ARTÍCULO DE REVISIÓN

LA EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DESPIGMENTANTE EN LA PIEL PARA EL DESARROLLO DE NUEVOS AGENTES

BLANQUEADORES EN COREA
KH Son * y MI Heo † * División de Evaluación de Cosméticos, Administración de Alimentos y Medicamentos de Corea, Complejo de
Administración de Tecnología de Salud Osong, 187 Osongsaengmyeong 2 (i) -ro, Osong-eup, Cheongwon-gun Chungcheongbuk-do,
363-700, Corea y † Facultad de Farmacia, Universidad Nacional de Kangwon, Chunchon 200-701, Corea Recibido el 21 de mayo de
2012, aceptado el 30 de septiembre de 2012

Palabras clave: cosméticos, efectos despigmentantes, melanina, melanocito, tirosinasa

Sinopsis cliniques d'agents dépigmentants peuvent être utilisées

En esta revisión, los métodos de evaluación para el
cribado de menting sustratos fueron investigados. Para
este propósito, la evaluación método de tirosinasa, una
enzima clave de la biosíntesis de melanina, es más
frecuentemente utilizado, pero evaluando métodos
basados en ción de factores de transferencia de señal
celular o la inhibición de melano- alguna transferencia
también se ha desarrollado. Evaluación del efecto
despigmentante con melanocitos es complejo. Tiene el
ventaja de ser capaz de analizar los efectos generales
sobre la melanina biosíntesis a niveles celulares. Antes de
las pruebas clínicas finales de despigmentantes, las
pruebas in vitro deben realizarse para confirmar la
eficacia despigmentante y la seguridad. Estudios clínicos
para despigmentación- Los agentes inhibidores se
pueden utilizar para investigar la prevención de la
melanina. Síntesis y para determinar si la melanina
desaparece de la piel. Por lo tanto, se debe emplear el
protocolo más apropiado, depender en el mecanismo de
acción del agente despigmentante.
Currículum Dans cette revue, les méthodes d'évaluation
pour sélectionner des sustancias dépigmentantes ont été
étudiées. Le procédé d'évalua- tion de la tirosinase,
enzyme clé de la biosynthe`se de la mélanine, est le plus
fréquemment utilisé, mais des méthodes de l'évaluation
basées sur la régulation des facteurs de transfert de
signaux cellul- aires, ou sur l'inhibition du transfert des
mélanosomes ont égale- ment été développées.
L'évaluation de l'efficacité de dépigmentation a` l'aide de
mélanocytes est complexe. Elle a l'avantage d'être capa-
ble d'analyzer l'ensemble des effets sur la biosynthe`se
de la méla- nueve au niveau cellulaire. Avant l'essai
clinique final des agents de la dépigmentation, des tests
in vitro doivent être menées pour con- más firme la
eficacia dépigmentante y la seguridad. Les études
pour étudier la Prevención de la biosíntesis de la
mélanina y del determinante si la mélanine de la peau
disparaıt. Par conséquent, le protocole le plus se apropia
de la función util, de la función de mécanisme d'action de
l'agent dépigmentant.
Introducción
Con la mejora del nivel de vida en el mundo global, más
personas han comenzado a buscar el bienestar y la
belleza. En el campo de la salud, la participación en el
mercado de productos que ayudan a las personas a
realzar el bienestar y la belleza se han expandido a
niveles crecientes. Incluso en el mercado de los
cosméticos, muchos productos funcionales como los
desarrollados para la hidratación de la piel,
blanqueamiento de la piel, cuidado de las arrugas, anti-
envejecimiento, cuidado de la espinilla, reducción de la
celulitis y mejora de la piel atópica.
Tales fenómenos a menudo han dado como resultado
una publicidad engañosa y confusa de productos
médicos. Para proteger a los consumidores de la
publicidad engañosa, el gobierno de la República de
Corea ha promulgado la Ley de Cosméticos la cual define
el alcance de los cosméticos funcionales de la siguiente
manera: productos cosméticos para blanquear la piel,
productos cosméticos para cuidado de arrugas y
productos cosméticos para la protección de la piel contra
los rayos UV.
Como la evaluación de los cosméticos funcionales se
introdujo de acuerdo con la Ley de Cosméticos de Corea
(2000), muchas actividades de investigación para el
cribado de nuevas sustancias funcionales se han activado
en el Industria de cosméticos coreana. Específicamente,
la categoría de blanqueamiento, productos que
conforman el 22.4% del mercado local de cosméticos
funcionales en 2011, lo que indica que es uno de los
cosméticos más importantes en la República de Corea
[1]. Tal fenómeno puede ser el resultado de la idea
tradicional coreana de que la piel blanca es el factor más
importante en la belleza.
Los compuestos despigmentantes ideales deben tener
un efecto blanqueador potente, rápido y selectivo sobre
los melanocitos hiperactivados, sin efectos secundarios a
corto o largo plazo, y conducir a la eliminación
permanente del pigmento no deseado, actuando en uno
o más pasos del proceso de pigmentación. Durante la
selección de tales sustancias funcionales, se deben de
realizar diversos estudios in vitro y / o in vivo para
determinar su eficacia y seguridad.
Para encontrar un nuevo agente despigmentante, es
importante entender el proceso y el mecanismo de
pigmentación. Las pigmentaciones epidérmicas y
dérmicas, , como el melasma, las pecas y el lentigo solar,
están relacionadas con un mayor número de melanocitos
y actividad de enzimas implicadas en la producción de
melanina [2, 3].Los melanocitos, las células que
producen melanina, se mueven desde la cresta neural
embrionaria a la piel, donde se diferencian para formar
melanosomas. La melanina sintetizada en los
melanosomas se traslada a los extremos detríticos de
melanocitos. Los melanosomas se transfieren a
queratinocitos y desaparecen con el desprendimiento de
queratina. Como resultado del papel clave desempeñado
por la tirosinasa en la biosíntesis de la melanina, la
mayoría de los agentes despigmentantes actúan
específicamente para reducir la función de esta enzima
por medio de varios mecanismos:
(i) interferencia con su transcripción y / o glicosilación,
(ii) inhibición por diferentes modalidades,
(iii) reducción en subproductos y
(iv) control post-transcripcional de guiones [4, 5].
Aunque un agente despigmentante puede ser altamente
efectivo, debe estar libre de problemas de seguridad si
se va a comercializar. En particular, un agente
despigmentante utilizado en la fabricación de cosméticos
funciones deben tener buenas características de
seguridad. Por ejemplo, la hidroquinona, el ácido
retinoico y compuestos orgánicos de mercurio tienen
buenos efectos blanqueadores, pero su uso en productos
cosméticos está prohibido en la República de Corea
debido a cuestiones de seguridad [6].
En resumen, es necesario llevar a cabo estudios de
seguridad en los primeros estadios de detección junto
con estudios de eficacia.
Los estudios de seguridad requeridos para el desarrollo
de productos cosméticos incluyen la toxicidad aguda, la
toxicidad subaguda y crónica, la irritación de la piel y la
mucosidad, la sensibilización de la piel, la
carcinogenicidad, la toxicidad reproductiva y los estudios
de genotoxicidad. Además, se puede clasificar en
pruebas in vitro, estudios in vivo y estudios de parches
humanos en términos de metodología.
En el pasado, los estudios in vivo basados en animales
tales como ratones, ratas o conejillos de Indias fueron
empleados principalmente. Sin embargo, la propagación
del movimiento de bienestar animal ha dado lugar a una
disminución en el número de estudios en animales.
En Europa se promulgo una Ley que estable la
prohibición paso a paso de estudios con animales que
utilizan materias primas para productos cosméticos [7].
Como resultado, se están desarrollando métodos
alternativos in vitro.
En esta revisión, se discuten varios métodos y
mecanismos para demostrar la eficacia de los agentes
despigmentantes y se investigan los métodos más
eficientes y estandarizados con los que se estudian los
agentes despigmentantes. Para estos fines, varios
métodos que puede usarse para evaluar la eficacia y la
seguridad, así como el mecanismo de acción de los
agentes despigmentantes en relación con la formación,
el movimiento y la degradación de la melanina se
identificaron a partir de la literatura publicada.
Evaluación de eficacia de los agentes despigmentantes
Los métodos para la evaluación de la eficacia de los
agentes despigmentantes incluyen pruebas in vitro ,
estudios in vivo y ensayos clínicos. Los ensayos in vitro se
centran en la detección de agentes despigmentantes
mediantes la investigación de mecanismos para la
activación o inhibición de los factores de transdferencia
de señales o enzimas implicados en la formación de
melanina. Recientemente se publicó un informe sobre un
método de evaluación que empleó un mecanismo de
inhibición de la transferencia de melanosomas formados
por melanocitos en queratinocitos. en queratinocitos [8,
9]. Para estudios clínicos, los rayos ultravioleta (UV) se
irradian para inducir la pigmentación. Y la medida del
efecto de blanqueamiento se lleva a cabo en esas áreas
pigmentadas. El agente despigmentante se aplica a
personas con lesiones pigmentadas y a continuación , se
lleva a cabo la medición del efecto del despigmentante.
Pruebas in vitro de agentes despigmentantes
Los métodos de prueba in vitro utilizados para la
evaluación de despigmentación los agentes se pueden
dividir en aquellos que actúan antes, durante y después
de síntesis de melanina (Tabla I) [4, 10]. Para métodos de
prueba in vitro que actuar antes de la biosíntesis de
melanina, los efectos de un agente despigmentante
puede ser evaluado de acuerdo a la expresión o actividad
de factores suprimiendo MITF, ERK u otra señal de
biosíntesis de melanina trans- factores de fer [11-13].
Para métodos de prueba in vitro que actúan durante
mela- nin biosíntesis, el mecanismo de inhibición de las
enzimas que son directamente involucrado en la
biosíntesis como la tirosinasa, TRP-1, TRP-2 y
dopachrometautomerase o la actividad de eliminación
de ROS puede ser evaluado. Las melaninas producidas
por los melanocitos son transportadas de melanosomas
en queratinocitos y luego causar epidermis
pigmentación. Por lo tanto, un informe describió la
proyección de despigmentantes mediante la evaluación
de la inhibición de melanosoma movimiento [8].
Además, para la evaluación in vitro de agentes
despigmentantes, una método para medir la cantidad de
melanina formada a través de la célula la cultura se usa
ampliamente. Este método tiene la ventaja de analizar
efectos generales en el sistema de producción de
melanina intracelular, independientemente de los
mecanismos de acción, por lo que es ampliamente
utilizado de inmediato antes de los estudios in vivo .
Regulación de la transferencia de señal celular
Principio.
Además de la evaluación del efecto de blanqueamiento
a través de la inhibición directa de tirosinasa, estudios
para evaluar agentes de menting a través de la
regulación de la transferencia de señal celular se han
intentado los factores implicados en la producción de
melanina. Es sabido que la biosíntesis de melanina
comienza cuando las señales inducidas por Los rayos u
hormonas UV, como a-MSH, se transfieren a celulares
factores para inducir la expresión de tirosinasa. Los
factores estimulantes como a-MSH y forskoline, que
inducir la producción de melanina para elevar la
concentración intracelular ción de cAMP, activar PKA y
fosforilar CREB para unión con CRE, que conduce a una
mayor expresión de MITF, una transcripción factor. MITF
regula la expresión de tirosinasa, una enzima que Tabla I
Clasificación de los agentes despigmentantes por un
mecanismo de interferencia con síntesis de melanina y
deposición Etapa de melanina Síntesis * Modo de acción
Compuestos Antes de la melanina síntesis Transcripción
de tirosinasa C2-ceramida, Tretinon Glicosilación de la
tirosinasa PaSSO 3 Ca Durante la melanina síntesis
Inhibición de la tirosinasa Hidroquinona, 4-Hidroxi anisol,
arbutina, ácido kójico, Aloesina, ácido azelaico, Ellagic
ácido, resveratrol, Oxyresveratrol Inhibición de la
peroxidasa Metimazol Fenoles, Cathecol Reducción del
producto y Secuestradores de ROS Ácido ascórbico,
Ascorbilo glucósido Ácido tiótico, a-tocoferol,
Hidroxicumarinas Después de la melanina síntesis -ácido
linoleico Degradación de la tirosinasa a-ácido linoleico,
Inhibición del melanosoma transferir Niacinamida, soja /
leche extracto, lecitinas y Neoglycoproteins Aceleración
de cambio de piel Ácido láctico, ácido glicólico, Ácido
retinoico, ácido linoleico PaSSO _ { 3} Ca, d-panteteína-S-
sulfonato de calcio; ROS, espectros de oxígeno reactivo
cies. * Basado en Briganti et al. [4] y Grimes et al. [10]. ©
2012 Sociedad de Científicos Cosméticos y la Société
Française de Cosmétologie Revista Internacional de
Ciencia Cosmética , 35 , 9-18 10 La evaluación de la
eficacia despigmentante en la piel determina la tasa de
biosíntesis de melanina. El aumento de expresión de la
tirosinasa promueve más tarde la producción de
melanina. Ahí- fore, la evaluación de la expresión de
MITF permitirá una selección eficiente de agentes
despigmentantes. Se sabe que MITF es un factor de
transcripción que regula la proliferación, supervivencia y
pigmentación de los melanocitos [14, 15]. Además, se ha
informado que MITF es una transcripción importante
factor de producción de varias de las enzimas
involucradas en la producción de melanina ción,
incluyendo tirosinasa, TRP-1 y TRP-2 [16-18]. Por otra
parte, Es bien sabido que a-MSH induce la expresión de
MITF [17-19]. Además de la vía de expresión MITF, se ha
informado que la biosíntesis de melanina está regulada a
través de la vía ERK para la degradación de MITF [20], y
el ácido lisofosfatídico, EGCG y hinokitiol afecta las vías
de transferencia de señal para regular la expresión sión
de MITF e inhibir la biosíntesis de melanina [11, 12].
Incluso aunque estos materiales no tienen inhibición o
muy débil de la tirosina nase actividad, muestran un
efecto de blanqueamiento. Aunque es compli- cated y es
difícil evaluar el efecto despigmentante de midiendo el
grado de expresión de MITF, este método ha sido
destacado porque es útil en la detección de agentes
despigmentantes sin inhibición directa de la actividad
tirosinasa.
Método. Cultivo celular: la línea celular de melanoma
B16 u otra línea celular equivalente (1 9 10 6 ) se inocula
en platos de 60 mm DMEM con suero bovino fetal al 10%
(FBS), TPA 100 nM, 1 nM de toxina del cólera, 50 μg ml
À1 estreptomicina y 50 lg ml À1 penicilina u otro medio
equivalente y luego se incuba al 5% CO 2 y 37 ° C.
Determinación de la concentración: la concentración se
determina después de un ensayo de cristal violeta [21]
para la toxicidad de una muestra. Celda la cultura se lleva
a cabo con concentraciones específicas de muestras,
medios se eliminan con cuidado de los pozos, y las células
se lavan con fosfato solución salina tamponada con
fosfato (PBS). Luego, 500 l de solución de cristal violeta
(0,1% de violeta de cristal por 10 mL de etanol, 90 mL de
DW agregado) es agregado a cada uno de 24 pozos. La
incubación se lleva a cabo a temperatura ambiente
durante 10 minutos, y el lavado se realiza cuatro veces
con agua cultivada de una manera que no cause la
eliminación de las células. Luego, se agregan 1000 lL de
etanol al 95% para disolver los pigmentos, y la
absorbancia se mide a 590 nm.
Tratamiento de muestra: cuando más de
aproximadamente el 80% de el fondo está ocupado por
celdas, los medios se intercambian con los sin FBS y la
incubación se lleva a cabo durante 24 h. Después de la
eliminación de medios, nuevos medios con 1 lM a-MSH y
muestra con- se agregan FBS y la incubación se realiza a
5% de CO 2 y 37 ° C durante 48 h. Las células se lavan dos
veces con PBS y luego se lavan suspendido en solución
tampón.
Medición de la cantidad de MITF expresada: el
suspendido las células se someten a la determinación de
proteínas, después de lo cual, 10 lg de proteína por
muestra se separa por electroforesis en gel de SDS-
poliacrilamida phoresis. Las proteínas separadas se
adsorben en nitrocelulosa membranas o láminas de
PVDF, y leche en polvo se utiliza para el bloqueo de la
membrana a temperatura ambiente durante 1 h.
Anticuerpos específicos del MITF como el anticuerpo
primario se agregan y se incuban a tempera- ture por
debajo de 4 ° C durante 16 h con agitación. Después del
lavado, un segundo anticuerpo con enzima unida se
agrega para inducir la unión e incubación pegado por 2
h. La película queda expuesta a la luminiscencia generada
por un reacción enzimática y se usa un densitómetro
para analizar el objetivo tein El anticuerpo de actina se
trata de acuerdo con el programa mencionado
anteriormente cedures. El valor del ensayo de actina se
utiliza para corregir la cantidad de MITF presente [11,
12].
Estadísticas: el grupo de control y el grupo tratado con a-
MSH se usan como controles positivos El grado de la
disminución en a-MSH-inducida MITF expresión por
muestra se mide. Este procedimiento se repite más de
tres veces Cuando el análisis estadístico de los resultados
muestra la disminución significativa, se considera que la
muestra tiene el efecto menting.
Ensayo de inhibición de la tirosinasa Principio.
La tirosinasa es una enzima que participa en la mayoría
de paso importante que determina la velocidad en la
biosíntesis de melanina. Melano- la génesis es iniciada
por la tirosina que se metaboliza en DOPA y luego
dopaquinona por tirosinasa. Esta primera reacción es la
tasa paso determinante en la melanogénesis. La
tirosinasa tiene varias formas, incluyendo mettyrosinase,
oxytyro- sinosa y desoxitirosinasa. Oxytyrosinase es una
forma activada, mientras que la desoxitirosinasa es una
forma inactivada [18, 22, 23]. La función de la tirosinasa
está estrechamente relacionada con la enfermedad. En
animal estudios, el trastorno en la biosíntesis de
melanina se ha encontrado para conducir a condición de
coloración anormal de melanina, como vitiligo o hiper-
pigmentación. En casos severos, el cáncer de piel puede
resultar de tales trastornos [22]. Por lo tanto, los estudios
sobre los inhibidores de la tirosinasa son altamente
importante para el desarrollo de nuevos medicamentos
para el tratamiento de coloración anormal de melanina,
así como cosméticos funcionales destinado a producir un
efecto despigmentante. El método utilizado para evaluar
el grado de inhibición de la tirosinasa es ampliamente
utilizado en la detección de agentes despigmentantes.
Como están las cosas fácil de usar y se puede aplicar para
evaluar muchas muestras en el Al mismo tiempo, se
considera que es el método más apropiado para
detección temprana de sustancias candidatas. Este
método, que es basado en una reacción enzima-sustrato,
es inducir la reacción de tirosina y tirosinasa durante un
período específico y para medir el cantidad de productos
después de la reacción.
 Método. Mushroom tyrosinase [23], melanoma
tirosinasa [24] o melanocitos humanos tirosinasa [25] se
puede utilizar. En general, la tirosinasa de hongos es
ampliamente utilizada porque es fácil de obtener. DOPA
puede ser el producto final para la medición, pero no es
ampliamente empleado debido a la necesidad del uso de
un isótopo radiactivo. HPLC [26], otro método que se
puede usar para medir DOPA, es no se usa con frecuencia
porque requiere un largo período de tiempo para
analizar muchas muestras. El método más apropiado
para medir seguro dopachrome, uno de los productos de
reacción, es realizar trometría a 475 nm [27] o 490 nm
[28].
En general, el método de ensayo de inhibición de la
tirosinasa es formado de la siguiente manera [29]. La
muestra se disuelve en etanol u otro disolvente
apropiado y diluido a una concentración apropiada rango
para la inhibición de la tirosinasa. Estas diluciones se
usan como soluciones de prueba (al menos cinco
concentraciones). Entonces, 220 lL de 0.1 M tampón
fosfato (pH 6.5), 20 lL de solución de prueba y 20 lL de
tirosinasa de hongos (1500-2000 U mL) À1 ) (o tirosinasa
humana) se agregan a un tubo de ensayo en orden.
Cuarenta microlitros de 1.5 mM la solución de tirosina
luego se agrega al tubo, y la reacción es conducido a 37 °
C durante 10 a 15 min. La absorbancia es entonces media
a 490 nm con un lector de ELISA. Para una solución en
blanco, Se agrega tampón de fosfato 0,1 M (pH 6,5) en
lugar de solución de prueba. La concentración de
solución de prueba que muestra 50% de actividad de
inhibición (IC 50) se calcula utilizando un programa
apropiado. Dependiendo de las condiciones, esta prueba
se puede ampliar o disminuir según sea necesario. La
arbutina o el éter etílico de ascorbilo también pueden
usarse como control positivo.
Tasa de inhibición de la tirosinasa% ¼ ¼ 100 À b À b 0 Þ
/ ð a À a 0 Þ Â 100 a : absorbancia de la solución en blanco
después de la reacción. b : absorbancia de la solución de
prueba después de la reacción. a 'y b ': absorbancia
cuando se prueba con la adición de tampón en lugar de
tirosinasa
Ensayo de inhibición de la autooxidación DOPA
Este ensayo se usa para medir la oxidación de DOPA
inhibida por tirosinasa. Este método es similar a la
tirosinasa antes mencionada ensayo de inhibición,
excepto que incluye el uso de DOPA como sustrato. Una
descripción de este método sigue [30]. La muestra se
disuelve en etanol u otro solvente apropiado, que se
diluye con un tampón apropiado, como tampón de
fosfato 0,1 M (pH 7,0), para alcanzar un rango apropiado
de concentración para la inhibición de Oxidación DOPA
Estas diluciones se usan como soluciones de prueba (al
menos cinco concentraciones). Luego, 850 lL de tampón
de fosfato 0.1 M (pH 7.0), 50 lL de solución de prueba y
50 lL de tirosinasa de hongos (1500-2000 U mL À1 ) (o
tirosinasa humana) se agregan a una prueba tubo en este
orden, y la reacción se realiza a 37 ° C durante 6 min.
Cincuenta microlitros de L-DOPA 0.06 mM (L-3,4-
dihydroxyphe- nilalanina) se agrega a esta solución, y la
reacción es llevado a cabo a 37 ° C durante 1 min. La
absorbancia se mide a 475 nm con un lector de
microplacas. Para una solución en blanco, 0.1 M tampón
de fosfato (pH 7,0) se agrega, en lugar de solución de
prueba. los concentración de solución de prueba que
muestra 50% de actividad de inhibición (IC 50) se calcula
entonces utilizando un programa apropiado.
Dependiente en las condiciones, esta prueba se puede
ampliar o disminuir según sea necesario. Se puede usar
arbutin o ethyl ascorbyl ether como control positivo.
Inhibición de la oxidación de DOPA%% Þ ¼ 100 À ð
Absorbancia de la solución de pruebaÞ / ðAbsorbencia de
solución en blancoÞ 100
Ensayo de inhibición de la dopacrometautomerasa
Principio.
En la biosíntesis de melanina, la tirosina se convierte en
dop- aquinona por tirosinasa. En presencia de cisteína,
dopaquinona produce cysteinyldopa, que finalmente
conduce a la producción de feomelanina [31]. Sin
embargo, en ausencia de cisteína, dopaqui- ninguno se
transforma en el dopacromo generador no enzimático.
Dopachrome se somete a la descarboxilación
espontánea para formar 5,6-dihidroxiindol (DHI) o
tautomerización para formar 5,6 -dihidroxiindol-2-ácido
carboxílico (DHICA). La formacion de DHICA de un
dopacromo es controlado por dopachrometautomer-
Plaza bursátil norteamericana. Esta
dopacrometautomerasa es otra de las principales
correlaciones enzimáticas ing con la vía de la
melanogénesis [32]. Dopachrometautomerase tiene una
distribución subcelular dentro de los melanocitos, que es
similar lar a la de tirosinasa. Cataliza la transformación de
dopa- Chrome en DHICA. Esto significa que la
dopacrometautomerasa actúa como un factor de
"conversión de dopachrome" [33]. La producción de
DHICA inducido por dopachrometautomerase
finalmente conduce a la marrón DHICA-eumlanina, que
es seguida por una mayor oxidación y poli- merization.
Método. El dopacromo se produce mezclando DOPA frío
(0,5 mg) L-DOPA por ml en fosfato de sodio 0.05 M, pH
6.8) con plata óxido (6 mg de Ag 2 O mg) À1 DOPA)
durante 3 min. Después de filtrar a través de un filtro
millipore de 0.22-lm, el sobrenadante se trata con Chelex
100 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EE. UU.) Para
eliminar todo rastros de astillas. El dopacromo se
prepara inmediatamente antes del uso debido a su
inestabilidad Los reactivos de ensayo consistieron en 125
lL de dopacromatutautomer- ase (0,9 mg de proteína
total), 250 l de la solución de dopacromo, 525 lL de un
tampón de fosfato de sodio 0.05 M, pH 6.8 y 100 lL de
MeOH o 1 mM de la muestra de prueba disuelta en
MeOH. los la actividad dopachrometautomerase se
determina midiendo el aumento en la absorbancia a 308
nm, lo que indica que la enzima catalizada formación de
DHICA a partir de dopacromo. La muestra se disuelve en
etanol u otro solvente apropiado, que se diluye con
tampón de fosfato 0,05 M (pH 6,8). Estas las diluciones
se usan como soluciones de prueba (al menos cinco
concentraciones). Un volumen de 525 lL de tampón de
fosfato 0.05 M (pH 6.8), 100 lL de solución de prueba y se
agrega 125 lL de dopacrometautomerasa en un tubo de
ensayo en este orden, y la reacción se realiza a 37 ° C por
10 min. Luego, la absorbancia se mide a 308 nm con un
Lector de ELISA Para una solución en blanco, tampón de
fosfato 0,05 M (pH 6.8) se agrega, en lugar de la solución
de prueba. La concentración de la prueba solución que
muestra el 50% de la actividad de inhibición (IC 50 ) se
calcula con un programa apropiado.
Ensayo anti-oxidación
Principio.
Los antioxidantes pueden tener efectos
despigmentantes por inter- actuando con o-quinonas,
evitando así la polimerización oxidativa de melanina
intermedios, o con el cobre en el sitio activo. Por otra
parte, antioxidantes, mediante la captación de ROS
generados en la piel después de la exposición a UV,
puede inhibir posibles segundos mensajeros que son
capaces de estimular la melanogénesis epidérmica
directamente o indirectamente [34, 35].
El ácido ascórbico interfiere con los diferentes pasos de
la melanización, al interactuar con iones de cobre en el
sitio activo de tirosinasa [36] y reducir la dopaquinona y
bloqueando la oxidación de DHICA [37]. Las propiedades
antioxidantes del a-tocoferol, que interfiere con la
peroxidación lipídica de membranas de melanocitos y
aumenta la contenido de glutatión intracelular, podría
explicar su despigmentación efecto [38, 39]. 6-Hydroxy-
3,4-dihydrocumarins han sido recientemente informado
de tener una actividad anti-melanogenic en cultivo
normal melanocitos humanos a concentraciones no
citotóxicas sin fering con actividad de tirosinasa [40]. La
aceleración en la biosíntesis tesis de glutatión dentro de
los melanocitos, que conduce a la inhibición de la
transferencia de tirosinasa a los premelanosomas, podría
ser el mecanismo de acción [41]. En general, el grado de
eliminación de radicales libres DPPH o el grado de
inhibición de la peroxidación lipídica se mide por ensayo
de oxidación
Método. Actividad de barrido de radicales libres: un
volumen de 0.1 ml de la muestra se agrega a 1,0 ml de
solución de 100 ml de DPPH-etanol, y la reacción se lleva
a cabo a 37 ° C durante 30 min. Entonces, la absorbancia
es medido a 520 nm [42].
Inhibición de la peroxidación de lípidos: Agregue
muestra de prueba de 0.1 mL y linoleato de etilo 10 lM a
un medio de incubación (4,89 mL) que contiene- con un
2% de dodecilsulfato de sodio, 1 l de cloruro ferroso y 0.5
mM peróxido de hidrógeno. Mantenga el medio de
incubación a 55 ° C durante 16 h. Se transfirió cada
mezcla de reacción (0,3 ml) al tubo de ensayo, que fue
seguido por la adición de 4% BHT (50 lL) para prevenir
más oxidación Agregue 1 ml de TBA al 0,67% a la reacción
mezcla. Vortex la muestra e incubar a 95 ° C durante 30
min. Después de enfriar, agregue 4 ml de una solución de
butanol metanólico al 15% y agitar la solución.
Centrifugar la mezcla de reacción durante 10 minutos ©
2012 Sociedad de Científicos Cosméticos y la Société
Française de Cosmétologie Revista Internacional de
Ciencia Cosmética , 35 , 9-18 12 La evaluación de la
eficacia despigmentante en la piel KH Son y MI Heo
Página 5
(1,000 9 g ) y mide la absorbancia del sobrenadante en
532 nm. La extensión de la peroxidación de lípidos se
determina midiendo ing la cantidad de la sustancia
reactiva TBA (TBARS). 1,1,3,3- El tetraetoxipropano se
usa como estándar y el peróxido de lípidos concentración
se expresa como la cantidad de malondialdehído y se
muestra como el porcentaje de inhibición de la
formación de MDA [43].
Evaluación del efecto despigmentante con melanocitos
Principio. El método utilizado para la evaluación del
despido- El efecto de los melanocitos es un sistema de
detección que simula condición similar a las condiciones
intracelulares en comparación con in vitro pruebas de
actividad enzimática o anti-oxidación y tiene la ventaja
de ser capaz de analizar los efectos generales sobre la
biosíntesis de melanina melanocitos Sin embargo, dado
que este método es complejo y suming, se cree que este
método es apropiado para confirmar evaluación
matérica de las muestras que se examinan
preliminarmente con un ensayo de actividad enzimática.
La evaluación del efecto despigmentante usando
melanocitos puede ser realizado mediante la medición
de la actividad de la tirosinasa intracelular o la cantidad
de melanina intracelular producida. Varios métodos son
utilizado dependiendo del tipo de línea celular, las
condiciones de cultivo y métodos de evaluación. La
siguiente tabla resume el melano- citos y condiciones de
cultivo que se utilizan con frecuencia (Tabla II). El cultivo
de melanocitos solo permite a los investigadores evaluar
los efectos sobre la cantidad de producción de melanina
en los melanocitos, considerando que no tiene en cuenta
los efectos sobre la señal extracelular transferir. Por lo
tanto, un cocultivo melanocito-queratinocito y un
cocultivo El método tridimensional de la piel ha sido
desarrollado. Cómo- nunca, tales métodos no son
ampliamente utilizados porque son caros y requieren
condiciones que son difíciles de lograr.
Método. Células de melanoma murino (B-16 F1) u otras
células similares se inoculan en una placa de 6 pocillos
que contiene DMEM con FBS o otros medios
equivalentes (1 9 10 5 células / pocillo), y la incubación
es canalizado a 5% de CO 2 y 37 ° C hasta más de
aproximadamente 80% del fondo del pozo está ocupado
por celdas. Los medios son luego reemplazados con
nuevos medios que contengan las diluciones apropiadas
de muestra de prueba, y la incubación se lleva a cabo a
5% de CO 2 y 37 ° C durante un período especificado
período de tiempo. Un rango apropiado de
concentración de la prueba la muestra se determina
mediante pruebas de toxicidad utilizando una violeta de
cristal ensayo. Los medios se eliminan, las células se
lavan con PBS y la tripsina se aplica para recuperar
células. La cantidad de celdas se cuenta con un
hematocitómetro. La centrifugación se lleva a cabo en
4,000-16,000 9 g por 10 min, y el sobrenadante se
elimina a obtener el pellet El pellet se seca a 60 ° C y se
disuelve con 100 lL de solución de hidróxido de sodio 1
M o lisis celular apropiada tampón para obtener
melanina intracelular en un baño de agua a 60 ° C. La
absorbancia se mide a 490 nm con un lector de
microplacas, y la cantidad de melanina se calcula como
un número de células específico Bers o contenido
proteico específico. La normalización se realiza con el
resultado de una prueba en blanco [44].
Prueba de inhibición de transferencia Melanosome
Principio. Melaninas sintetizadas en melanosomas de
melanocitos mover a los extremos dendríticos de los
melanocitos.
Entonces, los extremos dendríticos que contienen
melanosomas se transfieren a los queratinocitos, y las
queratinas se caen y desaparecen. Aunque la
transferencia de melanosomas se ve muy afectada por
Monés o rayos UV, el factor más importante es el
genético.
La activación del receptor 2 activado por proteasa (PAR-
2), un siete receptor acoplado a proteína G
transmembrana, que se expresa en los queratinocitos y
no en los melanocitos, se encontró que activa fagocitosis
de queratinocitos, mejorando la transferencia de
pigmentos [45]. Inhibición de la escisión de PAR-2 por
inhibidores de la serina proteasa, tales como RWJ-50353,
evita por completo la pigmentación inducida por UVB de
los análogos de la epidermis [46, 47]. Esta transferencia
de melanosoma prueba de inhibición es medir la
cantidad de melanina en queratino- cyte después del
cocultivo de melanocitos y queratinocitos, para
determinar mío si la muestra es capaz de inhibir el
movimiento de melanina.
Método de prueba. Cocultivo de melanocitos y
queratinocitos: Incubar prepucios en 0,25% de tripsina
durante 2 ha 37 ° C. Vortex la piel suavemente durante
30 s para separar la dermis de la suspensión de células
epidérmicas. Retire la dermis y luego sedimente las
células epidérmicas centrándolo fuge y resuspenda en
crecimiento de melanocitos o queratinocitos medio para
la siembra en 25 cm 2 frascos de cultivo de tejidos.
Mantener mela- nocice en medio basal M154
suplementado con 4% de calor inactivo cubierto FBS, 1%
solución antibiótica / antimicótica, 1 lg mL À1
transferrina, 1 lg ml À1 vitamina E, 5 μg ml À1 insulina,
0.6 ng mL À1 hFGF, 10 À8 M a-MSH y 10 À9 M ET-1.
Mantener queratinocitos en Medio basal M154
suplementado con queratinocito humano suplementos
de crecimiento y 1% de solución antibiótica /
antimicótica. Manchar posteriormente, los cultivos
establecidos de melanocitos con el éxito éster inimidílico
del diacetato de carboxi fluoresceína (CFDA) en 2 lmol L
À1 en solución salina equilibrada de Hanks durante 30
min. Agregue estos melanocitos a los queratinocitos en
una proporción de 1: 2 y cocultivo en crecimiento de
melanocitos normal / crecimiento normal de
queratinocitos medios 1: 2.
Tratamiento de muestra: mantener el cocultivo en
presencia o ausencia de muestra durante 6 días. Agregue
la muestra a los medios del coculturas cada 12 h. En el
7mo día, lavar las células en 5 ml de PBS que contiene
0.4% de FBS inactivado por calor y 0.2% de azida sódica.
Pre- fijar las células en paraformaldehído al 4% durante
30 min a 4 ° C seguido por permeabilización en la
clasificación de células activadas por fluorescencia
permeabiliz solución de agua durante 10 minutos a
temperatura ambiente, y lavar dos veces en PFA. Incubar
las células durante 45 minutos a temperatura ambiente
con la anticuerpo primario diluido en 10% de suero
humano normal / PFA (PFAN) a 1: 300. Enjuague las
células tres veces con PFA e incube durante 30 minutos a
37 ° C con IgG de cabra anti-ratón conjugada con Phy-
coeritrina (PE) a una dilución 1: 20 en PFAN. Lavar las
células dos veces y post-fix en paraformaldehído al 1%.
Detección de transferencia de melanosomas: análisis de
células por citometría de flujo tratar. CFDA y PE están
entusiasmados con la línea de 488 nm de un argón laser
de ion Detecta emisión de fluorescencia para CFDA y PE
selectivamente por colección con filtros de paso de
banda de 525 nm y 575 nm, respec- tively Los
melanocitos son positivos solo para CFDA.
Queratinocitos son positivo para PE. Evaluación de la
transferencia de melanosomas a queratinocitos como se
determina registrando la expresión de CFDA dentro de
PE-posi- células tivas [8].
Prueba clínica para agentes despigmentantes de la piel
El melasma es una disfunción
del sistema pigmentario, que produce hipermelanosis
facial irregular marrón o marrón grisáceo. A pesar de que
puede ocurrir en ambos sexos y en cualquier tipo de piel,
se observa con mayor frecuencia en mujeres [48] y
personas con pieles más oscuras – Fototipo de IV-VI -
especialmente aquellos que viven en áreas de radiación
ultravioleta intensa, como hispanos / latinos, asiáticos y
afroamericanos estadounidenses [49-51]. La condición
generalmente se desarrolla lentamente y
simétricamente y puede durar muchos años, con un
empeoramiento en el verano y mejora durante el
invierno.
Los factores contribuyentes comunes incluyen la
predisposición genética [50], embarazo [52] disfunción
endocrina o tratamientos hormonales [53, 54], uso de
anticonceptivos orales [55] y exposición a la luz
ultravioleta [50, 56]. Además, los cosméticos y
medicamentos que contienen agentes fototóxicos (por
ejemplo, medicamentos anticonvulsivos) también se han
relacionado con melasma [49].
Los estudios clínicos realizados para evaluar el efecto
despigmentante puede evaluarse para investigar el
efecto sobre la inhibición de la pigmentación de la
melanina o el efecto sobre la mejora de las áreas
pigmentadas.El sujeto es el ser humano pigmentado
artificialmente por Irradiación UV o que tiene un sitio de
hiperpigmentación, como pecas, lentigo o piel manchada
que puede ser investigada. Los cambios de tono de piel
pueden medirse visualmente por expertos o mediante el
uso de equipos tales como el Cromámetro. El método de
evaluación visual emplea el sistema de puntuación para
evaluar el grado de blanqueamiento. Por lo tanto, es
importante para desarrollar protocolos bien diseñados,
como un método de puntuación objetivo y el uso de
evaluadores calificados, para establecer fiabilidad de los
resultados.
El método de evaluación instrumental tiene la ventaja de
la medición cuantitativa y objetiva. Sin embargo, los
resultados pueden depender del tamaño y la condición
de los sitios objetivo y la experiencia y habilidad de los
técnicos. Por lo tanto, es deseable utilizar estos dos
métodos en paralelo y sacar conclusiones de los
resultados de ambos métodos.
Los melanosomas se mueven hacia el exterior de la piel
con queratinocitos y finalmente se desprenden con otra
piel. La capacidad de los productos de peeling químico
(p. ej. a-hidroxiácidos) para dispersar el pigmento de
melanina y / o acelerar el recambio epidérmico puede
dar como resultado una aclaramiento de la piel [57, 58].
Las pruebas clínicas de la tasa de recambio epidérmico se
pueden usar para la evaluación de agentes
blanqueadores.
Evaluación de eficacia sobre la pigmentación inducida
Selección de sujetos. Adultos sanos, hombres o mujeres,
de entre 18 y60 años, normalmente se seleccionan como
sujetos para estudios clínicos en humanos.
En principio, aquellos con fototipos de I-III son
preferibles , pero aquellos con fototipos III y IV también
se pueden incluir. La exposición de los rayos UVB debe
mantenerse al mínimo. Deben excluirse aquellos cuyo
estado de salud o afecciones de la piel que puedan
afectar los resultados y las mujeres que están
embarazadas o lactando.
Además, se deben excluir aquellos que alguna vez hayan
experimentado reacciones adversas a la luz solar,
transtornos de la piel o síntomas anormales de la piel
como eritema y manchas negras, ya que puede afectar la
interpretación de los resultados.
Número de sujetos El número de sujetos debe
seleccionarse en más de 20 puntos de datos válidos para
permitir la comparación estadística. Si se utiliza se debe
emplearen principio, el método de doble ciego.
Área de prueba. La parte superior de la espalda o la parte
superior del brazo, que rara vez está expuesta los rayos
UV, normalmente se seleccionan como un sitio de
irradiación.
Pigmentación inducida Un simulador solar equipado con
una lámpara de arco de xenón que tiene un espectro de
emisión continua similar a la luz solar y no muestra picos
específicos u otra fuente de luz equivalente para irradiar
rayos UV a sitios seleccionados. Las longitudes de onda
por debajo de 290 nm deben eliminarse utilizando un
filtro apropiado. La fuente de luz debe mantener una
intensidad constante de radiación durante el período de
prueba. Los rayos UV de 2-3 MEDs se irradian de
unidireccional o después de la irradiación de los rayos
UV de 1MED, la intensidad se puede ajustar dependiendo
del nivel de pigmentación inducida.
Solicitud de muestra. Cuando la intención es investigar
el efecto de prevención, se aplica una muestra
inmediatamente después de la irradiación UV. Si el
propósito es mejorar la condición de pigmentación
inducida, la muestra se aplica una o dos veces al día
durante 4-8 semanas de 2 a 3 días después de la
irradiación UV.
Evaluación del efecto despigmentante. El sitio para la
evaluación no debe de experimentar flujo de aire y debe
tener temperatura y humedad constantes. Después de
tomar un descanso de al menos 30 minutos en el sitio,
los sujetos son evaluados. El grado del efecto
despigmentante en sitios de prueba es examinado
visualmente por expertos para obtener puntajes y / o se
puede medir el grado de cambio en el color de la piel con
equipo apropiado, como Chromameter (Minolta, Osaka,
Japón),
DemaSpectrometer (Cortex Technology, Hadsund,
Dinamarca) o Mexameter (Courage-Khazaka Electronic,
Colonia, Alemania) [59].
Evaluación de eficacia en hipermelanosis
Selección de sujetos. Aquellos con pigmentación, como
pecas,lentigo o piel manchada, se seleccionan como
sujetos. Consulte los criterios descrito en 3.1.
Numero de sujetos El número de sujetos debe ser
seleccionadomás de 20 puntos de datos válidos para
permitir la comparación estadística. Si un grupo de
control, el método de doble ciego, en principio, tiene que
ser empleado.
Área de prueba. Sitios que muestran hiperpigmentación,
como llantas obrazos superiores, son seleccionados. Si se
usa una pieza de equipo para evaluación, los lugares de
irradiación deben seleccionarse teniendo en cuenta el
área mínima de pigmentación que puede medirse por
equipo.
Solicitud de muestra. La muestra se aplica una o dos
veces al día durante4-8 semanas.
Evaluación del efecto despigmentante. Consulte los
descritos en 3.1[60].
Evaluación de eficacia sobre la tasa de renovación del
estrato córneo por cloruro de dansilo prueba
Se seleccionan voluntarios sanos o mujeres sanos de
entre 18 y 60 años como sujetos para estudios clínicos.
Mujeres que están embarazadas o lactando están
excluidos. En general, los sujetos deben estar en buen
estado de salud y no puede tener trastornos de la piel o
síntomas anormales de la piel como eritema thema y
manchas negras, que pueden afectar la interpretación de
resultados. Se seleccionan cuatro sitios debajo de ambos
antebrazos para la aplicación ción de la muestra. La
aplicación de muestra se lleva a cabo de forma aleatoria
manera (lados superior e inferior de ambos antebrazos).
Cloruro de Dansyl (Cloruro de 5-metil-amino-1-
naftaleno-sulfonilo) se mezcla con vaselina para hacer
una mezcla al 5%. Antes de la aplicación de muestra, 5%
cloruro de dansilo se aplica a los sitios seleccionados
durante 15 h con el uso de parche. Los sitios
seleccionados se frotan fuertemente con el uso de un
dedo capa. Un irradiador fluorescente se usa para medir
el grado de fluo- pigmentación rescente Después de la
aplicación de 21 días de la muestra, el el grado de
desaparición de los pigmentos fluorescentes se mide
[58].
Evaluación de seguridad de los agentes
despigmentantes
Una de las cosas importantes a considerar en el
desarrollo de despigmentantes es seguridad. Para
medicamentos, porque están destinados a tratar
enfermedades, pueden ser útiles si sus beneficios o las
eficacias superan sus efectos secundarios. Sin embargo,
en el campo de cos- metics, todos los productos se
utilizan con fines de belleza. Por lo tanto, productos de
los cuales la seguridad no está establecida no pueden ser
utilizados, incluso si tienen una excelente eficacia. En
consecuencia, el problema de seguridad tiene que ser
abordado desde una etapa muy temprana en el
desarrollo de nuevos sustancias metic.
Aunque diferentes países tienen diferentes ámbitos de
seguridad evaluación aplicable a los cosméticos según la
naturaleza del sustancia, deben realizarse los siguientes
estudios: toxicidad aguda prueba de irritación cutánea y
sensibilización de la piel, prueba de irritación ocular,
prueba de fototoxicidad y sensibilización y una prueba de
parche humano.
En Además, prueba de toxicidad a dosis repetidas,
toxicidad para la reproducción, puede ser necesaria una
prueba de mutagenicidad / genotoxicidad o
carcinogenicidad, si necesario. Estas pruebas de
toxicidad se realizan a la manera de estudios in vivoies o
ensayos clínicos. Por lo tanto, los costos y el tiempo son
considerables requerido para realizar estudios
completos de toxicidad. Es deseable adoptar una buena
estrategia de diseño desde la etapa de selección para
identificar qué estudios de toxicidad deberían realizarse
para garantizar una evaluación efectiva de los agentes
despigmentantes. Para seleccionar el más estudios de
toxicidad apropiados y pertinentes, es importante
soportar las naturalezas y propiedades de las sustancias.
Para el común sustancias químicas, las toxicidades
esperadas se pueden determinar a partir de varios
informes publicados sobre las toxicidades de otros
similares sustancias.
Como muchos de los datos de toxicidad pueden estar
exentos de natural sustancias que se consideran seguras
porque han sido utilizado tradicionalmente, el cribado de
agentes despigmentantes para ser utilizado en la
fabricación de productos cosméticos está activa.
Recientemente, los estudios de toxicidad con animales
han sido restringidos por leyes, especialmente en países
europeos. Más especialmente, una ley que declara
prohibición paso a paso de los estudios en animales con
materias primas y productos cosméticos terminados se
promulgó en Europa en 2003. Como En consecuencia, se
ha vuelto difícil llevar a cabo estudios de toxicidad de
cosméticos. ics usando animales. Para superar tal
dificultad, toxicidad alternativa Los métodos de prueba
que no incluyen la experimentación con animales deben
ser desarrollado. En una etapa temprana de la detección
de nuevos agentes despigmentantes, una prueba de
citotoxicidad in vitro o una prueba HAP-CAM puede
usarse para estimartoxicidad del compañero Sin
embargo, se requieren estudios de toxicidad para
comercializar deben llevarse a cabo de acuerdo con
métodos validados recomendado por la OCDE u otras
organizaciones internacionalmente reconocidas zaciones
(Tabla III).
Observaciones finales
De varios mecanismos de la piel, los mecanismos de
hiperpigmentación nismo (el mecanismo que afecta la
biosíntesis de la melanina) ha sido investigado
activamente [61]. La melanina se sintetiza a partir de
tirosina. Sin embargo, hay varias rutas de biosíntesis,
dependiendo de las enzimas presentes y la presencia o
ausencia de materiales con un grupo -SH. Además, el
producto final puede ser eumelanina o feomelanina [62].
Además, varios factores están involucrados en la fusión
anin biosíntesis, que incluye (i) hormonas y citocinas, (ii)
enzimas, (iii) iones metálicos e (iv) interferón,
prostaglandina y tamine [63, 64]. En consecuencia, los
efectos de tales diversos factores debe investigarse
durante la proyección de una nueva despigmentación
agentes.
Sin embargo, no es eficiente ni rentable investigar todo
de los factores mencionados anteriormente. Es deseable
tomar los siguientes enfoque paso a paso al demostrar la
seguridad y eficacia de los nuevos agentes
despigmentantes. El primer paso es para cribar
sustancias candidatas mediante el empleo en métodos
de prueba in vitro que pueden probar todas las
sustancias posiblesdentro de un corto período de
tiempo. Aunque varios factores son involucrado en la
biosíntesis de melanina, la tirosinasa es la más
importante de las enzimas. Por lo tanto, la prueba del
efecto sobre las actividades de tirosinasa se ha adoptado
ampliamente para demostrar el efecto blanqueador de
nuevas sustancias candidatas (Tabla I). Además, para
detectar posturas que no están relacionadas con la
actividad de tirosinasa, anti-oxidación actividad o el
efecto en MITF u otros factores que regulan la mela- la
biosíntesis de nin puede ser investigada adicionalmente.
El segundo paso es investigar la seguridad y eficacia de
tales sustancias candidatas seleccionadas a niveles
celulares. Sustancias probadas ser altamente efectivo en
el primer paso descrito previamente puede muestran
citotoxicidad en cultivo celular o pueden no tener la
intención funcionan en las células porque no pueden
penetrar en la membrana celular. Por lo tanto, este paso
se considera esencial para demostrar la eficacia y
seguridad de los nuevos agentes despigmentantes.
Además, cocultivo de mela- los nocitos y queratinocitos
se pueden utilizar para desarrollar un nuevo depig-
agente de menting que inhibe el movimiento de
melanosomes. En esto paso, la prueba de citotoxicidad,
que es la prueba básica para la evaluación toxicidad,
debe realizarse en paralelo con la evaluación de eficacia.
El tercer paso es realizar varias pruebas preliminares
antes de estudios clínicos. Se realizan estudios in vivo
para demostrar laefecto despigmentante. Conejillos de
Indias marrones con hiperactivo piggy inducido
mentation se puede utilizar para investigar el efecto
despigmentante y anticipar las dosis apropiadas para los
sujetos humanos. Sin embargo, limi- tación en el uso de
estudios con animales se ha extendido por todo el
mundo, que conduce a la prohibición de estudios de
cosméticos o sus materias primas riales basados en
modelos animales. No son aceptables para los europeos
sensibilidades (y restricciones legales) más. Para superar
esta situación uation, un método que utiliza piel artificial
tridimensional puede ser un alternativa. En el tercer
paso, se deben realizar pruebas para determinar explotar
las estructuras y especificaciones de los agentes
despigmentantes.
Como este paso es el final para la comercialización, es
importante que las especificaciones se establecen
durante este paso. En particular, para sustancias
naturales, es esencial aislarlos y determinar sus
características estructurales para un control de calidad
adecuado en proceso de comercialización. Además, la
seguridad debe ser establecida para nuevas sustancias
sintéticas o sustancias recientemente aisladas. Neces- Se
deben llevar a cabo estudios de toxicidad sary, y
evaluación de seguridad basado en los resultados de
tales estudios se debe realizar antes de estudios clínicos.
Para los estudios de toxicidad, los métodos alternativos
tienen que ser activamente introducido, en lugar de
estudios en animales.
El último paso es demostrar el efecto despigmentante en
clínicas estudios e investigar cualquier posible reacción
adversa. Clínico las pruebas pueden incluir protocolos
para investigar la prevención de la melanina biosíntesis y
determinar si la melanina desaparece. Por lo tanto, el
protocolo más apropiado debe ser empleado,
dependiendo de el mecanismo de acción del agente
despigmentante. Como el proto- col para la irradiación
con rayos UV y para medir la inhibición de La biosíntesis
de melanina tiene las ventajas de la relativa facilidad de
reclutamiento de sujetos y regulación de la biosíntesis de
melanina, es considerado como preferible al protocolo
necesario cuando se prueban en sujetos con condiciones
de hiperpigmentación, como las pecas. Para los agentes
despigmentantes que se utilizarán en estudios clínicos, la
seguridad el problema es uno de la mayor importancia.
Es un requisito esencial para realizar estudios clínicos
después del establecimiento de la seguridad a través de
investigación del informe publicado o estudios de
toxicidad.
Como se describió anteriormente, hay varios métodos
que pueden ser utilizado para evaluar la eficacia de los
agentes despigmentantes. Por lo tanto, es importante
que los métodos más eficientes y apropiados sean
adoptado para demostrar la eficacia de un nuevo agente
despigmentante [31, 65-71]. Además, al desarrollar un
nuevo producto blanqueador que contiene una
combinación de varios agentes despigmentantes, es
deseable para seleccionar agentes despigmentantes con
diferentes mecanismos de acción en lugar de aquellos
con el mismo mecanismo. Tal combinación productos de
la nación pueden disminuir las reacciones adversas y
mostrar sinérgicos efectos.