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1. Introducción
2. Métodos
Los lotes de setas destinados a los ensayos de rompimiento celular, pasaran por un
proceso de disminución de tamaño de los cuerpos fructíferos, por medio de un
procesamiento manual seguido de la homogeneización de las partículas. Este proceso
busca minimizar la heterogenicidad de los lotes de setas y posibilitar la comparación de
la eficiencia entre los métodos probados. Muestras de masas iguales (500 g) fueron
retiradas aleatoriamente de la muestra principal, para ser utilizadas en todas las
metodologías de rompimiento celular.
cubrir las setas, siendo estos, dejados por 10 minutos. El exceso de nitrógeno líquido fue
retirado y las setas fueron dejadas a temperatura ambiente hasta el total
descongelamiento. Posterior al descongelamiento la masa de setas fue homogeneizada
usando una licuadora industrial y el homogeneizado obtenido, sometido a
centrifugación refrigerada a 4 °C a 4000 rpm durante 10 minutos, siendo este proceso
realizado 2 x. El extracto fue almacenado en frasco obscuro en congelador doméstico a
temperatura abajo de -6°C.
(1)
Ecuación (2)
Aldrich 2013). A partir de soluciones padrón de BSA (albumina de suero bovino) (0.1-
1.4 mg/mL), se construyó una curva analítica sumándose 3 mL del reactivo de Bradford
(Sigma-Aldrich) a 0.1 mL de las soluciones padrón de proteína en tubos de ensayo que
fueron agitados en un vórtex. Pasados 10 minutos de reacción las muestras padrón
fueron llevadas a lectura en espectrofotómetro a 595 nm (Fentom X 800).
Después de la construcción de la curva analítica, una alícuota de 0.1 mL de los
extractos enzimáticos, previamente diluída 1:10, en tampón fosfato de sódio pH 6, fue
adicionada a un tubo de ensayo conteniendo 3 mL do reactivo de Bradford y llevada a
lectura en espectrofotómetro después de 10 minutos de reacción.
El cálculo do concentración de proteínas fue hecho en base a la ecuación de la
reta de la curva de calibración linear:
Ecuación (3)
3 Resultados y discusión
3.1. Rompimiento celular: actividad enzimática y concentración de proteínas de los
extractos
Permeabilización con
acetona/congelamiento- 90 ±7,1 2363 ± 64,4 0,51 ±0,01
descongelamiento
Permeabilización con
Trito X-
100/congelamiento-
410 ±14,1 169 ± 22,9 0,11 ±0,01
descongelamiento
Congelamiento-
descongelamiento con 230 ±28,3 63 ± 8,8 0,69 ±0,02
N2 líquido
Los resultados de los métodos de purificación parcial con sulfato de amonio y acetona
están sumarizados en la Tabla 2:
Parcialmente
purificado con 4812 ±149,8 3,8 ±0,08 86,25
acetona
4. Conclusión
De entre los métodos de extracción de la enzima tirosinasa a partir del macro hongo
Agaricus bisporus, probados, la permeabilización con acetona fue el más eficiente,
resultando en extractos con las mayores actividades enzimáticas, con menor volumen de
extracto, lo que resulta en mejor relación costo benefício para la etapa de precipitación
de proteínas. Los ensayos de purificación parcial indicaron la mayor eficiencia en
términos de actividad recuperada para el método con la sal sulfato de amonio. La mejor
temperatura de almacenamiento fue a -6 °C con poca variación de la actividad total a lo
largo de 96h.
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