PRACTICA DE MANEJO DE MICROSCOPIO, TINCIÓN GRAM Y SIEMBRA EN

AGAR NUTRITIVO

Introducción
El microscopio óptico es un microscopio basado en lentes ópticas. También se le conoce
como microscopio de luz (que utiliza luz o «fotones») o microscopio de campo claro. El
desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton Van Leeuwenhoek.
Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de una única lente pequeña y convexa,
montada sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a
examinar (la muestra o espécimen). Este uso de una única lente convexa se conoce
como microscopio simple, en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos ópticos.

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con
el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el
medio que la rodea. El modo más simple de aumentar el contraste es la utilización de
colorantes. Si se desea simplemente aumentar el contraste de las células para la
microscopía, son suficientes los procedimientos que usan un solo colorante llamado de
tinción simple. Sin embargo, a menudo se utilizan métodos que no tiñen de igual modo
todas las células, es el proceso denominado tinción diferencial. Uno muy usado en
microbiología es la tinción Gram. Basándose en su reacción a la tinción Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos: grampositivas y gramnegativas. Esta tinción
tiene gran importancia en taxonomía bacteriana ya que indica diferencias fundamentales
de la pared celular de las distintas bacterias. Mientras que las bacterias gramnegativas
son constantes en su reacción, los microorganismos grampositivos pueden presentar
respuestas variables en ciertas condiciones (son gramlábiles). Por ejemplo, los cultivos
viejos de algunas bacterias grampositivas pierden la propiedad de retener el cristal
violeta, y, en consecuencia, se tiñen por la safranina apareciendo como gramnegativas.
Análogo efecto se produce en ocasiones por cambio en el medio del organismo, o por
ligeras modificaciones en la ejecución de la técnica. Por este motivo, es preciso atenerse,
en la práctica, al procedimiento establecido.
Para explicar el mecanismo de la tinción de Gram se han propuesto varias hipótesis
fundadas en la naturaleza química de las paredes celulares de los microorganismos.

Sembrar es colocar una muestra de inóculo, en un medio de cultivo para obtener el

crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre caja de Petri,
que contiene un gel (Agar) al que se han añadido las substancias que necesitan los
microorganismos para crecer. A esto lo llamamos medio de cultivo. A veces se añaden
otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el crecimiento de otras bacterias
que podrían contaminar el cultivo. La siembra se puede hacer en otros tipos de medios
de cultivo, como tubos de vidrio con gel, frascos con líquidos nutritivos para los
microorganismos.
Objetivo
Realizar una correcta utilización del microscopio óptico, tinción de Gram de Bacillus
thuringiensis y los tipos de siembra en agar nutritivo.
Metodología
Manejo del microscopio óptico

Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina

completamente, colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas
metálicas, para realizar el enfoque: a. acercar al máximo la lente del objetivo a la
preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando
directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo
en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. b. mirando, ahora sí, a
través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el
macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta
obtener un enfoque fino, pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi
enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque
fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a
enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación. El objetivo de 40x enfoca a muy
poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances:
incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo
con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo
de inmersión.
Preparación de muestra y tinción Gram
Se retirará una asada de un cultivo de B. thuringiensis en caldo nutritivo, se expande en
un portaobjeto limpio, se fijará a temperatura ambiente o con la ayuda de un mechero.
Se realizará la coloración de la siguiente manera: por 1 minuto cristal violeta (colorante
inicial), se lavará con agua destilada, 1 minuto en Lugol (mordiente), se decolora con
alcohol de 95° (decolorante), se lavará con agua destilada, 1 minuto con safranina
(colorante de contraste), se lavará con agua corriente, se secará suavemente, se deja
secar ambiente y posteriormente se visualiza en el microscopio óptico a 100X con aceite
de inmersión.
Siembra en Agar nutritivo
En 5 placas de Petri con A. nutritivo se marca con plumón indeleble cuatro cuadrantes
por placa, se retirará una asada del cultivo de B. thuringiensis y se realizará la siembra
por cuadrantes, estrías, diseminación, etc.