Cátedra de Biotecnología

Trabajo PRÁCTICO: Producción de insulina a partir de e.coli

Alumnos:
Sa Farid

DOCENTES:
Profesor Adjunto: Dra. Elisa Benitez
Jefe de Trabajos Prácticos: Bioqca. Laura I. Stella
Aux. Docente: Ing. Rocío García

Ciclo Lectivo 2019

Escherichia Coli
Es un bacilo gram (-) de la familia de las enterobacterias que se encuentra en el tracto
gastrointestinal de humanos y animales de sangre caliente.

Dominio Procariota

Reino Bacteria

División Proteobacteria

Clase Gammaproteobacteria

Orden Enterobacteriales

Familia Enterobacteriaceae

Genero escherichia

especie Escherichia coli

Nutrientes

Aproximadamente el 50% del peso seco del material celular es carbono, por lo que en todo
medio de cultivo debe existir un sustrato que proporcione el esqueleto carbonado básico para
la síntesis de las unidades estructurales que dan origen a las macromoléculas y estructuras
de la célula. En la mayoría de los casos este compuesto es de origen orgánico y entre los
más usados se encuentran los azúcares como: glucosa, sacarosa, fructosa, lactosa, entre
otros (bacterias heterótrofas). Por lo general en los procesos degradativos o catabólicos de
estos compuestos se produce también la energía necesaria para los procesos biosintéticos y
el funcionamiento general de la célula. En orden consecutivo el nitrógeno es el segundo
elemento en importancia que debe formar parte del medio de cultivo, ya que juega un papel
fundamental en la composición de las estructuras principales de la célula. Al nitrógeno le
corresponde del 8 al 15% del residuo seco. Es un factor esencial de las proteínas y forma
parte de los ácidos nucleicos, la pared celular, la membrana celular y otros componentes
importantes. En la mayoría de los casos se suministra en forma de amonio o de algunas de
sus sales, aunque existen otros que requieren aminoácidos, purinas, pirimidinas y vitaminas
(factores de crecimiento). Los requerimientos orgánicos de nitrógeno son relativamente caros,
por lo que a veces se trata de encontrar la satisfacción de esta demanda en subproductos
industriales (suero de leche) o en productos más baratos (soya, extracto de levadura), los
cuales pueden aportar algunos factores del crecimiento que se requieren en cantidades muy
reducidas. En menor cantidad, como micronutrientes, la E. Coli requiere de ciertos cofactores
enzimáticos como Co, N, Fe, Ca, Cu, Mn, etc. Los factores de crecimiento como la tiamina
son necesarios para un adecuado crecimiento; aunque en cultivos a escala laboratorio se
agrega mono y difosfato de potasio a fin de formar amortiguadores de pH, esto no es
necesario en escalas de biorreactor en los que el pH es controlado mediante adición de ácidos
y bases.

Metabolismo

La E. Coli es un microorganismo anaerobio facultativo la cual en los medios que contienen

fuentes de carbono se desarrolla como bacteria anaerobia al comienzo del proceso;
desintegra los hidratos de carbono mediante la fermentación, para después comenzar a
asimilar el oxígeno, crece como aerobia y realiza la respiración celular generando dióxido de
carbono y agua. Constituye una gran ventaja que pueda vivir tanto en presencia como en
ausencia de oxígeno.

Fermentación

La fermentación de glucosa por E.coli comienza con la glucólisis donde la glucosa se rompe
en dos moléculas de ATP y en dos moléculas de NADH. En este proceso la glucosa se
metaboliza a piruvato. Luego las moléculas de NADH se reoxidan para dar moléculas de
NAD+. En este proceso el piruvato forma CO2, etanol, acetato y H2, por una o más rutas
alternativas.

Respiración Aeróbica
En este proceso intervienen dos enzimas: una deshidrogenasa que oxida el aceptor de
electrones NADH y una citocromo oxidasa que reduce el aceptor de electrones desde O 2 a
H2O. Los electrones se transfieren de una enzima a otra a partir de un cofactor soluble en
lípidos, la ubiquinona (Q). El aceptor terminal de electrones es el oxígeno. La reacción redox
neta es:
2 NADH + 2H++ O2 a 2NAD++2H2O

Respiración Anaeróbica

En este proceso intervienen también 2 enzimas: en primer lugar una NADH hidrogenasa
donde el NADH es oxidado y una nitrato reductasa donde los electrones resultantes de la
reacción de oxidación se utilizan para convertir el nitrato a nitrito. Los electrones se transfieren
de una enzima a otra a través un cofactor liposoluble llamado ubiquinona. La reacción redox
neta es:
NADH+H++NO3- a NAD++NO-2+H2O

Los cultivos de E. coli para la producción de proteínas recombinantes son llevados a cabo en
condiciones aeróbicas, pues de esta manera se obtienen mayores rendimientos de biomasa
y producto debido a que la generación de energía es mayor que bajo condiciones
anaeróbicas. Además bajo condiciones anaeróbicas, la glucosa o las fuentes de carbono
pueden ser oxidadas parcialmente por la bacteria, lo que conlleva a la formación de algunos
subproductos de fermentación acido-mixta, que resultan tóxicos.

La demanda de oxígeno para la oxidación completa de la glucosa a dióxido de carbono es

una función directa de la velocidad de crecimiento de la bacteria.

Reproducción

La E.coli se reproduce mediante fisión binaria, en este proceso los cromosomas se copian a
sí mismos generando dos copias idénticas, la célula aumenta de tamaño y finalmente se
generan dos células nuevas idénticas a la célula madre.
En el caso de E. coli antes de que ocurra la replicación, el origen de replicación (OriC) se
ubica en un polo de la bacteria. Luego de finalizada la replicación de OriC, la secuencia migra
hacia el polo opuesto de la célula, continuando el proceso de replicación del resto del
cromosoma. Los cromosomas así ubicados en los polos celulares van a determinar la
posición del plano de división celular, asegurando que se dé en el ecuador de la célula.

La E.coli puede duplicarse cada veinte minutos bajo condiciones óptimas y el ADN bacteriano
tiene tasas de mutaciones elevadas por lo que se desarrollan nuevas cepas pudiendo generar
resistencia a los antibióticos y pudiendo soportar diferentes microambientes.

Producción de insulina recombinante a partir de Escherichia Coli

En condiciones adecuadas los microorganismos se multiplican de modo que se pueden
generar grandes cepas en corto periodos de tiempo, de esta manera los genes que controlan
la producción de insulina humana, se colocan en las células bacterianas, con el fin que dichos
microorganismos produzcan insulina humana.

Generación del vector recombinante

Durante la producción de insulina se genera un precursor la preproinsulina, la cual tras perder

un peptidoseñal se llega a la proinsulina. Estas son procesadas generando cadenas A y B
que después se unen mediante puentes disulfuro generando la proteína biológica. Surge la
posibilidad de producir insulina a nivel industrial para regular la glucemia (niveles de glucosa
en sangre de los pacientes). Se utiliza el gen que codifica para la insulina humana o la
secuencia que codifica las cadenas A y B. El gen es insertado en un vector (pBR322) -un
plásmido- dando origen a un vector recombinante, el vector una vez insertado en las bacterias
producirá la proteína recombinante . Es importante destacar que la insulina es la primera
proteína recombinante producida para su uso en humanos. Son proteínas generadas de
manera artificial a partir de ADN clonado. Se extrae el ADN de la célula luego de ser insertado
en vectores que se interiorizan en células o bacterias. Para la insulina humana se utilizan
Escherichia Coli, esto se debe a que el MO posee mayor velocidad específica de crecimiento
que las levaduras y otros mamíferos, fácil manipulación genética, no posee requerimientos
asociados costosos a medios de cultivo o equipamiento como para los organismos
superiores, existencia de una gran variedad de vectores de expresión estables y ser un MO
aprobado como hospededero en la producción de biofármacos. Partimos del genoma
aislamos una parte de esa secuencia y obtenemos un gran número de copias de ella, una
manera es la PCR. Luego elegimos el vector ,por ejemplo un plásmido, el cual abrimos e
insertamos el ADN. Posteriormente se realiza la ligación para generar el vector recombinante
lo que se hace a través de la enzima ADN ligasa. Luego se produce la inserción si se hace
en bacterias se denomina transformación, si se hace en células se denomina transfección.
Para ser capaz de internalizar el ADN ( debe ser competente el MO) se hace un tratamiento
previo al MO con cloruro de calcio donde se prepara la membrana para internalizar. Realizado
esto se procede a la transformación donde se hace un shock térmico ( cambio brusco de
temperaturas ) o electroporación ( aquí se observa que tan electrocompetente es el MO ).
Finalizada la transformación se busca que crezcan las bacterias recombinantes en un medio
de cultivo, este es selectivo para las bacterias con el ADN recombinante. Se selecciona una
colonia o clon de bacterias que se lleva en un cultivo líquido para favorecer su crecimiento,
esto sería la propagación de la colonia de bacterias. Luego de purificarlo (ver siguiente
sección), se hace una electroforesis para ver calidad esto es migración de fragmentos de
ADN a través de un campo eléctrico. Estos geles son de agarosa. Según su cc varían sus
poros. Las moléculas de distinto tamaño migran a distintas velocidades los más grandes
migran más lentos que los más pequeños. Los fragmentos se visualizan como bandas de
colores a través del bromuro de etidio y rayos UV con ello se puede confirmar la correcta
inserción del fragmento de interés en el ADN plasmídico.
Purificación

En procariotas se pueden obtener proteínas solubles en agua o agregados proteícos (cuerpos

de inclusión). Como no todas las células expresan las proteínas con el máximo de eficiencia
se eligen éstas para formar el banco maestro, almacenándose en crioviales, una vez que se
establecieron los factores genéticos adecuados entonces se debe asegurar la estabilidad del
clon productor, para ello se debe evitar que existan contaminaciones, mutaciones y pérdidas
del material genético. Con este objetivo se han desarrollado los bancos de trabajo. Tenemos
un stock de células productoras, se toma una muestra que va al banco de trabajo y sirven de
inóculo para expresar a la proteína de interés. Las proteínas recombinantes de la E coli
pueden ser expresadas de dos maneras: son excretadas al medio extracelular (solubles) o
son expresadas en el interior de la célula, bien en el espacio periplásmico o en el citoplasma
celular, pudiéndose ser solubles o insolubles (formando cuerpos de inclusión).
A nivel industrial la mayoría de los métodos se basan en la diferencia del ADN plasmídico y
del genómico. En las bacterias el ADN genómico es circular covalentemente cerrado así como
el plasmídico. El genómico se extrae fragmentado y el plasmídico se extrae entero. Se parte
de un cultivo del cual se busca purificar el ADN recombinante. Primero se centrifuga con lo
cual se concentra. Luego se sigue la lisis con esto se rompen las bacterias para liberar el
ADN agregando para ello un detergente aniónico SDS. Luego se agrega una base fuerte
como el hidróxido de sodio, la solución se lleva a pH 12, a este pH se desnaturaliza el ADN
lineal o sea el fragmentado, seguidamente pasamos a la neutralización de la muestra con
ácido acético esto se hace en condiciones de alta concentración salina agregándose para
ello, acetato de potasio. El ADN genómico va a precipitar junto con ARN y con proteínas y
además se van a generar dos fases líquidas una que contiene el ADN plasmídico, la cual se
pasa a un tubo, se concentra este último realizando precipitaciones con alcohol, lo cual causa
un cambio en la polaridad del medio y si se mantiene a baja temperatura se vuelve insoluble
el ADN plasmídico, se centrifuga a altas velocidades para concentrarlo y recuperarlo, luego
se lo resuspende en un buffer adecuado, y para chequear la correcta localización de la
secuencia en el ADN plasmídico se hacen estudios electroforéticos.

Condiciones de cultivo y biorreactor seleccionado

La fermentación discontinua es la más utilizada para la industria farmacéutica y para la

biotecnológica. Consiste en colocar el inóculo y el medio de cultivo, el cual tiene agitación y
aireación, si el proceso lo requiere. La desventaja es que posee baja productividad. Las
ventajas son que es simple, presentar bajo riesgo de contaminación y facilidad para ser como
patrón para estudios posteriores. Las limitaciones de esta operación son que existe una
concentración de sustrato limitante inhibitoria al crecimiento. Este efecto se denomina Crab
Tree y consiste en que la célula deja de consumir la fuente de carbono para producir el
producto sino que la utiliza para generar ácido acético u otras sustancias tóxicas que limitan
la obtención de altas densidades celulares. En numerosas ocasiones en la producción de
proteínas recombinantes la velocidad específica máxima de crecimiento no corresponde a la
máxima producción de proteínas. Se denomina µcrítica a la velocidad en la que la producción
de ácido acético es nula, ya que esta sustancia perjudica la producción de la proteína
recombinante. Esto puede variar de una cepa a otra (si es protótrofa o auxotrófica) como
también influye el medio en que se cultiva (complejo o definido). Un medio complejo es un
medio rico en extractos así como de vitaminas, purinas, pirimidinas y aminoácidos. El medio
definido está constituido principalmente por algunas sales y presentan una menor
productividad. Se requiere conocer la velocidad específica de producción y hay tres maneras:
cultivo discontinuo manipulando aireación y agitación, cultivo discontinuo modificando el
incremento del flujo de alimentación, en un cultivo discontinuo variando la velocidad de
dilución sin producir pérdidas de la información genética. La fermentación discontinua
incrementada permite incrementar la producción de proteína recombinante y disminuye
drásticamente los costos de producción. Propone resolver algunas cosas como la inhibición
del crecimiento debido a la acumulación del sustrato, formación de subproducto que impide
desarrollo del producto (ácido cítrico), la capacidad limitada de transferencia de oxígeno. Para
cultivar células de E.Coli a altas densidades se ha propuesto un medio de cultivo balanceado
donde la cantidad de nutrientes no sea tan elevada. El biorreactor es uno en donde la
concentración del sustrato limitante se aumenta de a poco, los nutrientes no se acumulan y
la velocidad de producción de microorganimos es baja. Los métodos de adición del
incremento pueden ser escalonados, constantes y exponenciales e influye en la productividad
y en la cantidad de productos de interés que se desea obtener. A flujos constantes la
velocidad de adición se mantiene constante y se logra aumentar el volumen de cultivo y la
densidad celular mientras que la velocidad específica de crecimiento disminuye. El flujo
escalonado o gradual permite que la velocidad de adición aumente generando un aumento
del crecimiento celular. Si la velocidad de adición del sustrato limitante se mantiene
proporcional a la velocidad de crecimiento celular entonces el crecimiento celular que se
registrará es exponencial. La ventaja de la adición con flujo exponencial es que permite
controlar y de esta manera disminuir la producción de acetato. Durante el proceso de
crecimiento celular se genera el ácido acético como subproducto. Esto es función del pH, de
la cepa, del tipo y concentración de la fuente de carbono, del medio utilizado y de la velocidad
específica de crecimiento. La formación de ácido acético y su actividad inhibitoria se pueden
controlar mediante un sistema de alimentación exponencial y a través del monitoreo de
niveles de oxígeno y fuentes de carbono. Existen procesos en los que se combina la
fermentación con la diálisis y la filtración, así como la utilización de las cepas con la enzima
fosfotransacetilasa mutadas. Otros de los elementos que puede provocar la inhibición del
crecimiento, así como la reducción en la calidad y estabilidad del producto son los niveles de
oxígeno bajos porque genera inestabilidad en los plásmidos y disminuye la producción de
aminoácidos. La limitación del cultivo incrementado (feed-batch) es que se genera
inestabilidad en los plásmidos debido al aumento significativo en el número de duplicaciones
y el mayor riesgo de contaminación que presenta en comparación con los sistemas
discontinuos. La selección entre un reactor feed-batch o quimiostato en la producción de
insulina en E.coli responde a las características del biocatalito. Los organismos
recombinantes y poblaciones producto de crianza selectiva sufren de inestabilidad genética,
problema que se exacerba en un quimiostato pero que se mantiene a raya en un proceso
feed-batch ya que estos procesos son cíclicos (esterilización–inoculación–cultivo –cosecha)
en lugar de continuos. La composición de la población puede revertirse a niveles naturales
porque las cepas de interés suelen reproducirse a una tasa más lenta que la especie original.

Bibliografía
· Producción de insulina a partir de organismos bacterianos. Hernandez G. J., Moralez
H. Y., Onesimo D.C. 2008
· Producción de proteínas recombinantes en E,Coli. Lara A. 2011