I.

MARCO TEÓRICO

Degradación de carbohidratos

 Agar Kligler

El agar con hierro de Kligler (KIA) es un medio de cultivo diferencial en tubo que cumple una
doble función: determinar la fermentación de hidratos de carbono y determinar la
producción de H2S. Como se puede ver en la tabla aquí abajo, el KIA, contiene dos hidratos
de carbono: 1% de lactosa y 0.1% de glucosa. Se pueden observar distintos
comportamientos de los microorganismos, pudiéndose fermentar ambos hidratos de
carbono, otros solo fermentan glucosa y algunos no pueden fermentar ni glucosa ni lactosa.

El sulfato ferroso es usado como un detector de sulfuro de hidrógeno, siendo menos

sensible que las sales férricas o ferrosas. El indicador rojo fenol es amarillo por debajo del
pH de 6.8. Como el medio esta amortiguado a un pH de 7.4, las cantidades relativamente
pequeñas de producción de ácido conducen a un cambio visible de color. (Elmer W.
Koneman, 2008)

AGAR HIERRO DE KLIGLER

- Extracto de vacuno, 3 g - Cloruro de sodio, 5 g

- Extracto de levadura, 3 g - Tiosulfato de sodio, 0.3 g

- Peptona, 15 g - Agar, 12 g

- Peptona de proteasa, 5 g - Rojo fenol, 0.024 g

- Lactosa, 10 g - Agua destilada hasta igualar

1L
- Glucosa, 1g
- pH final, 7.4
- Sulfato ferroso, 0.2 g

Fuente:Koneman
(2008)

La porción inclinada del agar o pico de flauta, expuesta en toda su superficie al oxígeno
atmosférico es aerobia; la parte inferior o profunda, está protegida del aire y es
relativamente anaerobia. Cuando se preparan los medios es importante mantener en igual
longitud la porción inclinada y la profundidad, haciendo que, de esta forma, se preserve el
efecto de las dos cámaras.

Según (MacFaddin, 2003) podemos ver como se realiza la fermentación según el uso de
lactosa o glucosa como hidrato de carbono fermentable y la producción de H2S:
 Fermentación sólo de la glucosa (alcalino/ácido)

la concentración de glucosa baja y el microorganismo empieza a utilizar peptonas del medio

como nutrientes de desarrollo. El catabolismo de la peptona libera amoniaco, haciendo que
el pH del medio se alcalinice.

Sin embargo, en el fondo de KIA el color amarillo se debe a la degradación anaerobia de la

glucosa. Debido a esta degradación se forman productos ácidos, dando un pH ácido, un
color amarillo. La reacción ácida se mantiene en el fondo debido a la tensión de oxígeno
más baja.

Fermentación de lactosa y de glucosa (ácido/ácido)

Algunos microorganismos pueden fermentar tanto la lactosa como la glucosa para obtener
sus nutrientes y producen una reacción en el KIA con un pico de flauta ácido y un fondo
ácido (ácido/ácido). Después de las horas de incubación, la lactosa, presente en mayor
cantidad, no se ha agotado y todavía existe un medio ácido.

Ausencia de fermentación de lactosa y glucosa (alcalino/alcalino; alcalina, sin

cambios)

Algunas bacterias no pueden fermentar ni la glucosa ni la lactosa, por lo que tienen que
obtener sus nutrientes a partir de la peptona del medio. Cuando las peptonas son
degradadas se produce un pH alcalino, debido a la liberación de amoniaco, el medio cambia
a un color rojo profundo. Se puede utilizar la peptona de manera aeróbica o anaeróbica.
Produciéndose dos posibles reacciones, la primera, con un pico de flauta alcalino y un fondo
alcalino, esto nos indica que el microorganismo degrada la peptona tanto aeróbica como
anaeróbicamente. Si se observa un pico de flauta alcalino y ningún cambio en el fondo,
podemos decir que se catabolizo la peptona solamente aeróbicamente. Por lo que,
podemos interpretar de cuatro maneras la reacción KIA:

Alcalino/ácido Sólo glucosa es degradada

Ácido/ácido Glucosa y lactosa degradadas

Alcalino/alcalino Ni la glucosa ni la lactosa son degradadas, uso de

peptonas

Alcalino/sin cambios Ni la glucosa ni la lactosa son degradadas, uso de

peptonas
  Agar Citrato Simmons

La composición del agar citrato Simmons es la siguiente:

Agar Citrato Simmons

Citrato de sodio 2.0 g

NaCl 5.0 g

K2HPO4 1.0

(NH4)H2PO4 1.0

MgSO4.7H2O 0.2

Azul de 0.08
bromotimol

Agar 15.0

pH final: 6.9 ± 0.2

Fuente: Bacteriología General (2005)

El agar citrato de Simmons es utilizado para poder probar la habilidad del microorganismo
de utilizar citrato como fuente de energía, siendo la única fuente de carbono del medio.
Dihidrógeno fosfato de amonio es una fuente de nitrógeno. El fosfato dipotasio actúa como
un buffer. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico del medio. El sulfato de
magnesio es un cofactor para diversas reacciones metabólicas.

Las bacterias que pueden crecer en este medio producen la enzima citrato permeasa, la cual
es capaz de convertir el citrato en piruvato. Luego este piruvato sigue su ciclo metabólico,
buscando la producción de energía. El crecimiento indica la utilización de citrato como
fuente carbonada.
Cuando la bacteria metaboliza el citrato, las sales de amonio se hidrolizan a amoniaco, lo
que incrementa la alcalinidad. El pH cambia el color del indicador, en este caso es azul de
bromotimol, el cual tiene un viraje de un verde a un azul en un pH aproximadamente de 7.6
(Alarcon ,2004). En la degradación de aminoácidos se ocurre una producción de INDOL.

Degradación de aminoácidos:

 Agar Lisina

Como se puede ver en la tabla a continuación tiene como indicador al púrpura de

bromocresol, siendo el intervalo de viraje de este entre 5.2 y 6.8, virando de amarillo a
púrpura en el rango mencionado. En el caso del agar lisina lo que evaluamos es la presencia
de enzimas capaces de descarboxilan aminoácidos específicos en un medio de prueba. Estas
enzimas son denominadas descarboxilasas las cuales forman aminas a partir de la
descarboxilación de un aminoácido, generando una reacción alcalina. (Elmer W. Koneman,
Diagnostico Microbiologico/ Microbiological diagnosis, 2008)

Se puede realizar la descarboxilación de por ejemplo: lisina a cadaverina, ortinina a

putrescina, arginina a citrulina; todas estas reacciones catalizadas por las enzimas
descarboxilasas.

Agar lisina (en gramos por litro)

Extracto de levadura 3.0

Glucosa 1.0

Lisina 10.0

Citrato de hierro y amonio 0.5

Tiosulfato de sodio 0.04

Púrpura de bromocresol 0.02

Agar 15.0

pH final: 6.7 ± 0.2

Fuente: (Aryal , 2015)

 Caldo indol (degradación del triptófano)

El citrato férrico amónico y el tiosulfato sódico son indicadores de la formación de ácido

sulfhídrico. Los cultivos que producen ácido sulfhídrico generan un ennegrecimiento en el
medio debido a la producción del sulfuro férrico.
Esta prueba se utiliza para determinar la producción de indol por los microorganismos, a
partir de la degradación del aminoácido triptófano, mediante la enzima triptofanasa.
Fundamento:
El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminación reductiva del triptófano y
esta reacción es llevada a cabo por algunas bacterias que poseen las enzimas
denominadas en su conjunto triptofanasas. Para detectar la producción de
indol se utiliza el medio Caldo triptófano y la lectura de la prueba se realiza con el reactivo
de Kovacs (alcohol isoamilo, p-dimetilaminobenzaldehído y ácido clorhídrico concentrado)
con el que el indol producido reacciona generando la formación de un anillo color rojo
fucsia.

Interpretación:
Si se observa un anillo de color fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, entonces nos
encontramos ante una Reacción (+) para la producción de indol, sin embargo si se mantiene
en su color original amarillento, será Reacción (-) para la producción de indol.

Degradación de la Urea

 Caldo úrea

Este método es utilizado para determinación de la utilización de la urea como fuente de

nitrógeno, para esto la bacteria debe poseer la enzima ureasa, para poder proceder a su
degradación, en esta descomposición se libera amoniaco que es el encargado de alcalinizar
el medio.
Caldo urea: Composición
- Fosfato monopotásico
- Fosfato disódico
- Extracto de levadura
- Indicador de pH, Rojo fenol
Fundamento:
El extracto de levadura es la única fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y como
cofactores y aporta los nutrientes fundamentales para el desarrollo bacteriano. Los fosfatos
constituyen el sistema buffer, mientras que el color rojo fenol es el indicador de pH, y la urea
es el sustrato de la enzima ureasa. Aquellas bacterias que poseen esta enzima, son
capaces de utilizar el nitrógeno que proviene de la urea, que hidrolizan, liberando amoniaco
y dióxido de carbono. Estos son los causantes de alcalinizar del medio, haciendo virar el
indicador de fenol del rosado a color grosella intenso o fucsia.
Interpretación:
Si notamos que el medio cambia de color rosado, a color grosella intenso o fucsia, entonces
la bacteria será ureasa (+), es decir contiene la enzima ureasa para degradar la urea, sin
embargo si permanece en su color original es ureana (-).

Reducción del Nitrato

 Caldo nitrato
Esta prueba se utiliza para reconocer la capacidad de la bacteria para reducir el nitrato,
convirtiéndolo en nitritos o en o en nitrógeno, es decir se estudia la presencia de nitrato
reductasa y nitrito reductasa.
Caldo Nitrato: Composición:
- Peptona
- Extracto de carne
- Nitrato potásico
- Agua destilada
- Reactivo gris
- Granallas de Zinc

Fundamento:
En esta prueba se detecta una respiración anaerobia: la que utiliza nitrato como aceptor
final de electrones. Los nitratos se reducen a nitritos y algunas bacterias reducen los nitritos
a productos gaseosos (N2 y N2O), y para comprobar esto se debe agregar zinc metálico.
Las enzimas responsables de ambas reducciones se denominan nitrato y nitrito reductasa,
respectivamente.

Interpretación:

Si se observa un cambio al color grosella la reacción es (+) para la reducción del nitrato, y si
tiene ausencia de este color será (-) a la reducción del nitrato a nitrito, o que los nitratos han
sido reducidos a amoniaco, nitrógeno gaseoso, óxido nítrico, óxido nitroso.

Movilidad Bacteriana

 Agar Motilidad

Agar Motilidad: Composición

- Tripteina
- Cloruro de sodio
- Agar
- KNO3
Fundamento:
En este medio de cultivo la tripteina, que es un digesto pancreático de la caseína, constituye
la fuente de nitrógeno, aminoácidos y carbono, necesario para que el microorganismo se
desarrolle favorablemente. Además es una fuente importante del triptófano lo que también
nos permite una detección de la trptofanasa, produciendo indol (añadiendo el reactivo de
Kovacs). El cloruro de sodio se encuentra para equilibrar el medio osmótico. El agar es
solidificante, se encuentra en una concentración que le permite tener características del
medio semisólido, que es útil para la detección de motilidad.
Interpretación:
Si se observa un medio turbio se puede concluir que obtenemos cepas móviles, sin
embargo si el crecimiento se nota solo en la línea de siembra, nos encontramos ante cepas
inmóviles.
II. BIBLIOGRAFÍA

 Aryal, S. (23 de octubre de 2015). Microbiology Info. Obtenido de Simmons Citrate

Agar- Composition, Principle, Uses, Preparation and Result Interpretation:
http://www.microbiologyinfo.com/simmons-citrate-agar-composition-principle-
uses-preparation-and-result-interpretation/
 ALARCÓN, L. Manual de prácticas de microbiología básica y microbiología de
alimentos. 2004. Primera edición. Universidad Autónoma de Ciudad de Juárez. Pág
37.
 Elmer W. Koneman, S. A. ( 2008). Diagnostico Microbiologico/ Microbiological
diagnosis. Ed. Médica Panamericana.
 MACFADDIN, J. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica. 2003. Argentina. Tercera edición. Editorial Médica
Panamericana. Capítulo 28 Prueba de movilidad. Págs 306,307 y 309.
 GRANADOS PÉREZ, R.; VILLAVERDE PERIS, M. C. 1998. Microbiología: bacteriología,
medios de cultivo y pruebas bioquímicas, micología general, parasitología general.
Ed. Paraninfo. Madrid, España.
 WILLEY, JOANNE M. 2005. Bacteriología General. Ed. McGraw-Hill. Madrid, España.
 WISTREICH, G. A; LECHTMAN, M. D. 1989. Prácticas de laboratorio en microbiología.
Segunda edición. Ed. Limusa. México D.F.

CUESTIONARIO

1. Nombre algunos ácidos producidos por bacterias. Mencione el género principal

que producen cada uno de estos ácidos.

 Acetobacterias: comprenden un grupo de bacilos Gramnegativos, móviles y

aeróbicos, que realizan una oxidación incompleta de alcoholes. Cuando el sustrato es
etanol, se produce ácido acético. Géneros: Gluconobacter, Acetobacter.

 BacteriasAcido Lácticas: Son un grupo de bacterias gram positivas anaerobicas y no

formadoras de esporas. Pueden ser cocos o bacilos. Producen ácido láctico cuando
fermentan carbohidratos. Géneros: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y
Streptococcus.

 Bacterias Propiónicas: Son bacterias que producen el ácido propiónico, ácido

biológico natural que es efectivo y selectivo de la flora bífida(bífido bacterias),
incrementándolas en el colon. Géneros: Bifidobacterium sp, algunas sp de
lactobacilos y Saccharomyces.

2. Algunos microorganismos usan carbohidratos sin formar niveles de ácidos

detectables. En tales casos, como podría determinar que el carbohidrato ha sido
utilizado.

Se puede usar tintes después de la incubación para saber si esta aun ahí el
carbohidrato, ejemplo en el caso de almidón se utilizó lugol después de que haya
ocurrido la incubación y por tanto se pudo determinar la presencia del mismo.
Se podría sembrar la bacteria en un medio diferencial en el cual el carbohidrato sea
la única fuente de alimento, si el microorganismo no se desarrolla, quiere decir que
no puede usar el carbohidrato, pero si llega a desarrollarse, lo usa.

3. Por qué las amilasas, gelatinasas, caseínasas y lipasas son clasificadas como enzima
hidrolítica.
 Porque cataliza la escisión o desdoblamiento de un enlace mediante hidrólisis; la
cual se da para acelerar las reacciones en las que una sustancia se rompe en
componentes más simples por reacción con moléculas de agua.

4. ¿Las enzimas que hidrolizan la caseína y gelatina rompen el mismo enlace químico.
Cuál es?
Las proteínas que se producen naturalmente son demasiado grande para entrar en la
célula bacteriana, por lo que primero deben ser degradadas a polipéptidos y
finalmente hasta aminoácidos, que entrarán en la célula. La gelatina, proteína de
estructura sencilla, es un colágeno desnaturalizado que tiene poco valor nutritivo,
pero se usa para detectar la actividad proteolítica y se hidroliza gracias a las enzimas
que rompen LOS ENLACES PEPTIDICOS de la gelatina. Con este test se determina la
capacidad de un organismo para producir enzimas de tipo proteolítico, gelatinasas,
que licúan la gelatina.

5. ¿Cuál es el nombre de amina formada por la descarboxilación de la lisina?

Esta amina se da de la descarboxilación del aminoácido L-lisina para formar

CADAVERINA (una diamina) y dióxido de carbono por la acción de la enzima especifica
lisina descarboxilasa.

La cadaverina es un líquido incoloro o de

color almibarado, fumante, que desprende
un olor fétido muy desagradable. Tiene
un punto de ebullición de 179 °C mientras
que su punto de fusión es de 9 °C. Posee
una densidad inferior a la del agua (ρ =
0,873 g/cm3)3 pero mayor que la
de pentanaminas como la 1-pentanamina.
Es un compuesto soluble en agua, etanol y
sólo ligeramente soluble en éter etílico. El
valor del logaritmo de su coeficiente de reparto, logP = -0,16, indica que es algo más
soluble en disolventes hidrófilos que en disolventes hidrófobos.
La cadaverina es un compuesto estable. Dado su marcado carácter básico (pKa1= 10,25 /
pKa2 = 9,13), es incompatible con cloruros de acilo, ácidos, anhídridos de ácido así como
con agentes oxidantes fuertes.