UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

Escuela Profesional de Ingeniería de Higiene y Seguridad Industrial

CURSO: MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL – BO112

TITULO DE PRACTICA: “NUMERACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS”

DOCENTE: MARTÍNEZ VILA, ALVARO MARTÍN

ALUMNO: BAZAN PEREZ LINDER EMIL

LIMA, PERU – VIERNES 15 DE JUNIO DE 2013

 Objetivos

 Evaluar la presencia en los alimentos de mohos y levaduras como indicadores de

calidad higiénico - sanitaria.
 Establecer la importancia de presencia de mohos y levaduras en muestras
alimentarias y ambientales (avena y suelo respectivamente)
 Identificar la representatividad, viabilidad y eficiencia de las respectivas muestras.
 Manejo de la metodología para el recuento de células viables
 Aprender sobre factores básicos de crecimiento, nutrición de hongos.
 Preparación de medios selectivos de microorganismos, más complejos (hongos)
en base a su bioquímica e interacción con microorganismos inferiores (bacterias)
 Aplicar correctamente principios empíricos acerca de intervalos o UFC en calidad
higiénico sanitarios de alimentos (microbiología alimentaria)
 FUNDAMENTO TEÓRICO

El estudio de los hongos comienza antes que el de las bacterias. En 1677, Hooke
construye unas lentes y estudia las manchas amarillas de las hojas de una rosa, donde
observa que estaban constituidas por organismos filamentosos, los cuales describe en
detalle e ilustra con dibujos. En 1729, Micheli describe el género Aspergillus entre otros
hongos. En la primera mitad del siglo XIX se realizan progresos en el estudio de los
hongos y no es hasta entonces que aquellos parásitos para el hombre comienzan a atraer
la atención. En la actualidad existen aproximadamente de 50 000 a 100 000 especies
“aceptadas” de hongos. De las mismas, alrededor de 200 son patógenas a los animales
y al hombre bajo ciertas circunstancias; de estas, una pequeña porción puede causar
enfermedad en el humano. Los hongos son microorganismos eucarióticos, aerobios, no
fotosintéticos, inmóviles; tienen una pared celular que constituye el 90 % del peso seco
del hongo, la cual está constituida de polisacáridos como: quitina, celulosa, glucanas y
mananas, entre otros; esto constituye entre el 70 al 80 % y el 10 al 20 % lo forman
proteínas y glicoproteínas las cuales son antigénicas y quizá expliquen la reacción
mediada por células que se produce frente a los antígenos de Candida (candidina) y
dermatófitos (tricofitina). Esta pared le imparte al hongo rigidez, actúa como barrera
osmótica, determina la forma del microorganismo, es importante en la taxonomía y
propiedades antigénicas. Además, los hongos sintetizan lisina, por biosíntesis del ácido
L-aminolipídico; tienen microtúbulos compuestos de la proteína tubulina, ergosterol en sus
membranas celulares (sitio donde actúan algunos fungistáticos como los polienos e
imidazoles bloqueando su formación), centríolo, mitocondria, ribosoma 80 S, núcleo
rodeado de membrana, retículo endoplásmico y mitocondrias. Son heterotróficos y la
mayoría obtiene sustancias orgánicas preformadas del medio ambiente. Los hongos
vierten enzimas hidrolíticas en sus alrededores, las cuales degradan el sustrato en
pequeñas subunidades y de esta forma es que ellos lo absorben. Los patógenos humanos
poseen las enzimas necesarias para obtener nutrientes directamente del hospedero. El
material alimenticio de reserva es el glucógeno. Solamente algunos hongos poseen
cápsula, por ejemplo, el Cryptococcus neoformans, compuesta de polisacárido, es
antigénica y antifagocítica. Por lo general, los hongos patógenos no producen toxinas,
provocan enfermedades crónicas con lesiones de tipo granulomatosas y son resistentes a
los tratamientos. Las micosis superficiales y cutáneas pueden ser crónicas, pero rara vez
afectan la salud general, mientras que las profundas sí la afectan y a veces son mortales.
Los hongos son reconocidos en el laboratorio por su morfología macroscópica y
microscópica, y de acuerdo con ello se dividen en dos grupos:
1. Hongos filamentosos: la hifa o filamento es el elemento primario de estos hongos;
son estructuras cilíndricas parecidas a tubos; pueden tener tabiques o septos en número
variable o no tenerlos y ser aseptadas o cenocíticas; poseen poros pequeños. Según la
forma que adopten pueden ser: vesiculosas, nodulares, pectinadas, en raqueta, en
candelabro fávico y otras. Al conjunto de hifas unidas y entrelazadas se les denomina
micelio, el cual puede ser aéreo o reproductivo, es el que crece en la superficie del medio
de cultivo y donde podemos encontrar las conidias o esporas; el micelio vegetativo o
nutritivo es aquel que se introduce en el medio de cultivo para absorber los nutrientes. En
el micelio aéreo se desarrolla la colonia del hongo, que de acuerdo con el género o
especie a que pertenezcan van a tener diferentes formas y colores. Así pueden ser:
algodonosas, pulverulentas, cerebriformes, crateriformes, etc.; y los pigmentos pueden
ser: rojo, carmelita, violeta, verde, amarillo y otros.
2. Hongos levaduriformes: forman colonias suaves, cremosas, con pigmentos variados
según el género y la especie; pueden ser: blancas, crema, color café, negras; van a estar
constituidas por células redondas, ovales o gemantes denominadas blastosporas o
blastoconidias; en algunas levaduras estas células quedan unidas y se alargan formando
una especie de filamento denominado pseudomicelio. La reproducción es asexual por
gemación.
Dimorfos: son aquellos que crecen tanto en la forma filamentosa como en la
levaduriforme, dependiendo esto, entre otros factores, de la temperatura a que sean
sometidos (25 o 37ºC) y de los nutrientes. Los hongos se reproducen sexual y
asexualmente. Desde el punto de vista médico la reproducción asexual es la más
importante, pues la mayoría de los hongos patógenos para el hombre sólo se reproducen
de esta forma. A pesar de que ya se ha encontrado en algunos la reproducción sexual,
esta no es fácil de obtenerla en los laboratorios, resultando muy útil y económico
identificarlos por su reproducción asexual. Las esporas asexuales se denominan conidias,
estas pueden formarse sobre conidióforos especializados, a partir de una hifa o sobre los
lados o extremos de estas. Dentro de una misma colonia pueden formarse más de una
clase de conidias.
TIPOS DE CONIDIAS O ESPORAS ASEXUALES
1. Microconidias pequeñas unicelulares: pueden ser redondas o piriformes.
2. Macroconidias grandes fusiformes o en forma de clava, de tabaco o lápiz: por regla
general septadas o multiseptadas.
3. Blastosporas o blastoconidias: célula redonda u oval que se reproduce por gemación
con separación posterior del brote o yema de la célula progenitora.
4. Clamidosporas: las células en la hifa se agrandan y forman paredes gruesas, son
resistentes a condiciones ambientales desfavorables y germinan cuando estas
condiciones mejoren.
5. Artrosporas: una hifa septada que se fragmenta en células individuales.

ESPORAS ASEXUALES
Se producen por meiosis y de acuerdo con su origen pueden ser:
1. Zigosporas: fusión de la punta de dos hifas cercanas y se desarrollan esporas grandes
de paredes gruesas.
2. Ascosporas: dentro de una célula especializada llamada asca se forman de cuatro a
ocho esporas.
3. Basidiosporas: en la superficie de una célula especializada llamada basidio se forman
cuatro esporas.
Existen diferentes clasificaciones de los hongos, está la de Whittaker en 1969, pero para
facilitar su ubicación vamos a clasificarlas en cuatro clases, atendiendo al tipo de
reproducción.
A) HONGOS PERFECTOS (poseen reproducción sexual y asexual).
Clase:
 Zygomycetes o Phycomycetes: Esporas asexuales, esporangiosporas; y sexuales,
zigosporas, micelio no tabicado. Ejemplo: Mucor, Rhizopus.
 Basidiomycetes. Esporas sexuales, basidiosporas; y asexuales, conidias.
Ejemplo: Setas.
 Ascomycetes. Esporas sexuales, ascosporas; y asexuales, conidias. Ejemplo:
Nannizzia, Arthroderma, Emmonsiella.
B) HONGOS IMPERFECTOS (poseen solamente reproducción asexual hasta el
momento).
Clase:
  Deuteromycetes: Esporas asexuales o conidias. Ejemplo: Candida, Malassezia
furfur, Trichophyton, etcétera. La mayoría de los hongos patógenos para el hombre
se encuentran en esta clase.

METABOLISMO DE LOS HONGOS

Los hongos requieren carbono, nitrógeno y otros elementos. El carbono es usado
para la síntesis de carbohidratos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. La oxidación de los
mismos proporciona la energía requerida por los hongos; además, secretan enzimas
extracelulares como la amilasa, proteasa y lipasa que degradan macromoléculas. El
nitrógeno es requerido para la síntesis de los constituyentes celulares como: aminoácidos,
proteínas, purinas, pirimidinas, ácidos nucleicos, glucosamina y quitina.
Casi todos los hongos son aerobios, pero algunas levaduras y hongos
filamentosos como el Mucor son facultativos. Ninguno es anaerobio estricto; pueden
tolerar variaciones de pH entre 2 y 10, mas su crecimiento óptimo es alrededor de 7;
prefieren un ambiente húmedo, sin embargo, las conidias o esporas pueden sobrevivir en
una atmósfera seca; la temperatura óptima para el crecimiento de la mayoría de los
hongos es entre 25 y 37 ºC, aunque algunos pueden crecer a bajas temperaturas y otros
a 45 ºC como, por ejemplo, Aspergillus fumigatus.

CULTIPO DE HONGOS
La mayor parte existen en la naturaleza y proliferan con facilidad en presencia de
fuentes simples de nitrógeno y carbohidratos. Los cultivos para hongos se hacen
comúnmente en juegos de pares, uno incubado entre 25-30°C y el otro entre 35-37°C . Un
medio común es el agar Sabouraud, incubado en el primer par de incubación
mencionado.
Antibióticos en los medios de cultivo para hongos:
La era actual de la quimioterapia antimicrobiana empezó en 1935 con el
descubrimiento de las sulfonamidas. En 1940 se demostró que la penicilina, descubierta
en 1929, es una sustancia terapéutica efectiva. Durante los siguientes 25 años, la
investigación sobre las sustancias quimioterapéuticas se centró en gran parte en los
elementos de origen microbiano llamados antibióticos. Después de aislar, concentrar,
purificar y producir en masa la penicilina, se crearon la estreptomicina, las tetraciclinas, el
cloranfenicol y muchos otros fármacos. Estas sustancias se aislaron originalmente a partir
de medios filtrados en los que se habían cultivado los mohos respectivos. Una de las
características más sobresalientes de los antimicrobianos modernos es la modificación
sintética de los fármacos conocidos. En este capítulo se describen los antimicrobianos
más utilizados en el tratamiento de las infecciones bacterianas.
MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS ANTIMICROBIANOS
Los antimicrobianos actúan de diversas formas: por toxicidad selectiva, inhibiendo
la síntesis y función de la membrana celular, inhibiendo la síntesis de proteínas o
inhibiendo la síntesis de ácidos nucleicos.
TOXICIDAD SELECTIVA
El antimicrobiano ideal exhibe toxicidad selectiva, lo que significa que el fármaco
es nocivo para el microorganismo patógeno sin dañar al hospedador. La toxicidad
selectiva a menudo es relativa y no absoluta. Esto implica que un fármaco a la
concentración que tolera el hospedador es nocivo para el microorganismo infeccioso. La
toxicidad selectiva es una función de un receptor específico necesario para la fijación del
fármaco o bien depende de la inhibición de algún acontecimiento bioquímico
indispensable para el microorganismo patógeno pero no para el hospedador. Los
mecanismos de acción de los antimicrobianos se pueden describir bajo cuatro
encabezados:
1. Inhibición de la síntesis de la pared celular.
2. Inhibición de la función de la membrana celular.
 Enzimas
La invasión bacteriana de los tejidos es facilitada con frecuencia por la liberación de
enzimas. Entre ellas se encuentran las hialuronidasas, colagenasas, coagulasas y
fibrinolisinas. Además, los hongos pueden elaborar enzimas; ejemplo: los dermatófitos
producen queratinasa, la cual les proporciona la habilidad de invadir los tejidos
queratinizados, tales como el pelo, la piel y las uñas. Otras dos enzimas adicionales que
parecen ser importantes en la patogenicidad de los hongos son: la fenoloxidasa y la
proteinasa. La producción de fenoloxidasa, la tolerancia de temperatura y la
encapsulación son mecanismos importantes de patogenicidad para Cryptococcus
neoformans. La fenoloxidasa es la enzima responsable de la habilidad de C. neoformans
para producir melanina sobre medios que contengan compuestos fenólicos. La manera en
la cual la fenoloxidasa promueve la virulencia no se conoce, pero cepas deficien- tes de
esta enzima son avirulentas para el ratón. Las proteinasas son designadas como factores
de virulencia para Sporothrix schenckii, Aspergillus, Candida y Coccidioides immitis.
Aunque la función precisa de esas enzimas varía en cada organismo, en general están
involucradas en la iniciación, extensión y diseminación de la infección fúngica.
3. Inhibición de la síntesis de proteínas (es decir, inhibición de la traducción y
transcripción de material genético.
4. Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos.

Oxitetraciclina. Se trata de un derivado de la familia de los antibióticos tetraciclínicos

(doxiciclina, minociclina) extraído del Streptomyces rimosus, con acciones
bacteriostáticas-bactericidas sobre numerosos microorganismos grampositivos y
gramnegativos, Clamidia, Mycoplasma, Rickettsia, etc., Responsables de infecciones
respiratorias, genitourinarias y cutáneomucosas.

Su mecanismo de acción se desarrolla sobre los ribosomas microbianos en donde altera

la síntesis de proteínas e inhibe el desarrollo y crecimiento (efecto bacteriostático) del
microorganismo, aunque pueden actuar como bactericidas al alcanzar elevadas
concentraciones en ciertos tejidos.

Su absorción digestiva, como los otros derivados, es amplia, difunde por sangre y se une
en con las proteínas plasmáticas. Se elimina por la orina sin modificaciones metabólicas a
través de filtración glomerular. En ciertas ocasiones alcanza la circulación fetal a través de
la placenta y el líquido pleural y cefalorraquídeo. Su vida media es prolongada (6-10
horas), se concentra en el nivel hepático y también se excreta por la bilis, por lo que se
detecta en las heces.

Indicaciones

Este medicamento se aplica en infecciones de diferente localización (bronquial, uretral,

urinaria) provocadas por gérmenes sensibles a las tetraciclinas.

Dosificación

La dosis media por vía oral es de 1 a 2 gramos por día, habitualmente 500mg cada 6
horas. En niños mayores de 8 años se pueden administrar dosis de 25 a 50mg/kg/día. Se
aconseja administrarla 1 hora antes o 2 horas después de las comidas.
  En pacientes con insuficiencia renal la dosis se reduce o se incrementan los
intervalos entre tomas. Los alimentos y en especial los lácteos interfieren su
absorción digestiva.
 Para el tratamiento de la brucelosis, 500mg de oxitetraciclina cuatro veces por día,
durante tres semanas, que se acompañan con estreptomicina, 1g intramuscular
dos veces por día durante la primera semana y una vez por día en la segunda
semana.

Reacciones adversas

 Gastrointestinales: anorexia, náusea, vómito, diarrea, glositis, disfagia,

enterocolitis y lesiones inflamatorias (con sobrecrecimiento de monilia) en la región
anogenital. Estas reacciones han sido producidas tanto por la administración oral
como parenteral de tetraciclinas. Raramente han sido mencionadas esofagitis y
ulcera esofágica, en pacientes que recibieron cápsulas o tabletas del grupo de las
tetraciclinas. La mayoría de estos tomaron su medicación inmediatamente antes
de ir a dormir.
 Cutáneas: exantema maculopapular y eritematoso. Se ha comunicado dermatitis
exfoliativa, pero es infrecuente. Fotosensibilidad.

Toxicidad renal: se ha descripto un aumento del nitrógeno ureico sanguíneo que en

apariencia está relacionado con la dosis.

 Reacciones de hipersensibilidad: urticaria, edema agioneurótico, anafilaxia,

púrpura schönlein-henoch, pericarditis y exacerbación de Lupus Eritematoso
Sistémico. Se han comunicado fontanelas salientes en lactantes e hipertensión
intracraneal benigna en adultos luego de una dosis terapéutica completa. Este
signo desapareció con la suspensión de la droga.
 Hemáticas: se han descripto anemia hemolítica, trombocitopenia, neutropenia y
eosinofilia.

Efectos laterales

Efectos secundarios que deben ser informados al médico

  Más comunes -- Dientes descoloridos (en los infantes y los niños); aumento de la
sensibilidad de la piel a la luz del sol
 Raros -- Dolor de abdomen; fontanela (área blanda en la cabeza) sobresaliente en
los infantes; dolor de cabeza; pérdida del apetito; náuseas o vómitos; cambios
visuales; piel amarilla
 Efectos secundarios que usualmente no requieren atención médica

Precauciones y advertencias

Al igual que otros preparados antibióticos, la oxitetraciclina, puede promover el desarrollo

de microorganismos resistentes, incluso hongos. Si aparece una sobreinfección, el
antibiótico debe ser suspendido e instituirse un tratamiento apropiado. En enfermedades
venéreas, cuando se sospecha una sífilis coexistente, se llevará a cabo un examen de
campo oscuro antes de comenzar el tratamiento y la serología se repetirá mensualmente
durante por lo menos cuatro meses. En tratamientos prolongados se llevarán a cabo
evaluaciones periódicas de laboratorio, incluidos estudios hematopoyéticos, renales y
hepáticos. Todas las infecciones debidas a estreptococo betahemolítico del grupo A
deberán ser tratadas durante por lo menos 10 días. Madres en período de lactación: las
tetraciclinas se excretan en la leche materna. Debido a las serias reacciones adversas
potenciales en los niños durante la lactancia, las tetraciclinas deben ser utilizadas sólo
cuando en la opinión del médico los beneficios potenciales superan los riesgos. La
absorción de tetraciclina es disminuida por antiácidos que contienen aluminio, calcio o
magnesio y preparaciones que contienen hierro. Se ha informado que el uso simultáneo
de tetraciclinas y metoxiflurano provoca toxicidad renal aguda.

ESTERILIZACIÓN DE SOLUCIONES ANTIBIÓTICAS

Tipo de Esterilización por otros tratamientos físicos: Filtración

Se usan membranas filtrantes con poros de un tamaño determinado (0.2 um o 0.45 um).
El tamaño del poro dependerá del uso al que se va a someter la muestra. Los filtros que
se utilizan no retienen virus ni micoplasmas, estos últimos están en el límite de separación
según el diámetro de poro que se utilice.
La filtración se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolábiles. Su uso para
esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones oftálmicas, soluciones
intravenosas, drogas diagnósticas, radiofármacos, medios para cultivos celulares, y
soluciones de antibióticos y vitaminas.

RECUENTO EN PLACA
La preparación del medio para recuento de hongos y levaduras se adjunta en
“CUADRO No 1”
• Debido a que es difícil saber si una sola bacteria dio origen a una colonia, se
expresa usualmente el número de células viables como unidades formadoras de
colonias (UFC). Como se trata de mohos y levaduras el laboratorio entre 15 – 150
o 20 – 200 UFC

Determinación del crecimiento

Recuento de células viables
Recuento en placa
• Permite medir el número de células viables en un medio determinado
• el tamaño de la población se expresa como unidades formadoras de colonias
(UFC)
• Simple y sensible
• Ampliamente usado en el recuento de microorganismos viables en alimentos agua
y suelo
• Los resultados pueden ser imprecisos si las células se agregan o agrupan (en
filamentos, por ejemplo) y varias células dan lugar a una colonia
VENTAJAS:
a) De gran sensibilidad se aplica medio e incubación adecuados, puede
detectarse hasta una única célula viva.
b) El recuento en placa no requiere un equipo complicado
DESVENTAJAS
a) No mide la totalidad de células, sino únicamente las viables.
b) Es lento, tedioso e impreciso. ( Anomalías de la técnica del recuento en placa)
 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

METODOLOGÍA

Instrumentos:

 Muestra de alimento (avena precocida en hojuelas)

 Placas Petri.
 Agar OGY (ésta última se explicará la esterilización por filtración del antibiótico), el
preparado sin la oxitetraciclina ya fue autoclavado y conservado en un matraz.
 Dos cápsulas de antibiótico- antiinfeccioso Oxitetraciclina (c/u 500mg.)
 5 tubos de prueba (10ml) y matraz (90ml) con agua peptonada ya esterilizada.
 Pipeta y pera de succión.
 Pipetas serológicas esterilizadas.
 Gradilla porta tubos.
 Una pisceta con agua destilada.
 Mechero Bunsen
 Algodón y pinzas
 Papel Craft y pabilo.
 Frasco de muestreo con tapón hermético de 1.8 Lt.

Equipos:

 Incubadora.
 Refrigeradora
 Baño María
 Licuadora.
 Equipo de filtración.
 Membrana de filtrado 25mm 0,45μm.
 Embudo esterilizado
 Equipo de bomba de filtrado (bomba de vacío)
 Rampa en acero inoxidable
 Soporte de filtro de membrana (multifiltración) o Rampa en acero inoxidable
 2 Frascos para vacío (kitasato) (1 litro y 500ml (esterilizado))
 Junta de goma (tapón) Guko para matraces Kitasatos
 50 cm de tubo flexible o manguera (2)
A) Tipo de Esterilización por otros tratamientos físicos: Filtración

1. Se arma el equipo de filtración. Se conecta el kitasato estéril de 500 ml,

tapado en la boca con un pedazo de algodón con la manguera y ésta
unida al adaptador que lo hace un terminal en ángulo recto, vertical y con
vástago especial para goteo que atraviesa el tapón de goma colocado en el
kitasato de un litro; éste último unido a la fuente de vacío con la otra
manguera que servirá de trampa para que el líquido no llegue directamente
a la bomba y lo malogre.
2. La otra manguera que sale del kitasato de 1lt. se conecta al soporte.
3. Se enciende el mechero para condiciones de esterilidad.
4. Se coloca en el equipo (soporte) de multifiltración el soporte poroso y
embudo de filtración
5. Con la pinza esterilizada con alcohol y flameada al mechero, que no esté
muy caliente se toma la membrana y se coloca en la base porosa de
membrana y luego se coloca el embudo de filtración de plástico
autoclavable.
6. La dilución de 0.1 gr. (cuidadosamente destapar las cápsulas y echar el
polvo de antibiótico en el frasco de muestreo de 1.8 lt.) de Oxitetraciclina
en 1lt. de agua destilada, se homogeniza.
7. Por el embudo se agrega 100 ml de la muestra de antibiótico (habrá una
marca de volumen en el embudo),
8. Se enciende el motor y se deja que filtre todo el líquido. Cuando toda la
dilución ya pasó por el filtro se apaga.
9. La muestra esterilizada del antibiótico se obtiene en el kitasato de 500 ml.
Taparla bien con el algodón y retirar del equipo de filtración, colocar
algodón también en la entrada de la manguera.

B) 1er método: RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA O POUR PLATE, o por

siembra en profundidad o también conocida como difusión.

1. Extraer de la refrigeradora la preparación de agar OGY sin antibiótico y

descongelarlo por 5 min aprox. a 45-47°C en el baño María.
2. Ir preparando la muestra de alimento en este caso de AVENA, pesar 10
gramos, echar con los primeros 90 ml de agua peptonada a la licuadora
y homogenizar primero a una velocidad por 30 seg. Y a dos
velocidades hasta completar dos minutos de homogenización.
3. Obtenemos así la muestra de 10-1, ahora en cada tubo de ensayo de
agua peptonada, realizar uno tras otro, manteniendo un orden 1 ml de
10-1, pasar a un tubo cualquiera; ahora del tubo elegido que será ya de
cc. 10-2, pipetear otro 1ml, de este último para colocar en otros 9ml de
otro tubo; así sucesivamente un pipeteo en cadena hasta lograr un tubo
de ensayo con 10-5 en pureza de muestra inicial.
4. Ahora verter alícuotas de 1ml de un tubo de cc. Menor, o sea de 10-5,
para no contaminar el resto de concentraciones, en una placa Petri, in
mediatamente echar 15-18 ml de agar OGY sacando del Baño María,
aproximadamente la mitad de la placa. Seguidamente de 2 - 2,2ml de
solución estéril de Oxitetraciclina Todo siempre cerca al mechero.
5. Realizar movimientos verticales y horizontales en el plano de la mesa,
buscando homogenizar, con mucho cuidado de no salpicar en la tapa
de la placa, luego hacer 5 movimientos circulares por ambos sentidos y
por últimos movimientos laterales, todo con una sola mano.
6. Realizar los mismos procedimientos con 4 placas más y con diferentes
alícuotas con respecto a su concentración. Procurar anotar el nombre
del curso con marcador permanente, así como el tipo de muestras que
se trabaja, método de cultivo y la indispensable concentración de la
muestras que se pipeteó con las pipetas serológicas
7. Esperar a que reposen y solidifiquen (10 min. aprox)
8. Tapa abajo llevamos en conjuntos las 6 primeras placas a la
incubadora, controlar una puesta de aprox. 48 horas máximo a una
temperatura oscilante de 35 – 37°C
9. Transcurrido el tiempo, describir observaciones y realizar un conteo
rápido de cada placa Petri, marcando y anotando posibles cantidades
en las placas o en apuntes propios.
 RESULTADOS Y OBSERVACIONES

N° de Levaduras Mohos TOTAL (UFC/gr)

dilución

10-1 Se encontraron colonias Se encontraron 8

brillosas, cóncavas, lisas mohos
circulares, de borde entero. filamentosos de
hifas blancas 21x10 = 21x10 UFC/gr
1 rosada, 8 blancas, 4
algodonosas
traslucidas.

10-2 Se encontraron: Se encontró:

1 rosada, elevadas, brillosa, 2 mohos blancos

circular, lisa. con centro negro
26x102 = 26x102
– verdoso y
2 blancas, circulares, opacas, UFC/gr
pulverulento
elevadas.
(esporas).
14 cremas entre pequeñas y
1 moho verde
grandes, circulares, brillosas y
pequeño.
elevadas.

10-3 Se encontraron colonias Se encontró 1 5 < (20 – 200

pequeñas en su mayoría. moho de hifas COLONIAS)
blancas con
1 blanca, 1 traslucida, 1 crema
centro negro –
de gran tamaño
verdoso CONTEO = <10
pulverulentas( UFC/gr.
esporas)

1 moho blanco
pequeño.
10-4 No hubo crecimiento Un moho 1 < (20 – 200
pequeño de hifas COLONIAS)
blancas

CONTEO = <10
UFC/gr.

10-5 No hubo crecimiento Se encontró 1 1 < (20 – 200

moho de hifas COLONIAS)
blancas con
centro negro –
verdoso( CONTEO = <10
esporas) UFC/gr.

COGIENDO DOS CONTEOS CONSECUTIVOS:

10-1: 21x10 UFC/gr

10-2: 26x102 UFC/gr

(26x102) /(21x10) es mayor que 2, entonces se considera menor recuento

Resultado: 21x10 UFC/gr

 DISCUSIÓN

1. Los fines de preparación de medios y micología, son extensos tema del curso, por
lo que se no se ha profundizado las cualidades en teoría para estos
microorganismos.
2. Las posibilidades de contaminación por cualquier factor, son muy altas, lo que
dificulta el trabajo con organismos y muestras delicadas, al tratarse del recuento
en placa.
3. Desinfección constante de las pinzas, influirá si se realiza de manera correcta en la
verificación de resultados.
4. Si se usa una pipeta serológica, recomendable empezar a separar alícuotas desde
las concentraciones más altas (10-5) hasta llegar a las más bajas (10-1)
5. Para no desnaturalizar el antibiótico, se le adiciona esterilizado por filtración,
cuando el medio se vierte a la placa Petri sobre las alícuotas, siempre en
proporción 0.1gr/lt de medio.
6. La muestra de avena en diluciones 10-1 y 10-2, ya en agua de dilución no se
pudieron homogenizar en su totalidad, pues se tornó casi sólido, lo cual impidió el
cometido.
21x10 UFC/gr de los resultados obtenido, no llegan al rango de peligro de
sobrecarga de mohos, que rectifica la calidad e inocuidad de la avena a granel.

CONCLUSIONES

1. Se vio la calidad y buen estado de la muestra de avena, demostrando ser bien

elaborado para el consumo humano.
. Resultado: 21x10 UFC/gr de los resultados obtenido, no llegan al rango de peligro
de sobrecarga de mohos (véase Anexos, TABLA 1), que rectifica la calidad e
inocuidad de la avena a granel.

2. El establecimiento de cultivos puros de hongos, y el manejo adecuado de la

fundamentación de los medios y aditivo de antibiótico suministrado.
3. La muestra no fue tan sencilla de trabajar por su naturaleza de solidificar rápido.
4. Se verificó que para este laboratorio, las muestras son fáciles de conseguir y por lo
tanto son representativos, viables y eficientes, aunque este último no tanto por
cuestión arriba mencionado.
5. Se supo la importancia de estandarización de carga microbiana límite para el
consumo humano.
6. Conjugar factores de crecimiento como nutrientes, temperatura, oxigenación en
este laboratorio.
7. Al ser prácticas continuas, es necesario también preservar los avances de
laboratorio, sin olvidar refrigerar al paso de 48 horas, con el objetivo también de
frenar el crecimiento si es que no se quiere obtener resultados indeseados

RECOMENDACIONES

1) Observar los detalles oral y procedimentalmente de cada método explicado por el

profesor. Prestar debida atención en los nuevos procedimientos en especial para
este laboratorio, como es la esterilización por filtración para la solución de
oxitetraciclina

1) Poner en cercanías al mechero cada instrumento de laboratorio que transporta

muestra, para así evitar contaminación con otros tipos de seres circundantes.
2) Para evitar infecciones, contaminación y resultados no deseados, empezar a
pipetear desde las soluciones más altas (-5,-6) es decir, la más diluida o de
menor concentración.
3) En los plaqueos y preparación de las placas Petri, evitar jugar o hablar,
manteniendo el orden y velando por la seguridad dentro del laboratorio.

4) Asegurar bien el vaso de la licuadora para evitar el escape de la dilución de la

muestra.

5) Usar una pipeta diferente para cada dilución

6) Las pipetas deben ser estériles y se debe tener cuidado de no confundir una con
otra al momento de las diluciones.

7) Al colocar el agar en las placas Petri se debe realizar movimientos de vaivén para
que se homogenice la muestra y no se solidifique muy rápido
 BIBLIOGRAFÍA

 BROCK-MADIGAN “Microbiología” Prentice Hall Latinoamericana 1° Ed 1991

 JAWETZ, MENICK Y ADELBERG Microbiología Medica MC Graw-Hill
INTERAMERICANA EDITORES, S.A.México 25ava.Ed 2001
 LLOP, VALDEZ- DAPENA, ZUAZO Microbiología Y parasitología Médicas
Editorial de Ciencias Médicas, TOMO I La Habana- Cuba 2001
EXTRA:

 MATERIALES DE LABORATORIO: http://www.labbox.com/es/productos/

Anexos

CUADRO No 1 Examen Microbiológico de superficies – DIGESA “Preparación de Medios

de cultivo” ANEXO ÚNICO

AGAR OGY
NOMBRE:
(Agar-Oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura)
Agar selectivo según Mossel y col.(1970) para la demostración y numeración de
mohos y levaduras en todo tipo de material de investigación (alimentos, material
clínico, etc.).
Descripción y El agar-oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura ha sido recomendado como
Uso: medio de rutina para la investigación de mantequilla.
En la investigación de muestras de heces procedentes de pacientes tratados con
Tetraciclina, las Enterobacteriáceas sólo son inhibidas de manera insuficiente. En
tales casos, es preferible el empleo de Gentamicina en vez de la Oxitetraciclina.
Disolver 30 g/litro, esterilizar en autoclave
(15 min. A 121ºC), dejar enfriar hasta unos
Extracto de 5,0
50ºC, incorporar 0,1 g/litro de Oxitetraciclina
levadura 10,0
en forma de solución acuosa o 0,05 g/litro de
Composición: D(+)glucosa 15,0
Preparación Gentamicina (1 mL/litro de Gentamicina en
(g/L) Agar-agar
solución) y verter en placas.
pH: 6.5 + 0,2
Aditivo: Las placas con medio de cultivo son claras e
Oxitetraciclina 0,1 o incoloras.
Gentamicina 0,05.
El material objeto de investigación se homogeniza, eventualmente, con solución
Ringer (Tabletas de RINGER), se diluye y se extiende sobre las placas mediante
Empleo e espátula.
interpretación Incubación: hasta 5 días a temperatura ambiente (aprox. 22ºC).
Contar el número de colonias de hongos por placa y mediante el factor de dilución,
calcular el número de gérmenes del material objeto de investigación.
NORMATIVA DIGESA:

A) Dirección de Higiene Alimentaria y Zoonosis, Resolución Ministerial 591-2008,

publicado el 27/08/2008

DESCRIPCIÓN: Norma Sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad

sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano.

PLANES DE MUESTREO

Los planes de muestreo sólo se aplican a lote o lotes de alimentos y bebidas; se

sustentan en el riesgo de la salud y las condiciones normales de manipulación y consumo
del alimento. Los planes de muestreo se expresan en términos de planes de muestreo de
dos y tres clases que dependen del grado del peligro involucrado. Un plan de dos clases
se usa cuando se puede tolerar la presencia o ciertos niveles de un microorganismo en
ninguna de las unidades de muestra. Un plan de muestreo de tres clases se usa cuando
se puede tolerar cierta cantidad de microorganismos en algunas de las unidades de
muestra.

Los símbolos usados en los planes de muestreo y su definición.

“n”: (minúscula). Número de unidades de muestra seleccionadas al azar de un lote, que

se analizan para satisfacer los requerimientos de un determinado plan de muestreo.

“c”: Número máximo permitido de unidades de muestra rechazables de un plan de

muestreo de dos clases o número máximo de unidades de muestra que pueden contener
un número de microorganismos comprendidos de “m” y “M” en un plan de muestreo de
tres clases. Cuando se detecta un número de unidades de muestra mayor a “c” se
rechaza el lote.

“m”: Límite microbiológico que separa la calidad aceptable de la rechazable y los valores
superiores a “m” indican lotes aceptables o inaceptables.

“M” (Mayúscula): Los valores de recuentos microbianos superiores a “M” son

inaceptables, el alimento representa un riesgo para la salud.

DISPOSICIONES ESPECÍFICAS

AVENA: Ubicado en el V. de los grupos de alimentos. Los criterios microbiológicos a

cumplir para éste alimento en específico son:

V. GRANOS DE CEREALES, LEGUMINOSAS, QUENOPODIÁCEAS Y DERIVADOS

(harinas y otros)

V.8. Hojuelas a base de granos (gramíneas, quenopodiáceas y leguminosas) que

requieren cocción
 TABLA 1

LÍMITE POR gr.

AGENTE MICROBIANO CATEGORÍA CLASE n C
m M
Aerobios mesófilos 2 3 5 2 10^4 10^6
Mohos 2 3 5 2 10^3 10^4
Coliformes 5 3 5 2 10^2 10^3
Bacillus cereus 8 3 5 1 10^2 10^4
Ausencia /
Salmonella sp. 10 2 5 0 25gr. ……………

GRAFICOS (Representativos)

Ensamblando el equipo de filtración Solución al 0.1% de Oxitetraciclina ya esterilizada

CRECIMIENTOS EN LAS PLACAS:

Notabilidad de mala homogenización, pero igual hay crecimiento. A la derecha,

notabilidad de hongos de más tamaño.