LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

ESCUELA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

CARACTERIZACION BIOQUIMICA DE
ENTEROBACTERIAS Y BACILOS
Diana Lorena Armero (1224770) lorena_armero89@hotmail.com
Diego Felipe Mancilla (1040205) pipemancilla_jf@hotmail.com

RESUMEN
Se realizó el análisis microbiológico de una bebida de frutas “Salpicon” (es una
combinación de variadas frutas cortadas en trozos pequeños, aderezada con azúcar y
zumo de frutas), del cual se tomó una muestra de aproximadamente 10 g, la muestra se
homogeneizó con agua peptonada en un triturador Luego se realizaron diluciones de 10-1
a 10-5 en tubos que contenían agua peptonada y en cajas de Petri Esteriles. Para el
número más probable de coliformes totales y fecales, se pipeteo 1 mL de cada una de las
diluciones (10-1 a 10-3) a tubos con caldo de lauryl sulfato por triplicado y se dejó incubar
por 48 horas a 37°C, posteriormente se observó la producción de gas y se agregó el
reactivo de Kovacs para determinar la existencia de coliformes totales. Para el recuento
de mesófilos, enterobacterias, hongos y levaduras se tomaron las disoluciones (10-3 a 10-
5
) y se colocaron en cajas de petri estériles, posteriormente se diluyeron con agar (PCA),
para mesófilos. Agar cristal violeta para enterobacterias y Saboraud para hongos y
levaduras, se dejó incubar por 48 horas a 37°C y se realizó el conteo respectivamente.
Para la prueba de oxidasa se tomó una colonia de una placa de recuento de
enterobacterias (Agar cristal violeta) y se sembró en superficie en agar nutritivo, luego
incubó por 48 horas a 37°C posteriormente se tomó una colonia de este con un palillo y se
extendió en una tira de bactident oxidasa.

Palabra Clave: Coliformes, Enterobacterias, Mesofilos, saboraud, lauryl sulfato.

INTRODUCCION

MATERIALES Y METODOS
Homogenización de la muestra
En una probeta se midió 10mL de Salpicón y se agregó con agua peptonada a una bolsa
estéril. Posteriormente la bolsa se llevó al homogeneizador también conocido como
stomacher, que dispone de dos paletas que se encargan de golpear el alimento
contenido en la bolsa, el tiempo de homogenización fue determinado por el personal del
laboratorio teniendo en cuenta la muestra y evitando alterar la flora microbiana presente.
En la figura 1 se presenta la muestra en el homogeneizador (Stomacher).
 Figura 1. Homogenización de la
Muestra de salpicón

Preparación de Diluciones
Para prepara la dilución 10-1: de la muestra homogenizada se tomó 1ml con pipeta
volumétrica y se llevó a un tubo de ensayo que contenía 9mL de diluyente, de este tubo
se tomó 1mL y se transfirió a otro tubo que contenía 9ml de diluyente obteniendo la
dilución 10-2, de este tubo se tomó 1ml y se preparó la dilución 10-3.

Número más probable para coliformes totales y fecales

Prueba presuntiva para coliformes totales:
Se pipeteó 1 ml de las diluciones 10-1 a 10-3 en tubos con caldo lauryl sulfato y se
incubaron por 48 horas a 37ºC.
Prueba confirmativa para coliformes totales:
Se confirmó los tubos positivos con producción de gas en la prueba presunta.
A los tubos incubados se les adicionó reactivo de Kovacs, se agito suavemente y se
observó la posible formación de un anillo rojo en la suerficie (Prueba psotiva), para
confirmar si los microrganismos son capaces de degradar triptófano y producir indol.

Recuento de mesófilos (Agar cuenta gérmenes):

Se tomó alícuotas de 1mL con una pipeta volumetrica de las diluciones de 10-3 a 10-5 y se
adicionaron a 3 cajas de Petri estériles y previamente marcadas (PCA), posteriormente se
adicionó el agar cuenta gérmenes fundido a una temperatura de aproximadamente 45°C.
Se mezcló el inoculo con el medio fundido aplicando movimientos suaves a la caja en
forma circular, se dejó solidificar y se invirtió la caja de Petri para incubar por 48 horas a
una temperatura de aproximadamente de 37°C.

Recuento de Enterobacterias totales:

Se transfirió alícuotas de 1ml de cada una de las diluciones 10-3 a 10-5 a 3 cajas de Petri,
Esteriles y previamente marcadas. Se vertió el agar cristal violeta y se mezcló las
diluciones con el medio. Despues de la solidificación, se incubo por 48 horas

Prueba de Oxidasa:
De la prueba de recuento de enterobacterias totales se tomó una colonia del agar cristal
violeta y se sembró en superficie en agar nutritivo, se dejó incubar por 48 horas y
posteriormente se tomó una colonia de este con un palillo y se extendió en una tira de
bactident oxidasa marca Merck.

Recuento de hongos y levaduras:

Se transfirió alícuotas de 1ml de cada una de las diluciones 10-3 a 10-5 a 3 cajas de Petri,
Esteriles y previamente marcadas. Se adicionó agar Sabouraud fundido y se mezcló
suavemente las diluciones con el medio. Después de la solidificación, se incubo por 48
horas.

RESULTADOS Y DISCUSION
Número más probable para coliformes totales y fecales
Después de 48 horas de incubación se observó una producción de gases en los tubos con
caldo lauryl sulfato, ver figura 4, para los tres tubos de las diluciones de 10-1 a 10-3,
obteniendo un resultado positivo para la prueba presuntiva para coliformes totales.

Producción de
gases

Figura 2. Tubos con caldo de lauryl sulfato

Después de 48 horas de incubación
(10-1 a 10-3)

En la figura 3, se presenta un zoom fotográfico de como se observa los resultados de una

prueba presuntiva para coliformes totales (Producción de gases)
 Producción de gases

Figura 3. Produccion de gases.

Prueba presuntiva para coliformes totales

Para la prueba confirmativa de coliformes totales se aplicó a cada uno de los tubos el
reactivo de kovacs; en todos los tubos de las distintas diluciones se observó un resultado
positivo, se presentó un anillo rojo, como se presenta en la figura 4.

Figura 4. Tubos con caldo de lauryl sulfato con

El reactivo de kovacs (10-1 a 10-3)

Interpretación de resultados
De acuerdo a la tabla del índice NMP con límites de confianza del 95% los resultados de
la prueba fueron para los triplicados de las tres diluciones fueron positivos 3-3- 3, el NMP
de mayor o igual a 2400/g.
En esta prueba se utilizó el caldo lauryl sulfato, medio de cultivo selectivo y de
enriquecimiento para la investigación de coliformes, que en principio la peptona
proporciona al medio los nutrientes necesarios para el crecimiento rápido de los
microorganismos. Los fosfatos controlan el pH del medio y el cloruro de sodio ayuda a
mantener el equilibrio osmótico.

Recuento de colonias
Se asume que cada una de las colonias que se crece sobre el medio de cultivo proviene
de
Una célula viable, aunque esto no puede ser totalmente cierto debido a que las colonias
pueden prevenir de pares, cadenas o grupos de células que no están completamente
aisladas.
Para realizar el cálculo de número de células por mL o g sobre la muestra original no es
muy recomendado, y es por esto que es necesario realizar diluciones de la muestra, que
matemáticamente los resultados son más manejables. Las diluciones más comunes son
10-1 ,10-2 y 10-3 que es lo mismo que decir 1/10, 1/100, 1/1000.
Argumento matemático:

1𝑚𝐿 (𝑔)𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 1𝑚𝐿 (𝑔) 1𝑚𝐿(𝑔) 1

= = = = 10−1
1𝑚𝑙 (𝑔)𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 + 9𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒 1𝑚𝐿(𝑔) + 9𝑚𝐿 10𝑚𝐿 10

(Black, 2002) (Venegas, 2004)

También se puede reportar las unidades formadoras de colonias (ufc) / g Asi:

Ejemplo:
Dilución 10-2
Caja1: 250 colonias
Caja 2: 238 colonias
250 + 238
= 488 (𝑀𝑒𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑎𝑟𝑖𝑡𝑚𝑒𝑡𝑖𝑐𝑎)
2

INFORME: 488ufc/g o mL x 102

Reglas para el conteo de colonias

1. Rango entre 30 – 300 colonias por placas:
Esta forma se aplica cuando el reconteo contempla un número de microorganismos de
diferentes tipos. Ejemplo: Rec. De aerobios mesofilos, de psicrófilas, termófilos

2. Rango entre 20 – 300 colonias por placas:

Esta norma se emplea cuando el reconteo contempla un número de bacterias que
presentan alrededor de su crecimiento una reacción enzimática. Ejemplo: Rec.
Staphylococcus areus, Bacillus cereus y coliformes

3. Rango entre 10 – 100 colonias por placas:

Esta norma se aplica cuando el reconteo contempla un número de microorganismos con
características maroscopicas importantes. Ejemplo: Hongos y Levaduras. (Salgado, 2006)

Recuento de mesófilos:
Tras la inoculación en agar Cuenta Gérmenes y la posterior incubación a 37°C se realizó
Un conteo de colonias. Obteniendo los siguientes resultados:

PCA 10-5 = menos de 30 colonias (18)

PCA 10-4 = 75 colonias

PCA 10-3 y PCA 10-5 No se encuentran entre el rango de 30 a 300 colonias

Cálculos:
PCA 10-4 = 75 colonias (75x104 = 75000 = 7.5x105)
750000 ufc/mL

Esto es demostrable en la figura 5 donde se observa una cantidad de colonias dentro de

la placa de PCA 10-4, entre 30 y 300, para los cuales el método del número más probable
es insuficiente.

Figura 5. Placa petri para el recuento de mesófilos

Después del periodo de incubación (10-4)

Otros microorganismos mesófilos como el Staphilococcus aerus producen toxinas que

pueden ser tan peligrosas como la misma presencia de ellos (Madigan, 2003).

Recuento de Enterobacterias totales

La familia Enterobactereacea comprende un número muy variado de géneros y especies
bacterianos cuyo hábitat natural es el tubo digestivo del hombre y los animales. No todos
los bacilos Gram negativos que tienen este hábitat forman parte de la familia
Enterobacteriaceae . Se los encuentra en el suelo, agua, frutas, vegetales y otras plantas
y en los animales desde los insectos al hombre (Albino, 2008).
Se realizó el recuento de enterobacterias totales todas las diluciones de 10-3 a 10-5,
Obteniendo los siguientes resultados:

Cristal Violeta 10-5 = 1 colonia (1,0x105)

Cristal Violeta 10-4 = 7 colonias (7,0x104)

Cristal Violeta 10-3 = 47 colonias (4,7x104)

En la figura 6, se presenta la cantidad de colonias dentro de la placa de Cristal Violeta

10-3, donde se realiza un conteo de 47 colonias.

Figura 6. Placa petri para el recuento de Enterobacterias

Después del periodo de incubación (10-3)

Recuento de Hongos y Levaduras

Los hongos son organismos que pueden alterar los alimentos; en ocasiones la
degradación es visible al ojo humano y en ocasiones los hongos se reproducen y forman
micotoxinas que son sustancias tóxicas perjudiciales para la salud. Las levaduras al igual
que los mohos pueden producir alteraciones en los alimentos sobre todo en aquellos con
pH bajo. (Ministerio Agricultura, 2001).

En el recuento de Hongos y Levaduras de todas las diluciones de 10-3 a 10-5, se

obtuvieron los siguientes resultados:

Saboraud 10-5 = 147 colonias más 1 colonia invaciba (147x103)

Saboraud 10-4 = 54 colonias (5,4x105)

Saboraud 10-3 = 10 colonias (menos de 30 colonias)

PREGUNTAS
1. ¿Cuál es fundamento de las diferentes pruebas que ha realizado?
Mesófilos:
En el recuento de microorganismos mesofilos se estima la flora total, pero sin especificar
los tipos de gérmenes. Esta determinación refleja la calidad sanitaria de los productos
analizados indicando, además de las condiciones higiénicas de la materia prima, la forma
como fueron manipuladas durante su elaboración.
Tienen un valor limitado como indicador de presencia de patógenos o sus toxinas. Un
recuento total de mesofilos bajo no asegura que un alimento esté exento de patógenos o
sus toxinas. (Pascual, 2000)
Este recuento se considera como indicador del grado de contaminación de los alimentos
en cualquier etapa del proceso de producción, permite también obtener información sobre
la alteración incipiente de los alimentos y su probable vida útil (Merck, 2002).

Enterobacterias:
El recuento total de enterobacterias se utiliza como indicador de contaminación fecal, y
como uno de los indicadores de Buenas Prácticas de Fabricación. Se utiliza como
indicador de la calidad microbiológica de alimentos procesados, y recuentos elevados
señalan una elaboración inadecuada o una contaminación posterior, o ambas cosas a la
vez; siempre implica un riesgo higiénico-sanitario. (Vandevenne, 2002)

Hongos y levaduras:
En estos medios la peptona es la fuente nitrogenada para el crecimiento de hongos y
levaduras, el carbohidrato es la fuente energética. El agar Sabouraud corresponde a las
recomendaciones de la USP y de la Ph. Eur. Para recuento de hongos y levaduras, ya
que se trata de un medio que suministra todos los requerimientos necesarios. La maltosa,
cumple con los requerimientos nutritivos, de forma general de hongos y levaduras
patógenos y no patógenos (panreac, 2005).

2. ¿Cuáles son los componentes de cada uno de los medios de cultivo que se
utilizan?.
La composición de 1 litro de agar cuenta gérmenes:
Peptona de caseína: 5.0g Extracto de Levadura. 3.0g Lactosa: 10.0g Tergitol 7: 0.1g Azul
de bromotimol: 0.025g Agar: 15g Agua destilada 1000mL (Panreac, 2005)

La composición de 1 litro de agar cristal violeta:

Extracto de Levadura 3.0 g Peptona de Gelatina 7.0 g Mezcla de Sales Biliares 1.5g
Lactosa 10.0g Cloruro de Sodio 5.0g Rojo Neutro 0.03 g Cristal Violeta 0.002g Agar
Bacteriológico 15.0g Agua destilada 1000mL (MCD lab, 2008)

La composición de 1 litro de agar Sabouraud:

Dextrosa 20g Peptona 10g Agar 18g Agua destilada 1000ml (Cañedo y Ames, 2004)

BIBLIOGRAFIA

- Albino, G. Recuento de Enterobacterias Totales. Universidad nacional Pedro Ruiz

Gallo. (Perú, 2008)

- Black, J.G. Microbiology-Guide of laboratory. Fifth edition, USA – 2002, pág. 215-
219

- Cañedo V., Ames, T. Manual de laboratorio para manejo de hongos

entomopatógenos. Centro Internacional de la Papa. (Lima, 2004). Pag.19

- Madigan, M Brock, T. D Martinko J. M., Parker, J. Brock biología de los

microorganismos. Editorial Pearson. 10 Edición (2004) Pág. 82-85

- MCD lab. Especificaciones agar bilis y rojo violeta.(2008). Obtenido el 5 de junio

de 2012

- Merck (2002). Merck Microbiology Manual. 12 Edición

- Ministerio de Agricultura y Ganadería. (2001) Manual de Procedimientos para el

control microbiológico de alimentos. Instituto Interamericano de Cooperación para
la Agricultura. Asunción. Pag.34.
- Panreac. Manual básico de Microbiología, Ingredientes - Medios deshidratados -
Placas preparadas Frascos preparados - Tubos preparados – Laminocultivos.
(2005)

- Pascual, Maria.R. Microbiología Alimentaria: Metodología Analítica para Alimentos

y Bebidas. Editorial Diaz de Santos. (España, 2000) pág. 13.

- Salgado, Maria.T. Microbiologia de los alimentos. Editorial Universidad de Caldas.

(Colombia, 2006), pág. 33

- Vandevenne, Corrie. Metodos de análisis Microbiologicos de los alimentos.

Editorial Diaz de Santos. (España, 2002) pág. 72,73

- Venegas, Maria.C. Guias para el laboratorio de microbiología de alimentos.

Editorial Universidad de Caldas. (Colombia, 2004), pág. 7-24