
Los dos adsorbentes (fase estacionaria) más ampliamente utilizados son el gel de sílice
(SiO2) y la alúmina (Al2O3), ambas de carácter polar. La alúmina anhidra es el más
activo de los dos, es decir, es el que retiene con más fuerza a los compuestos; por ello se
utiliza para separar compuestos relativamente apolares (hidrocarburos, haluros de

4
alquilo, éteres, aldehídos y cetonas). El gel de sílice, por el contrario, se utiliza para
separar sustancias más polares (alcoholes, aminas, ácidos carboxílicos). El proceso de
adsorción se debe a interacciones intermoleculares de tipo dipolo‐dipolo o enlaces de
hidrógeno entre el soluto y el adsorbente. El adsorbente debe ser inerte con las
sustancias a analizar y no actuar como catalizador en reacciones de descomposición.

En general los más empleados comúnmente son:

• Celulosa • Oxido de magnesio

• Sulfato cálcico (yeso) • Alúmina

• Sílice • Carbón activo

• Florisil

El orden de elución de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase

móvil o eluyente. Este puede ser un disolvente único o dos miscibles de distinta
polaridad. En el siguiente recuadro se recoge por orden creciente de fuerza eluyente los
disolventes más comúnmente empleados.

Hexano < tetraclorometano < cloroformo < diclorometano < acetato de etilo < acetona <
2‐propanol < metanol < agua

En general, estos disolventes se caracterizan por tener bajos puntos de ebullición y

viscosidad, lo que les permite moverse con rapidez. Raramente se emplea un disolvente
más polar que el metanol. Usualmente se emplea una mezcla de dos disolventes en
proporción variable; la polaridad de la mezcla será el valor promediado en función de la
cantidad de cada disolvente empleada. El eluyente idóneo para cada caso ha de
encontrarse por "el método del ensayo y del error"(Placa & Fundamento, n.d.).

Los eluyentes más empleados son:

• Éter de petróleo • Cloroformo

• Ciclohexano • Éter dietílico

• Benceno • Acetato de etilo

• Tetracloruro de carbono • Acetona

• Diclorometano • N- propanol

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• Etanol • Agua

• Metanol • Ácido acético

6
Parámetros Básicos de cromatografía
Parámetros básicos de cromatografía

Un parámetro es una cantidad que puede tener distintos valores y que caracteriza un
proceso, una operación o un resultado. La parametrización de datos en cromatografía,
como en otros métodos facilita la tabulación y la comunicación de dichos
datos[ CITATION Vil04 \l 12298 ].

Constantes de Distribución

Al encontrarse un soluto disperso en una fase que entra en contacto con otra, ocurre un
fenómeno de distribución, en el cual dicho soluto puede tener mayor afinidad a alguna
de las dos fases. De esta manera, se genera un equilibrio entre la cantidad de soluto que
existe en una fase y en otra. La constante asociada es la llamada constante de
distribución, que se define para un soluto A como:

𝐷� = � 1 /� 2

Donde [A]1 y [A]2 son la concentración de A en la fase 1 y 2

respectivamente[ CITATION UNA07 \l 12298 ].

Factores de influencia en la retención

La retención que ocurre del soluto en la fase estacionaria, se debe generalmente a la

diferencia de polaridades entre las fases estacionaria y la móvil, promoviendo que el
soluto se reparta entre ellas según su coeficiente de distribución[ CITATION UNA07 \l
12298 ].

En la cromatografía de gases, el to, es evaluado convenientemente a partir del tiempo de

retención del “pico de aire”. En la cromatografía de líquidos, cualquier compuesto no
retenido puede usarse como muestra para medir el to.

El tiempo muerto de la columna puede usarse para determinar el llamado tiempo de

retención ajustado o corregido, t’R.

t'R = tR – to

Retención y Equilibrio en Cromatografía

El soluto se encuentra en un equilibrio de distribución entre la fase móvil y la
estacionaria, y dependiendo del desplazamiento de dicho equilibrio es la retención del
mismo. Una importante medida de la proximidad de bandas es el llamado factor de
separación, α, donde dos bandas adyacentes, teniendo los valores k1 y k2:

α = k2 / k

El factor de separación, α, es usualmente identificado con la selectividad del sistema

cromatográfico, es decir, la habilidad del sistema a prever diferentes tiempos de
retención para dos compuestos específicos[ CITATION UNA07 \l 12298 ].

Los valores de α depende de los dos solutos y de:

La composición química de la fase estacionaria.

La composición química de la fase móvil (excepto en cromatografía de gases).

La temperatura.

Eficiencia de separación de una columna

La eficiencia de una columna cromatográfica depende del ensanchamiento de banda que

ocurre cuando un compuesto pasa a través de la columna[ CITATION Sil11 \l 12298 ].

Las columnas cromatográficas consisten en un número de zonas adyacentes en cada una

de las cuales hay suficiente espacio para que un analito esté en equilibrio entre dos
fases. Cada una de estas zonas se conoce con el nombre de plato teórico (de los que hay
N en cada columna). La longitud de una columna contiene una altura del plato, H, que
tiene unidades de longitud, normalmente en micras. El valor numérico de N y H para
cada columna en particular es expresado en referencia a cada analito. La altura del plato
está relacionada con la anchura del pico del analito y la distancia que recorre dentro de
la columna, X:

� = σ^2/ X

Donde σ es un estándar de desviación de la banda gaussiana.

Número de platos

Expresada como una cantidad adimensional, refleja el número de veces que el soluto se
reparte entre las dos fases durante su paso a través de la columna[ CITATION Sil11 \l
12298 ].
El número de platos teóricos en la columna entera viene dado por:

� = �/� = � ∗ �/ σ^2

Donde L es la longitud de la columna.

Procesos de ensanchamiento de banda

El número de platos de una columna (eficiencia, N) es una medida del ensanchamiento

de la banda cromatográfica. Cuando inyectamos un pequeño volumen de analito en una
columna forma una banda estrecha en su inicio, pero a medida que el analito migra la
banda se va ensanchando. [ CITATION UNA07 \l 12298 ].

� = � + � /� + � ∗ �

Donde:

A representa el término de caminos múltiples.

B representa la difusión axial, la cual depende de la movilidad de las moléculas en las

fases.

� La velocidad

C representa la resistencia a la transferencia de masa.

Resolución

Es una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos A y B[ CITATION

Sil11 \l 12298 ]. La separación relativa de dos bandas a menudo se refiere a su
resolución, Rs. La resolución se define como:

Donde,

t1 y t2 se refieren a los tiempos de retención (tR) de la primera y la segunda banda.

W1 y W2 son el ancho de dichas bandas.

La resolución depende de la retención y selectividad de manera proporcional. A mayor

selectividad y retención, mayor resolución[ CITATION UNA07 \l 12298 ].
Cuantificación en cromatografía

Para evaluar esto, se calculan los parámetros cromatográfico de cada ensayo que sirven
como referencia. De ésta manera se eliminan fuentes de error, pues se trabaja en las
mejores condiciones posibles, acercándose a resultados reproducibles y por tanto
precisos, y lo más exactos que ésta técnica nos permite[ CITATION UNA07 \l 12298 ].

Análisis químico
Determinación de antioxidantes en aceites

Terbutil Hidroquinona (TBHQ) se utiliza como antioxidante en los aceites. La

autooxidación es la reacción que sufren los compuestos orgánicos cuando están en
contacto con el oxígeno atmosférico, por la presencia de luz, puede ser catalizado por
metales traza y por radicales libres en los compuestos. Es asi que se utilizan
antioxidantes, reactivos químicos que permiten retrasar o eliminar el daño que genera la
autooxidación en aceites[ CITATION Car16 \l 3082 ].

La cuantificación se realiza utilizando Cromatografía de Gases. Para ello se pesa

aproximadamente doce gramos de aceite en un balón de 25ml y se afora con Etanol,
paralelo se prepara un patrón del antioxidante de 200 ppm. En primera instancia se
inyecta el patrón hasta obtener área de pico constante (por lo menos tres valores) y
luego se inyecta la muestra de igual forma. Se cuantifica el contenido de antioxidante
mediante la relación de área de pico de muestra entre área de pico de patrón. La
concentración de TBHQ debe estar entre 80 y 120 ppm para aceite y entre 130 y
160ppm para aceite empleado en margarina[ CITATION Car16 \l 3082 ].

Caracterización de aceites escenciales

Los aceites esenciales de diferentes plantas se pueden emplear como saborizantes de

alimentos, perfumería, licorería, confitería, cosmética y en la medicina. Además, poseen
propiedades antisépticas, antimicrobianas y antifúngicas[ CITATION Riv08 \l 3082 ].

Este análisis se basa en la caracterización de aceites esenciales que se encuentran en

especias o condimentos. Luego de la respectiva extracción de los aceites, éstos se
caracterizan, es decir se determina que componentes contiene cada aceite. El método
empleado se denomina cromatrografía de gases, el cual utiliza un software que contiene
los diferentes aceites esenciales extraidos y los cualifica por medio de una lectura que
puede durar de 30 a 90 minutos. Cuando el aceite pasa por el detector éste lo reconoce
inmediatamente y especifica el tipo de aceite[ CITATION Riv08 \l 3082 ].

Determinación de cafeína

Se basa en el estudio cuantitativo de la cafeína por cromatografía de líquidos de alta

resolución (HPLC) para el control de la calidad del café, y de esa forma conocer si estas
cantidades se ajustan a las normas requeridas. Primero se prepara las disoluciónes
patrón de cafeína, a partir de 40 mg de cafeína (previamente secada) hasta obtener
concentraciones de 4, 8, 16, 24, 40 y 400 ppm. Luego de la respectiva extracción
(sólido-líquido) del compuesto de intéres, se preparan las muestras y se realizan
diferentes ensayos, empezando por construir una recta de calibrado con las soluciones
patrón de concentración conocida. Una vez que tenemos dicha recta patrón, esta nos
servirá para interpolar en ella las areas correspondientes a nuestros problemas (cafeína
extraida de los distintos cafés ensayados) y obtener la cantidad de cafeína que
contienen. Se debe ensayar con las muestras de cafeína y fase móvil agua-acetonitrilo en
proporciónes diferentes hasta encontrar la idónea. Por lo general, cuando se realizan
todas las pruebas necesarias y de acuerdo con los resultados obtenidos, la fase móvil
óptima que permitíra una mejor interacción con la fase estacionaria y la mejor
separación sera la compuesta por la fase móvil agua acetonitrilo en proporción
20:80[ CITATION Cal11 \l 3082 ].

Determinación de carbohidratos

Varios son los métodos que se han utilizado para este analisis, dentro de ellos los
cromátograficos. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ha llegado a ser
una de las técnicas de laboratorio más importantes como herramienta analítica para
separar y detectar compuestos químicos. Esta técnica permite la separación,
identificación y cuantificación de los azúcares presentes en muestras órganicas (miel,
cereales, cacao). Los carbohidratos de la miel son analizados en muchos casos, para
obtener información sobre diferentes aspectos de su calidad, de esta forma se tiene la
determinación de azúcares reductores (glucosa y fructosa representan más del 90% de
todos los azúcares reductores), de sacarosa, azúcar total, y glucosa
comercial[ CITATION Foi13 \l 3082 ].

Dentro de la metodología tenemos que, primero se realiza la preparación de los patrones

para obtener las curvas de calibración, y lograr validar esta metodología. Una vez
validado el método se lleva a cabo el proceso de extracción de cada muestra la cual
luego de ser ultracentrifugada a 1.000 rpm por 10min, es inyectada en el HPLC-IR, esta
entrega los cromatogramas con las áreas de cada analito. Finalmente se cuantifican las
muestras, para determinar los azúcares presentes y su concentración[ CITATION
Foi13 \l 3082 ].
CROMATOGRAFÍA PLANA
Con base en la naturaleza del soporte en el que se aloja la fase estacionaria, tenemos dos
tipos:
1. Cromatografía en papel
2. Cromatografía en capa fina (TLC)

 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC):

La cromatografía en capa fina, es una técnica de separación de los componentes de una

mezcla. Los deja pasar a través de una fase estacionaria mediante el flujo de una fase
móvil. En la cromatografía en capa fina, el grado de elución de las sustancias dependerá
tanto de su propia polaridad como de la polaridad del eluyente utilizado.
Para la cromatografía en capa fina (TLC) la fase estacionaria es una capa de partículas
de unos milímetros de espesor (adsorbente gel de sílice, celulosa, óxido de aluminio,
poliamidas), fijadas sobre un soporte sólido generalmente de aluminio, plástico o vidrio.
Después de aplicar el analito cerca de la parte inferior de la placa seca, el disolvente o
eluyente (tolueno, éter de petróleo, ciclo hexano, acetona) empieza a producir la
separación. (UNAM, 2007)
Existen fases estacionarias que contienen indicador de fluorescencia para facilitar la
identificación de muestras; si no se usa indicador se requerirán otras técnicas de
revelado. (UNAM, 2007)
 Entre los reveladores más comunes para la cromatografía plana, cuando las
manchas que se generan son de color son inmediatamente visibles, mientras que
si son incoloras se revelan mediante:

1. Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase
estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F254 ó F366), el número
que aparece como subíndice nos indica Ia longitud utilizado.
2. La introducción de la placa en vapores de yodo.

 El grado de retención en cromatografía plana se expresa como índice de

retención Rf:
La mancha en una placa de TLC se caracteriza por la distancia que recorre con relación
a la distancia recorrida por la fase móvil.
(Clament, 2002)

(DISTAN DE DESPLAZAMIENTO DEL SOLUTO)

=Rr
( DISTANCIA DE DESPLAZAMIENTO DEL DISOLVE NTE)

 Factores que influyen en una separación por cromatografía de capa fina:

1. Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben más en la fase

estacionaria.
2. La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin corrientes de aire.
3. Limpieza de las placas. Muchas placas están contaminadas con grasa u otro tipo
de agentes Para el trabajo a pequeña escala, estas deben limpiarse corriendo
primero una mezcla de cloroformo y metanol y después dejar secar
completamente antes de aplicar la muestra.
4. Pureza del disolvente o eluyentes.

 CROMATOGRAFÍA EN PAPEL:

En la cromatografía sobre papel la fase estacionaria no se dispone en forma de columna,

sino que está constituida, por una hoja de papel filtro, el sustrato a analizar se coloca
cerca del borde del papel o de la superficie absorbente en forma de una pequeña mancha
circular, obtenida aplicando una gota de la solución de la muestra y dejándola secar
[ CITATION Har00 \l 12298 ]. Luego, se sumerge este borde del papel en el disolvente
revelador o de desarrollo que constituye la fase móvil. El disolvente asciende por el
papel por capilaridad, arrastrando consigo el sustrato, antes de que alcance el extremo
superior del papel, se detienen el flujo de disolvente retirando el papel de la cámara de
desarrollo y se marca con un lápiz la posición alcanzada por el frente del disolvente.
Normalmente, el sustrato no se ha desplazado a la misma velocidad que el disolvente,
sino que ha quedado retrasado, tanto más cuanto más fuertemente era retenido por el
papel. Se señala también la posición de la mancha de sustrato; si esta mancha es
coloreada, su localización es inmediata, si es incolora, debe hacerse visible de algún
modo mediante las siguientes técnicas.
Se calcula entonces la razón:

(distancia recorrida por el sust rato)

=Rr
(distancia recorrida por el disolvente)
Rr: razón de frentes
Para un sistema de solventes y un tipo de papel determinado, cada sustancia tiene un
valor de Rr característico. Una mezcla compleja que no se separa por completo en un
solo cromatograma en papel puede resolverse mediante cromatografía bidimensional en
papel, en esta técnica se realiza un cromatograma como se describió antes, salvo que la
muestra se aplica en una esquina de una hoja de papel filtro y que el cromatograma se
corre en forma paralela a uno de los borden del papel [ CITATION Don061 \l 12298 ].
Luego de que el cromatograma está completo y el papel se secó, la hoja se rota 90 0 y se
realiza una cromatografía paralela al segundo borde utilizando otra sistema de solventes.
Dado que cada compuesto migra a una velocidad característica en un sistema de
solventes determinado, la segunda cromatografía debería incrementar en grado
sustancial la separación de la mezcla en sus componentes.
 [ CITATION Don061 \l 12298 ]

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es básicamente una forma
altamente mejorada de cromatografía líquida en columna.

En lugar de dejar que un solvente gotee a través de una columna bajo la gravedad, es
forzado a través de altas presiones de hasta 400 atmósferas. Eso lo hace mucho más
rápido.

Todas las separaciones cromatográficas, incluida la HPLC, operan bajo el mismo

principio básico; separación de una muestra en sus partes constituyentes debido a la
diferencia en las afinidades relativas de diferentes moléculas para la fase móvil y la fase
estacionaria utilizada en la separación[ CITATION Dhu15 \l 3082 ].

Esta técnica genera un gran valor en las industrias químicas y farmacéuticas, así como
en la biotecnología y la bioquímica ya que es muy utilizada y de gran ayuda. La
cromatografía preparativa comprende un amplio rango de aplicaciones, desde el
aislamiento de 1µg de muestra para identificación espectroscópica hasta el aislamiento
de un compuesto puro de una mezcla de 100 g [ CITATION Ave13 \l 12298 ]

Proceso:

La cromatografía líquida consta de una fase móvil y una fase fija. La fase móvil es un
líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. La separación
cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones específicas que se generan
en las dos fases antes mencionadas.

A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto

rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no es limitada por la
volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra.

La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales

lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de
alto peso molecular. Además, la HPLC ofrece una mayor variedad de fases
estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y más
posibilidades para la separación (Ozores, 2016)

Figura 1 Esquema de equipo HPLC [ CITATION Dhu15 \l 3082 ]

Aplicaciones del HPLC
Según [ CITATION Dhu15 \l 3082 ], la información que se puede obtener por HPLC incluye la
resolución, identificación y cuantificación de un compuesto. También ayuda en la separación y
purificación química. Las otras aplicaciones de HPLC incluyen:

Comida y sabor
1. Medición de la calidad de los refrescos y el agua.
2. Análisis del azúcar en zumos de frutas.
3. Análisis de compuestos policíclicos en hortalizas.

CROMATOGRAFÍA DE GASES
Es una técnica analítica instrumental que sirve para separar y analizar los componentes
de una mezcla. Como su nombre lo indica, emplea gases en el desarrollo de sus
funciones, los cuales básicamente son la fase móvil que arrastra los componentes de la
mezcla. Este gas acarreador, que en la mayoría de los casos es el helio, recorre el
interior de una columna cromatográfica, mientras que al mismo tiempo terminan
separándose todos los componentes. (1,3) Otros gases acarreadores utilizados para este
fin son nitrógeno, hidrógeno, argón y metano. (2)

Es una herramienta indispensable de alta utilidad en los estudios de laboratorios, ya que

es una versión microscópica de un sistema de destilación, capaz de generar resultados
de gran calidad y precisos. (2,3)

Tipos de cromatografía de gases

Cromatografía (gas – sólido) Posee una aplicación limitada debido a la retención

semipermanente de las moléculas activas o polares y a la obtención de picos de elución
con colas (una consecuencia del carácter no lineal del proceso de adsorción), de modo
que esta técnica no ha encontrado una gran aplicación excepto para la separación de
ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular.

La cromatografía gas - líquido se basa en la distribución del analito entre una fase
móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte. (3)

Funcionamiento

El cromatógrafo de gases funciona gracias a la interacción de dos de sus fases una móvil
y una estacionaria. La fase móvil, es aquella que arrastra la muestra por el interior de la
columna cromatográfica. Si la muestra es líquida es necesario un proceso de
vaporización, y para garantizar esto, sus componentes deben tener presiones de vapor
altas. (3)

Para realizar una separación, se inyecta una pequeña cantidad de la muestra a separar en
una corriente de gas inerte a elevada temperatura; esta corriente de gas atraviesa una
columna cromatográfica (fase estacionaria) que separa los componentes de la mezcla
por medio de un mecanismo de partición (cromatografía gas-liquido), de adsorción
(cromatografía gas- sólido) o, en muchos casos, por medio de una mezcla de ambos los
componentes separados, emergerán de la columna a intervalos discretos y pasarán a
través de algún sistema de detección adecuado, o bien serán dirigidos hacia un
dispositivo de recogida de muestras. (4)

Descripción del cromatógrafo de gases

En un cromatógrafo de gases podemos distinguir los siguientes elementos esenciales:

- Recipiente con al fase móvil o gas portador.Es una bala de gas inerte (N2, He, Ar), a
elevada presión y de gran pureza, provista de un manorreductor y un sistema para
regular un flujo pequeño de gas.

- Sistema de introducción de la muestra. Es el lugar por donde vamos a introducir la

muestra, generalmente en disolución, con ayuda de una microjeringa. Se suelen inyectar
volúmenes muy pequeños del orden de los microlitros. En el sistema de inyección la
muestra se volatiliza y es arrastrada hacia la columna por la fase móvil.

- Horno y Columna. El siguiente componente del cromatógrafo es el horno, que es un

recinto donde está la columna, la cual está conectada por un extremo al sistema de
inyección y por otro al detector.

La columna es el elemento principal del cromatógrafo pues se trata de un tubo de acero

o sílice fundida en cuyo interior está la fase estacionaria. Los componentes de la
muestra arrastrados por el gas portador son más o menos retenidos por la misma y en
consecuencia se separan unos de otros. El tiempo de retención de un compuesto en
cromatografía de gases va a depender, por una parte, de su naturaleza, es decir, de su
estructura, composición química y volatilidad, y por otra, de las características del
sistema cromatográfico, como tipo de fase estacionaria, longitud de la columna y
Temperatura de la separación.
Se emplean actualmente cientos de tipos diferentes de fases estacionarias, si bien las
podemos agrupar en tres variantes: Fases estacionaria Sólidas, líquidas, y ligadas.

Estas últimas, basadas en una estructura de silicona, son las más empleadas. Hay
muchas variedades de diferentes polaridades que nos permiten elegir la fase más
adecuada para una muestra concreta.

- Detector. La salida de la columna está conectada al detector, cuya misión es la de

generar una pequeña señal eléctrica cuando pase un analito por él. Dicha señal,
proporcional a la cantidad de analito, es amplificada y enviada a un registro, donde es
representada en función del tiempo transcurrido desde la inyección de la muestra, dando
lugar a un cromatograma. También puede el detector enviar su señal a un ordenador
donde es almacenada y procesada adecuadamente.

En la Cromatografía de Gases se pueden emplear una gran variedad de detectores.

Podemos considerar por una parte los detectores clásicos, que suministran como
información analítica únicamente el tiempo de retención y el área y altura del pico
cromatográfico. Por otra parte, se emplean también detectores más complejos en la
llamada hibridación instrumental, que aportan una información mucho más completa de
los componentes separados de la muestra.(5)

Grafico 1. Esquema de un cromatógrafo de gases (3)

APLICACIONES
-En la industria farmacéutica se utiliza como una herramienta de análisis de calidad en
búsqueda de impurezas en los lotes de medicamentos fabricados.

-Ayuda a detectar y cuantificar muestras de drogas, o permite realizar análisis para

comprobar si un atleta estaba dopado.

-Sirve para analizar la cantidad de compuestos halogenados en fuentes de agua.

Asimismo, de los suelos puede determinarse su nivel de contaminación por pesticidas.

-Analiza el perfil de ácido graso de muestras de distintos orígenes, ya sea vegetal o

animal.

-Transformando las biomoléculas en derivados volátiles, pueden ser estudiados por esta
técnica. Así, se puede estudiar el contenido de alcoholes, grasas, carbohidratos,
aminoácidos, enzimas y ácidos nucleicos. (3)

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