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I-Phenylpropan-1-ol-2-on (L-PAC)

Herstellung aus Benzaldehyd

von Andrew Smallridge, Maurice Trewhella und Margaret Del

Guidice, Robert Coughlin, Wafaa Mahmoud; A. Halim EI-Sayed und

John W. Rothrock

Ephedrin (α- [1- (Methylamino) ethyl] benzol-methanol),

ursprünglich aus Pflanzen der Gattung Ephedra isoliert, tritt als die

natürlich vorkommende Isomere I-Ephedrin und d-Pseudoephedrin,

und andere pharmakologisch aktive Isomere umfassen D-Ephedrin und

I-Pseudoephedrin. Diese Verbindungen sind adrenerge Sympathomimetika

Mittel und haben Antihistamin-Aktivität; I-Ephedrin ist weit verbreitet als

Bronchodilatator, während D-Pseudoephedrin als abschwellendes Mittel weit verbreitet ist.


Verbindungen dieser Gruppen liegen in einem sehr weiten Bereich vor

verschreibungspflichtige und rezeptfreie pharmazeutische Formulierungen.

Die Herstellung von I-Phenylacetylcarbinol, einer Vorstufe von

I-Ephedrin durch Katalyse unter Verwendung von ganzen Bäckerhefezellen in wässriger Lösung

Medium war einer der ersten mikrobiellen Biotransformationsprozesse zu

kommerziell genutzt werden Neuberg (1921); siehe auch Hildebrandt (1934). Diese

Reaktion beinhaltet die Hefe-induzierte Kondensation von Benzaldehyd mit

Acetyl-Coenzym A. Die Reaktion wurde umfassend untersucht und hat

Es wurde gezeigt, dass es durch das Enzym Pyruvatdecarboxylase Groger vermittelt wird

(1966). Es wurde auch gezeigt, dass die Reaktion relativ breit ist

Spezifität für das Substrat, wodurch eine Vielzahl von substituierten Aromaten ermöglicht wird

Aldehyde, die in die entsprechenden substituierten optisch aktiven Phenylacetylcarbinole


umgewandelt werden sollen Long (1989) ...

Wir haben nun überraschenderweise festgestellt, dass hefevermitteltes Acyloin vorliegt


Die Kondensation von Benzaldehyd kann in einem organischen Lösungsmittel erreicht werden

unter Verwendung von nicht fermentierender Hefe und dem Zusatz eines geringen Anteils von

Ethanol zum Reaktionsgemisch unterdrückt die Bildung unerwünschter Nebenprodukte. Noch


überraschender ist es, wenn man die Reaktion bei vermindertem Druck durchführt

Temperatur kann eine noch stärkere Reduktion von Nebenreaktionen erreicht werden,

ohne Verlust der katalytischen Aktivität. Der Effekt der Temperatursenkung

scheint sowohl für wässrige als auch nicht-wässrige allgemein anwendbar zu sein

systeme mit nicht fermentierender hefe ...

Jede Hefe, die eine Reduktion bewirken kann, kann verwendet werden. Es ist

wirtschaftlich vorteilhaft die billigste verfügbare Hefe zu verwenden, und

Gewöhnliche Bäckerhefe, Saccharomryces cerevisiae, ist bevorzugt. Stämme

Hefen für andere Zwecke, einschließlich Brauhefe und Wein oder

Sherryhefen könnten ebenfalls eingesetzt werden. Stämme speziell angepasst an eine

organische lösungsmittel umwelt oder für verbesserte reduktionseffizienz kann

verwendet werden; solche Stämme umfassen konventionell selektierte und genetisch

modifizierte Stämme. Für eine maximale Effizienz der Reaktion ist es ratsam,

Geben Sie die maximale Oberfläche der Hefe für den Kontakt mit den Reaktanten an. Dies kann
unter Verwendung von "aktiver" Trockenhefe erfolgen, die im Handel leicht als "Instant-
Trockenhefe" erhältlich ist und bei gelagert werden kann

Zimmertemperatur. Alternativ kann auch gut pulverisierte Trockenbäckerhefe verwendet werden

verwendet werden. Andere Hefen, wie die in Leuenberger (1988) beschriebenen,

oder Pilze, wie jene, die in Chenevert (1992) offenbart sind, können ebenfalls verwendet
werden.

Der Fachmann kann leicht prüfen, ob dies der Fall ist

Spezifischer Organismus wird im Sinne der Erfindung unter Verwendung von

die hier beschriebenen Verfahren.


Vorzugsweise ist der aliphatische Alkohol oder der aliphatische Aldehyd Ethanol oder
Acetadehyd, geeigneterweise 0,1 ml pro Gramm Hefe. Dies führt zu einer

deutliche Steigerung der Carbinolausbeute und Reduzierung der Menge

von aromatischen Alkoholen als Nebenreaktion erzeugt. Ethanol ist bevorzugt,

da dies zu einem überlegenen Umsatz der aromatischen Aldehyde zu führt

das gewünschte Carbinol und geringere Ausbeute an unerwünschtem Reduktionsprodukt.

Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, wird das geglaubt

das Ethanol oder Acetaldehyd bietet ein alternatives Substrat für die

Reduktaseenzyme hemmen somit die Bildung von Nebenprodukten wie z

als Benzylalkohol. Daher ist davon auszugehen, dass andere aliphatische Alkohole

oder aliphatische Aldehyde könnten die gleiche Funktion erfüllen.

Obwohl die Reaktion bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden kann,

geeigneterweise 16-24 ° C, vorzugsweise 20 ° C, haben wir überraschenderweise gefunden, dass

Deutlich bessere Ergebnisse werden bei niedrigeren Temperaturen erzielt, in denen

Bereich 0-5 ° C. Der Grund für die verbesserte Leistung und weiter

Die beobachtete Reduktion von Nebenreaktionen wird derzeit nicht verstanden;

wir haben jedoch beobachtet, dass die Aktivität der Hefe bei diesen vermindert ist

Die Temperaturen sind vergleichbar mit denen bei Umgebungstemperatur. Dieses Ergebnis

ist besonders überraschend, da normalerweise zu erwarten ist, dass a

Hefe-vermittelte Reaktion würde ein Temperaturoptimum bei zeigen

Umgebungstemperatur oder leicht erhöhte Temperatur, obwohl Shiu (1996), haben

zeigten, dass isolierte Pyruvatdecarboxylase das an der

Acyloin-Kondensationsreaktion, zeigt erhöhte Aktivität bei 4 ° C

Es ist bekannt, dass zur Aufrechterhaltung der Funktion eines Enzyms in

eine Umgebung mit organischen Lösungsmitteln ist erforderlich für das Enzym vollständig sein
hydratisiert, indem es von ein paar Schichten von Wassermolekülen umgeben ist. Diese
Voraussetzung ist ein Verhältnis von 0,6 bis 1,2 ml Wasser / g

Hefe, vorzugsweise 1,0 ml Wasser / g Hefe. Dies führt zu einer einzelnen Phase

organisches System, da das gesamte Wasser von der Hefe aufgenommen wird. Eine zweiphasige

System reduziert die Ausbeute des Produkts und macht die Isolierung des Produkts

erheblich schwieriger.

Sobald die durch Hefe vermittelte Reaktion abgeschlossen ist, wird die Hefe

kann leicht durch Filtration vom Reaktionsgemisch abgetrennt werden und

Waschen. Das Reaktionsgemisch, das Produkt enthält, setzt nicht ab

Material, Lösungsmittel und kleinere Verunreinigungen, wird konventionell unterworfen

Reinigung, zum Beispiel durch Flash-Destillation, um das gereinigte zu ergeben

Produkt. Optional kann die Hefe mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert werden

wie Ethylacetat, um eine marginale Menge an weiterem Produkt zu ergeben.

Während das Verhältnis von Hefe zu Substrat variiert je nach

individuelles System und wird leicht experimentell unter Verwendung von bestimmt

routinemäßige probemethoden haben wir für die umstellung gefunden

von Benzaldehyd zu Phenylacetylcarbinol beträgt das optimale Verhältnis 5 g

Hefe / mmol Benzaldehyd; Erhöhen der Hefemenge führt nur zu

eine geringe Steigerung der Umwandlung und geringere Hefemengen sorgen für geringere

Umwandlung.

In ähnlicher Weise kann die optimale Reaktionszeit leicht bestimmt werden.

und für das Benzaldehyd-Phenylacetyl-Carbinol-System haben wir Reaktionszeiten von 12 bis 72


Stunden untersucht und festgestellt, wann

Die Reaktion wird länger als 24 Stunden fortgesetzt, es gibt sehr wenig

Verbesserung des Umsatzes und Steigerung der Produktion

von Nebenprodukten.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Herstellung unerwünscht


Nebenprodukte werden durch Durchführung der Katalyse-Reaktion unten reduziert

Umgebungstemperatur. Vorzugsweise beträgt die Temperatur 0-5 ° C.

Quelle: Smallridge (2001)

Saccharomyces cerevisiae Zugangsnummer ATCC 834 der

Sammlung amerikanischer Schriftkultur, 12301 Parkland Drive, Rockville,

Md., 20852 USA. wurde auf einem Medium gehalten, das (pro Liter) enthielt:

10 g Hefeextrakt, 10 g Malzextrakt, 4 g Dextrose,

20 Gramm Agar. Das flüssige Medium zum Züchten der Hefezellen und

zur Herstellung von enthaltenem L-PAC (pro Liter): 6 Gramm Hefeextrakt,

4 g NH & sub4; SO & sub4 ;, 0,6 g MgSO & sub4 ;, 1 g KH & sub2; PO & sub4 ;, 100 g

Traubenzucker, mit dem Rest Wasser. Zur Sterilisation eine Lösung von Dextrose

und eine Lösung, die die anderen Bestandteile enthielt, wurde separat autoklaviert, dann
gemischt und der pH auf 6,2 eingestellt. Die Hefe wurde für gewachsen

24 h auf dem flüssigen Medium bei 28 - 30 ° C zentrifugieren, resuspendieren

steriles Wasser wird erneut zentrifugiert. Die gewaschenen und zentrifugierten Zellen wurden in
einer Lösung resuspendiert

3% (w / v) Natriumalginat (Aldrich Chemical Company) enthaltend. Das

letztere Zellsuspension wurde als Tropfen in 2% Calciumchlorid extrudiert

Lösung, wodurch Perlen gebildet wurden, die in der CaCl & sub2; -Lösung gehalten wurden

1 Stunde vor dem Filtrieren und Waschen auf einem Büchner-Trichter. Diese

Dann wurden Kügelchen aus immobilisierter Hefe verwendet, um das Medium zu beimpfen

die Schüttelkolben so, dass die Zelldosis 2,8 Gramm (Zellfeuchtgewicht) pro betrug

100 ml Medium in 250 ml Erlenmeyerkolben. Mter unter zittern

1 Stunde unter aeroben Bedingungen wurde das Schütteln unter anaeroben Bedingungen
fortgesetzt

Bedingungen. Vorgereinigter (durch Destillation) Benzaldehyd wurde zu viert zugegeben

gleiche aliquote Mengen in Intervallen von 1 Stunde während des anaeroben Schüttelns. Die
Summe

Die Menge an zugesetztem Benzaldehyd betrug 6 g pro Liter Medium. Danach,

unter fortgesetztem Schütteln unter anaeroben Bedingungen wurden kleine Proben erhalten

innerhalb der folgenden 24 Stunden zurückgezogen und auf L-PAC untersucht von

die Methode von Groger (1966). Der maximale Liter L-PAC betrug 5,5 giL.

Quelle: Coughlin (1992)

3,4-substituierte Benzaldehydverbindung, wobei die 3 und 4

Substitute sind Hydroxy, Alkoxy oder, wenn zusammengenommen, Alkylendioxy

(z. B. Methylendioxy) ersatz wird mit einer wachsenden Kultur von

ein Acyloin produzierender Mikroorganismus bei einer Temperatur von ungefähr 25-30 ° C.

und das erzeugte L-Acyloin wird aus der Fermentationsbrühe durch isoliert

Extraktion, Chromatographie und Kristallisation.

Die verwendeten Acyloin produzierenden Mikroorganismen sind das Verfahren

meiner Erfindung sind vorzugsweise im Handel erhältliche Hefestämme

Üblicherweise wird als "feuchte Preßhefe" die Back- und Brauindustrie verwendet, insbesondere
ausgewählte Stämme von Saccharomyces cerevisiae.

Zusätzlich sind ausgewählte Stämme von Mikroorganismen, die zu den Schizomyseten,


Myxomyceten und Eumyceten gehören, wirksam bei der Durchführung der

gewünschte stereospezifische Umwandlung in das L-Acyloin.

Für jede gegebene Spezies von Mikroorganismen ist es notwendig, durch einen einfachen Test
Acyloin-produzierende Stämme von Mikroorganismen auszuwählen.

Dieser Test beinhaltet das Züchten des ausgewählten Mikroorganismus in Kontakt mit

3,4-disubstituiertem Benzaldehyd und Filtrieren und Extrahieren der Fermentationsbrühe mit


Ethylacetat. Ein Teil des Extrakts wird dann auf Filterpapier getupft und chromatographiert mit n-
Butanol gesättigt mit

3% ige wässrige Ammoniumhydroxidlösung. Ein positives blaues Tetrazolium

Ein Spot-Test zeigt das Vorhandensein des gewünschten Acyloins und der Stämme an
Anschließend werden bei der Fermentation positive Tetrazolium-Tests eingesetzt

verarbeiten ... Ein geeignetes steriles Nährmedium enthaltend assimilierbar

Kohlenstoff- und Stickstoffquellen werden mit einem ausgewählten Stamm von geimpft

Mikroorganismus und belüftet und gerührt, bis ein wesentliches Wachstum der

Mikroorganismus ist aufgetreten. Im Allgemeinen ist ein Zeitraum von 1-7 Tagen erforderlich.

Typische Medien, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind in angegeben

die folgenden Tabellen. Nach der Wachstumsphase wird der ausgewählte 3,4-disubstituierte
Benzaldehyd in einer Konzentration von etwa 1 bis 10 g der Verbindung pro Liter Medium und
Medium zu dem Medium gegeben

enthaltend die unter Rühren bei ca. 28 ° C inkubierte Testverbindung

für einen Zeitraum von 1-10 Stunden.

Nach der Inkubationszeit befindet sich die fermentierte Brühe, die die gewünschte Verbindung
zusammen mit anderen Stoffwechselprodukten enthält

extrahiert mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für das Acyloin wie z

Ester einer niederen aliphatischen Säure, vorzugsweise Ethylacetat.

Der Lösungsmittelextrakt enthält neben dem gewünschten Acyloin

nicht umgesetzter Aldehyd sowie das entsprechende substituierte Benzyl

Alkohol und die substituierte Benzoesäure. Die gewünschte Acyloinverbindung

wird von den verwandten Verbindungen durch Verfahren einschließlich


Partitionschromatographie, durch fraktionierte Kristallisation und durch Extraktion mit
abgetrennt

wässrige Natriumbisulfatlösung.