MÉTODOS DE TINCIÓN PARA EXOPOLISACARIDOS (EPS)

La observación de exopolisacaridos con alguna técnica de microscopía óptica,

puede realizarse por diferentes procedimientos como son la observación directa de
microorganismos o el tratamiento con colorantes mediante tinción positiva y
negativa, procesos dirigidos a incrementar el contraste y por consiguiente a
optimizar el resultado.

Algunos de los métodos y las técnicas más habituales para la observación de

muestras con microscopía óptica es la tinción, lo que permite procedimientos de
observación con microscopía de fluorescencia y confocal con diferentes tipos de
fluorocromos y sondas moleculares.

TINCIÓN

Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie,

en el cual hay uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los
microorganismos y poder realizar la observación con diferentes tipos técnicas de
microscopia para su posterior análisis. La mayoría de veces se requiere este tipo de
procedimientos dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste
con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse
claramente sin algún tratamiento previo.

EXOPOLISACARIDOS

La superficie de las células microbianas es una rica fuente de contenido de

moléculas de polisacáridos como peptidoglicano, lipopolisacáridos, ácidos teicocos.
Estos polisacáridos son parte de la membrana o pared celular que dan las
características exclusivas de los microorganismos. Sin embargo, hay algunos
polisacáridos asociados o independientes de la superficie de la célula que son
excretados y han sido llamados Exopolisacaridos.

Estos exopolisacáridos extracelulares (EPS) podrán participar en la estructura

exterior de la superficie de las células microbianas por la formación de una cápsula,
en alternativa, el EPS secretado por una capa mucoide por el microorganismo ya
no está asociada a la célula y, normalmente, no contribuyen a la estructura
microbiana. Los demás componentes de la superficie de la célula no se alteran si el
exopolisacarido están ausente (Sutherland, 1990, 2001).

Los EPS, en su entorno normal, desempeñan un papel en la protección contra la

deshidratación de la célula microbiana, la fagocitosis, el ataque de bacteriófagos,
antibióticos, compuestos tóxicos (por ejemplo, iones metálicos tóxicos, compuestos
de azufre, etanol), estrés osmótico, la adhesión a superficies sólidas y la formación
de biofilm (Degeest y De Vuyst, 1999).

¿QUÉ SON LOS EXOPOLISACÁRIDOS DE BACTERIAS LÁCTICAS?

Las bacterias lácticas y las bifidobacterias se incluyen dentro de las bacterias Gram
positivas las cuales, tras aplicar el método de tinción diferencial desarrollado a
finales del XIX por Christian Gram, mantienen el colorante primario (azul) y se
distinguen de las Gram negativas que pierden el color primario y se tiñen con el
colorante secundario (rojo) debido a la diferente composición y organización
estructural de su superficie.

Figura 1. Representación esquemática de la superficie de bacterias Gram-positivas

y Gram-negativas. MC: membrana celular, PC: pared celular, ME: membrana
externa, EPS: exopolisacáridos.

Los EPS bacterianos pueden estar organizados estructuralmente de forma

compacta, formando una cápsula que presenta uniones muy fuertes a otros
componentes de la superficie celular y permanece unida a la misma. Generalmente
estas cápsulas polisacarídicas (CPS) se detectan como zonas claras que rodean a
la bacteria cuando ésta se visualiza al microscopio óptico mediante tinción negativa
(tinta China, por ejemplo).
El interés de la investigación y caracterización de los números EPS descritos hasta
la actualidad en las bacterias lácticas se debe a su relación con la modificación, bien
sea positiva o negativa, de las propiedades sensoriales (principalmente viscosidad,
textura y estructura) de los alimentos fermentados en los que se encuentran estas
bacterias productoras de EPS. Más recientemente, se ha suscitado un renovado
interés en el estudio de estos biopolímeros puesto que se les atribuyen posibles
efectos beneficiosos para la salud.

los EPS de bacterias lácticas se dividen en homopolisacáridos (HoPS) los cuales

están compuestos por un único tipo de monosacárido y hay un único enzima
implicado en su síntesis, y los heteropolisacáridos (HePS) que están constituidos
por dos o más tipos de monosacáridos, que pueden llevar unidos otras moléculas,
y en su síntesis y polimerización están implicados varios enzimas.

Estos están codificados por genes que se encuentran agrupados en el genoma.

Según el tipo de monosacárido presente, los HoPS se subdividen en fructanos
(compuestos por fructosa) y glucanos (compuestos por glucosa). Según el tipo de
enlace (α o β) y la posición que ocupa el carbono del enlace principal, existe una
gran variedad de polímeros que reciben distintos nombres y son producidos por
distintos miembros de las bacterias lácticas.

HoPS Enlace predominante (≥ Ejemplos de especies

50%) productoras
α‐glucano
Dextrano α‐D‐Glucp (1→6) Lactobacillus reuteri
Lactobacillus sakei
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus parabuchneri
Lactobacillus plantarum
Leuconostoc mesenteroides
Streptococcus mutans
Streptococcus salivarius
Mutano α‐D‐Glucp (1→3) Lactobacillus reuteri
Streptococcus mutans
Streptococcus downei
Streptococcus sobrinus
 α‐D‐Glucp (1→6) / α‐D‐
Aternano Leuconostoc mesenteroides
Glucp (1→3)
Reuterano α‐D‐Glucp (1→4) Lactobacillus reuteri
β‐glucano
→3)[β‐D‐Glcp (1→2)]‐ β‐D‐ Lactobacillus diolivorans
Glcp (1→ Pediococcus parvulus
Oenococcus oeni
Propionibacterium
freudenreichii

β‐fructano:
Levano β‐D‐Frup (2→6) Lactobacillus reuteri
Lactobacillus
sanfranciscensis
Streptococcus sobrinus
Streptococcus salivarius
Tipo β‐D‐Frup (2→1) Lactobacillus reuteri
Inulina Leuconostoc citreum
Streptococcus mutans
Tabla 1. Tipos más frecuentes de homopolisacáridos producidos por bacterias
lácticas.

TINCIÓN SIMPLE

1. Sobre el extendido seco se colocan unas gotas de azul de metileno y se deja

actuar unos minutos.
2. Se elimina el exceso de colorante lavando con agua de forma suave, con ayuda
de piseta. Se seca el extendido, para ello se pasa lentamente el portaobjeto, en
forma horizontal, sobre la llama del mechero manteniendo el extendido hacia
arriba. La operación se repite hasta sequedad total, cuidando evitar la
combustión del extendido.
3. Se observa al microscopio.
TINCIÓN DIFERENCIAL

TINCIÓN DE GRAM

La técnica de la tinción de Gram fue ideada y desarrollada por Christan Gram en el

año 1884.

Para la realización de una tinción de Gram se utilizan dos colorantes. Uno de

carácter primario, como es el cristal violeta, y otro de contraste, como la safranina.
También se utiliza un mordiente para la safranina, como es el lugol, y un decolorante
como el alcohol/acetona.

Esta tinción pone de manifiesto la afinidad tintorial de la pared, la cual depende de

su composición para que el microorganismo sea considerado gram+ o gram-. Los
microorganismos Gram positivos se diferencian de los Gram negativos en que
tienen más mureína, una pared celular Mono estratificada y presencia de ácidos
teicoicos. Los gram- tienen menos mureína, una pared celular biestratificada y no
tienen ácidos teicoicos.

Metodología.

1. Limpiar el portaobjetos con gasas y encender el mechero.

2. Colocar una gota de agua destilada y luego esterilizar el asa bacteriológica.
3. Tomar una pequeña muestra de la cepa y diluirla en el portaobjetos.
4. Posteriormente esterilizar el asa.
5. Fijar la muestra al calor flameandola en el mechero, cuidando no quemar la
muestra.
6. Colocar el portaobjetos sobre un soporte.
7. Cubrir la muestra con cristal violeta, esperar 1 minuto y enjuagar.
8. Cubrir la muestra con solución de Lugol, esperar 1 minuto y enjuagar.
9. Cubrir la muestra con alcohol-acetona, esperar que transcurran 20 segundos y
enjuagar.
10. Cubrir la muestra con safranina, esperar 1 minuto y enjuagar.
11. Dejar secar la muestra.
12. Observar en el microscopio con todos los aumentos.
13. Agregar 1 gota de aceite de inmersión y observar en el microscopio a 100x.

MÉTODO ÁCIDO RESISTENTE (ZIEHL-NEELSEN)

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos

(ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren
la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con
colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes.

Procedimiento:

 El frotis se tiñe durante unos 5 min con Fucsina fenicada aplicando calor suave.
 Lavar con agua.
 Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClH concentrado.
 Lavar y teñir durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de contraste).
 Lavar y secar.

Resultados:

Bacterias Acido Resistentes: color rojo

Bacterias No acido resistentes: color azul

TINCIÓN NEGATIVA

Es una técnica de microscopía que permite contrastar las muestras mediante una
sustancia opaca a los fotones (microscopía óptica) o a los electrones (microscopía
electrónica). En el primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para el caso
de bacterias que esporulan, esta técnica permite visualizar las esporas como entes
refringentes sobre un campo de fondo oscuro.
En caso de microscopía electrónica de transmisión, se emplean sustancias de
alto número atómico que, por tanto, resultan opacas a los electrones transmitidos.
Típicamente, estas sustancias son acetato de uranilo, citrato de plomo o molibdato
de amonio. Al electrónico, esta técnica permite visualizar virus, flagelos, bacterias y
otros entes de escaso tamaño.

COLORACION DE CAPSULAS

DEFINICIÓN DE CÁPSULAS

Muchos procariotas sintetizan polímeros orgánicos que se depositan en el exterior

de la pared celular, como una capa blanda más o menos amorfa denominada
cápsula o capa mucosa, que se pone de manifiesto claramente por tinción negativa.

Están constituidas por exopolímeros que varían en su composición. Generalmente

son homo o heteropolisacáridos como levanos, dextranos, glucanos. En el caso del
Bacillus sp. es un péptido formado por ácido glutámico.

Generalmente, las cápsulas se ponen de manifiesto mediante una tinción negativa.

Fundamento:

Las capsulas, por su característica química, no se tiñen normalmente con

colorantes como el cristal violeta o la safranina. Pero pueden observarse con una
tinción negativa, solamente se tiñe el medio circundante.

Reactivos: Tinta china

Técnica: Colocar la muestra en el porta-objeto con una gota de tinta china. Colocar
suavemente el cubre-objeto sobre la suspensión. Colocar el portaobjeto entre dos
papeles absorbentes y presionar con los dedos para que el exceso de líquido sea
absorbido por los papeles.

Interpretación: Las cápsulas se observan como aureolas de color celeste o azul

pálido alrededor de las células azul oscuro o rosado.
DETERMINACION DE BACTERIAS POR FLUORESCENCIA

Principio

El colorante Anaranjado de Acridina es un colorante fluorescente utilizado en la

determinación del ciclo celular debido a que se intercala entre el ADN y el ARN. El
colorante es útil, asimismo, para la tinción de microorganismos en muestras gruesas
o purulentas.

Procedimiento

1. Preparar un frotis de la muestra a teñir en un porta limpio.

2. Dejar secar al aire.
3. Fijar el frotis con metanol al 100 % durante 1 ó 2 min.
4. Escurrir el metanol en exceso y dejar secar el frotis.
5. Cubrir el porta con el colorante Anaranjado de Acridina durante 2 min.
6. Enjuagar completamente con agua del grifo y dejar secar.
7. Los frotis se pueden examinar inicialmente a un aumento de 100X a 400X,
utilizando un microscopio de fluorescencia.
8. Los resultados deben ser confirmados mediante examen a 1000 X, con un
objetivo de inmersión.

Resultados

Las bacterias y los hongos se tiñen de naranja brillante. El fondo aparece de color
negro a verde amarillento.
HOECHST 33342

Hoechst es un compuesto derivado bis-benzimidazol

que se une al surco menor del AND. Se utiliza con
frecuencia en microscopía defluorescencia para
colorear el ADN. Hoechst tiene un color amarillo
cuando se encuentra disuelto con agua, y emite luz
azul cuando recibe luz ultravioleta.

Hay dos tipos principales de Hoechst: Hoechst 33258

y Hoechst 33342.El Hoechst 33342 contiene un
grupo etilo en sustitución del grupo hidroxilo en terminal (un grupo etil eter), lo que
lo hace más hidrofóbico, y con menor penetración en la membrana plasmática.

NARANJA DE ACRIDINA

El fluorocromo naranja de acridina se une al

ácido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones
de naranja de acridina, el color de la
fluorescencia puede variar, dependiendo del
pH y de la concentración.

El naranja de acridina ha sido empleado

como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo
y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido
nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción.

El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los

hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de
estudios han demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja de acridina es
tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial de hemocultivos
positivos.
REFERENCIAS

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Barcelona: MASSON S.A...