PRACTICA 1.

LAVADO Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES

I.-INTRODUCCION.- Los microorganismos pueden producir enfermedades cuando

infectan personas, animales y plantas y cuya gravedad oscila entre una infección débil,
intoxicación e incluso la muerte. Pueden contaminar los alimentos y producir cambios
físicos y químicos en ellos, haciéndolos en algunos casos incomibles e incluso venenosos.
Los microorganismos son responsables también de la alteración de muchos otros
materiales, generando graves pérdidas económicas. Por ello es indispensable disponer de
procedimientos para controlar la contaminación y el crecimiento microbiano. Las
principales razones para controlar la contaminación y el crecimiento microbiano. Las
principales razones para controlar a los microorganismos pueden resumirse de la siguiente
forma:

• Para evitar la transmisión de las enfermedades y las infecciones.

• Para eliminar los microorganismos de un hospedador que está infectado.

• Para eliminar microorganismos de diferentes materiales y así evitar su deterioro y

alteración.

II.-OBJETIVOS

• Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización de materiales de vidrio y

medios de cultivo de uso común en microbiologia

• Conocer el efecto que causa cada uno de los agentes de control microbiano sobre la célula

III.-MARCO TEORICO.- Los microorganismos pueden ser eliminados, inhibidos o

muertos por agentes físicos, agentes químicos, o por procesos físicos y agentes
quimioterapéticos. Se dispone de una gran variedad de técnicas y agentes que actúan de
maneras diferentes y cada uno tiene su aplicación y límite de uso.

Un agente físico es una propiedad o condición que causa un cambio, por ejemplo la
temperatura, la presión, radiación y los filtros.

Un agente químico es una sustancia que causa una reacción específica y que se caracterizan
por una estructura molecular típica, por ejemplo tenemos los compuestos fenólicos, los
alcoholes, alógenos (cloro y yodo), aldehídos, oxido de etilo, fenoles.

Un proceso físico es un procedimiento que causa un cambio, por ejemplo la filtración la

esterilización, incineración, higienización.

Se utilizan varios términos específicos para escribir a estos agentes y procesos:

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Esterilización: El proceso que destruye todas las formas de vida se llama esterilización. Un
objeto estéril, en sentido microbiológico esta libre de microorganismo vivos. Un objeto ó
una sustancia está estéril ó no está estéril; no puede estar nunca semiestéril o casi estéril.

Desinfectante: Un agente, usualmente un producto químico que mata las células

vegetativas pero no necesariamente las formas esporuladas de los microorganismos
productores de enfermedades, se denomina un desinfectante. El término se aplica
comúnmente a sustancias usadas sobre objetos inanimados. La desinfección es el proceso
mediante el cual se destruyen las células vegetativas pero no necesariamente las esporas de
los agentes infecciosos.

Antiséptico: Una sustancia que se opone a la infección (sepsis) o previene crecimiento o

acción de los microorganismos, bien sea destruyendo o bien inhibiendo su crecimiento ó
actividad, se denomina un antiséptico. El término está usualmente asociado a sustancias
aplicadas al cuerpo.

Higienización: Un agente que reduce la población microbiana hasta niveles que se juzgan
seguros para las exigencias de la salud pública se denomina un higienizante crecimiento.
Los higienizantes suelen aplicarse a objetos inanimados y generalmente se emplean.
Usualmente es un agente químico que mata el 99.9% de las bacterias en en el cuidado
diario de equipos y utensilios en las plantas lecheras y de preparación de alimentos, así
como para los vasos, platos y utensilios en los restaurantes. El proceso de desinfección
producirá higienización. Sin embargo en el sentido estricto, higienización implica una
condición sanitaria ó de limpieza cosa que la infección no implica necesariamente.

Germicida (microbicida): Un agente que mata las células vegetativas pero no

necesariamente las formas esporuladas de los gérmenes se llaman germicida (microbicida).
En la práctica, germicida es casi sinónimo de desinfectante. Pero un germicida se usa
generalmente para toda clase de gérmenes microbios y para cualquier aplicación.

Bactericida: Un agente que mata las formas vegetativas de las bacterias. Del mismo modo,
los términos fungicida, viricida y esporocida se refieren a agentes que matan a los hongos,
virus y esporas respectivamente.

Bacteriostasis: Una condición en la que se previene (se inhibe) el crecimiento de las

bacterias se denomina bacteriostasis (adjetivo: bacteriostático. Del mismo modo,
fungistático describe la acción de un agente que detiene el crecimiento de los hongos. Los
agentes que tienen en común la capacidad de inhibir los crecimientos de los
microorganismos se designan colectivamente, como agentes microbiostáticos.

Agente Antimicrobiano: El término de agente antimicrobiano se refiere a un agente que

interfiere con el crecimiento y metabolismo de los microbios. En el uso común, el término
denota inhibición de crecimiento y cuando se refiere a grupos específicos de organismos,

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suelen usarse con frecuencia los términos tales como antibacteriano ó antifungico. Algunos
agentes antimicrobianos se utilizan específicamente para el tratamiento de infecciones,
estos se denominan agentes terapéuticos.

TEMPERATURA

Es un factor de enorme importancia ya que la temperatura influye mucho en las velocidades

de reacción de todos los procesos químicos metabólicos ligados al crecimiento de todo
organismo. El aumento o la disminución de la temperatura pueden retardar en algunos
casos el crecimiento, e incluso pueden destruir al microorganismo contaminante. La
temperatura es una magnitud que expresa el nivel de calor que sufre un cuerpo, entonces, el
control de microorganismos por aumento de la temperatura es igual que por el aumento de
calor del medio donde se encuentra.

Es bien sabido que todos los organismos dependen del agua, la mayoría de su masa total es
agua y todas las actividades metabólicas se realizan en medios acuosos (por ejemplo el
citoplasma).

Así pues, la utilización de calor es un método bueno para lograr la esterilidad de los medios
de cultivo, materiales y otros elementos, pero la combinación de la temperatura (calor) y
agua (humedad) puede ser aplicado para la esterilización más efectiva de diferentes
elementos y materiales. Los métodos más usados en el control de microorganismos con la
temperatura incluyen el calor húmedo, el calor seco.

Calor húmedo:

El efecto que causa este calor es matar al microorganismo por la coagulación de sus
proteínas cuando se encuentran en una zona atmósfera húmeda y sometidos a altas
temperaturas, además, es mucho más rápido y efectivo en su acción.

La acción letal del vapor proviene del calor latente liberado cuando se condensa en una
superficie fría aumentando de esta manera la temperatura de la zona enfriada. La
destrucción de las esporas bacterianas sigue un comportamiento de forma similar en tanto
que el vapor se condensa en la pared de la espora y aumenta su contenido en agua que
finalmente hidroliza y degrada el contenido proteico.

El uso de temperatura de 100ºC se logra con el uso de equipos especiales (Autoclave) que
combinan el efecto de la temperatura con la presión. El uso de vapor de agua a
temperaturas de 121ºC por 15 minutos mata todos los microorganismos incluyendo las
esporas bacterianas. Este proceso es el principio que aplica el autoclave y la olla a presión
en los laboratorios de control microbiologíco.

Calor seco:

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En una atmósfera seca, totalmente exenta de humedad, las bacterias como muchas proteínas
son más resistentes y no mueren hasta que tiene lugar la oxidación de sus componentes, lo
cual ocurre a temperaturas mucho más elevados que la que se requiere para coagular las
proteínas.

IV.-MATERIALES Y EQUIPOS

 Papel Craff
 Pavilo
 Detergente
 Cajas Petri
 Pipetas
 Detergente
 Agua Destilada
 Piceta
 Autoclave
 Horno (Estufa)

V.-PROCEDIMIENTO.-

1.-Lavar perfectamente las cajas Petri y las pipetas con escobillon y detergente. Enjuagar
con abundante agua corriente.

2.-Excurrir el exceso de agua y enjuagara el material con agua destilada con una piceta por
las paredes interiores. Dejar excurrir el agua sobre papel craff.

3.-Una vez seco el material se procederá a envolver las cajas Petri y pipetas con papel craff.
Para los tubos y matraces se elaboraran tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten
con holgura, sobre los que finalmente se les colocara un capuchón de papel craff.

4.-Para la esterilización en autoclave (Calor húmedo) se coloca los materiales dentro de la

canastilla se tapa y se coloca a una temperatura de 121 °C hasta que suba a 15 libras de
presión por 15 minutos. Una vez que la presión baje a 0 se deja escapar el vapor restante y
se abre el autoclave para sacar los materiales.

5.-Para la esterilización en horno (Calor Seco) se coloca losmateriale dentro del horno y se
coloca a una temperatura de 150 °C por dos horas.

6.-Cuando se quiera utilizar se debe hacer en condiciones asépticas abrir el papel con
cuidado para no contaminar los materiales ya esterilizados.

VI.-RESULTADOS.-

VII.-CONCLUSIONES.-

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VIII.-RECOMENDACIONES.-

IX.-BIBLIOGRAFIA.-

-Cappuccino, James G. and Sherman Natalie. 2005. Microbiology: a laboratory manual. 7th
edition. Pearson/Benjamin Cummings. USA. QR63 C36 2005

-Leboffe Michael J. and Burton E. Pierce. 2006. Microbiology laboratory theory and
application. 2nd edition, Morton Publishing Co. USA. QR63 L43 2006.

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PRACTICA 2. MEDIOS DE CULTIVO

I. INTRODUCCIÓN

Un medio de cultivo es cualquier sustancia cuyo interior o sobre la cual pueden

desarrollarse los microorganismos en el laboratorio.

El desarrollo o cosecha de microorganismos obtenidos en el medio se denomina cultivo,

cuando los microorganismos de un cultivo son de la misma especie, se dice que es un
cultivo puro; cuando dos o más especies de microorganismos se desarrollan en un medio, se
le conoce con un cultivo mixto; si un cultivo contiene accidentalmente más de una especie
de microorganismos, se habla de un cultivo contaminado.

II. OBJETIVOS

Demostrar que los gérmenes tienen requerimientos nutritivos variados, los que son tomados
en cuenta al preparar un medio de cultivo.

III. MARCO TEORICO

Composición de un Medio de cultivo

a. a. Sustancias nutritivas apropiadas (proteinas, carbohidratos, sales minerales,

agua, etc.)
b. Tener un pH conveniente; generalmente de 6.8 a 7.6.
c. Estar previamente esterilizados.
d. Estar protegidos de contaminación.

Finalidad de los medios de cultivo

a. Aislamiento de gérmenes
b. Identificación
c. Conservación de bacterias
d. Clasificación
e. Obtención de toxinas
f. Recolección o cosecha para preparación de vacunas.

Clasificación de los medios de cultivo

A. Por su naturaleza: Pueden ser:

1. Naturales.- En la naturaleza existen varias sustancias que pueden utilizarse como

medios de cultivo, Ejm. La sangre, la leche, o el suero sanguíneo estéril que se
usa para cultivar bacterias patógenas.

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 2. Artificiales.- Pueden estar compuestos por gran variedad de materias y se
subdividen en :
- Sintéticos.- Son medios cuya composición química es conocida. Ejm :
aminoácidos, azucares, vitaminas.
- No sintéticos.- Son medios cuya composición química es desconocida.
Ej.: leche, extracto de levadura, etc.

Los medios sintéticos y no sintéticos se clasifican en:

a. Medios Líquidos.- Ej.: el caldo nutritivo

b. Medios Sólidos .- Pueden ser:
 Reversibles o licuables: Cuando a temperaturas corrientes de 20 ºC
permanecen sólidos, pero que pueden ser licuados mediante aplicación
de calor sin alterar sus características nutritivas. Ej.: Agar Nutritivo,
Agar Mac Conkey.
 Irreversibles y no licuables: Son aquellos que una vez solidificados
no pueden ser licuados nuevamente por medio de calor, porque tienen
elementos termolábiles en su constitución. ej.: Agar sangre, agar huevo,
etc.

B. Por la función que desempeñan.- Pueden ser:

1. Comunes.- Permiten el desarrollo indiscriminado de todo tipo de microorganismos.

ej.: Agar Nutritivo, Caldo Nutritivo, Agar Plate Count, Gelatina, etc.
2. Especiales.- Pueden ser:
a. Medios mejorados.- Son aquellos a los que se les agrega determinadas
sustancias nutritivas como sangre, yema de huevo; las cuales estimulan las
exigencias nutritivas de ciertos microorganismos. ej.: Agar sangre, caldo suero,
agar suero, etc.
b. Medios Selectivos.- Se caracterizan por poseer en su composición sustancias
que favorecen el desarrollo de determinados microorganismos, inhibiendo el de
otros. Ejm. Agar SS, agar Baird Parker, agar mac Conkey, etc.
c. Medios diferenciales.- Son los que ponen de manifiesto algunas
propiedades bioquímicas del microorganismo como formación de gas, cambios
en el pH, fenómenos de óxido- reducción, etc. ej.: Agar gelatina, caldo
nitratado, agar Kliger, caldo glucosado, etc.

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Composición y preparación de algunos medios de cultivo

A. Medios Líquidos

a) Caldo Nutritivo

- Extracto de carne (Bacto-Geef Extract) 3 gr.

- Peptona ( Bacto-Lactose) 5 gr.
- Agua destilada 1000 ml.

b) Caldo Lactosa

- Extracto de carne 3 gr.

- Peptona 5 gr.
- Lactosa (Bacto-Lactose) 5 gr.
- Agua destilada 1000ml

c) Agua peptonada de Koch

- Peptona 10 gr.
- Cloruro de sodio 5 gr.
- Agua destilada 1000 ml

B. Medios Sólidos

a) Agar Nutritivo

- Extracto de carne 3 gr.

- Peptona 5 gr.
- Agar 15 gr.
- Agua destilada 1000 gr.
- pH 7.0 - 0.1

b) Gelatina Nutritiva

- Peptona 5 gr.
- Extracto de carne (Bacto Beef Extract) 3 gr.
- Gelatina 120 gr.
- Agua destilada 1000 ml.
- pH 7 - 0.1

c) Agar Sangre

El agar sangre es una combinación de un agar base (agar nutritivo) con el agregado de 5 %
de sangre ovina, también puede usarse sangre humana, para cultivos en una placa de Agar.
El agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa también para ver la

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capacidad hemolítica1 de los microorganismos patógenos (que es un factor de Virulencia).
Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se determina el tipo de
hemólisis que posee:

 Alfa: halos verdosos (oxidación de la hemoglobina de los glóbulos rojos a

metahemoglobina en el medio)
 Beta: halos incoloros (hemolisis total)
 Gamma: inexistencia de halos (sin hemolisis)

COMPOSICIÓN

- Infusión de corazón de buey (Beef Herat Infusión From) 3 gr.

- Peptona 10 gr.
- Cloruro de Sodio 15 gr
- Agar 15 gr.
- Agua destilada 1000 ml.

IV. MATERIALES Y EQUIPOS

4.1. Materiales

 Tubos de ensayo
 Placas Petri
 Probetas
 Matraz de Erlenmeyer

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La hemólisis (eritrocateresis) es el fenómeno de la desintegración de los eritrocitos (glóbulos rojos o
hematíes).

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  Mecheros
 Tuberculina de 10 ml (2 unidades)
 Piceta
 Agua destilada
 Materiales considerados en la práctica N° 1.

4.2. Equipos

 Autoclave
 Estufa

V. PROCEDIMIENTO

1. Pesar las sustancias indicadas en las formulas respectivas, calculando

las cantidades en relación con los volúmenes requeridas.
2. Disolverlas en la cantidad de agua destilada necesaria llevando a 45 a 50°C.
3. Filtrar si es necesario, enfriar moderadamente y ajustar el pH entre 6.8 y 7.4 u
otro que fuera indicado.
4. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ºC.
5. El medio estéril se enfría rápidamente a 45 – 50 ºC y mientras todavía se
encuentra líquido, se le añade de forma aséptica 5% de sangre estéril
desfibrinada; se mescla bien evitando que se incorporen burbujas de aire.
6. Repartir en placas Petri previamente esterilizados, siempre frente a una llama
(Mechero de Bunsen o alcohol). Para una mejor conservación de la placa de
Agar Sangre y para obtener halos hemolíticos más claros ajustar el pH a 6,8
±0,2.

Los medios sólidos se reparten en placas Petri o en tubos de prueba teniendo

cuidado de darles la inclinación que deben tomar al tiempo de ser empleados
antes de que enfríen y solidifiquen.

Los medios líquidos se reparten en tubos de prueba en ambiente estéril.

7. Incubar a 37º C de 24 a 48 horas.

Al final, el medio queda listo para su empleo y se almacenará de preferencia en la

nevera. También pueden almacenarse al medio ambiente. Es deseable guardar los
medios preparados en bolsas de nylon herméticamente cerradas para evitar un
deterioro muy rápido por disecación.

VI. RESULTADOS

VII. CONCLUSIONES

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VIII. RECOMENDACIONES

XI. BIBLIOGRAFIA

XII. CUESTIONARIO

1. ¿Por qué es importante determinar el pH de un medio de cultivo?

EJEMPLOS PARA LA INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

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