Biotransformation for L-Ephedrine Production

P.L. Rogers, H.S. Shin and B. Wang. Department of Biotechnology, University of New South

Wales, Sydney 2052, Australia

1 Introduction 2

2 Factors Affecting L-phenylaœtylcarbinol (L-PAC) Production 4

2.1 Pyruvate Decarboxylase (PDC) Activity 4

2.2 Metabolic Status of Yeast 5

2.3 Benzaldehyde Concentration 5

2.4 End-product Inhibition 9

3 Biotransformation Using Yeasts - Free Cells 9

3.1 Fed-Batch Process 9

3.2 Continuous Process 10

4 Biotransformation Using Yeasts - Immobilized Cells 15

5 Biotransformation Using Purified PDC - Free Enzyme 15

5.1 Characteristics of Purified PDC 17

5.2 Factors Influencing Biotransformation Kinetics 17

5.3 Kinetic Analysis 20

6 Biotransformation Using Purified PDC-Immobilised Enzyme 22

6.1 PDC Immobilisation 23

6.2 Factors Influencing Biotransformation Kinetics 23

6.3 Continuous Biotransformation 23

7 Discussion and Conclusions 24

8 References 26
L-Ephedrin wird in pharmazeutischen Präparaten häufig als abschwellendes und
antiasthmatisches Mittel verwendet

Verbindung. Eines der wichtigsten Zwischenprodukte bei seiner Herstellung ist L-

Phenylacetylcarbinol (L-PAC).

die entweder aus Pflanzen (Ephedra sp.) gewonnen werden kann, chemische Synthese unter
Isolierung von

ein racemisches Gemisch oder durch Biotransformation von Benzaldehyd unter Verwendung
verschiedener Hefen.

In der vorliegenden Übersicht wurden kürzlich signifikante Verbesserungen der mikrobiellen

Biotransformation erzielt

werden sowohl für Fed-Batch- als auch für kontinuierliche Verfahren unter Verwendung von
freien und immobilisierten Hefen bewertet.

Aus früheren Fed-Batch-Kulturdaten wurden maximale L-PAC-Konzentrationen von 10-12 g L-1

mit angegeben

Ausbeuten von 55-60% theoretisch bezogen auf Benzaldehyd. In letzter Zeit jedoch
Konzentrationen von mehr

Unter Verwendung einer Wildtyp-Färbung von Candida utilis wurden mehr als 22 g L-1 erhalten.
Dies wurde erreicht

durch optimale Steuerung des Hefestoffwechsels (über Mikroprozessorsteuerung der

Atemwege)

Quotient, RQ), um die Substratpyruvatproduktion zu erhöhen und Pyruvat zu induzieren

Decarboxylase (PDC) -Aktivität. Prozesse, die gereinigtes PDC involvieren, wurden ebenfalls
evaluiert

Es wurde gezeigt, dass L-PAC-Gehalte von bis zu 28 g L-1 mit Ausbeuten von 90-95% erhalten
werden können.

theoretisch bezogen auf den zugesetzten Benzaldehyd. Im Test die Vor- und Nachteile von
Die verschiedenen Strategien für die mikrobielle und enzymatische Produktion des L-PAC werden
verglichen.

In Anbetracht des zunehmenden Interesses an mikrobiellen Biotransformationen, L-PAC-

Produktion

bietet ein interessantes Beispiel für die Verbesserung durch Online-Steuerung eines Prozesses,
an dem Folgendes beteiligt ist

Inhibition sowohl des toxischen Substrats (Benzaldehyd) als auch des Endprodukts (L-PAC,
Benzylalkohol)

1. Einleitung

Die Umwandlung von organischen Verbindungen mit Biokatalysatoren - Enzyme, Zelle

Organellen oder ganze Zellen sind wichtige Prozesse in der organischen Synthese

wurden in großem Umfang bei der Herstellung von Steroiden, Antibiotika, Vitaminen und
anderen hochwertigen Produkten eingesetzt (1). Die Vorteile solcher Biotransformationen sind

dass es sich um reaktionsspezifische Verfahren handelt (z. B. Kondensation, Hydrierung,

Veresterung,

Decarboxylierung usw.) und kann einen hohen Grad an Regio- und Stereospezifität beinhalten.
Im

Außerdem werden in den meisten Fällen relativ milde Reaktionsbedingungen angewendet (2).
Sowie diese

vorteile einige problembereiche wurden identifiziert. Dazu gehören unter anderem

Substratarmut und

Produktlöslichkeiten in der wässrigen Phase, Substrat- und Produkttoxizität zusammen mit

Niedrige Ausbeuten und niedrige Produktivitäten, insbesondere bei der Biotransformation

ganzer Zellen. Als ein

Englisch: www.tab.fzk.de/en/projekt/zusammenf...ng/ab103.htm In jüngster Zeit wurden

beträchtliche Forschungsarbeiten zur Verbesserung von Deutsch:
www.tab.fzk.de/de/projekt/zusammenf...ng/ab103.htm

Biotransformationskinetik unter Verwendung von Zweiphasensystemen (3,4,5),

Biotransformation in a

„Mikro-wässrige“ Umgebung in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels (6, 7, 8), die

Verwendung von
Umkehrmizellen (9,10) und die Anwendung der Extraktion überkritischer Flüssigkeiten für das
Produkt

Entfernung (11,12).

Mikrobielle Biotransformation zur Herstellung von biologisch aktivem Chiral

Verbindungen (L-Form), die wichtige Bausteine im Pharmazeutikum sind

Industrie ist ein Bereich, der in der letzten Zeit erheblich gewachsen ist. Dies wurde weitgehend

aufgrund der toxikologischen Probleme, die mit dem Arzneimittel aufgetreten sind

Verwendung von racemischen Gemischen (13).

In der vorliegenden Übersicht werden verschiedene Strategien für einen

Biotransformationsprozess bewertet

welches die Umwandlung von Benzaldehyd zu L-Phenylacetylcarbinol (L-PAC) beinhaltet, ein

Zwischenprodukt bei der Herstellung von L-Ephedrin und verwandten Pseudoephedrinen. Das
kann sein

wird als interessanter Biotransformationsprozess zur Bewertung angesehen, da er beides

umfasst

toxische Substrat- und Endprodukthemmung.

L-Ephedrin ist ein natürliches pflanzliches Alkaloid, das ursprünglich aus den getrockneten
Jungen isoliert wurde

Zweige von Ephedra, einer Pflanze mit interessanten pharmakologischen Aktivitäten. Auszüge
aus

Ephedra sp., Insbesondere Ephedra sinica, E.equisetina und E.distachya, allgemein genannt

"Ma Huang" in China wird seit mehreren tausend Jahren als Volksheilmittel für

Induziert Schweiß, beruhigt den Atem und lindert die Ausscheidung von Urin. Der Wirkstoff von

Dieser Extrakt, L-Ephedrin, wurde erstmals 1855 isoliert, und das internationale Interesse daran

Medikament wurde durch die klassischen Untersuchungen von Chem & Schmidt im Jahr 1930
angeregt, die

über seine kardiovaskulären Wirkungen und seine Ähnlichkeit mit Adrenalin berichtet (14)

Ephedrin, chemisch bekannt als 1-Methylamino-ethyl-benzylalkohol oder

2-Methylamino-l-phenyl-l-propanol enthält zwei asymmetrische Kohlenstoffatome, so

dass es vier optisch aktive Formen gibt (Abb. 1), von denen die (L-) Isomeren sind

klinisch verwendet. Diese vier Isomere kommen natürlich in Ephedra-Pflanzen vor und können es
sein

mit Alkohol und Benzol extrahiert. Gereinigtes Ephedrin wird geruchsneutral gewonnen,

farblose Kristalle oder als weißes kristallines Pulver mit bitterem Geschmack. Ephedrin und
Pseudoephedrin sind sehr stabil. Eine Lösung von Ephedrinhydrochlorid versiegelt z

Sechs Jahre zeigten weder Oxidation noch Aktivitätsverlust (15, 16). Seine pharmakologische
Hauptverwendung ist

als abschwellende oder antiasthmatische Verbindung, obwohl jüngste Berichte auf sein Potenzial
hingewiesen haben

in Adipositas-Kontrolle (17).

Für L-Ephedrin wurden drei Produktionsmethoden angewendet: die traditionelle Extraktion aus

Pflanzenarten von Ephedra, einem synthetischen chemischen Prozess, der die Racematspaltung
beinhaltet

und ein Verfahren, das die Biotransformation von Benzaldehyd zu L-PAC durch

verschiedene Arten von Hefen, gefolgt von reduktiven Animationen (18, 19).

Der Biotransformationsprozess, der die Kondensation eines „aktiven

Benzaldehyd '(aus Brenztraubensäure) und Benzaldehyd ist in Fig. 2 dargestellt. Die Herstellung
des LPAC wird durch das Enzym Pyruvatdecarboxylase (PDC) katalysiert und kann damit in
Verbindung gebracht werden

Bildung von Benzylalkohol-Nebenprodukten aufgrund der Aktivität von Alkoholdehydrogenase

(n) (ADH)

und / oder andere unspezifische Oxidoreduktasen. Einige Spuren von Benzoesäure als
Nebenprodukt haben auch

wurde gemeldet.

Frühere Studien haben Konzentrationen von 10-12 g L-1 L-PAC im Ansatz berichtet

Kultur mit freien Zellen (20, 21) und mit immobilisierter Hefe (22, 23). Die Zugabe von
Cyclodextrinen
(insbesondere & bgr; -Cyclodextrin) wurde gezeigt, dass es die L-PAC-Produktion mit
immobilisierter Substanz erhöht

Saccharomyces cerevisiae (24) waren zwar wieder maximale Konzentrationen von 12 g L-1 L-PAC

berichtet. Bewertung einer großen Anzahl von Hefestämmen durch Netrval und Vojtisek (19)
identifiziert

Stämme von Saccharomyces, Candida und Hansenula sp. die in der Lage waren, signifikante L-
PAC

Produktion in Shake-Aal-Kulturen (bis maximal 6,3 g L-1). Dehnungsverbesserungsstudien zu

Acetaldehyd- und L-Ephedrin-resistente Mutanten zu entwickeln, wurde von Seely et al. (25)

mit Mutanten, die in der Lage sind, die L-PAC-Spiegel im Vergleich zu Wildtyp-Stämmen zu
erhöhen. Jedoch,

Die maximalen L-PAC-Spiegel überstiegen 10 g L-1 nicht n weitere grundlegende Untersuchungen

zur Biotransformation aromatischer Substrate durch Hefen,

Andere Autoren haben angegeben, dass Oxidoreduktasen, die keine Alkoholdehydrogenate sind,
sein können

beteiligt an der Bildung von Benzylalkohol-Nebenprodukten (26-31).

Die derzeitige Geschäftspraxis beinhaltet ein Fed-Batch-Verfahren mit fermentativem

Hefewachstum

auf Zucker, um Biomasse, Brenztraubensäure zu produzieren und PDC-Aktivität zu induzieren.

Die Wachstumsphase ist

gefolgt von Biotransformation unter weiterer Zugabe von Zucker und programmierter Fütterung
von

Benzaldehyd zur Maximierung der L-PAC-Produktion. Infolgedessen wird die Bildung von L-PAC
eingestellt

der folgenden Faktoren, die entweder zusammen oder unabhängig voneinander wirken:

(a) Verringerung der PDC-Aktivität aufgrund von Benzaldehydhemmung;

(b) Brenztraubensäurebegrenzung am Ende der Biotransformationsphase;

(c) Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen aufgrund einer längeren Exposition gegenüber
Benzaldehyd und / oder zunehmenden Konzentrationen

von Benzylalkohol und L-PAC.

2 Faktoren, die die Produktion von L-Phenylacetylcarbinol (L-PAC) beeinflussen

2.1 Pyruvat-Decarboxylase (PDC) -Aktivität

Obwohl die Produktion von L-PAC von der PDC-Aktivität abhängt, wurden bisher nur wenige
Forschungsergebnisse zu diesem Thema veröffentlicht

Induktion und Deaktivierung dieses Enzyms während des Biotransformationsprozesses. In

unserer Forschung.

Es wurden Studien durchgeführt oder ein Candida utilis-Stamm aufgrund seiner Verträglichkeit
ausgewählt

Benzaldehyd und produzieren relativ hohe Mengen an L-PAC. Die Hefe wurde chargenweise
angebaut

Kultur unter partiellen Fermentationsbedingungen, um Biomasse zu produzieren und auch PDC-

Aktivität zu induzieren. Wie in 3 gezeigt, erreichte die PDC-Aktivität nach 18 bis 20 Stunden ein
Niveau von 0,9 U mg Protein –1, während

die ADH-Aktivität betrug 1,4 U mg Protein-1. Die fermentative Natur des Stoffwechsels war

veranschaulicht durch Ethanolanreicherung von 35 g L-1. Wie bereits erwähnt, die verbesserte
PDC-Aktivität

sollte für eine schnelle L-PAC-Produktion förderlich sein, während die höhere ADH-Aktivität dazu
führen kann

Mehr

Benzylalkohol.

2.2 Stoffwechselstatus der Hefe

In einer Studie zur Entwicklung von Strategien zur Online-Steuerung des L-PAC-Prozesses wurde
die Wirkung des

Der Atmungsquotient (RQ) für die Produktion von L-PAC wurde von unserer Gruppe untersucht.
Ein RQ

Der Wert von 1,0 für das Wachstum auf Glucose entspricht dem vollständigen Wachstum der
Atemwege, während die RQ-Werte höher sind

als 1,0 zeigen den fermentativen Metabolismus an. Eine zunehmende Fermentation führt zu
einer Erhöhung des RQ

vales. Daten unter Verwendung von C.utilis-Zellen, die in kontinuierlicher Kultur bei
kontrollierten RQ-Werten von 1,0, 1,9 gezüchtet wurden
und 4.4 sind in 4 gezeigt. Die Biotransformationen wurden in Schüttelkolben bei 300 ° C
durchgeführt

C, pH

= 6,0 bei verschiedenen Anfangskonzentrationen von Benzaldehyd (0,5-4,0 g L-1).

Anfangsspezifische Sätze L-PAC

(qPAC) und Benzylalkoholproduktion (qBA) wurden aus den kinetischen Daten geschätzt. Aus Fig.
4 ist es

Es zeigt sich, dass ein vollständiges Wachstum der Atemwege (RQ = 1,0) zu einer niedrigen und
einer hohen spezifischen L-PAC-Rate führte

spezifische Rate der Benzylalkoholproduktion. Die Erhöhung der RQ hatte einen signifikanten
Effekt auf die Verbesserung der LPAC-Produktionsraten und Ausbeuten (65-70% theoretisch bei
höheren RQ-Werten). Für die

Biotransformationsprozess war ein RQ-Wert von 4-5 für die Hefewachstumsphase optimal

entsprach einem RQ, der ausreichend Hefe-Biomasse für eine schnelle Biotransformation
produzierte,

während die Produktionsraten und -erträge von L-PAC gesteigert werden. Durch den Einsatz von
Online-Gasanalysatoren für

O2 (paramagnetisch) und CO2 (infrarot) Messungen, Schnittstelle zu einem Mikroprozessor für

Berechnung des RQ und anschließende Rührerdrehzahlanpassung, eine effektive Regelstrategie

für RQ wurde entwickelt.

2.3 Benzaldehydkonzentration

Die Wirkung von Benzaldehyd auf die L-PAC-Produktion von S. cerevisiae wurde von Gupta
untersucht

et al. (32) und Agarwal et al. (33). Die letzteren Autoren berichteten, dass einmal der
Benzaldehyd

Die Konzentration stieg über 16 mM (1,7 g L-1), die Speziesrate der L-PAC-Produktion

verringert und über 20 mM (2,1 g L-1) hinaus wurde es vollständig gehemmt. Wenn der Rest

Benzaldehyd sank unter 4 mM (0,4 g L-1), die Bildung von Benzylalkohol war vorherrschend

über L-PAC. Sie schätzten den optimalen Konzentrationsbereich für Benzaldehyd

war 4-16 mM. Weitere Studien (34) führten die optimale Konzentration für L-PAC an

Produktion als 10 mM (1,1 g L-1). In jüngsten Studien unserer Gruppe wurde bei C.utilis
festgestellt, dass das Wachstum für

Benzaldehydkonzentrationen über 1,0 g L-1. Eine Wachstumshemmkonstante für Benzaldehyd

war

geschätzt auf 0,30 g L-1 (unveröffentlichte Daten). Unter Verwendung der anfänglichen
Ratenanalyse wird die Wirkung von Benzaldehyd bestimmt

Die Produktion von L-PAC wurde untersucht. Eine Analyse der Daten für eine Reihe von Anfangs

Die Benzaldehydkonzentrationen (0,5-4,0 g L-1) sind in Fig. 5 gezeigt. Aus der Analyse. das
Maximum

Die spezifische Rate der L-PAC-Produktion (qPAC) wurde mit 0 10 gg-1 h -1 für RQ = 4,4, Ks,
geschätzt

Wert (Sättigungskonstante) betrug 1,0 g L-1 Benzaldehyd und Konzentrationen von Benzaldehyd
in

Ein Überschuss von 3,0 g L-1 verursachte eine signifikante Abnahme des qPAC. In Studien von
Tripathi ct al. (34) mit a

Stamm von S. cerevisiae wurde ein maximaler qPAC-Wert von 0,07 gg-1 h-1 angegeben.

2.4 Hemmung des Endprodukts

Die Hauptprodukte, die wahrscheinlich das Hefewachstum und den Stoffwechsel sowie L-PAC
beeinflussen

Produktion sind: Ethanol durch fermentativen Stoffwechsel, Benzylalkohol-Nebenprodukt und

die

L-PAC Produkt selbst. Es ist auch möglich, dass sich Acetaldehyd oder Benzoesäure ansammelt

beeinflussen die L-PAC-Produktion, obwohl nur sehr geringe Mengen während nachgewiesen
wurden

Biotransformation mit freien Zellen von C.utilis.

In diesem Zusammenhang haben Seely et al. (25) mutagenisierte Stämme von S. cerevisiae und
C. flareri

mit klassischen Methoden, z. N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin (NTG), ultraviolettes Licht

(UV)
und Gammastrahlen und haben Mutanten mit erhöhter Resistenz gegen Acetaldehyd und
Lephedrin ausgewählt. Es wurden Stämme isoliert, die in der Lage waren, L-PAC in höheren
Mengen als die Eltern zu produzieren

Kulturen und Endkonzentrationen bis zu einem Maximum von L-PAC von 9,9 g L-1 wurden
berichtet.

Studien in unserem Labor an einem C.utilis-Stamm haben gezeigt, dass das Potenzial signifikant
ist

Hemmung des Wachstums von Endprodukten und Nebenprodukten.

Produktinhibitionskonstanten für das Wachstum (Kp)

wurden zu 4,1 g L-1 L-PAC, 5,0 g L-1 Benzylalkohol und 39 g L-1 Ethanol geschätzt

(unveröffentlichte Daten). Die Wirkung dieser Produkte auf die spezifische Rate der L-PAC-
Produktion (qPAC)

denn die freien Zellen sind noch zu bestimmen.

3 Biotransformation mit hefefreien Zellen

3.1 Fed-Batch-Prozess

Ein Fed-Batch-Verfahren zur Herstellung von L-PAC kann in drei grundlegende Phrasen unterteilt
werden:

(1) Wachstum der Hefe unter Teilfermentationsbedingungen, um ausreichend Biomasse zu

erzeugen

für den Biotransformationsprozess und auch zur Erleichterung der Anreicherung von Pyruvat für

anschließende L-PAC-Produktion; (2) optimale Induktion von PDC für die Biotransformation -
jedoch PDC - Induktion in

Eine zunehmend fermentative Umgebung führt zur Umwandlung von Pyruvat in Ethanol über

Acetaldehyd und eine Zunahme von Alkoholdehydrogenasen, die Benzylalkohol verstärken

können

Formation;

(3) programmierte Zufuhr von Benzaldehyd zur Aufrechterhaltung von Konzentrationen von 1-2
g L-1 und

anschließende Herstellung von L-PAC.

Wie bereits erwähnt, wurden L-PAC-Konzentrationen von 10-12 g L-1 in der

Literatur mit verschiedenen Arten von Hefen. Es ist jedoch erst vor kurzem, dass höhere Niveaus
gewesen sind

gefunden. Vermutlich trat in vielen früheren Studien ein Pyruvatmangel auf und war
unzureichend

Aufmerksamkeit wurde auf die anfängliche Pyruvatakkumulation, die PDC - Aktivität und den
Stoffwechselstatus des Gens gerichtet

Hefe. In einigen Studien (20, 28) wurde der Zusatz von Pyruvat und Acetaldehyd bewertet, um
einen höheren Wert zu erzielen

L-PAC-Niveaus; Die Effekte waren jedoch unterschiedlich und in vielen Fällen wurde keine
Verbesserung gefunden.

In einer kürzlich von unserer Gruppe durchgeführten Studie wurden L-PAC-Werte von bis zu 22 g
L-1 erreicht

die optimale Kontrolle des Metabolismus eines C.utilis-Stammes (RQ = 4-5) und die anhaltende
Fütterung

Benzaldehyd unter Aufrechterhaltung einer Konzentration von 1-2 g L-1 im Bioreaktor (35). Die
Ergebnisse

eines typischen Experiments in einem kontrollierten Bioreaktor (T = 200

C, pH = 6,0) unter Verwendung eines vollständig definierten

Medium sind in Fig. 6 gezeigt. Vor der PDC-Aktivierung betrugen die

Brenztraubensäurekonzentrationen typischerweise 10-15 g

L-1 mit geringer PDC-Aktivität (0,2 U mg Protein-1). Nach Zellwachstum und Pyruvatansammlung

(insgesamt 22 h) mit Glukosezugabe zur Aufrechterhaltung des aktiven Metabolismus wurde die
PDC - Aktivität gesteigert (bis

größer als 1,0 U mg Protein-1). Die Benzaldehydzufuhr wurde eingeleitet und führte zu einer
anschließenden

L-PAC-Produktion. Wie in 6 gezeigt, trat eine Akkumulation von Benzylalkohol bei 4 g L-1 auf und
LPAC erreichte 22 g L-1. Die Biotransformation hörte schließlich aufgrund der damit
einhergehenden Pyruvatverarmung auf

durch Abnahme der PDC-Aktivität. Zelllebensfähigkeitsstudien nach 14 h Biotransformation

zeigten 100%

Rentabilitätsverlust. Die Produktivität für die Biotransformationsphase betrug 1,6 g L-1 h-1 mit
einer Ausbeute von

65% theoretisch bezogen auf den eingesetzten Benzaldehyd. Es wurde keine Benzoesäure
nachgewiesen.

3.2 Kontinuierlicher Prozess

Kontinuierliche Versprechungen werden oft als die Vorteile höherer Produktivität, einfacher
bezeichnet

Prozesskontrolle und kompatibler Betrieb mit anschließender nachgeschalteter

Produktrückgewinnung.

Es gibt jedoch relativ wenige Berichte über die Anwendung von freien Zellen in kontinuierlicher
Kultur

Biotransformationsprozesse, obwohl Rohner et al. (36, 37) haben über den Erfolg berichtet

Anwendung von Chemostat-Kulturen von S. cerevisiae zur stereospezifischen Reduktion von

Acetessig

Säureester zu den 3- (5) -Hydroxybutansäureestern. Ein kontinuierlicher einstufiger stationärer

Zustand

Das Produktionssystem erwies sich als überlegen gegenüber den Puls-Batch- und Fed-Batch-
Systemen in Bezug auf

Produkt optische Reinheit, Biomassekonzentration und Produktionsraten. Es wurde auch darin

gegründet

verarbeiten, dass das reduzierte Produkt (3- (5) -Hydroxybuttersäureester) inhibierte die Zellen
(36) nicht, obwohl das Ausgangsmaterial

(Acetessigsäureester) beeinflusste sowohl die Atmung als auch die Zellphysiologie von S.
cerevisiae.

Bei der L-PAC-Herstellung werden sowohl das Substrat (Benzaldehyd) als auch das Produkt

(L-PAC) haben signifikante inhibitorische Effekte auf den Hefestoffwechsel und die PDC-Aktivität.
Diese Faktoren

erfordern die Gestaltung eines komplexeren kontinuierlichen Kulturprozesses, und schlagen eine
Beteiligung vor

mehrstufiger Betrieb und Benzaldehydzufuhr in einem späteren Stadium, um den stationären

Zustand aufrechtzuerhalten

Bedingungen. Andere Arbeiter haben über die Verwendung einer einstufigen kontinuierlichen
Kultur für die berichtet

Produktion von aktiven Hefezellen für die L-PAC-Produktion (34), jedoch die Biotransformation

Benzaldehyd wurde in diskontinuierlicher Kultur durchgeführt.

In neueren Studien in unseren Laboratorien wurde eine detaillierte Bewertung verschiedener

kontinuierlicher Kulturverfahren durchgeführt

Systeme durchgeführt wurde, und die Ergebnisse dieser Forschung können wie folgt
zusammengefasst werden:

(1) Eine einstufige kontinuierliche Kultur, die als glucosebegrenzter Chemostat mit

Die kontinuierliche Zufuhr von Benzaldehyd war für den Biotransformationsprozess aufgrund der

stark hemmende Wirkungen von Benzaldehyd auf das Zellwachstum.

(2) Bei einem zweistufigen System können zunächst teilweise fermentative Bedingungen
hergestellt werden

Stufe für Brenztraubensäureakkumulation und PDC-Induktion zu sorgen, während Benzaldehyd

sein kann

der zweiten Stufe hinzugefügt, um die Biotransformation zu erleichtern. Es wurde jedoch

festgestellt, dass die

Die Biomasseausbeute unter den teilweise fermentativen Bedingungen in der ersten Stufe war
zu gering, um produziert zu werden

ausreichend Hefezellen für eine schnelle L-PAC-Produktion im zweiten

Bühne.

(3) Zur Überwindung der Nachteile des ein- und zweistufigen Verfahrens ein dreistufiger

System wurde wie folgt konzipiert:

Stufe 1. Eine vollständig aerobe Stufe (RQ = 1), um C.utilis Ausbeuten von Yx / s = 0,450,50 gg-1
zu liefern

Glucose, nahe der theoretischen maximalen Biomasseausbeute.

Stadium 2. Ein teilfermentatives Stadium (RQ = 4-5), das die PDC-Aktivität ebenso erhöht wie

für eine gewisse Anreicherung von Brenztraubensäure sorgen. Eine zusätzliche Zufuhr von
Glucose wurde geliefert

zu dieser zweiten Stufe.

Stufe 3: Es wurde eine kontinuierliche Biotransformationsstufe mit Benzaldehydzugabe an
eingestellt

verschiedene Vorschubgeschwindigkeiten. Zu dieser Stufe wurde auch eine Glucosezufuhr mit

niedrigem Gehalt zugeführt, um Substrat bereitzustellen

zur Fortsetzung der Stoffwechselaktivität der Hefe.

Es wird ein Diagramm des dreistufigen Prozesses zusammen mit einem typischen Satz von
Betriebsbedingungen gezeigt

in 7.

Dieses System wurde mit einer Reihe von Benzaldehyd- und zusätzlichen Glucose-Zufuhrraten
bewertet

unter Verwendung eines definierten Mediums, das 60 g L-1 Glucose enthält, zur ersten Stufe.
Unter voll aeroben Bedingungen

Bedingungen (DO> 20% Luftsättigung) wurde festgestellt, dass nahezu 30 g L-1 Biomasse
vorhanden waren

in der ersten Stufe hergestellt (RQ = 1). PDC-Induktion bis zu 0,50 U mg Protein -1 und Pyruvat

Akkumulation auf 2-3 Betriebseigenschaften für 3-stufiges kontinuierliches Verfahren zur PAC-
Herstellung

Abb. 7. Betriebsbedingungen für einen dreistufigen kontinuierlichen Biotransformationsprozess

typische Enzymaktivitäten für jede Stufe

g L-1 trat während der Stufe 2 sowie bei der Bildung von 45-50 g L-1 Ethanol auf. Das Ethanol hat

es wurde gezeigt, dass es für die Verbesserung der Löslichkeit von Benzaldehyd während Stufe 3
vorteilhaft ist;

es wird jedoch ein erheblicher Verbrauch an Glukose dargestellt. Wie in Fig. 8 gezeigt, wenn die

Die Zufuhrrate von Benzaldehyd wurde erhöht Fig. 8a, b. Einfluss einer erhöhten
Benzaldehydzufuhr auf die dreistufige L-PAC-Produktion

Prozess, eine Benzaldehyd-Zufuhrrate; b Konzentrationen: (o) Benzaldehyd, (F) Benzylalkohol,

(Q)

L-PAC

Inkrementell während 300 h erhöhte sich die L-PAC-Konzentration auf 10,6 g L-1 bis zu einem
kontrollierten Wert
Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 4 l während der Stufe 3 führten zu einer Abnahme der
L-PAC-Gehalte und der

Anreicherung von Benzaldehyd. Unter diesen Bedingungen verringerte sich die PDC-Aktivität auf
weniger als

0,05 U mg Protein -1. Bei der maximalen stationären L-PAC-Konzentration von

10,6 g L-1 betrug die Produktivität, bezogen auf das Gesamtvolumen der drei Fermenter, 0,44 g
L-1 h-1

mit einer Ausbeute von 0,80 gg-1 (56% d.Th.) bezogen auf den eingesetzten Benzaldehyd.

4 Biotransformationen mit Hefen - immobilisierten Zellen

Es wurde berichtet, dass die Zellimmobilisierung von Hefen die toxischen Wirkungen von Hefen
verringern kann

Benzaldehyd aufgrund von Teilungsbeschränkungen und den toxischen Substratgradienten, die

sind

innerhalb der immobilisierenden Matrix etabliert (22, 23, 38).

Jüngste Studien unserer Gruppe unter Verwendung von C.utilis-Zellen, die in Calciumalginat
immobilisiert sind

Perlen mit einem Durchmesser von 2-3 mm haben diese erhöhte Beständigkeit gegenüber
Benzaldehyd (39) bestätigt, mit

Die immobilisierten Zellen produzierten in Shake-Aal-Experimenten höhere L-PAC-Spiegel als

freie Zellen.

In Versuchen mit der programmierten Einspeisung von Benzaldehyd in einen geregelten

Bioreaktor (T = 20

Gleichstrom, pH = 5,0), unter ähnlichen Bedingungen wie zuvor mit freien Zellen beschrieben,
betrug die LPAC-Endkonzentration 15 g L-1 (39). Die PDC-Aktivität der Zellen in den Beads war

anfänglich bei 0,65 U mg Protein-1 fielen sie auf 0,2 U mg Protein-1 ab, wobei L-PAC aufhörte

Produktion aufgrund von Pyruvatmangel. Elektronenmikroskopische Aufnahmen am Ende der

Biotransformation (9) zeigte an, dass eine größere Zellwandschädigung innerhalb des Calciums
aufgetreten war

Alginatperlen. Der Grund dafür war der endgültige L-PAC-Spiegel von 15 g L-1 mit
immobilisierten Zellen
Umso besser ist es, wenn die mit dem freizelligen Fed-Batch-System erzielten 22 g L-1 deutlich
unterschritten werden

Kontrolle des Hefestoffwechsels (über RQ) im letzteren Fall sorgte für mehr Pyruvat

Akkumulation. Mit den freien Zellen wurden Gehalte von 10-15 g L-1 erreicht, während für die
immobilisierten Zellen

Zellsystem die maximale Konzentration betrug nur 5 g L-1.

Als diese Bewertung mit immobilisiertem C.utilis auf einen kontinuierlichen Bioreaktor
ausgedehnt wurde,

Die stationären L-PAC-Werte waren niedrig (nicht mehr als 4 g L-1 im Dauerbetrieb). Diese

Die Ergebnisse ähnelten denen von Mahmoud et al. (22, 38), die über eine semikontinuierliche
Behandlung berichteten

immobilisierter Zellprozess. Diese Autoren fanden bei immobilisierten S. cerevisiae, dass L-PAC

Produktion im ersten und zweiten Zyklus (mit einer dazwischen liegenden Reaktivierungsdauer
von 24 h) könnte

erreichen 4,5 g L-1. Versuche, den Prozess auf drei oder mehr Zyklen auszudehnen, führten zum
Abreißen der

Zellen / Kügelchen in ständiger Gegenwart von Benzaldehyd.

5 Biotransformation mit gereinigtem PDC-freiem Enzym

Eines der Probleme bei der Verwendung ganzer Hefezellen für den Biotransformationsprozess ist
das

erhebliche Mengen an Benzaldehyd werden in unerwünschte umgewandelt Fig. 9a-d. Vergleich

von elektronenmikroskopischen Aufnahmen von immobilisierten Zellen von C.Utilis in

Kalziumalginatkügelchen. a, b Vor Exposition gegenüber Benzaldehyd, c, d nach längerer

Exposition

zu 1-2 g L-1 Benzaldehyd. Die Maßstäbe sind auf den vier Fotografien angegeben. Nebenprodukt
Benzylalkohol. Die Verwendung von gereinigtem PDC bietet die Möglichkeit, dies zu überwinden

Problem. Im letzteren Fall muss jedoch Pyruvat als Substrat zugeführt werden, und es ist
vorhanden

die weitere Wahrscheinlichkeit, dass das zugesetzte Pyruvat durch Decarboxylierung entfernt
wird, liegt bei
Acetaldehyd und Kondensation zu Acetoin.

Bringer-Meyer und Sahm (40) haben die Verwendung von gereinigtem PDC aus untersucht

Zymomonas mobilia und S. carlsbergensis für die L-PAC-Produktion und zeigten, dass die PDC

von Z.mobilis ist wegen seiner geringen Affinität zu Benzaldehyd und zur Biotransformation
ungeeignet

wegen signifikanter Substratinhibierungseffekte. Allerdings sind die Untergründe eben und

folgerichtig

Die mit S. carlsbergensis erreichten L-PAC-Konzentrationen waren in dieser Untersuchung relativ

niedrig.

Um einen effektiven Vergleich zwischen dem Hefe-Biotransformations-Prozess und einem zu

ermöglichen

welches das gereinigte Enzym beinhaltet, ist es notwendig, ähnliche Betriebsbedingungen zu

bewerten und

Substratkonzentrationen. Details unserer jüngsten Studie (41) sind wie folgt.

5.1 Eigenschaften von gereinigtem PDC

Gereinigtes PDC wurde aus Zellen von C. utilis hergestellt, die unter teilweise fermentativen
Bedingungen wuchsen

in einem 100-1 bei einer konstanten Temperatur von 250 fermentiert

C und einem pH-Wert von 6,0. Bei der PDC-Aktivität

0,9 U mg Protein-1 erreicht hatten, wurden die Zellen geerntet, bei hohem Druck aufgebrochen

Homogenisator und die PDC wurden mittels (NH4) 2SO4 gereinigt. Fällung und Gel

Chromatographie. Frühere Studien mit PDC haben gezeigt, dass das Enzym ein Dimer aufweist

Tetramer - Struktur (α2β2), die sich in vitro in Dimer - und Monomeruntereinheiten mit dem

gleichzeitige Freisetzung der Cofaktoren Thiaminpyrophosphat (TPP) und Magnesiumionen (42).

Diese Dissoziation, die hauptsächlich vom pH-Wert abhängt, wird auch von der Käuferspezies
beeinflusst. Das

Es wurde festgestellt, dass die Dissoziation in Tris-Cl im Vergleich zu Phosphat- und Citratpuffern
größer ist. Als ein

In der berichteten Studie (41) ergaben die Reaktionsgemische verschiedene PDC-Aktivitäten und
Pyruvat: Benzaldehyd-Verhältnisse mit 30 mM TPP, 0,5 mM MgSO4.7H2O in 40 mM Phosphat

Puffer (pH 6,0), um maximale Enzymstabilität zu erreichen.

Wie in Fig. 10 gezeigt, wurde der Km-Wert von PDC für Pyruvat zu 2,2 mM bei bestimmt

250

C und pH 6,0 mit einer Sättigung bei Konzentrationen von mehr als 10 mM Pyruvat. Der Km-Wert
ist

in guter Übereinstimmung mit anderen berichteten Werten für PDC aus Hefen (43-45).

5.2 Einflussfaktoren auf die Biotransformationskinetik

Über die Auswirkungen verschiedener Faktoren auf die Bildung von L-PAC mit gereinigtem PDC
wurde in berichtet

Detail (41) und kann wie folgt zusammengefasst werden

(a) Höhere Ausbeuten an L-PAC wurden bei niedrigeren Temperaturen aufgrund verringerter
erhalten

Acetaldehydproduktion. Aus diesem Grund wurde für das Enzym eine Temperatur von 40 ° C
gewählt

Biotransformationen. Abb. 10. Abschätzung des Km-Wertes für Pyruvat für PDC aus C.utilis bei T
= 250

C, pH = 6,0

(b) Der optimale pH für die Bildung von L-PAC war 7,0, während der für Acetaldehyd war

die Produktion betrug 6,0.

(c) Da Acetaldehyd ein hemmendes Nebenprodukt ist, war seine Rolle bei der L-PAC-Bildung

untersucht. Anfängliche Ratenstudien ergaben, dass die Inhibitionskonstante (Kp) für

Acetaldehyd betrug

in der Größenordnung von 20 mM (0,9 g L-1), was anzeigt, dass es eine signifikante Rolle bei der
Verringerung der LPAC-Bildungsrate spielen könnte.

(d) Der Einfluss eines organischen Lösungsmittels wie Ethanol auf die Erhöhung des
Benzaldehyds

Löslichkeit und Erhöhung der L-PAC-Produktionsrate wurden bewertet. Die Auswahl von Ethanol
als
wassermischbares organisches Lösungsmittel beruhte auf folgenden Angaben: PDC hat
signifikante

Beständigkeit gegen Denaturierung durch Ethanol bis zu einer Konzentration von 3 M (46), PDC
wurde berichtet

stark hydrophobe Substratbindungsstellen aufweisen und die Anwesenheit von Ethanol

unterstützen kann

Enzym / Substrat-Wechselwirkungen (47). Außerdem soll Benzaldehyd unendlich sein

Löslichkeit in Ethanol (48) im Vergleich zu seiner sehr begrenzten Löslichkeit in Wasser (0,3 g 100
ml-1). Initiale

Ratenstudien zeigten, dass eine Erhöhung der Rate um 30-40% durch Zugabe von 2,0-

3,0 M Ethanol.

Basierend auf den obigen optimalen Bedingungen ist die Substratsättigungskonstante (Km) für
Benzaldehyd

wurde bestimmt (Fig. 11), und es ist interessant zu bemerken, dass die Substrathemmung
(Benzaldehyd)

Toxizität) war für das freie Enzym nur oberhalb von Konzentrationen von 180 my (19,1 g &
supmin; ¹) erkennbar. Diese

vergleicht mit Daten für die Abb. 11. Abschätzung des Km-Wertes für Benzaldehyd für PDC aus
C.utilis bei T = 40

C, pH = 7,0

Einfluss von Benzaldehyd auf das Wachstum von C.utilis bei Konzentrationen über 10 mM

gefunden, um das Wachstum vollständig zu hemmen. Der Km-Wert für die

Benzaldehydsubstratbegrenzung für die

Das freie Enzym wurde zu 42 mM bestimmt, was gut mit Werten für km von 50 mM für
verglichen werden kann

PDC von S.carlsbergensis in der Literatur (40).

Neben den Pyruvat- und Benzaldehydkonzentrationen wurde dieser Initialwert ermittelt

Die L-PAC-Bildungsraten werden signifikant von der PDC-Aktivität beeinflusst. Wie aus Fig. 12
ersichtlich ist,

höhere PDC-Aktivitäten führten über einen weiten Bereich von Benzaldehyd zu höheren
Anfangsraten

Konzentrationen (bis zu 200 mM). Die Benzaldehydtoxizität war für die niedrigeren PDC-
Aktivitäten größer.

Obwohl die Anfangsraten stark von der PDC-Aktivität beeinflusst wurden, war die endgültige L-
PAC

Konzentrationen wurden nicht in gleichem Maße beeinflusst. Es gab auch einen Trend zu mehr

Acetaldehydproduktion bei höheren PDC-Aktivitätsniveaus (Tabelle 1).

Der Einfluss des Molverhältnisses Pyruvat: Benzaldehyd ist in Tabelle 2 angegeben

Daten, während die höchste molare Biotransformationsausbeute von 97,8% (bezogen auf
anfängliches Benzaldehyd)

wurde unter Verwendung von 150 mM Benzaldehyd und einem Molverhältnis von 1,5 die
höchste Konzentration von 191 erreicht

mM (28,6 g L-1) L-PAC wurde unter Verwendung von 200 mM Benzaldehyd und einem
Molverhältnis von 2,0 nach einer Stunde erhalten

8 h Biotransformation. Molare Umsatzausbeuten nahe 90% (bezogen auf Ausgangspyruvat)

waren

nur im Bereich von 150-200 mM Benzaldehyd erreicht, wenn Molverhältnisse von 1,0 oder 0,5
gegeben waren

gebraucht. In anderen Situationen wurde ein höherer Anteil an Pyruvat in Nebenprodukte

umgewandelt (frei)

Acetaldehyd und Acetoin) oder Fig. 12. Wirkung der PDC-Aktivität auf die
Anfangsgeschwindigkeit der L-PAC-Bildung in Gegenwart von verschiedenen

Benzaldehydkonzentrationen und äquimolare Natriumpyruvatkonzentrationen in 40 mM

Phosphatpuffer (pH = 7,0), enthaltend 30 uM TPP, 0,5 mM MgSO4,7H2O und 2,0 M Ethanol.

Die Anfangsraten wurden innerhalb von 30 min bei 40 bestimmt

C. Die Symbole beziehen sich auf PDC-Aktivitäten von

(J) 4,0, (F) 5,0, (Q) 6,0, (O) 7,0, (J) 8,2 und (F) 10,0 Einheiten.ml

-1

im Reaktionsgemisch in überschüssigen Konzentrationen verblieben. Es ist interessant, auch das

zu bemerken

Erhöhungen der anfänglichen Benzaldehyd- (200-300 mM) und PDC-Aktivität (7,0-20 U ml-1)
traten nicht weiter auf

Erhöhen Sie die endgültigen L-PAC-Konzentrationen, vermutlich aufgrund von

Substrattoxizitätseffekten.

5.3 Kinetische Analyse

Detaillierte Kinetik eines typischen Zeitverlaufs für die Biotransformation von 150 mM
Benzaldehyd mit

gereinigte PDC sind in Fig. 13 gezeigt; Sie zeigen die zeitliche Abhängigkeit der gleichzeitigen
Bildung von LPAC, Acetaldehyd und Acetoin zusammen mit der Biotransformation von Pyruvat
und

Benzaldehyd. In den ersten 2-3 Stunden nahm die Bildung von L-PAC rasch zu, während die
Bildung von L-PAC weiter zunahm

Die Bildung erfolgte langsamer und wurde durch den Substratmangel und das wahrscheinliche
Produkt beeinflusst

Hemmung. Nach einer Inkubationszeit von 6 h wurde eine maximale L-PAC-Konzentration von
147 mM erhalten (22

gL-1), eine Massenbilanz basierend auf Pyruvat, zeigte an, dass von dem ursprünglichen 225 mM
Pyruvat 147 mM

hatten zur Bildung von L-PAC beigetragen, 25 mM Pyruvat waren in Aceton und 22 mM
umgewandelt worden

war zu freiem Acetaldehyd umgewandelt worden. Das verbleibende Pyruvat betrug 30 mM, was
anzeigt eine abschließende Massenbilanz auf Pyruvatbasis. Bei vollständiger Ausnutzung von 150
mM

Benzaldehyd, die Massenbilanz bezogen auf die Benzaldehydumwandlung zu L-PAC nach innen
geschlossen

2%. Die geringe Massenbilanzabweichung war wahrscheinlich auf Verdunstungsverluste von

Benzaldehyd zurückzuführen

und / oder kleinere experimentelle Fehler. Zusätzlich nach 6 h Inkubation 20-30% der
anfänglichen PDC-Aktivität

noch verblieben, was auf das Potenzial für eine weitere Biotransformation hinweist, wenn mehr
Benzaldehyd vorhanden wäre
verfügbar.

6 Biotransformation unter Verwendung von perilem PDC - immobilisiertem Enzym

Frühere Studien haben berichtet, dass Zellen und Enzyme in geeigneten Gelen und Matrices
immobilisiert sind

Substrathemmungseffekte durch Maßbegrenzung und das Substrat minimieren könnten

Gradienten, die innerhalb des immobilisierenden Materials existieren (22, 23, 38). Darüber
hinaus ist die

Die Entwicklung eines immobilisierten Systems bietet die Technologie für langfristige
kontinuierliche

Betrieb, vorausgesetzt die Enzymstabilität kann aufrechterhalten werden. 6.1 PDC-

Immobilisierung

In unserer jüngsten Arbeit wurden verschiedene Immobilisierungsmethoden für PDC evaluiert,

einschließlich

Adsorption an Kationenaustauscherharzen und Einschluss in Gelmatrices (49). Man fand heraus,

dass

Der Einschluss in Calciumpolyacrylamidgel ergab eine höhere Aktivität als die Adsorption an
beiden

Amberlite IR-200 oder CM-Sephadex (Aktivitäten ausgedrückt als U ml-1-immobilisierendes

Material) und

dass die Zugabe von 0,2-0,3% Glycerinaldehyd zu dem Polyacrylamidgel die PDC verbesserte

Bindungskapazität und erhöhte PDC-Aktivität um 40%. Der 'scheinbare' Km für PDC ist
immobilisiert

in Bezug auf Pyruvat wurde bei 250 bestimmt

C aus Anfangsgeschwindigkeitsdaten und einem Wert von 3,2 mM

geschätzt aus der Lineweaver-Burk-Analyse. Dies steht im Vergleich zu 2,2 mM für das freie
Enzym - das

Höhere Km für das immobilisierte Enzym im Einklang mit den Beschränkungen des Stofftransfers
innerhalb der

Gel.

6.2 Einflussfaktoren auf die Biotransformationskinetik

In ähnlicher Auswertung wie bei freier PDC die optimalen Bedingungen für die immobilisierte
PDC

wurden bestimmt. Höhere Temperaturen führten zwar zu einem anfänglichen Anstieg des L-PAC

Produktionsrate, die relativ hohen Acetaldehyd- und Acetoin-Konzentrationen bei 250

C ergab

reduzierte endgültige L-PAC-Bildung. Wie für das freie Enzym, eine Temperatur von 40

C wurde ausgewählt zu

Maximieren Sie die L-PAC-Ausbeute. Der optimale pH für L-PAC mit immobilisiertem PDC wurde
verschoben

etwas sauerere Bedingungen (pH = 6,5) im Vergleich zum freien Enzym (pH = 7,0). Ethanol

Es wurde erneut festgestellt, dass die Anfangsraten (aufgrund der verbesserten Löslichkeit von
Benzaldehyd) erhöht werden und a

Konzentration von 3-4 M ergab eine 40% ige Erhöhung der Anfangsraten im Vergleich zur
Kontrolle.

Für einen Batch-Biotransformationsprozess lieferte der immobilisierte PDC-Prozess keine

echte Vorteile gegenüber dem kostenlosen PDC-System. Die Ergebnisse entsprachen

weitestgehend den Erwartungen

immobilisiertes Enzym, das bei höheren Benzaldehydkonzentrationen (bis zu 300

mM). Die maximalen L-PAC-Endkonzentrationen waren ähnlich, d.h. 27,1 gl-1 mit 300 mM

Benzaldehyd und 1,5 Molverhältnis Pyruvat: Benzaldehyd.

6.3 Kontinuierliche Biotransformation

Die Betriebsparameter für einen kontinuierlichen Prozess sind in Fig. 14 mit dargestellt

Zunehmende Molverhältnisse und Verweilzeiten (dh abnehmende Verdünnungsraten) führen zu

erhöhte Bildung von L-PAC und Nebenprodukten, Acetaldehyd und Acetoin. Während der
höchste

Eine Konzentration von 5,3 g L-1 L-PAC wurde mit einem Molverhältnis von 2,0 bei D = 0,05 h-1
erreicht. Höhere LPAC-Produktivitäten konnten bei höheren Verdünnungsraten erzielt werden. In
einer Bewertung der langfristigen

Bei der Durchführung des Verfahrens wurde ein allmählicher Rückgang der PDC - Aktivität
festgestellt

Die Halbwertszeit des Enzyms wird auf 32 Tage geschätzt. Abb. 14. Einfluss der Verdünnungsrate
und der Molverhältnisse von Pyruvat: Benzaldehyd auf die L-PAC-Produktion

unter Verwendung von immobilisiertem PDC in einem Festbett-Bioreaktor. T = 40 c, pH = 7,0. L-

PAC-Konzentrationen für

Molverhältnisse: (Q) 1,0, (& alpha;) 1,5, (J) 2,0; Produktivitäten für Molverhältnisse: (O) 1,0, (U)
1,5, (F) 2,0

7 Diskussion und Schlussfolgerungen

Ein Vergleich der verschiedenen Biotransformationsprozesse zur Umwandlung von Benzaldehyd

zu

L-PAC ist in Tabelle 3 angegeben. Aus den Daten ist ersichtlich, dass sowohl für freie als auch für
immobilisierte Hefe

Bei der Biotransformation handelt es sich um einen Prozess mit relativ geringem Wirkungsgrad,
bei dem eine erhebliche Umleitung stattfindet

von Benzaldehyd zu Benzylalkohol und einem Verlust von bis zu 30-40% aufgrund der Bildung
von Nebenprodukten. Diese Ablenkung wurde auf die Aktivität von Alkoholdehydrogenaten in
Hefe zurückgeführt.

Untersuchungen von Nikolova und Ward (29) unter Verwendung von Mutantenstämmen von S.
cervisiae, denen ADH-I fehlt,

-11 und -111 zeigten, dass diese Stämme noch Ethanol und Benzylalkohol produzieren konnten

und vermuteten, dass andere Oxidoreduktasen diese reduktiven Biotransformationen

katalysierten.

Andere Autoren (50, 51) haben das Vorhandensein von durch Zn aktiviertem ADH-IV in geringen
Mengen nachgewiesen

Mengen in S. cerevisiae und es ist möglich, dass dieses Enzym eine gewisse Rolle in Ethanol
spielt und

Benzylalkoholproduktion.

Unter Verwendung von Hefestammselektion, immobilisierter Zelltechnologie und

Cyclodextrinaddition

frühere Studien haben maximale L-PAC-Konzentrationen von 10-12 g L-1 berichtet. Aktuelle
Studien von
Unsere Gruppe hat jedoch mit der Kontrolle der Hefeaktivität und des Stoffwechsels (via

Kontrolle des Atmungsquotienten, RQ), dass in definierten Medien im Normalfall L-PAC-

Konzentrationen bis zu 22 g L-1 erreicht werden können

Biotransformationszeit. Dies ist auf die Akkumulation von Brenztraubensäure und die Induktion
von PDC zurückzuführen

und kontrollierte Zufuhr von Benzaldehyd. Es ist interessant festzustellen, dass andere Autoren
(52) verwenden

definierte Medien und ein Candida-Stamm haben ebenfalls relativ hohe Spiegel an
Brenztraubensäure erreicht

Manipulation der PDC-Aktivität. Darüber hinaus bietet der Einsatz definierter Medien auch die
Vorteile

der leichteren Lösungsmittelextraktion von L-PAC und weniger

Umweltverschmutzungsproblemen im Vergleich zur Verwendung von

industrielle Substrate wie Melasse.

Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, dass kontinuierliche Biotransformationsprozesse keine bieten

Vorteile gegenüber einem Fed-Batch-Verfahren unter optimaler Kontrolle. Dies ergibt sich aus
der

hochtoxische Natur des Substrats Benzaldehyd, die die Lebensfähigkeit der Zellen erheblich
verringert und

PDC-Aktivität in einem kontinuierlichen Prozess. Rohner et al. (36, 37) zeigten, dass eine
Chemostatkultur vorliegt

war am besten für eine Biotransformation geeignet, bei der die stereo-spezifische Reduktion von

Acetoessigsäureester; in diesem Fall jedoch die Hemmwirkung von Substrat / Produkten auf S.

cerevisiae waren viel niedriger.

Die Verwendung von gereinigtem PDC für die Biotransformation zeigte, dass das PDC dies konnte

seine Aktivität bei Benzaldehydkonzentrationen von mehr als 2-0 mM (21 g L-1) halten und LPAC-
Konzentrationen von bis zu 28 g L-1 ergeben. Es wurden sehr hohe Konversionseffizienzen erzielt
(größer als

95% der Theorie bezogen auf zugesetzten Benzaldehyd) als keine wesentlichen aromatischen
Nebenprodukte
produziert. Bei dem gereinigten PDC-Verfahren war es jedoch erforderlich, Brenztraubensäure
mit einem zuzugeben

Molverhältnis Pyruvat: Acetaldehyd größer als 1,0 aufgrund der Bildung der Nebenprodukte

Acetaldehyd und Acetoin. Massenbilanzen auf beiden Benzaldehyd und das Pyruvat schlossen
sich innerhalb von 2%, was die Genauigkeit der Analyse anzeigt

Verfahren und die Identifizierung aller wichtigen Produkte im Biotransformationsprozess.

In einer Gesamtbewertung des L-PAC-Prozesses wird deutlich, dass signifikante Verbesserungen

möglich sind

kann entweder durch verbesserte Prozesskontrolle der Hefebiotransformation oder durch die

Entwicklung eines enzymatischen Prozesses basierend auf gereinigtem PDC. Die Wahl wird
letztendlich darauf beruhen

nach wirtschaftlichen Kriterien; es kann jedoch auch durch die Entwicklung von genetisch
beeinflusst werden

gentechnisch veränderte Hefestämme mit verstärkter PDC und reduzierter

Oxidoreduktaseaktivität,

was zu höheren L-PAC-Ausbeuten und -Produktivitäten führt.