Uso combinado de consorcios microbianos aislados de diferentes suelos agrícolas

y ciclodextrina como técnica de biorremediación para suelos contaminados con herbicidas

J. Villaverde a, *, M. Rubio-Bellido a, A. Lara-Moreno a, F. Merchan b, E. Morillo a

Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología (IRNAS-CSIC), Apartado 1052, 41080,

Sevilla, España b Departamento de Microbiología y Parasitología, Universidad de Sevilla,
Facultad de Farmacia, C / Profesor García González, 2, 41012, Sevilla, España

Resumen

El herbicida diurón fenilurea es persistente en el suelo, el agua y el agua subterránea y se

considera una molécula altamente tóxica. El principal producto de su biodegradación exhibe
mayor toxicidad que el diurón y es persistente en el medio ambiente. Cinco consorcios
microbianos degradantes de diuron (C1-C5), aislados de diferentes suelos agrícolas, fueron
investigados por la actividad de mineralización de diuron.

El consorcio C2 pudo mineralizar el 81.6% del diurón en solución, mientras que el consorcio C3
solo pudo mineralizar el 22.9%. También se probaron consorcios aislados en lodos de suelo y en
todos los casos, excepto el consorcio C4, se redujo drásticamente el DT50 (el tiempo requerido
para que la concentración de diurón disminuya a la mitad de su valor inicial), de 700 días (control
no inoculado) a 546 , 351, y 171 días para los consorcios C5, C2 y C1, respectivamente. Para probar
la efectividad del consorcio aislado C1 en un escenario más realista, los ensayos de mineralización
de diurón del suelo se realizaron en condiciones estáticas (40% de la capacidad de retención de
agua del suelo). Se observó una mejora significativa de la mineralización de diurón después de la
inoculación con C1, con el 23.2% del herbicida mineralizado en comparación con el 13.1% para el
experimento de control. Hidroxipropil -b- ciclodextrina, un potenciador orgánico biodegradable de
la biodisponibilidad de contaminantes, que se utiliza en combinación con bioaumentación C1 en
condiciones estáticas, resultó en una disminución significativa en el DT50 (214 días; 881 días,
experimento de control). Según nuestro conocimiento, este es el primer informe sobre el uso de
consorcios microbianos aislados en el suelo en combinación con ciclodextrinas propuesto como
una técnica de biorremediación para suelos contaminados con pesticidas.

1. Introducción

Los suelos agrícolas o industriales poseen comunidades microbianas grandes y, a menudo, muy
diversas, que potencialmente pueden exhibir muchas propiedades degradativas. Cuando estas
capacidades se implementan completa y rápidamente, los químicos orgánicos pueden ser
destruidos fácilmente. Sin embargo, muchos compuestos sintéticos persisten durante algún
tiempo en estos entornos, aunque sus moléculas son biodegradables, y se ha preguntado si la
inoculación podría mejorar apreciablemente la descomposición de estos compuestos.

En suelos contaminados en los que el tiempo necesario para la degradación del contaminante
químico no es importante, es probable que no se justifique la bioaumentación , ya que la
población microbiana inicial se multiplicará para destruir el químico no deseado (Thompson et al.,
2005). Sin embargo, cuando la destrucción rápida es importante, puede que no sea apropiado
confiar en la respuesta natural de la comunidad indígena. También está claro que los
microorganismos que actúan sobre ciertos contaminantes no están presentes en algunos sitios. Un
compuesto que es metabolizado por muchas especies probablemente se encontrará con una o
varias especies en cualquier comunidad microbiana dada que sea capaz de transformarlo
(Mrozik y Piotrowska-Seget , 2010). El uso de consorcios microbianos para mejorar la eficiencia de
la biodegradación ha aumentado debido a su capacidad de metabolismo sinérgico. El
intermediario metabólico de una bacteria puede ser utilizado por otra para una degradación
eficiente, acelerando así la biodegradación y evitando los posibles efectos tóxicos de los
metabolitos formados (Li et al., 2017; Villaverde et al., 2017).

El uso de pesticidas constituye un aspecto crítico de la agricultura moderna, y son absolutamente

necesarios. Sin embargo, el uso excesivo y continuo de pesticidas ocasiona daños al medio
ambiente. Alrededor del 90 por ciento de los pesticidas agrícolas aplicados nunca llegan a sus
organismos objetivo (Singh y Singh, 2016). Estos compuestos se dispersan y con frecuencia se
detectan en el aire, el suelo y el agua. Además, los pesticidas pueden pasar fácilmente a los tejidos
de los organismos vivos y dar lugar a la bioacumulación. Las metodologías de biorremediación
para tratar plaguicidas en el suelo han recibido una atención considerable (Morillo y Villaverde ,
2017), y la biorremediación ha demostrado ser una herramienta eficaz para descontaminar los
plaguicidas en sitios contaminados en el medio ambiente.

Los efectos nocivos de los herbicidas de fenilurea han provocado la necesidad de comprender los
procesos que controlan su comportamiento y el destino de dichos herbicidas en el sistema de agua
del suelo en entornos agrícolas. En el compartimento del suelo, los herbicidas de fenilurea pueden
transformarse en metabolitos e incluso mineralizarse completamente a través de una gama de
procesos bióticos y abióticos, aunque se considera que la biodegradación es el principal proceso
responsable de su atenuación natural en el medio ambiente (Hussain et al., 2015).
. La biodisponibilidad de la fenilurea no se considera un problema importante que afecte la
biodegradación (Sorensen et al., 2003); sin embargo, con el envejecimiento, la biodisponibilidad
del herbicida puede disminuir debido a la difusión en micro y macroporos o al secuestro dentro de
la materia orgánica del suelo o matrices minerales (Johannesen et al., 2003).

En aquellas ocasiones en que los tratamientos de biorremediación no logran resultados

satisfactorios, uno de los factores más importantes es atribuible a la alta capacidad de adsorción
de muchos pesticidas a las partículas del suelo. Esto se debe principalmente a su baja solubilidad
en agua que limita su disponibilidad a los microorganismos, lo que es un problema potencial para
la biorremediación de suelos contaminados.

La capacidad de las ciclodextrinas (CD) para formar complejos de inclusión con una amplia
variedad de moléculas huésped hidrófobas se ha utilizado en la agricultura. La capacidad de los CD
para alterar las propiedades físicas, químicas y biológicas de las moléculas huésped se ha utilizado
para la preparación de nuevas formulaciones de pesticidas. Los CD forman complejos con una
amplia variedad de productos químicos agrícolas que incluyen herbicidas, insecticidas, fungicidas,
repelentes, feromonas y reguladores del crecimiento (Gines et al., 1996; Villaverde et al.,
2005; Yanez et al., 2012 ~) . Desde un punto de vista ambiental, los CD se han propuesto como un
agente alternativo para mejorar la solubilidad en agua de los compuestos hidrófobos (Morillo et
al., 2004; Villaverde, 2007; Sanchez- Trujillo et al., 2014, 2013; Trellu et al., 2016) y, por tanto, su
biodisponibilidad. El mecanismo de acción se basa en el hecho de que los CD tienen una cavidad
hidrofóbica dentro de las moléculas, en la que los compuestos orgánicos de forma
y tamaño apropiados pueden formar complejos de inclusión (Gómez et al., 2010). Los CD
presentan varias ventajas sobre los disolventes orgánicos y los surfactantes no iónicos, como la
desorción mejorada, la no toxicidad para los microorganismos, una mayor biodegradabilidad y una
absorción insignificante en la fase sólida. Por estas razones, han surgido como una herramienta
útil para la eliminación química de los suelos.
El objetivo de este estudio fue probar una herramienta de biorremediación efectiva basada en la
inoculación de consorcios degradantes microbianos aislados de suelos agrícolas con un registro de
aplicación de pesticidas (> 10 años), junto con el uso de HPBCD (hidroxipropil-ciclacodextrina), que
es capaz de aumentar la biodisponibilidad del herbicida diuron en suelos contaminados
artificialmente. Según nuestro conocimiento, la técnica de biorremediación propuesta para la
limpieza de suelos contaminados con pesticidas se informa por primera vez.

2. Materiales y métodos

2.1. Productos químicos, ciclodextrina y suelo.

Presmar SL (Sevilla, España) proporcionó el grado técnico (98%) de diuron [N- (3 , 4- diclorofenil) -
N, Ndimetilurea ] . Grado analítico (99%) 3 , 4- dicloroanilina (DCA) se adquirió de Sigma-
Aldrich. Radioetiquetado [ring-14C] - diuron fue comprado en el Instituto de Isótopos, Budapest,
Hungría (36 mCi mmol1, pureza ¼ 99.9% y pureza radioquímica 100%). HPBCD fue suministrado
por Cyclolab, Budapest, Hungría. Un suelo agrícola del suroeste de España con un pH de 7, 2.0% de
CaCO3, 2.1% de materia orgánica y una distribución de tamaño de partícula de 31.6% de arena,
53.6% de limo y 14.8% de arcilla (textura limo limo) fue seleccionado para este estudio. La muestra
se tomó del horizonte superficial (0e20 cm) y se secó al aire durante 24 h y se pasó a través de un
tamiz de 2 mm. La distribución del tamaño de partícula se midió con un bouyoucos densímetro; la
materia orgánica se midió por oxidación con K2Cr2O7; El pH se determinó en un extracto de suelo
/ agua 1: 2.5; y el contenido total de carbonato se midió utilizando
el método manométrico ( Demolon y Leroux , 1952).

2.2. Enriquecimiento del degradador de diuron

Los consorcios microbianos se aislaron de cinco suelos agrícolas diferentes (S1, información
complementaria) que se habían manejado con pesticidas durante más de 10 años. Se agregaron
10 g de cada suelo a matraces Erlenmeyer esterilizados de 250 ml, (autoclave Auster -G, P-Selecta
con un ciclo a 120ºC). C, presión de entrada de 103 kPa , durante 20 min) que contiene 50 ml de
un medio de sal mineral (MSM) enriquecido con 40 mg de diurón L1 como la única fuente de C y
energía. En todos los ensayos, se añadió diurón al medio mineral junto con una solución de
micronutrientes (NS) (mg L1) : 75.0 MnCl2 4H2O; 37,5 FeSO4 7H2O; 25.0 SnCl2 2H2O; 12,5 ZnSO4
7H2O; 12,5 Al2 (SO4) 3 18H2O; 12,5 NiCL2 6H2O; 12.5 CoCl2 2H2O; 10.0 CaSO4
2H2O; 3.75 KBr ; 3,75 KCl ; 2.50 LiCl . El medio también se esterilizó en autoclave a 120ºC. C
durante 20 min. Los cultivos se incubaron con agitación orbital (150 rpm) a 30ºC. C, y cada 15 días
se transfirieron 10 ml del cultivo a otro matraz que contenía el mismo medio mineral estéril y se
incubaron nuevamente.

Después de cuatro transferencias de enriquecimiento (60 días), 100 ml del cultivo. se sembraron
en medio de agar R2A (0,5 g L1, MgSO4 7H2O; peptona; casaminoácidos ; extracto de levadura;
glucosa; almidón; K2HPO4; piruvato sódico y 20 g de agar L1) y se incubaron durante 72 horas a
30ºC. DO.

Cinco diversos consorcios aislados que potencialmente tenían diuron actividad de degradación se
sembraron de R2A-agar petri platos y posteriormente almacenada
en crioviales Microbank ™ (2 microtubos ml que contenían medio R2A y 20 esferas porosas de 3
mm de diámetro) y se mantuvieron a 80 C ( Villaverdeet al., 2012).

2.3. Identificación del consorcio microbiano

La identificación de la cepa del consorcio C1 se realizó extrayendo ADN del cultivo líquido y
amplificando los genes 16S rRNA mediante PCR usando cebadores de oligonucleótidos universales
(Lane, 1991): 16F27 (recocido en la posición 8e27, numeración de E. coli) y 16R1488 (recocido en
el complemento de la posición 1511e1488). Los productos de la PCR se clonaron en un vector T / A
(vector fácil PGEMT de PROMEGA). Después de que las colonias se analizaron por PCR, el ADN
plasmídico de las colonias seleccionadas se purificó y la inserción se secuenció con cebadores
universales T7 y SP6. Finalmente, las secuencias del gen 16S rRNA (1450 pb) se compararon
mediante la búsqueda con BLAST con la base de datos EzBioCloud.

2.4. Experimentos de mineralización y biodegradación.

La mineralización de diurón marcado con 14C en (1) solución y (2) suspensión de suspensión de
suelo (bajo agitación mecánica continua a 120 rpm) o (3) suelo en medios estáticos se midió (por
triplicado) a través de la evolución de 14CO2. Todos los componentes del microcosmos se
esterilizaron antes de los ensayos, excepto el suelo investigado.

Los ensayos de mineralización se llevaron a cabo en respirómetros (250 ml

de Erlenmeyer modificados ) en los que (1) se colocaron 50 ml de medio de sales minerales
(MSM ) y se agregaron 14C marcados en el anillo (450 Bq por matraz) y diuron sin marcar para
obtener un concentración final de 10 mg L1; (2) Se colocaron 50 ml de MSM y se agregaron 14C
marcados en anillo (450 Bq por matraz) y diurón sin marcar a 10 g de suelo para obtener una
concentración final de 50 mg kg1; (3), se agregaron 14C-marcado (450 Bq por matraz) y diuron no
marcado a 10 g de suelo para obtener una concentración final de 50 mg kg1 y se agregó MSM
hasta alcanzar el 40% de la capacidad de retención de agua del suelo. La concentración de
herbicida se seleccionó para simular un derrame accidental de herbicida e (Rubio- Bellido et al.,
2015).

Para los experimentos con suelo (2 y 3), se agregaron inicialmente a 2,5 g de suelo 0,25 ml de
una solución madre de diurón L1 de 2.000 mg en acetona, que también contenía diurón marcado
con 14C (450 Bq ) (25% del total) suelo utilizado, 10 g). Posteriormente, el suelo se mantuvo a
temperatura ambiente bajo la campana de humos durante el tiempo necesario para evaporar
cualquier rastro de acetona medido por la pérdida de peso hasta valores constantes
(aproximadamente 24 h). El 75% restante se agregó y se mezcló para evitar daños en los
microorganismos indígenas del suelo. Los matraces se inocularon con los diferentes consorcios
(bioaumentación) y micronutrientes (NS, bioestimulación) y se cerraron con tapones revestidos de
teflón antes de la incubación a 20 ± 1. DO.

En el experimento (3) también se empleó una solución de HPBCD, con una concentración
correspondiente a 10 veces la del diurón agregado previamente en matraces experimentales de
mineralización del suelo (2,14 102 mmol ), para mejorar la biodisponibilidad del herbicida. Se
realizó un experimento preliminar para determinar la concentración de HPBCD necesaria para
obtener la extracción de diuron más efectiva del suelo, y para este propósito, se empleó un rango
de las concentraciones de extractante en el suelo contaminado con 50 mg kg1 de diuron . A partir
de estos resultados, se concluyó que la capacidad deextracción a una concentración equivalente a
10 veces la cantidad molar del herbicida inicialmente agregado al suelo fue similar a la obtenida
cuando se probaron concentraciones más altas de HPBCD.

En los diferentes experimentos de mineralización, se agregó 1 ml de cada consorcio microbiano

con una densidad de inóculo inicial de 108 unidades de formación de colonias (CFU) ml1. En los
experimentos en solución, (1) y (2), la densidad final del inóculo fue de 2 106 CFU mL1. También se
prepararon controles de microcosmos no inoculados. La producción de 14CO2 se midió como la
radiactividad que aparecía en la trampa alcalina de los matraces biométricos , que contenía 1 ml
de NaOH 0,5M . Periódicamente, la solución se retiró de la trampa y se reemplazó con álcali
fresco. La solución de NaOH se mezcló con 5 ml de un cóctel de centelleo líquido (Ready Safe de
Perkin Elmer, Inc., EE. UU.) Y la mezcla se mantuvo en la oscuridad durante aproximadamente 24 h
para disipar la quimioluminiscencia . La radiactividad se midió luego en un contador de centelleo
líquido (Beckman Instruments Inc., Fullerton, California, modelo LS5000TD).

Los experimentos de biodegradación se realizaron de la misma manera que los ensayos de

mineralización en la solución (1), pero en este caso, solo se usó diuron no radiomarcado , y el
metabolito principal DCA se analizó en diferentes puntos temporales utilizando HPLC (LC-2010A
HT Shimadzu ). La columna cromatográfica fue una columna de fase inversa Kromasil C18, la fase
móvil fue acetonitrilo y ácido fórmico al 0,01% (60:40, v / v), y la detección se realizó utilizando un
detector de matriz de fotodiodos a 220 nm. El tiempo de retención de HPLC y los espectros de
matriz de fotodiodos del estándar DCA se usaron para identificar este compuesto.

La enumeración de bacterias viables en este experimento (posibles degradadores de cepas

bacterianas de diuron ) para cada consorcio se determinó contando las UFC. La enumeración
bacteriana se llevó a cabo utilizando 100 ml de la solución inoculada, que se aplicaron en placas de
agar-agar preparadas a partir de un medio LB. Las UFC se contabilizaron después de 48 h.

2.5. Modelo de cinética de mineralización.

Todas las curvas de mineralización de diuron se ajustaron al mejor modelo cinético, empleando un
archivo excel provisto por el grupo de trabajo FOCUS (2006) sobre cinética de degradación, para
facilitar el análisis cinético de la degradación del compuesto primario mediante curvas de tasa y la
herramienta de resolución (paquete estadístico de Microsoft ). Las curvas de mineralización se
ajustaron a dos modelos cinéticos: un modelo simple de primer orden (SFO) y un modelo
secuencial bifásico de primer orden (Hockey-Stick, HS) como se describe en Rubio- Bellido et
al. (2015). Estos modelos se seleccionaron para su consideración en función de su relativa
simplicidad y su potencial para adaptarse mejor a los conjuntos de datos cinéticos de disipación
medidos para diuron que parecen ser monofásicos o bifásicos ( Beulke et al., 2005).

3. Resultados y discusión

3.1. Mineralización de diurón en solución.

Las curvas de mineralización de diuron obtenidas para la mineralización en solución utilizando los
diferentes consorcios aislados se muestran en la Fig. 1.

Todas las curvas de mineralización se ajustan a un modelo secuencial cinético bifásico de primer
orden (Hockey-Stick, HS). El comportamiento bifásico consiste en dos curvas de primer orden
secuenciales (K1 y K2) (Rubio- Bellido et al., 2015). K1 puede explicarse desde el punto de vista de
la biodisponibilidad, en un escenario en el que diuron y / o sus moléculas de metabolito
producidas estarían completamente disponibles para los degradadores. Por otro lado, K2
representa la dificultad de la mineralización continua del diurón por parte de los diferentes
consorcios estudiados, que alcanzan una meseta aunque no todos los pesticidas están
mineralizados. La posible explicación podría ser el diferente umbral de toxicidad de los
microorganismos presentes en cada consorcio inoculado hacia el intermedio principal de anilina
altamente tóxico, DCA, formado en la degradación de diuron , dando lugar a diferentes perfiles de
mineralización con diferentes extensiones de mineralización de diuron para cada consorcio
investigado ( Villaverde et al., 2017). El DCA acumulado formado podría provocar que se
inhibieran las reacciones de la ruta catabólica diuron que conducían a su mineralización
( Chakraborty et al., 2017). Las enzimas metabólicas clave a menudo son inhibidas por los
productos finales de la vía que controlan.

Con el objetivo de confirmar dicha hipótesis, se llevaron a cabo ensayos de biodegradación

de diuron en presencia de los diferentes consorcios investigados, donde se midieron DCA y
enumeración bacteriana en diferentes momentos, para determinar el posible efecto tóxico del
metabolito en las cepas bacterianas que componer cada consorcio estudiado, (Fig. 2 y Tabla
1). Se observó un perfil de formación de DCA similar, alcanzando una meseta de
aproximadamente 4 mg de concentración de DCA L1 después de 20 días de experimento, para
todas las inoculaciones (Fig. 2). Simultáneamente, se pudo determinar un aumento significativo en
la concentración de CFU con respecto a la concentración inicialmente agregada (2 106 UFC / mL)
en todos los casos, justo después de que la mineralización de diuron alcanzara una meseta
(aproximadamente 36 días), lo que llevó a un aumento adicional después de 50 días cuando no se
observaron avances en la tasa de mineralización para todos los consorcios (Tabla 1). Indica la falta
de un efecto tóxico en los diferentes consorcios microbianos por el metabolito estudiado. Por lo
tanto, se puede concluir que si la acumulación de DCA provocó la disminución drástica de la tasa
de mineralización de diuron , las nuevas rutas catabólicas de diuron siguen activas para degradar
el herbicida sin lograr su mineralización.

Los parámetros de mineralización determinados a partir del modelo cinético se muestran en la

Tabla 2. Como se ve en la Fig. 1 y la Tabla 2, se encontraron diferentes resultados para cada
consorcio. El consorcio C3 mostró la menor capacidad de mineralización de diurón de 22.9%,
mientras que C2 mostró los mejores resultados de mineralización, tanto en el grado de
mineralización, 81.6% como con respecto al DT50, 29.7 días. También vale la pena señalar que se
observó una mineralización significativa para todos los consorcios aislados, lo que demuestra la
capacidad de los consorcios investigados para la mineralización de diurón. La mineralización de los
pesticidas es muy difícil para un solo aislado y los consorcios de bacterias a menudo se requieren
para una degradación completa (Bhatt et al., 2007). Es probable que ninguno de los consorcios
logre una mineralización de herbicida del 100%, lo que se explica en función de las dos categorías
de transformaciones que pueden ocurrir. En la primera, la biodegradación proporciona C y energía
para respaldar el crecimiento y, por lo tanto, el proceso se considera vinculado al crecimiento. En
la segunda categoría, la biodegradación no está vinculada a la multiplicación como, por ejemplo,
en escenarios donde la fuente principal de C se encuentra en una concentración muy baja, como
en acuíferos, aguas subterráneas, etc. (Wang et al., 2015; Sorensen et al ., 2007), y C solo se usa
para obtener energía con el fin de mantener la actividad de la biomasa o cuando el contaminante
se metaboliza . En nuestro caso, el escenario más probable sería la transformación vinculada al
crecimiento, ya que la concentración empleada en los ensayos de mineralización fue de 10 mg L1
similar a la concentración encontrada en la solución del suelo en un suelo contaminado (50
mg kg1) . Este escenario estaría de acuerdo con la extensión total de la mineralización observada,
donde parte del diurón 14C se incorporará a la biomasa como intermedios pero no se
mineralizará, como se comentó anteriormente (Alexander, 2000).

3.2. Mineralización de diuron en suspensión de suelo.

El objetivo de estos experimentos fue determinar la efectividad de la bioaumentación con cada
consorcio aislado en la mineralización de diurón en el suelo. El suelo elegido fue aquel del cual se
aisló el consorcio C5. La flora endógena del suelo se evaluó para determinar la mineralización
de diurón (control, Fig. 3), y la extensión global de la mineralización fue de solo 7.35%. Este
resultado indicó la necesidad de bioaumentación en el caso de contaminación por diurón de este
suelo.

Curvas de mineralización de Diuron obtenidas en medio MSM y en presencia de micronutrientes

(NS), luego de que se muestra la inoculación de los diferentes consorcios microbianos en la Fig. 3.
Todos los consorcios fueron probados, excepto C3, que no se usó porque mostró el peor
porcentaje de la mineralización de diurón en solución (fig. 1). Los parámetros cinéticos de
mineralización obtenidos después de modelar los datos de la Fig. 3 se muestran en la Tabla 3. Para
tres consorcios, C5, C2 y C1, La DT50 se redujo significativamente de 700 días (control) a 546, 351
y 171 días, respectivamente, pero la DT50 no se redujo en la inoculación con el consorcio
C4. Cuando se inoculó el suelo con C5, el consorcio obtenido del mismo suelo, no se observaron
los mejores resultados de mineralización, aunque se esperaría una competencia más reducida con
la flora endógena y el período de aclimatación.

La bioaumentación todavía se considera un procedimiento que tiene resultados impredecibles. La

razón de esto es que muchos factores abióticos y bióticos afectan su resultado final. Entre los
factores bióticos, los más importantes parecen ser las interacciones entre microorganismos
autóctonos e inoculados, como la depredación y la competencia por nutrientes y nichos ( Cycon et
al., 2017). De los buenos resultados observados en la bioaumentación con algunos de los
consorcios aislados, se puede concluir que las cepas específicas que degradan el diurón dentro de
cada consorcio aislado son bastante específicas, y cuando este herbicida es la fuente principal de
C, no hay competencia con el resto del suelo. Existe flora (Singer et al., 2005), excepto en C4,
donde su flora no fue capaz de aclimatarse a la flora endógena del suelo. Además, el proceso de
biodegradación se considera dependiente de microorganismos, lo que significa que las condiciones
en el suelo probablemente serían más desfavorables para el consorcio C5 (del suelo investigado)
que para los consorcios C1. Las condiciones naturales (por ejemplo, la temperatura) son difíciles
de controlar para mantener una biodegradación óptima, ya que el proceso de enriquecimiento
estaba muy lejos de las condiciones realistas en el suelo. En resumen, a partir de la mineralización
de diurón en el sistema de lodos, se puede concluir que el consorcio C1 sería la mejor opción para
la bioaumentación de suelos en suelos agrícolas contaminados con diurón .

La extensión global de la mineralización de diurón en presencia del suelo estudiado fue siempre
menor que la determinada en solución. Está ampliamente aceptado que la absorción de
contaminantes a las partículas del suelo puede afectar la biodegradación / disipación al modificar
la biodisponibilidad química (Chung y Alexander, 2002; Huesemann et al., 2003; Crampon et al.,
2014; Reid et al., 2013; Guo et al., 2014 al., 2016). La protección contra el ataque microbiano
puede surgir de la formación de residuos unidos (interacciones covalentes entre el compuesto y
las partículas del suelo), reduciendo la bioaccesibilidad a losmicroporos ( Kah y Brown,
2006). Cabe señalar que durante los ensayos de mineralización (100 días) se alcanza un equilibrio
de sorción de diurón y también se producirá el proceso de envejecimiento. Semple et al. (2007)
afirmaron que la biodisponibilidad se puede usar como un descriptor de la velocidad y el alcance
de la biodegradación en la biorremediación de contaminantes orgánicos en el suelo. Feng y Boyd
(2005) enfatizaron que el tiempo de contacto entre los contaminantes y las partículas del suelo
(envejecimiento) es un factor crítico que influye en la biodisponibilidad de los compuestos
orgánicos. El envejecimiento aumenta la absorción del contaminante en el suelo porque el
producto químico tiene más tiempo para ingresar a matrices orgánicas o minerales y, por lo tanto,
para absorber material microporoso ( Villaverde et al., 2009; Morillo et al., 2014).

3.3. Mineralización de diuron en suelo: condiciones estáticas.

La mayoría de los consorcios degradantes de diurón aislados de diferentes suelos agrícolas fueron
efectivos para la biorremediación de diurón en solución y en suspensión de suelo, especialmente
en el caso del consorcio C1 con el que se obtuvieron los mejores resultados de
mineralización. aunque se observó una efectividad significativamente reducida en el sistema de
suspensión del suelo (Tabla 3). Se realizaron ensayos de mineralización estática para examinar la
efectividad en un escenario más realista. La biodisponibilidad del herbicida debe reducirse
significativamente porque el contacto entre las moléculas de diurón y las partículas del suelo se
incrementa como resultado de un aumento en la relación suelo : solución . El grado en que se
produce la degradación se utiliza a menudo como un indicador de la biodisponibilidad química en
el suelo. Un aumento en la biodisponibilidad del diurón a los microorganismos se considera una de
las principales causas de una mayor mineralización ( Giaccomazzi y Cochet , 2004). Como los
hongos y muchas bacterias tienen diámetros superiores a 1000 nm, y ningún organismo de vida
libre es menor a 100 nm, una molécula dentro de estos nanoporos más pequeños no está
disponible para el metabolismo, siempre que se retenga dentro de los poros del suelo y no se
difunda en Poros más grandes habitados por microorganismos ( Pignatello y Xing, 1996).

Las curvas de mineralización de diurón del suelo se obtuvieron en el suelo

no esterilizado mediante bioestimulación con
nutrientes. El control no tratado, bioaumentación con el consorcio C1 y / o aplicación de HPBCD
como potenciador de la biodisponibilidad se muestran en la Fig. 4. HPBCD es ampliamente
reconocida como una herramienta con el medio ambiente para la biorremediación de
contaminantes orgánicos debido a su capacidad de formar complejos de inclusión entre las
moléculas hidrófobas y su cavidad hidrófoba, que aumenta su hidrosolubilidad y los hace más
biodisponibles para la biodegradación (Morillo et al., 2012). En el presente estudio, cuando se
aplicó la solución HPBCD, se pudo observar una mejora significativa en el grado de mineralización
(27,3%), así como una disminución en el DT50 (745 días), en comparación con el suelo sin
tratamiento (Tabla 4). La aplicación de HPBCD hizo que una mayor cantidad de diurón estuviera
biodisponible, acelerando así su biodegradación ( Villaverde et al., 2013).

Cuando se aplicó bioaumentación utilizando C1, el consorcio microbiano más degradante

de diurón probado en el sistema de suspensión, también se observó una mejora significativa en
comparación con la mediada por la flora endógena, alcanzando el 23.2% de la mineralización
global, con una disminución particularmente notable en el DT50. (355 días). Jacques et al. (2007)
evaluaron la capacidad de un consorcio microbiano definido (formado por cinco cepas
degradadoras específicas diferentes) aisladas de tierras de cultivo contaminadas con HAP para
mineralizar cuatro concentraciones diferentes de antraceno ,fenantreno y pireno en el suelo. Para
pesticidas, Lopes et al. (2013) evaluaron el potencial de la inoculación microbiana para reducir
la contaminación por molinato del suelo en los suelos de arrozales, y Lima et al. (2009) evaluaron
una herramienta de limpieza potencial basada en bioaumentación con degradadores microbianos
de atrazina específicos en un suelo contaminado con una formulación comercial de atrazina.

Con el objetivo de determinar los posibles degradadores de microorganismos pesticidas en C1, los
componentes del inóculo se identificaron mediante el análisis del gen 16S rRNA . Se identificaron
tres cepas diferentes pertenecientes a los géneros Pseudoxanthomonas y
Bacillus: Pseudoxanthomonas. Indica , Bacillusanthracis y Bacillus cereus. Ma et al. (2014) aislaron
una nueva bacteria degradante de imidacloprid , identificada
como Pseudoxanthomonas Indica por el análisis del gen 16S rRNA . Este aislamiento pudo
degradar el 70.1% del insecticida en el suelo contaminado en seis días. Las especies de Bacillus
Bacillus cereus y Bacillus spp1 degradaron el diuron en un 21% y 19% de la concentración
inicialmente aplicada, respectivamente, después de 35 días de incubación en medios de cultivo
líquidos ( Ngigi et al., 2011).

El efecto de la aplicación de HPBCD en combinación con la inoculación de C1 en el suelo también

se muestra en la Fig. 4. Con estos tratamientos, el grado de mineralización fue de 42.2% y también
se observó una gran disminución en DT50 (214 días). HPBCD provocó una mejora sustancial en
la mineralización dediurón debido a la formación de un complejo de inclusión con diurón ,
aumentando su solubilidad y, por lo tanto, su biodisponibilidad para el consorcio degradador
microbiano ( Villaverde et al., 2013). La combinación de bioaumentación con un potenciador de la
biodisponibilidad, como ciclodextrina o surfactantes, aumenta la probabilidad de éxito
( Odukkathil y Vasudevan , 2013). Garon et al. (2004) utilizaron cepas de hongos
y ciclodextrinas para degradar el fluoreno y optimizar la biodisponibilidad y degradación
del fluoreno en el suelo, y los resultados de ese estudio indicaron que A. cylindrospora y maltosil-
ciclodextrinapodrían usarse con éxito en los sistemas de biorremediación
de fluoreno . Simpanen et al. (2016) investigaron la biorremediación de 16 HAP en suelos
históricamente contaminados con creosota utilizando experimentos de laboratorio y de campo, y
encontraron que las modificaciones de nutrientes y la circulación de la solución de metil-BCD
mejoraron la biodegradación microbiana del suelo. Pero, hasta donde sabemos, ningún trabajo ha
informado el uso de ciclodextrinas y la bioaumentación para la biorremediación de plaguicidas.

4. Conclusiones

La combinación de bioaumentación utilizando diferentes consorcios de degradadores de diurón ,

aislados de diferentes suelos agrícolas (C1eC5), y la bioestimulación con nutrientes esenciales y / o
un potenciador de la biodisponibilidad, ciclodextrina , dio como resultado una estrategia exitosa
para acelerar labiorremediación de diurón en el suelo . El consorcio más efectivo fue el C1,
formado por tres especies bacterianas diferentes (identificadas por el análisis del gen 16S rRNA ),
que se había informado previamente como degradadores de diuron . Tanto los microorganismos
indígenas como los exógenos se beneficiaron enormemente de la bioestimulación utilizando una
solución nutritiva. El potenciador de la biodisponibilidad, HPBCD, provocó una mejora sustancial
en la mineralización de diuron debido a la formación de un complejo de inclusión con diuron , que
aumentó su solubilidad y por lo tanto su fracción biodisponible después de la aplicación. Según
nuestro conocimiento, este es el primer informe sobre el uso de consorcios
microbianos aislados del suelo en combinación con ciclodextrinas propuesto como una técnica de
biorremediación para suelos contaminados con pesticidas.

Se están realizando estudios moleculares con el objetivo de determinar la presencia de los genes
diuron relacionados que codifican las principales enzimas involucradas en el metabolismo del
herbicida fenilurea en cada uno de los consorcios estudiados para ayudar a dilucidar la vía de
biodegradación de diuron en diferentes escenarios ambientales.

Expresiones de gratitud
Los autores están en deuda con Presmar SL por proporcionar el grado técnico diuron . Este trabajo
fue apoyado por el Ministerio de Economía y Competitividad de España (cofinanciado por
el Fondo Europeo de Desarrollo Regional, FEDER) , bajo el proyecto de investigación CTM 2013-
42599-R y el Proyecto de la Junta de Andalucía RNM 894, que hizo posible el reclutamiento. de la
Dra. Marina Rubio Bellido .

Anexo A. Datos suplementarios.

Los datos complementarios relacionados con este artículo se pueden encontrar en

https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2017.10.172.