Recuento de Staphylococcus aureus

-Método de recuento en placa-

A. Introducción
B. Medios de cultivo y reactivos
C. Preparación de la muestra, suspensión inicial y diluciones decimales seriadas
D. Procedimiento
E. Interpretación de los resultados
F. Entrenamiento en la distinción y recuento de colonias de Staphylococcus aureus
G. Confirmación de colonias sospechosas
H. Cálculo y expresión de resultados, en los métodos de recuento en placa con identificación.
I. Supuestro práctico
J. Contestación a las preguntas
K. Comprobar de respuestas

A. Introducción
Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por cocos (de 0,8-1,0 mm de diámetro)
Gram positivos que se dividen en más de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en
racimos. Son inmóviles y no forman esporas. Anaerobios facultativos y catalasa positivos.

Algunas cepas de S. aureus son patógenas para el hombre. Puede producir infecciones
generalizadas además de lo que se conoce como intoxicación estafilocócica. Ésta es una
intoxicación alimentaria resultados del consumo de alimentos en los que S. aureus se ha
multiplicado y producido enterotoxina/as (conocidas como Staphylococcal EnteroToxins; SET).

La dosis infectiva es alta ya que es necesario un número de al menos 106 UFC/g para producir
cantidad suficiente de enterotoxina para producir la enfermedad en el consumidor.

Es común referirse a las cepas de estafilococos coagulasa positivas y DNAsa termoestable positivas
como potencialemente productores de enterotoxinas, aunque no todas las cepas con estas
propiedades las producen realmente, sino sólo un porcentaje de ella, variable con su origen.

Dado que es un microorganismo presente en la flora normal de los animales de sangre caliente
(más del 50 % de las personas son portadoras de S.aureus en fosas nasales, garganta, manos, pelo,
etc.) y se trata de una especie muy sensible a la acción del calor y de los desinfectantes, su
presencia en determinados niveles en los alimentos indica higiene defectuosa por mala
manipulación. Si, además, los S. aureus aislados son cepas enterotoxigénicas, suponen un riesgo
para la salud.

Puede ocurrir que no se detecte S. aureus en un alimento, que el número detectado sea pequeño y
que, sin embargo, exista cantidad detectable suficiente de enterotoxina estafilocócica. En este caso,
los microorganismos que originaron la toxina han ido descendiendo en número e, incluso,
desapareciendo, mientras que la toxina, por su mayor resistencia, permanece en el alimento.
 En este ejercicio, veremos el método para el recuento en placa de Staphylococcus aureus coagulasa positivos basado en la norma ISO 6888.

B. Medios de cultivo y reactivos

-Diluyente: Generalmente, agua de peptona o triptona al 0,1%.

Aunque pueden usarse otros diluyentes dependiendo de las características de la muestra, tal y como recogen las distintas partes de la norma ISO 6887

- Agar Baird Parker (BP). Ver composición y preparación

- Caldo cerebro corazón (Brain Heart Infusión: BHI). Ver composición y preparación

- Plasma de conejo con ácido etilen diamino tetraacético (EDTA)

Plasma de conejo, desecado y titulado, que evita reacciones falsas en la prueba de la coagulasa. Este producto se adquiere en casas comerciales.

C. . Preparación de la muestra, suspensión inicial y diluciones decimales seriadas

Se llevará a cabo según la Norma ISO 6887, dependiendo del tipo de producto.

Ver más detalles sobre la preparación de la muestra en el ejercicio: "Metodos generales de recuento en placa, cálculo y expresión de los resultados"
Preparación de la suspensión inicial

Preparar la dilución inicial o dilución 10-1.

Para ello, pesar 10 gramos de muestra en una bolsa de Stomacher, previamente tarada,
mezclar con 90 mL de agua de triptona al 0,1% (x gramos de muestra + 9x mL de diluyente)
y homogeneizar en el Stomacher durante 1 a 3 minutos. El tiempo varía según el tipo de
alimento.

Preparación de diluciones decimales seriadas

A partir de la primera dilución (10-1 ó 1/10), se preparan diluciones de 1 en 10 sucesivas.

Con una pipeta o punta estéril, tomar 1 mL de la dilución inicial y añadirlo a 9 mL de agua de
triptona al 0,1%. Tendremos la dilución 10-2.

Para obtener las diluciones siguientes hay que tomar 1 mL de la dilución anterior y añadirlo a
otro tubo con 9 mL de diluyente, así hasta obtener las diluciones necesarias.
 Como hemos visto en anteriores recuentos, el número de diluciones a realizar depende de:

 Si queremos conocer la flora del alimento respecto al parámetro que estemos analizando, en cuyo caso dependerá del número de
microorganismos que se espera encontrar, cuanto mayor sea el número de microorganismos que esperamos más diluciones decimales deben
hacerse del alimento.

 Si queremos conocer si la muestra que estamos analizando cumple un límite microbiológico establecido en la legislación, en cuyo caso
dependerá del valor de dicho límite.

D. Procedimiento

Siembra placas de agar Baird Parker mediante extensión en superficie (Ver vídeo de la siembra)

Partiendo de las diluciones decimales, sembrar 0,1 ml por duplicado, en placas Baird Parker,
mediante extensión en superficie.
 Incubar a 37ºC durante 48 ± 2 horas.

Después de la incubación, examinar las placas para ver la presencia de colonias

sospechosas de S. aureus

E. Interpretación de los resultados

Crecimiento típico de S. aureus en Agar Baird Parker

Las colonias típicas de Staphylococcus aureus sobre agar Baird-Parker
sonredondas, de bordes lisos, convexas, de 2-3 mm de diámetro,
húmedas, brillantes, negras, con un borde blanco fino, rodeadas de una
zona opaca y de un halo claro de 2-5 mm.
Colonias típicas
Fundamento:

El cloruro de litio y el telurito potásico que forman parte del medio inhiben
el desarrollo de la flora competitiva; el piruvato sódico y la glicocola
favorecen el crecimiento de los estafilococos.

El medio de cultivo es opaco, debido a que se le incorpora emulsión de

yema de huevo. S. aureus sintetiza una lipasa que, al actuar sobre la
lipoproteina de la yema de huevo, produce un aclaramiento alrededor de
las colonias. Alrededor de las colonias se forma también una zona opaca
como consecuencia de la formación de un precipitado de sales de calcio y
magnesio, insoluble en ácidos grasos. Esta zona opaca se hace más visible
a partir de las 24 horas de incubación.

El aclaramiento del medio que rodea a las colonias junto con el color negro
brillante de las mismas, son las características típicas mas visibles de las
colonias típicas.

Colonias atípicas

Las colonias que no presentan ese color negro brillante o que no tienen
alrededor un halo claro de lipolisis son consideradas atípicas y desechadas.

Recuento de colonias sospechosas

 Después del periodo de incubación, examinar las placas y seleccionar las
placas que contengan hasta 150 colonias típicas de S. aureus (y hasta 300
colonias totales típicas y no típicas). Dilución Dilución 10- Dilución
Dilución 10-1
10-2 3 10-4
Para realizar el cálculo se eligen las placas de dos diluciones sucesivas 134 típicas 15 típicas 2 típicas 0 típicas
donde al menos una placa de las seleccionadas contenga un mínimo de 10 Número de 213 totales 23 totales 3 totales 0 totales
colonias típicas. Colonias 142 típicas 14 típicas 1 típicas 0 típicas
228 tota 26 totales 5 totales 0 totales
A continuación, debemos debemos hacer confirmación/identificación de las
colonias sospechosas contadas. Seleccionaremos dos diluciónes consecutivas, en este caso las
diluciones 10-1 y 10-2

F. Entrenamiento en la distinción y recuento de colonias de Staphylococcus aureus

Analice cada placa y conteste a la pregunta en la columna de la derecha haciendo clic sobre la letra (en azul) que precede a la contestación u opción que
crea correcta.
Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan :

a ) características típicas de S. aureus

b ) características atípicas de S. aureus

Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan :

a ) características típicas de S. aureus

b ) características atípicas de S. aureus

Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan :

a ) características típicas de S. aureus

b ) características atípicas de S. aureus

Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan :

a ) características típicas de S. aureus

b ) características atípicas de S. aureus

Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan :

a ) características típicas de S. aureus

b ) características atípicas de S. aureus

En esta placa de Baird Parker :

a ) aparecen colonias típicas de S. aureus

b ) no aparecen colonias típicas de S. aureus

En esta placa de Baird Parker :

a ) aparecen colonias típicas de S. aureus

b ) no aparecen colonias típicas de S. aureus

 En esta placa de Baird Parker :

a ) aparecen colonias típicas de S. aureus

b ) no aparecen colonias típicas de S. aureus

En esta placa de Baird Parker :

a ) aparecen colonias típicas de S. aureus

b ) no aparecen colonias típicas de S. aureus

G. Confirmación de colonias sospechosas

Confirmación de colonias (Ver vídeo de la prueba de la Coagulasa)

Para confirmar las colonias contadas como S. aureus es necesario comprobar que un número representativo de ellas (un 10% o un mínimo de 5) son
coagulasa positivas (es decir que dan un resultado positivo en la prueba de la coagulasa).

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. La mayoría de las cepas de Staphylococcus aureus patógenas
(enterotoxigénicas) producen esta enzima.

Las colonias típicas seleccionadas se siembran en caldo infusión cerebro-corazón, BHI (Brain
Heart Infusion) contenido en tubos.

Incubación:

Incubar a 37 ºC durante 18-24 horas.

Prueba de la coagulasa:

En un tubo de 10 x 75 mm estéril, se vierten 0,3 ml. de plasma de conejo EDTA

reconstituido.

Se añade 0,1 ml. del cultivo obtenido en caldo BHI.

Mezclar suavemente
 Incubación:

Incubar a 37 ºC y examinar a las 6 horas de incubación.

Coagulasa positiva

La reacción es positiva cuando el coágulo formado es firme.

Coagulasa negativa

La reacción es negativa cuando no se coagula el plasma.

H. Cálculo y expresión de resultados, en los métodos de recuento en placa con identificación.

Cálculo de resultados
 Del número de colonias características/sospechosas que se resiembran (A), las colonias que han dado positivo en la prueba de la coagulasa son las
colonias que responden a los criterios de identificación (b) y, por tanto se confirman como S. aureus.

A partir de los resultados de la confirmación/identificación, se calcula el número de colonias después de la identificación/confirmación (Σa), según la
siguiente expresión:

Finalmente, se calcula el número de Unidades Formadoras de Colonias por gramo o mililitro (N), según la siguiente expresión:

Ver más detalles sobre la preparación de la muestra en el ejercicio: "Cálculo y expresión de los resultados obtenidos en métodos de recuento en placa
(con confirmación posterior de las colonias sospechosas)"

I. Supuesto práctico

Se hace un recuento de S. aureus coagulasa positivos en una muestra de carne picada. Observe las placas y después conteste a las preguntas.

Los resultados obtenidos en los duplicados de este supuesto práctico han sido los siguientes

Placas de Baird Parker (Haga clic sobre la placa para verla a más aumento)

Duplicado A Duplicado B
10-1
10-2
10-3

Tras el recuento inicial de colonias sospechosas, se somete a confirmación 4 de ellas (A), los resultados obtenidos se muestran a continuación.

Resultado de la prueba de la coagulasa:

Colonia #1
 Colonia #2

Colonia #3

Colonia #4

J. Contestación a las preguntas

Una vez interpretado los resultados conteste a las siguientes preguntas haciendo clic en los radiobotones de la opción correcta

1- A la vista de los resultados, para realizar el recuento de S. aureus coagulasa positivos, qué diluciones utilizaría para calcular el número de UFC/g:
 a) Dilución 10-1 y 10-2

b) Dilución 10-2 y 10-3

c) Dilución 10-3

2- Cuál es el 'ΣC':

a) 439

b) 70

c) 7

3- El nivel de dilución correspondiente a la primera dilución retenida ha sido de:

a) 1/100

b) 1/1000

c) 1/10000

4- El número de colonias que responden a los criterios de identificación (b) son:

a) 4

b) 5

c) 1

5.- Finalmente, el Número de Unidades Formadoras de Colonia de S. aureus coagulasa positivos por gramo de muestra es:
a) N= 7 x 105 UFC/g de S. aureus coagulasa positivos

b) N= 3,5 x 105 UFC/g de S. aureus coagulasa positivos

c) N= 1,6 x 104 UFC/g de S. aureus coagulasa positivos