Alunos: Estevão W.

Nathália Amaral

Jéssica Ferreira

Resultados

Volume Abosorbâncias
Eluído(mL) λ2: 620 nm λ1: 560 nm
1 -1,71E-02 -1,97E-02
2 -1,96E-02 -2,31E-02
3 -1,92E-02 -2,20E-02
4 -1,93E-02 -2,24E-02
5 -1,96E-02 -2,27E-02
6 -1,45E-02 -2,03E-02
7 7,16E-02 3,07E-02
8 0,15943 8,57E-02
9 0,10616 5,10E-02
10 2,20E-02 8,60E-04
11 -8,15E-03 -1,66E-02
12 -1,47E-02 -2,11E-02
13 -1,57E-02 -2,11E-02
14 -1,55E-02 -2,08E-02
15 -1,79E-02 -2,28E-02
16 -1,28E-02 -1,62E-02
17 -1,29E-02 -1,64E-02
18 -1,46E-02 -1,62E-02
19 -2,03E-02 -1,68E-02
20 -1,95E-02 -3,92E-03
21 -2,42E-02 8,22E-03
22 -2,22E-02 2,39E-02
23 4,03E-03 6,42E-02
24 -1,54E-02 4,63E-02
25 -1,83E-02 4,07E-02
26 -1,98E-02 2,81E-02
27 -1,80E-02 2,58E-02
28 -2,29E-02 9,68E-03
29 -2,21E-02 6,78E-04
30 -1,81E-02 -4,16E-03
31 -1,80E-02 -1,21E-02
32 -1,40E-02 -1,23E-02
Tabela 1: Tabela de Resultados
4. Tarefas

a) Construa o cromatograma com as absorbâncias lidas para cada corante e seus

volumes de eluição, determinando o volume inicial e final das colunas.

Com os resultados de absorbâncias lidos, em cada comprimento de onda, para cada

fração coletada, foi elaborado um cromatograma em função do volume.

Vermelho de Fenol x Azul de Dextran

2.00E-01

1.50E-01
Absorbância

1.00E-01

5.00E-02

0.00E+00
0 5 10 15 20 25 30 35
-5.00E-02
Volume eluído (mL)

620nm 560nm

Gráfico 1: Cromatograma - Volume(mL) x Absorbância

a) O volume inicial de amostra foi aproximadamente 75µL e o

volume final de amostra foi 32 mL, que corresponde ao volume
total nos tubos de ensaio.
De acordo com o cromatograma obtido, podemos identificar que para o
comprimento de onda 560 nm, o detector, no caso o espectrofotômetro, foi capaz de
determinar as duas substâncias, apresentando assim dois grandes picos em seu
cromatograma. O primeiro pico relacionado ao corante Azul de Dextran apresentando sua
absorbância máxima de 0,085702 no volume 8mL. O segundo pico está relacionado ao
Vermelho de Fenol apresentando sua absorbância máxima de 0,064224 no volume de
23mL.
Já para o comprimento de onda 620 nm, o mesmo não aconteceu, o detector foi
capaz apenas de determinar o corante Azul de Dextran, apresentando assim apenas um
grande pico no cromatograma, registrando no volume 8mL seu maior valor de
absorbância, 0,15943.
Em ambos os comprimentos de onda o detector se mostrou sensível, porém para
o comprimento de onda 620nm, o detector é seletivo para o corante Azul de Dextran.
b) O que aconteceu com o volume de amostra recolhido em relação ao que foi
aplicado e por quê?

Como foi citado no item anterior, o volume inicial sofreu uma diluição. Essa
diluição ocorrida durante o processo de separação se deve a constante adição de fase
móvel e ao processo de dispersão das moléculas dentro da coluna, visto que na mesma já
apresentava fase móvel na hora da injeção.

c) Por que as resinas devem ser guardadas em azida sódica? Onde atua a azida?

O Sephadex, é um conjunto de polissacarídeos de α-D-glicose. Essa resina

deve ser armazenada em azida sódica, pois esta atua como um inibidor de
crescimento microbiano, uma vez que os microrganismos podem ocupar
os poros da resina, diminuindo sua eficiência, ou alterar algumas
características físico-químicas da resina.

d) Como você procederia caso desejasse trabalhar com maior volume de amostra?

Para se trabalhar com volume maior de amostra, seria necessária uma bureta
maior, para que possa suportar maior volume de fase estacionária, ou seja uma coluna
maior. Isto provocaria uma maior eficiência de separação.

e) Duas moléculas de mesmo peso molecular obtiveram diferentes tempos de

retenção. Explique.

Duas moléculas que possuem o mesmo peso molecular não necessariamente

apresentam o mesmo tamanho, já que as mesmas podem apresentar arranjos diferentes,
disposição de átomos diferentes.
Na cromatografia de exclusão molecular, a separação das substâncias está baseada
na diferença de tamanho, uma vez que, as menores substâncias conseguem entrar nos
poros da fase estacionária apresentando assim maiores tempos de retenção, já as maiores
não conseguem entrar nos poros e assim são eluídas mais rapidamente.
Na prática foi possível identificar que o corante Azul de Dextran, que apresenta
maior peso molecular e maior tamanho, foi o primeiro a sair da coluna em relação ao
vermelho de fenol, que apresenta menor peso molecular e tamanho, de acordo com o
esperado.

f) Você está utilizando uma Sephacryl 5-500 HR. Entretanto, a eluição está
demorando excessivamente. O que fazer?

Como a resina Sephacryl é um gel mais rígido, mais viscoso que a Sephadex, ou
seja, é mais resistente a passagem da fase móvel, apresentando assim maior tempo de
corrida. Para resolver essa situação pode aumentar a pressão da fase móvel, para assim
aumentar a velocidade de eluição.

g) O que fazer quando a única chance de separação de duas substâncias é através do

aumento do "mesh" da resina e da ampliação do número de pratos teóricos?

O grau de reticulações, ligações cruzadas entre as cadeias,

determinam o mesh de uma resina. Quanto menor o número de ligações
cruzadas entre as cadeias, maior será o tamanho dos poros (maior o mesh).
Então para aumentar o mesh de uma resina basta utilizar uma com menor
grau de reticulação. Porém este aumento do diâmetro da partícula, piora a
separação, tal fato pode ser compreendido pela Equação de Van Deemter,
uma vez que aumenta a altura dos pratos teóricos, diminuindo o número
total dos mesmos. Uma forma de diminuir esse problema gerado pelo
aumento dos poros da resina é aumentar a velocidade da fase móvel através
do aumento de pressão. Esse aumento tem que ser controlado, pois se não
pode danificar a integridade física da resina.

h) Como você calibraria a sua coluna?

Para calibrar a coluna, utilizaríamos padrões conhecidos de um determinado

analito, anotando seu tempo de retenção, as condições do meio, altura e tipo da fase
estacionária, além da fase móvel utilizada. Uma vez que, o mesmo analito apresenta o
mesmo tempo de retenção caso todas as condições da eluição sejam mantidas constantes.

5. Referências Bibliográficas

• Apostila, Análise Insturmental: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Centro

Federal de Educação Tecnológica de Química-RJ

• Disponível em: http://www.gbiosciences.com/ResearchProducts/Blue-

DextranLoading-Dye.aspx - Acessado em 9/06/2019.

• Disponível em: <http://www.jornallivre.com.br/123476/composto-quimicoazida-de-

sodio.html> Acesso em: 7/06/2019.