Extracción selectiva y cuantificación de linfocitos

J.Quishpe1,L. Vaca1
1Departamento de Ciencias de la Vida y de la Agricultura, Laboratorios de Docencia, Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE, Sangolquí, Ecuador.

jpquishpe1@espe.edu.ec, lvaca2@espe.edu.ec

Métodos de Criogenización / CPA: Agentes

Introducción
La centrifugación de alta
RPM tiene velocidades
de hasta 30.000 rpm,
para amplio rango de
separaciones, permite la
separación de partículas
muy pequeñas en un
tiempo práctico, tienen
usualmente rotores a 4°C,
denominadas centrífugas
en frío [1].
crioprotectores penetrantes: Dimetilsulfóxido
(DMSO), Etilenglicol (EG), Glicerol, Trehalosa.
1) Congelación de 3-2 °C /min a -196 °C/min
lenta (equilibrio) tiempo = 2 horas) baja [CPA]
2) Vitrificación: congelación instantánea a
Alta [CPA] -196°C tiempo: < 10 minutos
3)Almacenamiento (a - 4 °C)
a bajo cero
4) Conservación en Liofilización
estado seco [3].
Fig1.Cromatografía de Inmunoafinidad [4] .

Metodología
8) Usar trypan blue y
1) Toma de muestra de sangre. conteo Neubauer.

2) Dilución 1:1 Sangre entera Sobrenadante 7) Obtención del pellet

y de PBS10X (3ml). (plasma) (Linfocitos).

3) Adición del medio de PBMC e 6) Adición de buffer lisis de

densidad (mantener dos fases). histopaque eritrocitos y centrifugación.

Granulocitos, .
4) (20min)Centrifugadora de eritrocitos RBC 5) Extracción de la
enfriamiento a 4°C 1800rpm.
suspensión de PBMC.

Resultados
81% Células
viables
29% Células no
7
viables
6,8
Log(células /mL)

6,6
6,4
6,2
6 Células totales
5,8
Células viables Células no viables
𝟖, 𝟓𝟓𝒙𝟏𝟎𝟔 cell/ml
Fig2. Pellet del linfocitos
Fig3. Recuento celular en Fig4 .Razones obtenidas de células
cámara de Neubauer viable s y no viables
Discusión
Monocitos in vitro con factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos GM-CSF y citocinas como interleucinas IL-4, se
diferenciaron en células dendríticas DC, que expresaran antígenos tumorales (inmunoterapia del cáncer) [5] .

8550 cell/µL
1000 a 4800 cell/µL Recomendaciones
*El rendimiento y viabilidad de las
3000 a 9500 cell/µL
separaciones de leucocitos de la sangre por
Conclusiones buffer lisis de eritrocitos es mucho mayor
que gradiente de densidad [2].
Se logró purificar linfocitos tanto viables como no viables mediante la * El transporte de muestras debe ser con kit
centrifugación en Lymphoprep el medio de gradiente de densidad para derrames (material absorbente, un
cuantificando 8,55𝑥106 cell/ml totales de las cuales el 81% son viables por desinfectante, contenedor).
medio de recuento en la cámara de Neubauer con trypan blue. * La toma de muestras animales debe ser
menos doloroso y estresante, el estrés
afectará el resultado del estudio [6].
Referencias
[1] Alshareef, N. (2012). KAU-Faculty of Science- Biochemistry department.http://www.kau.edu.sa/GetFile.aspx?=CENTRIFUGATION%20short.pdf
[2] Dagur, P., & McCoy, P. (2015). Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. HHS Public Acces.
[3] Jang, T., & Clhoel, S. (2017). Cryopreservation and its clinical applications. Integrative Medicine Research , 12-18.
[4] Mohr, F., & Pezbilla, S. (2018). Cromatografía de inmunoafinidad eficiente de linfocitos directamente de sangre entera. Acientific Reports.
[5] Neidhardt, E., & Berard , F. (2004). Dendritic cells induce differentiation of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes. Breast Cancer Research.
[6] Parasuram, S., & Raveendran, R. (2010). Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacothe, 87-93.