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Artículos

https://doi.org/10.1038/s41564-019-0469-7

Una vía enzimática en el microbioma intestinal humana


que convierte la A a la sangre de tipo O universales

Peter Rahfeld 1,2, lyann Sim 1,2,8, Haisle Luna 3,4,8, Iren Constantinescu 3,4, Connor Morgan-Lang 5,6,
Steven J. Hallam   5, Jayachandran N. Kizhakkedathu   3,4 y Stephen G. Withers   1,2,7 *

El acceso a enzimas eficientes que pueden convertir A y de tipo B glóbulos rojos para donante O 'universal' podría aumentar en gran medida la capa de SUP- de sangre para
transfusiones. Aquí mostramos la proyección metagenómica funcional de la microbiota intestinal humana para las enzimas que pueden eliminar los antígenos afines A y tipo B de
azúcar. Entre los genes codificados en nuestra biblioteca de 19.500 fosmids expresadas llevan ADN bacteriano intestinal, identificamos un par enzima del anaerobio obligado plautii
Flavonifractor que trabajan en concierto para convertir de manera eficiente el antígeno A al antígeno H de sangre de tipo O, a través de una galactosamina intermedio. La estructura
de rayos X de la NORTE- acetilgalactosamina desacetilasa revela el sitio activo y el mecanismo del miembro fundador de una familia esterasa. El galactosaminidasa expande las
actividades dentro de la familia GH36 CAZy. Su capacidad para convertir completamente de A a O del mismo tipo rhesus a muy bajas concentraciones de enzimas en la sangre
entera simplificará su incorporación en la práctica de transfusión de sangre, la ampliación de suministro de sangre.

Ambas enzimas convirtieron sus RBCs correspondientes con la eliminación completa de los

do transfusión ya que el plasma de individuos del grupo sanguíneo A contiene anticuerpos


contra elcoincidente
antígeno B,orrect
y viceversa; por lodetanto,
de los tipos lases
sangre transfusiones
un requisito incompatibles
central de pueden
resultan en la activación del com- plemento y de glóbulos rojos (RBC) de lisis, que puede ser
respectivos antígenos. Sin embargo, cantidades sustanciales de enzima y condiciones de
tampón muy específicos fueron todavía se necesitan para la conversión, especialmente para el
tipo A (60 mg de enzima por unidad de sangre). Junto con la observación de alguna reactividad
letal 1 . Estos antígenos de superficie celular son estructuras de hidratos de carbono que de bajo nivel de las células B convertidos en los estudios de compatibilidad cruzada, esto
terminan en potencialmente limita- das aplicación práctica 4 . La eliminación completa de ambos los antígenos
α- 1,3-linked- NORTE- acetilgalactosamina (GalNAc) o galactosa (Gal) para A y tipo B de A y B con una única enzima se exploró usando un tosidase endo-galactosemia (EABase) que
sangre, respectivamente (Fig. 1 ). tipo O RBCs, por otro lado, contiene ninguno de estos escinde los trisacáridos terminal, pero estaba limitado por su estrecha especificidad de subtipo 7 .
azúcares terminales, y por lo tanto puede ser transfundida universalmente a los pacientes Se emplearon métodos de evolución dirigida para ampliar la especificidad, pero los retos de la
del mismo tipo rhesus 2 . creación de una enzima totalmente universal y la formación de un antígeno de tipo no-H
En consecuencia, se necesita un buen suministro de grupo O glóbulos rojos en los bancos de sangre GlcNAc terminados causadas este enfoque a ser abandonada 8 . Identificación de las mejores
para hacer frente a situaciones de emergencia en las que el paciente tipo de sangre es desconocido o enzimas permitiría que este campo se mueva hacia adelante.
incierto, o cuando la oferta es limitada.
El concepto de la eliminación enzimática de la GalNAc o turas Gal estruc- de A o B
RBCs como medio de conversión de glóbulos rojos A o B a O se propuso primero y
demostró por Goldstein et al. 3 . el uso de una α- galactosidasa de grano de café verde, los El cribado de bibliotecas de metagenómica ofrece un enfoque eficaz para el descubrimiento
glóbulos rojos de tipo B se convirtieron en O y una transfusión de éxito posterior se formó de las actividades enzimáticas de interés 9 codificado dentro de la multitud de microorganismos
per- 4 . Sin embargo, se necesitan cantidades de gramos de enzima, Ren- DERING el que aún no se han cultivado o incluso identificado 10 . Tales enfoques requieren cuidadosa
enfoque práctico. La conversión de tipo A a O todavía es más difícil, en gran parte porque selección de la fuente de metagenómica para optimizar las posibilidades de descubrimiento
el tipo A antígeno está presente en muchos subtipos que difieren en sus vínculos internos 5 enzima exitosa. Pensamos que el microbioma intestino humano era una buena fuente ya que las
( Fig complementario. 1). Un importante avance hacia conversiones prácticos, ING estructuras de antígeno A y B están presentes dentro de las mucinas que recubren la pared
INCLUYENDO de tipo A, se hizo por análisis de una biblioteca de bacterias tanto para A y intestinal 11 . Estas mucinas sirven como una barrera a la invasión de las bacterias del intestino,
actividades de conversión de B, usando STRATES tetrasacárido sub-. Se encontraron dos pero también sirven como puntos de unión y una fuente de nutrición para los miembros de la
familias de glicosidasas que muestran una alta actividad de antígeno de escisión a valores microbioma. En consecuencia, algunas de estas bacterias deben expresar glicosidasas que
de pH neutros: la GH109 CAZy escinden los antígenos A y B, que a su vez podría ser útil para la conversión de sangre de tipo
O.

α- NORTE- acetilgalactosaminidasas y la GH110 α- galactosidasas 6 .

1 Departamento de Química de la Universidad de British Columbia, Vancouver, Columbia Británica, Canadá. 2 Michael Smith Laboratories, Universidad de British Columbia, Vancouver, Columbia Británica, Canadá. 3 Departamento

de Patología y Medicina de Laboratorio, Centro de Ciencias de la Vida, Universidad de British Columbia, Vancouver, Columbia Británica, Canadá. 4 Centro para la Investigación de la Sangre, Life Sciences Center de la

Universidad de British Columbia, Vancouver, Columbia Británica, Canadá. 5 Departamento de Microbiología e Inmunología, Life Sciences Center de la Universidad de British Columbia, Vancouver, Columbia Británica,

Canadá.
6 Programa de Postgrado en Bioinformática, Centro de Ciencias del Genoma de la Universidad de British Columbia, Vancouver, Columbia Británica, Canadá. 7 Departamento de Bioquímica, Ciencias de la Vida Center de la

Universidad de British Columbia, Vancouver, Columbia Británica, Canadá. 8 Estos autores contribuyeron por igual: Lyann Sim, Haisle Luna. *correo electrónico: withers@chem.ubc.ca

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Tipo A antígeno de El tipo O RBC Tipo B RBC

RBC Un antígeno H antígeno B

3 3 3 3 3
α β β β β α β β
2 α 2 α 2 α

α- NORTE- acetil-galactosaminidasa α- galactosidasa

galactosa NORTE- acetil-galactosamina NORTE- acetil-glucosamina fucosa

Fig. 1 | A básico, los antígenos B y H en los glóbulos rojos. Los antígenos se presentan como tipo 1 vínculos; otros enlaces posibles se presentan en la Fig complementaria. 1. Las flechas negras marcan los puntos de

escisión para la α- NORTE- acetil-galactosaminidasa o α- galactosidasa durante la conversión al antígeno H. Los azúcares se muestran utilizando la notación CFG 29 .

construcción de la biblioteca metagenómica y la detección Análisis de las enzimas GH109


Hemos construido una biblioteca metagenomic que contiene grandes (35-65 kb) La familia GH109 fue fundada sobre la base de su actividad A-antígeno de escisión y se
fragmentos de ADN extraído de muestras fecales RESPETA por un donante masculino de muestra emplear un NAD inusual + -dependiente MECANISMO descubierto primero en
AB + tipo de sangre. Tal biblioteca contiene varios genes por bacteria, aumentando la enzimas de GH4 6 , 15 . Los parámetros cinéticos se determinaron para las tres enzimas
probabilidad de expresión de al menos algunos de esos genes y que permite la expresión GH109 identificados aquí,
de pequeñas 'vías' de múltiples genes. Nuestra biblioteca compuesta ~ 19.500 clones en B GH109, bv GH109_1 y bv GH109_2 (Tabla 2), así como la GH109 de meningosepticum
51 × placas de 384 pocillos, potencialmente alrededor de 800.000 genes; por lo tanto, el Elizabethkingia
cribado ini- cial de dicha biblioteca con caros sustratos Un antígeno era poco práctico. Más ( em GH109), que tiene la actividad específica más alta publicada para A escisión antígeno 6 ( Tabla
bien, primero tamizados con, sustratos fluorogénicos-el sensibles simples metilumbeliferil Suplementaria 3). Prometedora, se observaron eficiencias catalíticas similares para las cuatro
(MU) α- glucósidos de galactosa y NORTE- acetil-galactosamina (Gal- α- MU y GalNAc- enzimas con cada uno de los tres A sustratos subtipo ensayadas. Su capacidad para eliminar
un antígeno de A + eritrocitos fue entonces probado en la presencia de 40 kDa de dextrano
como un Crowder macromolecular para concentrar la enzima en la super- ficie celular dieciséis , el
α- MU; Fig complementario. 2). Esta pantalla inicial, con una mezcla de los 2 sustratos, uso de tarjetas aprobadas Micro Typing System (MTS). Estos son columnas de centrifugación
produjo un subconjunto de 226 golpes. Estos se volvieron a cribar contra cada sustrato que contienen anticuerpos contra A o antígeno B, y se puntúan 4-0 de acuerdo con su nivel
individual, la identificación 44 con α- GalNAcase y 166 con α- actividad galactosidasa. A de retraso de los glóbulos rojos, y así su contenido de antígeno. En ausencia de Crowder,
continuación realizó una segunda ronda de selección en estos éxitos usando el antígeno A ninguna de las enzimas fue eficaz, mientras que en su presencia solamente em GH109 trabajó
y B tetra- sustratos sacárido glicósido muestran en complementario Fig. 2, a través de un (Cuadro 4). condiciones de baja fuerza iónica también se han demostrado para impulsar la
ensayo de enzima acoplada 8 ( La Fig. 3 complementaria), junto con un control sin sustrato: actividad de em GH109 en las células 6 ,
sólo si se escinde la Gal inicial o GalNAc pueden las enzimas de acoplamiento actuar y
liberar MU. Once de estos éxitos contenía un antígeno de escisión de la actividad, uno de
los cuales también escinde antígeno B, mientras que seis fluorescencia producida en pero la enzima no es eficaz en la sangre entera sin aditivos.
ausencia de sustrato, que codifican por lo tanto las vías que generan productos
fluorescentes no relacionados. Análisis de la enzima GH36 de Collinsella sp. fosmid K05
La proteína GH36 dentro del fosmid K05 (llamado do spGH36) escinde tanto
GalNAc- α- MU y el tetrasacárido antígeno A (Fig. 4 complementario). Esto es
consistente con miembros de la familia GH36, que contiene principalmente α- galactosidasa
Secuenciación y análisis inicial de los accesos y
Los once fosmids se secuenciaron en un MiSeq Illumina y los marcos de lectura abiertos (ORFs) α- NORTE- acetilgalactosaminidasas 17 . El análisis filogenético alineado su secuencia dentro
en la misma que están presentes en la CAZy Data- base de ( http://www.cazy.org/ ) 12 se identificaron del cluster 4 de las subfamilias GH36 18 ( Fig complementario. 5), un grupo que contiene, en
utilizando el software Metapathways 13 . Debido a la considerable profundidad de los datos de estrecha proximidad, una GH36 de
secuenciación microbioma humano ahora disponibles, los organismos de los que todos los Clostridium perfringens que también se conoce para escindir un estructuras de antígeno 19 . Sin
afectados fos frecuencias medias fueron derivados podrían ser identificados. Sus secuencias (Fig. 2 ) embargo, do spGH36 mostró capacidad limitada para eliminar A antígenos de glóbulos rojos,
Se pueden agrupar en cinco grupos desde las ocho de los once derivado de fragmentos de anotando solamente un 3 en MTS tarjetas, incluso cuando se utiliza con un Crowder
lapeado excesiva de los genomas de sólo dos Bacteroides sp. La única proteína CAZy codificada macromolecular (Cuadro 1).
por un gen común a todos los fosmids en el grupo B es una enzima GH109 ( Bacteroides vulgatus); grupo
A también contiene un GH109 ( B. vulgatus), mientras que un GH109 es la única proteína codificada Análisis de fosmid N08 desde plautii Flavonifractor
CAZy en el otro Bacteroides- fosmid derivado ( Bacteroides stercoris). Dado que las enzimas que habíamos encontrado no ofreció ventajas sobre el pre viamente
descubierto em enzima GH109 6 , nuestra atención se dirigió a las enzimas relacionadas con CAZy
codificados en el N08 de fosmid F. plautii,
Fosmid N08, desde el anaerobio obligado plautii Flavonifractor 14 , especialmente ya que escinden ambos antígenos A y B. Sorprendentemente, cuando
contiene tres ORFs se encuentran dentro de CAZy: un módulo de unión a CBM32 glúcidos probamos las proteínas purificadas individuales contra los sustratos de pequeña
aparente, y dos glicósido potencial GH36 hydrolases- y una GH4. Por último, fosmid K05 de molécula A y tetrasacárido B, la única escisión observada fue del sustrato antígeno B ( α-
una Collinsella sp., probablemente Gal) por fp GH36. por lo tanto Probamos pairwise combinaciones de estas enzimas y se
Collinsella tanakaei, no contiene ORF obvias relacionadas con CAZy. Aquí la generación de una encontró que la combinación de fp CBM32 y fp GH36 escinde rápidamente el
sub-biblioteca de fosmid K05 permitió la identificación ción de la ORF con A-antígeno de escisión tetrasacárido antígeno de A a H trisacárido antígeno (Fig. 3a y en la Tabla
de actividad, más tarde identificado como un GH36 (Fig. 4 complementaria y complementario Suplementaria 5). Cromatografía en capa fina (TLC) análi- sis de mezclas de reacción
Tabla 1). Los genes que codifican estas proteínas fueron clonados, expresados ​en Escherichia con las enzimas individuales revelaron que
coli
y los productos de proteína purificado y caracterizado. fp CBM32 catalizó la conversión de un antígeno a una más polar

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AB + Fosmid_E11 B. stercoris

AB + Fosmid_I04 El grupo A

B. vulgatus
AB + Fosmid_N03

AB + Fosmid_J22

AB + Fosmid_G15 Grupo B

B. vulgatus
AB + Fosmid_G12

AB + Fosmid_O11

AB + Fosmid_L22 GH109

CBM32 GH36 GH4


AB + Fosmid_K22

AB + Fosmid_N08 F. plautii

AB + Fosmid_K05 Collinsella sp.

Fig. 2 | Visión general de los ORF en los fosmids secuenciados. Visión general de los ORF dentro de los fosmids secuenciados individuales. Un rojo actividad señales de punto en un antígeno, y una actividad de rojo y azul

señales de puntos en A y sustratos de antígeno B. Las flechas representan la dirección ORF de cada gen. Fosmids con secuencias solapantes están alineados en racimos. Los colores de las flechas representan la

clasificación de la familia dentro de la base de datos de CAZy. Rojo, GH4; azul, GH36; amarillo, GH109; verde, CBM32.

una segundo
18 h 37 ° C
GalN
> > 30 min 37 ° C
100.000 9 2,99 min
7
Respuesta (NC)

5
80000 RBCs A
3
unidades de fluorescencia relativa

60000 -11
2 3 4 5 6
9

7
40000
Respuesta (NC)

5
+ RBCs B +
3
20000 1

-1
1 2 3 4 5 6
0
13
11
4
36
32

H
08

Respuesta (NC)

97531
H

fp
BM
a

4
G

4
_N

fp
36

H
H

G
C
va

fp fp
id

fp
G
sm

fp
id
sm

Fo

+
+

O + RBCs
36
+

32
fo

32

H
BM
AB

fp
BM

fp
C

fp -11
2 3 4 5 6

Tiempo (min)

La Fig. 3 | actividad combinatoria de fp CbM32 y fp GH36 sobre un sustrato de antígeno. una, ensayo de enzima acoplada para A tipo1 antígeno tetra escisión MU usando las enzimas individuales y combinaciones
de pares de fp CBM32 (verde), fp GH36 (azul) y fp GH4 (rojo). La actividad completa se observó sólo si fp CBM32 y fp GH36 se combinaron. Un vacío (pCC1FOS TM) fosmid fue utilizado como un negativo y el activo AB
+ Fosmid_N08 como control positivo. La línea de negro separa los datos obtenidos después de diferentes tiempos de incubación, dejó 18 h y derecha 30 min. barras de color mixtos representan las diferentes
combinaciones de enzimas. El símbolo '>' indica que la reacción había llegado a la máxima señal de fluorescencia detectable. segundo. A +, B + y O + RBCs fueron tratados con una combinación de

fp GalNAcDeAc y fp GalNase. Se utilizó el ensayo de HPAE-PAD para identificar el producto de escisión, mediante la separación de los monosacáridos. En este caso, los glóbulos rojos sólo el A + liberado
galactosamina (GalN, 2,99 min). Los azúcares se identificaron sobre la base de las normas, como se presenta en complementario Fig. 6. Ambos experimentos se realizaron dos veces, independientemente, con

resultados similares.

pero en el producto todavía ultravioleta-activo, mientras que la posterior adición de Se obtuvieron resultados similares con sustratos mucina gástrica, para los que
fp GH36 liberado galactosamina, junto con el antígeno H trisaccha- paseo. análisis de presumiblemente evolucionó esta enzima. Estas dos enzimas se denominan de aquí
espectrometría de masas de las mezclas de reacción demostró que fp CBM32 es una en adelante como fp deacetilasa GalNAc ( fp GalNAcDeAc) y fp galactosaminidasa ( fp GalNase)
desacetilasa antígeno A, por lo tanto, la disminución de 42 en m / z y el producto más polar, (Tabla 2).
mientras fp GH36 es un minidase galactosa- (Fig. 4 ). Esto se confirmó adicionalmente Si bien esta vía para la degradación del antígeno fue previa- mente sin caracterizar,
mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con el análisis pulsada fascinante se había sugerido hace más de 50 años como una explicación de la llamada
la detec- ción amperométrica (HPAE-PAD) de la reacción (Fig complementario. 6), que 'adquirido' fenómeno B en la que los pacientes con sepsis Un tipo infectados con Clostridium
mostró que el tratamiento de un antígeno con las dos enzimas liberadas galactosamina, tertium se sometió a un cambio aparente en el tipo de sangre de tipo B 20 , como también lo
mientras que las enzimas individuales No. hicieron las muestras forenses de tejidos humanos que habían sido sumergidas

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Un tipo de antígeno 1 tetra MU [M - H] -

[M + Cl] -
889,3
3 3
MU
α β β 925,4

2 α
monoisotopic masa: 890,32 927.4

936.4 1,003.3 M / z
714,9 833,9

600.0 800,0 1,000.0

- Acetil fp GalNAcDeAc

[M - H] -
GalN tipo1 antígeno tetra MU

847,3
3 3 [M + Cl] -
MU
α β β
2 α 883,2
monoisotopic masa: 848,31
893,3
686,7 723,2 772,4 1,086.2
M/z

600.0 800,0 1,000.0

- fp GalNase

[M - H] -

H tipo1 antígeno tri- MU [M + Cl] -

686,1 722,1
3
MU
β β


724,2
monoisotopic masa: 687,24 732,2
654,8 815,7 936,6 1,079.5
m/z
600.0 800,0 1,000.0

galactosamina galactosa NORTE- acetil-galactosamina NORTE- acetil-glucosamina fucosa

La Fig. 4 | vía de desacetilación para A escisión antígeno. El tipo1 antígeno A tetra MU es desacetilado por fp GalNAcDeAc, seguido de la escisión de galactosamina por fp GalNase, produciendo antígeno H. Los
espectros de masas muestran la pérdida de masa de 42 de desacetilación por fp GalNAcDeAc y 161 pérdida de masa después de la escisión de la unión galactosamina. La flecha negro indica la especie
desprotonados y la flecha gris indica el aducto de cloruro del producto. Los azúcares se presentan como estructuras químicas (parte marcado con rojo de la estructura química es el grupo funcional de ser
convertido por fp GalNAcDeAc) y símbolos utilizando la notación CFG 29 .

en el río Támesis 21 . Se supone que esto surgió debido a que los anticuerpos anti-B todo desacetilasas Acetamidosugar han demostrado ser enzimas organometálicos,
policlonales utilizados en la tipificación fueron incapaces de distinguir entre Gal terminal y que requieren iones metálicos divalentes 25 . En consonancia con esto, el tratamiento con
GalN. De hecho, las bacterias aisladas de pacientes con sepsis se purificaron y se 100 uM EDTA borrado en gran medida la enzima activi- dad, mientras que la adición de
encontraron fracciones de proteína con actividad lase y galactosaminidasa deacety- Mn 2+, Co 2+, Ni 2+ o Zn 2+ aumento de la misma. Otros inhibidores de amidasas (no-metalo) no
propuesto, pero no carac- ized 22 , 23 . Nuestro descubrimiento de estas dos enzimas explica, por tuvieron efecto (Tabla 8). La enzima tiene un amplio perfil de pH con un óptimo alrededor
tanto, aún más este fenómeno interesante mientras que también proporciona una entrada útil de pH 8 (Fig complementario. 8) y una especificidad de sustrato estrecha (Tabla 6),
en la conversión de tipo RBC controlada. restringido a los diferentes subtipos A y versiones más cortas de los mismos. Sin
embargo, dentro de esos subtipos, no es muy discriminatorio, existiendo solamente una
Investigación de la tercera enzima en la fosmid, la GH4, mostró que, mientras que instancia diferencia del doble aproximada de la actividad específica en toda la gama
hidroliza Gal- α- pag- nitrofenol ( pag NP), GalN- α- pag NP y GlcN- α- pag NP, que no escinde
(Tabla 7). Tal dependencia del pH y especificidad perfil es ideal para la conversión de
cualquier sustratos a base de A-antígeno (Tabla 6), y por lo tanto no parece glóbulos rojos ya que todos los subtipos de A serán desacetilizado, pero nada más.
desempeñar un papel directo en la conversión de un antígeno.

caracterización de fp deacetilasa GalNAc La especificidad de la porción de CBM de la proteína se exploró utilizando la matriz de
análisis bioinformático Más cerca de esta proteína con Phyre 2 , 24 indi- cado un dominio glucano del Consorcio para Glicómica funcional (CFG). Como se ve en complementario Fig. 9 y
~ 308-amino-ácido en el amino terminal y un ~ CBM32 145-amino-ácido cerca del complementaria del conjunto de datos, Tab 1, los objetivos preferidos eran glicanos con ING
extremo carboxilo terminal, con regiones enlazador entre. análisis de truncamiento repetibilidad NORTE- acetil lactosamina estructuras (LacNAc), como también se observa para el
(complementario Fig. 7) confirmó esta estructura básica ya que todos los constructos miembro fundador de la familia CBM32 26 . Sin embargo, a diferencia de que CBM, la nuestra
que contienen el dominio desacetilasa intacta eran de hecho catalíticamente activo muestra ninguna unión a antígeno en la sangre estructuras de alta afinidad. Repetición de
(Tabla 7). Por tanto, esta proteína se clasifica como el miembro fundador de una estructuras LacNAc son un componente común de las superficies celulares 27 , siendo un
familia esterasa de carbohidratos con especificidad para un antígenos. componente universal de complejo e híbrido

NORTE- glicanos, así como algunos O- glicanos y glicolípidos. Aquí,

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una
tal como la mostrada en la Fig. 4d . Del mismo modo, la mutación de los residuos que
coordinan el metal divalente, Asp 100, y su 252 a aspara- gine y fenilalanina,
respectivamente, resultó en ~ 5000-plegado de tasa disminuye, consistente con su papel
S61 * en el mecanismo. El resto del ligando es en gran parte con el grupo C1-OH del resto de
galactosilo extremo reductor que señala en el disolvente (Fig expuesto en la superficie. 5b ),
Lo que explica cómo la unión del sustrato a la cara de la célula sur- es acomodada por la
enzima. Lo más importante, las interacciones polares vistos entre el grupo de
D121 fucosiltransferasa y la Ser 61 y Asp 121 cadenas laterales (Fig. 5b ) Explicar la alta
especificidad observada de fp GalNAcDeAc hacia sustratos que contienen fucosa de
D100 núcleo. Esta especificidad es crucial para el uso de esta enzima en selectiva Una
H252 eliminación antígeno (Cuadro 6). La estructura de este complejo también muestra que es
muy poco probable que los residuos GalNAc internas de las estructuras de trisacáridos
de repetición de tipo 3 se escinden, sólo la GalNAc terminal.
do db

OH
O

NUEVA HAMPSHIRE -
H97
O E64 H
H
caracterización de fp GalNase
O
O
E64 OH El análisis filogenético de los lugares de secuencias fp GalNase en un subgrupo (5) de la
M ++
Y315

norte
O- O familia GH36 (Fig complementario. 5) 18 . El dominio catalítico 390-amino-ácido se
C99 HN
encuentra en el centro de esta proteína grande (1.079 aminoácidos), con un dominio de
H252
D100 unión a carbohidratos potencial en el terminal C (Fig. Suplementario 7). La eliminación
Y315 D100
de este dominio C-terminal no tuvo ningún efecto sobre los parámetros cinéticos de la
H252
enzima con sustratos solubles (Tabla 7), pero dio lugar a una eficiencia reducida en la
escisión de RBCs desacetilizado A + (Fig. Suplementaria 10). La enzima es específica
Fig. 5 | estructura cristalina de FpGalNAc deacetilasa. una, Una representación esquemática de la
para los azúcares que contienen galactosamina y no escindir restos GalNAc en
estructura beta-hélice de cinco veces de fp GalNAc DeAc_D1ext de color a partir de N (azul) a C termini
cualquier texto con- probado. Sin embargo, tiene una bastante amplia especificidad para
(rojo). Los Sus 252 y Asp 100 residuos que coordinan el ion metálico divalente (esfera roja) se muestran en
la escisión de de- NORTE- galactosaminides acetilados que van desde la simple glicósido
palos amarillo y azul, respectivamente. segundo, Representación superficial de la bolsa del sitio activo con
arilo GalN- α- pag NP a tetrasacárido-antígenos (Tabla 6). En efecto (Tabla 7), k gato/ K METRO valores
cota trisacárido antígeno B. residuos de galactosilo se muestran en amarillo palos y el residuo fucosil en
para los tres subtipos A ensayadas fueron todas similares entre sí y a los de la
rosa. El asterisco indica la localización del grupo C1-OH del grupo galactosil-extremo reductor a la que un
desacetilasa. Valores de k gato/ K METRO para la escisión del antígeno B eran más de 2000
residuo GlcNAc se une normalmente en el ligando antígeno B natural. do, residuos de sitio activo que
veces menor que para el antígeno GalN correspondiente pero no obstante fueron
participan en interacciones con el grupo galactosilo extremo no reductor. interacciones polares en segundo y
suficientes para producir un golpe positivo en la pantalla original. Esta especificidad para
do se muestran como líneas grises discontinuas y moléculas de agua se muestran como esferas azules. los NORTE-
sustratos galacto-configurado de-acetilado alfa, junto con su pH óptimo de ~ 6,5-7,0, se
grupo acetilo del grupo GalNAc en un modelado un trisacárido antígeno se muestra por un palo magenta
adapta bien para su uso en la conversión de tipo de sangre en conjunción con la
semi-transparente. Una densidad de electrones (2 F o - F do) mapa del ligando trisacárido antígeno B,
desacetilasa (complementario Fig. 11 y el cuadro complementario 12).
contorneado en 1,0 σ, se muestra en la malla cian.

re, mecanismo de desacetilación propuesto; primer paso.

Escisión de un antígeno de glóbulos rojos


presumiblemente servir como el punto de anclaje para la unión del dominio lase Para evaluar si nuestras enzimas se pueden utilizar para la conversión de glóbulos rojos, el tipo
deacety-, con lo que su dominio catalítico cerca de la Un antígeno sin competir por su A +, B + y O + RBCs se incubaron con fp GalNAcDeAc y
propio sustrato. En apoyo de este modelo, la eliminación del dominio resultó en una fp GalNase, individualmente y como una mezcla, y los azúcares liberados se analizaron en un
disminución de la actividad en los glóbulos rojos (Tabla 9), sin efecto sobre las tasas cromatograma de iones HPAE-PAD. Como mostramos en la figura complementaria. 12, ni de
de escisión de sustrato soluble (Tabla 7). las enzimas utilizadas individualmente liberados de cualquier producto de azúcar. Sin
embargo, cuando se empleó la mezcla de los dos, galactosamina fue lanzado claramente de
tipo + RBC A, pero sin azúcar fue liberado de B + o O + (Fig. 3b ), En consonancia con su alta
El análisis cristalográfico de fp deacetilasa GalNAc especificidad hacia solamente el antígeno A. Esto es muy importante ya que demuestra que
Solución de la fp estructura cristalina GalNAcDeAc_D1ext reveló un dominio catalítico GalNAc no se libera de la superficie de RBC en cualquier otro contexto.
que adopta una estructura beta hélice de cinco veces con un sitio activo que alberga un
ion metálico divalente coordinado por Asp 100 y Su 252 (Fig. 5 y en la Tabla
suplementaria 10). Co-cristalización de la enzima con trisacárido antígeno B como un Nos mudamos a las pruebas para la eliminación de antígenos de los glóbulos rojos
cierre análogo del producto de reacción dio a conocer su modo de unión. En la base de que usan las tarjetas de MTS estándar de la industria. El tratamiento con fp GalNase solo
la cavidad del sitio activo, la galactosemia extremo no reductor de tosilo resto, que es el no eliminar una o antigenicidad B en la concentración empleada (Tabla 13), en
grupo que distingue entre A y el antígeno B, hace que las interacciones de enlaces de consonancia con su inactividad en sustratos GalNAc, y su baja actividad en Gal. Sin
hidrógeno con su 97, Glu 64 y dos de las aguas de metal coordinado ( Higo. 5c ). embargo, la incubación con fp GalNAcDeAc solo eliminó una antigenicidad, debido a la
Modelado de la conversión de las la acetamida a una amina comprometer con ello la de carácter definitivo
de la anti-Un anticuerpo empleado. Cantidades de fp GalNAcDeAc hasta 3 μ g ml - 1 fueron
NORTE- grupo acetilo de la un trisacárido en esta estructura (Fig. 5c ) Nos permitió hacer suficientes sin la ayuda de dextrano, mientras que la inclusión de 300 mg ml - 1 dextrano
mutaciones racionales de los aminoácidos cercanos que pueden estar implicados en la reduce la ing load- requerido para 0.5 μ g ml - 1 ( Suplementaria Cuadro 13). En comparación,
desacetilación del sustrato. Glu 64 demostró ser crítica para la actividad ya que sus alanina el mejor enzima anterior (complementario Fig. 13), em GH109, ​era inactivo en los hematíes
y leucina mutantes eran tiva inac- (Tabla 11), lo que sugiere un papel directo, en ausencia de dextrano a menos tampones bajos en sal eran
probablemente en la activación de la molécula de agua nucleofílica dentro de un
mecanismo

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una
fp además GalNAcDeAc fp GalNase

Totalidad de las 5: RBC Completo 10: RBC Completo 50: RBC Completo 50 dex: RBC

10 6 H (69,49%) A + H (0,23%) 10 6 H (68,87%) A + H (0,27%) 10 6 H (73,60%) A + H (0,53%) 10 6 (74,02%) A + H (0,27%)

10 5 10 5 10 5 10 5

Antígeno H-FITC
Antígeno H-FITC
Antígeno H-FITC

Antígeno H-FITC
10 4 10 4 10 4 10 4

10 3 10 3 10 3 10 3

10 2 10 2 10 2 10 2

muestras de RBC (30,19%) A (0,09%) muestras de RBC (30,82%) A (0,09%) muestras de RBC (25,85%) A (0,02%) muestras de RBC (25,68%) A (0,03%)

10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5

Antígeno A-APC Antígeno A-APC Antígeno A-APC Antígeno A-APC 50 μ g


5 μ g ml -1 10 μ g ml -1 50 μ g ml -1 ml -1 + MC

segundo
em GH109
GH109 5: RBC GH109 10: RBC GH109 50: RBC GH109 50 dex: RBC

10 6 H (2,13%) A + H (9,10%) 10 6 H (1,03%) A + H (12,09%) 10 6 H (4,68%) A + H (38,94%) 10 6 H (65,65%) A + H (0,25%)

10 5 10 5 10 5 10 5
Antígeno H-FITC

Antígeno H-FITC

Antígeno H-FITC

Antígeno H-FITC
10 4 10 4 10 4 10 4

10 3 10 3 10 3 10 3

10 2 10 2 10 2 10 2

muestras de RBC (7,67%) A (81,10%) muestras de RBC (6,35%) A (80,53%) muestras de RBC (22,01%) A (34,37%) muestras de RBC (33,92%) H A (0,18%)

10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5

Antígeno A-APC Antígeno A-APC Antígeno A-APC Antígeno A-APC 50 μ g


5 μ g ml -1 10 μ g ml -1 50 μ g ml -1 ml -1 + MC

La Fig. 6 | Validación de conversión de tipo de sangre enzimática. a, b, El análisis FACS de RBCs + A tratada con diferentes concentraciones de fp además GalNAcDeAc

fp GalNase ( una) o em GH109 ( segundo) durante 1 h a 37 ° C con y sin Crowder macromolecular (MC). Los RBCs enzimáticamente modificados fueron tratados con anticuerpo anti-H (más anticuerpo marcado con
FITC secundario) y APC marcada con anticuerpo anti-A para determinar la presencia de los respectivos antígenos. La región que contiene antígenos H está marcada con un cuadro rojo. Los controles no tratados se

muestran en la Fig complementario. 14. El experimento se repitió con dos + RBC donantes independientes A, que muestra resultados similares.

empleado, mientras que en la presencia de dextrano de la concentración mínima eficaz era Nuestra combinación de una histona y un galactosaminidasa convierte RBCs A + a
15 μ g ml - 1, una carga de 30 veces superior. tipo O RBCs 'donante universal' a través de un mecanismo único, utilizando bajas cargas
Para evaluar si la conversión de un tipo de glóbulos rojos por nuestro par enzima fue de enzimas. La muy alta actividad y especificidad de estas enzimas en ambas soluciones
completa, que probaron para la formación de gens la H anti- que debe estar presente en los tampón y sangre entera hacen estos candidatos muy prometedores para una aplicación
glóbulos rojos de tipo O enzimas convertido, tanto por células activadas por fluorescencia rentable en las rutinas automatizadas ya existentes de recogida de sangre, procesamiento
(FACS) y análisis por medición de los tiempos de aglutinación. Los anticuerpos anti-A y y almacenamiento, con importantes implicaciones para la flexibilidad de nuestro suministro
anticuerpos anti-H que no reaccionan de forma cruzada con RBCs GalN contienen fueron de sangre y sus posibles aplicaciones en el trasplante de órganos.
utilizados en estos estudios (Fig complementario. 14). Como se muestra en la Fig. 6 , El uso de
sólo el 5 μ g ml - 1 de nuestra par enzima, incluso en ausencia de Crowder macromolecular,
resultó en versión con- aparentemente completa de A antígenos a los antígenos H, basado en
los ods met analíticos utilizados. Asimismo, los datos de aglutinación anticuerpo anti-H
métodos
mostraron la conversión exitosa de hasta 26 donantes A + RBC diferentes (Tabla 14) con no Productos químicos y enzimas comerciales utilizadas en este estudio fueron adquiridos de Sigma-Aldrich
detectable residual Un antígeno. Es importante destacar que estas enzimas trabajaron al menos que se indique lo contrario. glucósidos metilumbeliferil monosacáridos fueron un regalo de H. Chen

menos tan bien en la sangre como en un sistema tampón: tal capacidad para funcionar en la y el tipo 1 Un antígeno penta MU fue un regalo de D. Kwan 30 .

sangre no se ha demostrado por cualquier enzimas previamente probados. Para confirmar


esto completamente, la conversión de toda una unidad de sangre fue validado con éxito
Las heces humanas de cribado biblioteca metagenómica. Para la generación de la biblioteca de los
(Tabla 15). Además, hemos demostrado que las enzimas utilizadas en la conversión fueron
metagenómica humanos fosmid, muestras fecales frescas humanos se obtuvieron de un varón sano con grupo
retirados por los procedimientos de lavado basado centrifugation- simples que se usan sanguíneo AB +. Se obtuvo el consentimiento del participante voluntaria antes de su donación, basado en las
durante el procesamiento de RBC normal (Fig. Suplementaria 15). Claramente, se necesita directrices de la Junta Ética de Investigación Clínica de la Universidad de Columbia Británica. La extracción de

más trabajo para confirmar la eliminación de todas las trazas de un antígeno que podrían ser ADN directa y la creación de la biblioteca fosmid se realizaron de acuerdo con el procedimiento descrito en
Armstrong et al. 31 . Una breve protocolo sigue.
reconocidos por humanos policlonal anti-Un anticuerpo, pero quizás no por los anticuerpos
anti-A que se utilizan comúnmente en la tipificación. Se puede generar por sustratos de difícil
Biblioteca La metagenómica humanos fosmid se preparó a partir de muestras fecales frescas humanas que se
acceso. Estudios con eritrocitos papaína tratada para exponer mejor antígenos enterrados 28 y obtuvieron de un varón asiático saludable de grupo sanguíneo AB +. El participante no comer cualquier alimento que
los estudios de compatibilidad cruzada a la conversión adicional de la sonda están en marcha. contenga prebióticos o probióticos, ni recibió ningún antibiótico 30 días antes de la recogida de muestras. extracción de
ADN directa se realizó usando un procedimiento de lisis química modificada 31 adaptado de un procedimiento publicado
previamente 31 , 32 . Una parte alícuota de 10 ml de tampón de extracción (100 mM Tris / HCl pH 7,0, mM NaH 100 2 correos 4 pH
7,0, 100 mM EDTA pH 8,0, 1,5 M NaCl; antes de su uso añadir 1% (v / v) CTAB, 0,5 mg ml - 1 lisozima, 0,2 mg ml - 1 Achromopeptidase)
se añadió a 5 mg de muestra fresca, y se incubó durante 10 min en hielo en un Erlenmeyer de 50 ml

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tubo, con inversión de una vez por minuto, seguido por cinco ciclos de congelación en nitrógeno líquido durante 5 en medio LB (12,5 μ g ml - 1 cloranfenicol, 25 μ g ml - 1 kanamicina, 15% (v / v) de glicerol, 0,2% (v / v) de
min y descongelación a 42 ° C en un baño de agua. Después, 1 ml de tampón de extracción II (5% de SDS (p / v), maltosa, mM MgSO 10 4).
tiocianato de guanidinio 4 M, Tris / HCl pH 7,0 10, 1 mM EDTA pH 8,0; antes de su uso se añaden 0,5 mg ml - 1 lisozima,
0,2 mg ml - 1
Fosmid golpeó secuenciación. Para aislar el ADN fosmid para la secuenciación, el golpe positiva fosmid stocks
de glicerol se utilizaron para inocular 5 ml de medio TB (12,5 μ g ml - 1
Achromopeptidase, 5 mg ml - 1 proteinasa K, 10 μ l ml - 1 se añadió 2-mercaptoetanol) y la muestra se incubó durante 2
h en un baño de agua C 65 ° con agitación a 100 rpm Los sedimentos se precipitaron mediante centrifugación cloranfenicol, 25 μ g ml - 1 kanamicina, 100 μ g ml - 1 arabinosa, 0,2% (v / v) de maltosa, mM MgSO 10 4), y se incubó
(4.000 sol, 4 ° C, 10 min) y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo cónico de 50 ml. El sedimento restante se durante la noche a 37 ° C y 220 rpm Fosmid aislamiento se realizó utilizando el kit miniprep de plásmido
resuspendió y se extrajo con una mezcla de 5 ml de tampón de extracción I y 0,5 ml de tampón de extracción II. GeneJet (Thermo Fisher). Los fosmids aislados se purificaron contaminen lineal E. coli ADN utilizando el
Después de la sedimentación, se combinaron los dos sobrenadantes. Para aislar el ADN del medio ambiente, 20 plásmido-Safe DNasa ATP-dependiente (Epicenter), seguido de otra ronda de purificación con un kit de
ml de fenol ultrapura fresco / cloroformo / alcohol isoamílico (24: 24: 1) se añadió y la suspensión se mezcló purificación GeneJet PCR (Thermo Fisher). La concentración se calcula con un Quant-iT dsDNA SA Assay Kit
durante 10 min a 10 ° C con agitación a 100 rpm Las dos fases se separaron mediante centrifugación (13.200 sol, 10 (Invitrogen) en un fluorímetro Qbit (ThermoFisher). de tamaño de ADN esperado se validó con un gel de
° C, 10 min) y el sobrenadante se retiró cuidadosamente sin perturbar la fase orgánica. La precipitación del ADN agarosa al 1%. Para la secuenciación completa fosmid, 2 ng de cada fosmid fue enviado al Centro de
presente en el sobrenadante se llevó a cabo mediante la adición de 0,1 volumen de acetato de sodio 3 M, pH 5,2 y Secuenciación del UBC (Vancouver, Columbia Británica, Canadá). Cada fosmid fue con código de barras de
0,7 volúmenes de hielo frío 100% de 2-propanol. Después de incubación a 4 ° C durante 30 min, la solución se forma individual y se secuencia utilizando un sistema de iluminación MiSeq.
centrifugó (13.200 sol, 4 ° C, 20 min) y el sobrenadante se descartó. El sedimento de ADN obtenido se lavó con
etanol helado al 70%, se incubaron a 4 ° C durante 30 min, se centrifugó (13.200 sol, 4 ° C, 20 min) y después se
descartó el sobrenadante. El ADN se resuspendió en tampón TE (10 mM Tris / HCl, EDTA 1 mM pH 8) a 4 ° C Todos los datos de la secuencia en bruto Illumina MiSeq fueron recortadas y ensambladas utilizando un script
durante la noche. Los pasos de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico de extracción y precipitación con etanol se Python disponible en GitHub en https://github.com/hallamlab/FabFos . Brevemente, Trimmomatic se utiliza para eliminar
repitieron el día siguiente y el sedimento final se resuspendió en Tris 10 mM, pH 8. El rendimiento fue de los adaptadores y secuencias de baja calidad a partir de las lecturas 38 . Estas lecturas se cribaron para las secuencias de
aproximadamente 800 μ g de ADN de una muestra de 14 g. Fin-reparación (CopyControl Fosmid Biblioteca Kit de vector y huésped utilizando BWA 39 y después se filtró usando samtools y una secuencia de comandos bam2fastq para
Producción (Epicentro)) se realizó con 20 μ g de ADN a través de la incubación a temperatura ambiente durante 1 h eliminar los contaminantes. Estos de alta calidad y purificada dice estaban reunidos por Megahit con k- mer valores que
y inactivado a 70 ° C durante 10 min. selección de tamaño se realizó usando un aparato de electroforesis en gel de oscilan entre 71 y 241, aumentando en incrementos de 10 (ref. 40 ). Desde estas bibliotecas a menudo tenían más de
campo pulsado en un gel de agarosa al 1% utilizando agarosa ultra pura de bajo punto de fusión (Invitrogen) y 0,5 × 20.000 veces la cobertura, para evitar la acumulación de errores de secuenciación interferir con la secuencia de montaje
TAE con los siguientes ajustes: ángulo incluido de 120 °, el tiempo de encendido inicial de 0,10 s, tiempo de adecuado, el mínimo k-
conmutación final del 21.79 s, con un aumento gradual lineal de los factores y gradiente de tensión de 6,0 V.
Después de la ejecución, el ADN se tiñó en el gel con SYBR Gold (ThermoFisher) durante 1 h en la oscuridad. mer multiplicidad se establece en 1% de la cobertura estimada de un fosmid. Fuera de la secuencia de comandos Python,
Con una hoja de afeitar limpia, el ADN se cortó en una gama de 36 a 65 kpb. El gel aislado se fundió a 70 ° C asambleas que produjeron más de un contig fueron andamiaje utilizando minimus2 41 . comandos parametrizados se pueden
durante 30 min; entonces, después de estar seguro de que todo el gel se había derretido, la temperatura de la encontrar tanto en la documentación en la página de GitHub y en la propia secuencia de comandos Python.
muestra se redujo a 45 ° C durante 10 min. GELasa (12 μ l) se añadió a la agarosa fundida junto con la cantidad
apropiada de tampón de GELasa y la reacción se incubó a 45 ° C durante 3 h con mezcla ocasional, después de lo
cual se transfirió a 70 ° C y se incubó a 10 min para inactivar la GELasa . Amicon Microcon y filtros (Millipore) se Fosmid ORF predicción y validación golpeado. Fosmid ORFs se identificaron utilizando la versión de metagenómica
utilizaron para reemplazar la agarosa derretida con agua y para concentrar el ADN a 14 μ l. La ligación, de Pródigo 42 y en comparación con la base de datos CAZy mediante BLASTP como parte del paquete de software v2.5
encapsidación de fagos y la transducción de la DNA seleccionado por tamaño se realizaron utilizando el Kit MetaPathways 13 . MetaPathways parámetros: longitud> 60, la puntuación de BLAST> 20, la relación de puntuación de
CopyControl Fosmid Biblioteca de Producción disponible comercialmente (Epicenter). A 20 μ g muestra de ADN explosión> 0,4, mi valor < 1 × 10 - 6.
aislado produjo aproximadamente 40.000 clones, 20.000 de los cuales fueron dispuestos en 51 × placas de 384 Todos los ORF predichos con anotaciones a los miembros de una familia o de GH (CBM con conocidos o
pocillos llenos de medio LB (12,5 μ g ml - 1 sospechosos α- galactosidasa y / o α- NORTE- actividades acetilgalactosaminidasa) se clonaron en el plásmido pET16b
utilizando la estrategia de clonación de puerta de oro 43 ; las secuencias de cebadores se indican en la Tabla
suplementaria 16. Las proteínas se expresaron en BL21 (DE3), se cultivaron en medio de inducción de auto 10 ml
ZY5052 44 durante 20 h a 37 ° C y 220 rpm Las células se recogieron por centrifugación (4.000 sol, 4 ° C, 10 min) y se
resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis (mM NaH 100 2 correos 4,

pH 7,4, 2% (v / v) de Triton-X 100, 1 × Inhibidor de proteasa sin EDTA (Pierce)). Un ensayo acoplado 30 se realizó
con 50 μ lisado celular bruto l de los candidatos mezcla con 50 μ l de tampón de ensayo (100 mM NaH 2 correos 4, pH
7,4, 50 μ g ml - 1 Sphex, 50 μ g ml - 1 Afca, 50 μ g ml - 1 BgaC, 100 μ MA antígeno tipo 1 tetra MU o 100 μ MB antígeno tipo 1 tetra
cloranfenicol, 50 μ g ml - 1 kanamicina, 2% de maltosa, mM MgSO 10 4) y 15% de glicerol utilizando un selector de MU) y se incubó a 37 ° C. Todas las reacciones se realizaron como triplicados en una placa de 96 pocillos de
colonia Qpix2 (Genetix). Después de la incubación durante la noche a 37 ° C, las placas se almacenaron a - 70 ° C. color negro. La fluorescencia (365/435 nm) se monitorizó continuamente durante 4 h utilizando un lector de
placas de Synergy H1 (BioTek). Los ensayos de extractos crudos que muestran actividad de escisión para A o
Para el cribado, 51 × Placas de 384 pocillos biblioteca AB + Blood Fosmid se descongelaron a temperatura antígeno B se repitieron, esta vez sin las enzimas acopladas, y el producto de reacción se aisló a través de una
ambiente y se replican en placas de 384 pocillos que contenían 50 μ l cribado medio LB (12,5 μ g ml - 1 cloranfenicol, columna de HF Bond Elut C18 y se analizaron con espectrometría de masas-cromatografía líquida y / o TLC. TLC
25 μ g ml de kanamicina, 100 μ g ml - 1 se realizó utilizando placas de TLC 60 F254 TLC Silica Gel (EMD Millipore).
arabinosa, 0,2% (v / v) de maltosa, mM MgSO 10 4). Las placas se incubaron a 37 ° C durante 18 h en un recipiente
sellado que contiene un depósito de agua para evitar la evaporación excesiva. Sobre las placas de detección
cultivadas, 45 μ l de la mezcla de reacción (mM NaH 100 2 correos 4, pH 7,4, 2% (v / v) de Triton X-100, 100 μ M GalNAc- α-
MU, 100 μ M Gal- α- MU) se añadió usando el instrumento QFill (Genetix). Las placas se incubaron a continuación a 37
° C (en un recipiente sellado) durante 24 h, y la fluorescencia (excitación: 365 nm, emisión: 435 nm, barrido-modo, la Hit ensayo de validación para AB + Fosmid_N8. Para identificar las enzimas responsables de la actividad A
ganancia 80) de cada placa se midió en horas 1, 2 , 4, 8 y 24 a través de un lector de placas de Synergy H1 (BioTek). y B-antígeno-escisión, purificadas fp CBM, fp GH36 y fp GH4 se ensayaron en mM NaH 100 2 correos 4, pH 7,4 a
Para todos los pozos, una 37 ° C. La reacción se realizó en 100 μ volúmenes L que contenía 100 μ MA o antígeno B tipo1 tetra MU, 0,1 mg ml - 1
Sphex, AFCA,
Z- puntuación se calculó, que viene dada por la fórmula: Z- puntuación = (valor de la mediana por fluorescencia) / 0,1 mg ml - 1 BgaC. El tiempo de incubación era o 18 h o 30 min, dependiendo del progreso de la reacción. La
desviación estándar (ref. 33 ). señal de fluorescencia (365/435 nm) que resulta de la liberación MU por hidrólisis se controló usando un lector
Todos los impactos positivos por encima de un cierto umbral (complementario Fig. 16), fueron re-dispuestos en de placas de Synergy H1 (BioTek) y los resultados se presentan en unidades de fluorescencia relativas. El AB +
una nueva placa de 384 pocillos, designado la placa 'simple sustrato hit' y se almacena a - 70 ° C. Dos placas de Fosmid_N8 fue utilizado como un positivo y los vacíos (pCC1FOS) fosmid como un control negativo.
cribado fueron replicados de la placa 'simple sustrato hit' y re-examinados para ya sea GalNAc- α- MU o Gal- α- la
actividad MU para verificar y deconvolute la actividad detectada previamente.
síntesis de tipo antígeno. Las síntesis de los tipos de antígenos A y B 1/2/4 tetra MU se realizaron con una
Para determinar cuál de los golpes puede escindir estructuras de antígenos A o B, su actividad sobre 50 μ MA versión ligeramente modificada del protocolo (Fig. Suplementaria 17) descrito en Kwan et al. 8 , como sigue.
tipo1 antígeno tetra MU o 50 μ MB tipo1 antígeno tetra MU (complementario Fig 2) se determinó usando un ensayo de
enzimas acopladas. Una versión de este ensayo acoplado (complementario Fig 3) fue descrito previamente por
Kwan et al. 30 . Nuestro ensayo se modificó para detectar también la escisión del antígeno tipo 1A, mediante el uso de De dos pasos antígeno H tipo 1/2/4 tri- la síntesis de MU. Todos los tres síntesis se realizaron en escalas de 20
BgaC 34 en lugar de BgaA 35 como la enzima de acoplamiento. Potencial mg GalNAc- α- MU / GlcNAc- α- MU en 10 ml Tris 50 mM / HCl, NaCl 200 mM, pH 7,4, mM MnCl 10 2, 50 U de
fosfatasa alcalina, 1,5 equivalente UDP-Gal, 1,2 PIB-Fuc equivalente (escalado en el producto LacNAc-MU).
α- NORTE- acetilgalactosaminidasas o α- galactosidasas serían escindir el azúcar terminal, liberando el H Dependiendo del producto deseado, se añadieron las glicosiltransferasas apropiadas a una concentración de
antígeno tipo I tri- MU. Posteriormente, una α- fucosidase (afca 36 ), una 100 μ g ml - 1: para el tipo I CgtB, S42 y Te2FT; para el tipo II, HP0826 y WbgL; para el tipo IV, LgtD y Te2FT
β- galactosidasa (BgaC 34 ) y una β- hexosaminidasa (Sphex 37 ) escindirá los azúcares residuales en exo-manera, hasta que se (Tabla 17). La reacción se realizó a 37 ° C y el progreso se controló mediante TLC (fase móvil, acetato de etilo /
libera alcohol 4-metilumbeliferil; detectable como un aumento de la fluorescencia. Para lograrlo, 50 μ g ml - 1 de cada enzima se metanol / agua con una relación de 6: 2: 1), con detección a través de la luz ultravioleta (360 nm) después de
añadió a la mezcla de reacción. Todos los impactos positivos por encima de un cierto umbral se volvieron a cribar por 10% de H 2 ASI QUE 4 de inmersión y calentamiento. Cuando la reacción se había detenido, la mezcla se aplicó a
triplicado y se utilizó una cepa de célula huésped que contiene un vector que carece de cualquier inserto como control una columna de HF Bond Elut C18, se lava con varios columna
negativo. Todos los impactos comprobados fueron almacenadas por separado en - 70 ° C

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volúmenes de 5% de metanol, y el producto se eluyó con 25% de metanol. Después, el disolvente se eliminó Para determinar el pH óptimo para la desacetilasa, fp GalNAcDeAc (5 μ g ml - 1)
a vacío. y 50 μ MA tipo1 antígeno penta MU se pre-incubó durante 10 min a 37 ° C en tampón de fosfato de sodio 25
mM a una serie de valores de pH (5,8 a 10,0). La reacción se inactivó con 100 mM de tampón de fosfato
Un tipo de antígeno 1/2/4 tetra la síntesis de MU. La etapa de síntesis final se realizó utilizando 10 mg H de sodio pH 7,5, 100 μ M EDTA, 5 μ g ml - 1 fp GalNase, 50 μ g ml - 1 Sphex, 50 μ g ml - 1 Afca y 50 μ g ml - 1 BgaC,
antígeno tipo 1/2/4 tri- MU en 5 ml Tris 50 mM / HCl, NaCl 200 mM, pH 7,4, mM MnCl 10 2, 25 U de fosfatasa volumen final 100 μ l. La señal de fluorescencia (365/435 nm) que resulta de la liberación MU por hidrólisis
alcalina, 1,5 equivalente UDP-GalNAc y 100 ug ml - 1 BgtA (Tabla 17) a 37 ° C. El progreso se siguió se controló mediante un lector de placas de Synergy H1 (BioTek) durante 30 min a 37 ° C.
mediante TLC, y una vez completa, la mezcla de reacción se aplicó a una columna de HF Bond Elut C18,
se lava con varios volúmenes de columna de metanol al 5%, y el producto se eluyó con 25% de metanol.
Después, el disolvente se eliminó a vacío y el producto final, se disolvió en agua, se purificó
adicionalmente en un 1,5 × 46 cm columna de exclusión HW-40F tamaño- y luego se liofiliza. inhibición FpGalNAcDeAc. Diferentes potenciales inhibidores de fp GalNAcDeAc se ensayaron en formato de
placa de 96 pocillos usando el ensayo acoplado. La reacción se realizó en un 100 μ l escala a 37 ° C con 50 μ MA
tipo1 antígeno penta MU y 5 μ g ml - 1

fp GalNAcDeAc en mM NaH 100 2 correos 4 pH 7,4 con 10 μ g ml - 1 fp GalNase, 50 μ g ml - 1


B antígeno tipo 1/2/4 tetra la síntesis de MU. La etapa de síntesis final se realizó utilizando 10 mg H antígeno tipo Sphex, 50 μ g ml - 1 Afca, 50 μ g ml - 1 BgaC. EDTA (1, 10, 100 μ M), marimastat (1, 10,
1/2/4 tri- MU en 5 ml Tris 50 mM / HCl, NaCl 200 mM, pH 7,4, 25 U de fosfatasa alcalina, 1,5 equivalente 100, 1000 μ M), dimetilsulfóxido (2%, 4%) y cóctel inhibidor de proteasa EDTA libre (Pierce) (1 ×, 2 × y 4 x) se ensayaron
UDP-Gal y 100 μ g ml - 1 BoGT6a (Tabla 17) a 37 ° C. progreso de la reacción se siguió mediante TLC, y una como inhibidores. La fluorescencia (365/435 nm) se monitorizó continuamente durante 1 h usando un lector de
vez completa, la mezcla de reacción se aplicó a una columna de HF Bond Elut C18, se lava con varios placas de Synergy H1 (BioTek). Aquellos compuestos o mezclas que muestran fuertes efectos inhibidores se
volúmenes de columna de metanol al 5%, y el producto se eluyó con 25% de metanol. Después, el disolvente ensayaron de nuevo sin las enzimas acopladas y la formación de producto se analizó mediante TLC, para
se eliminó a vacío y el producto final se disolvió en agua y se purificó adicionalmente en un 1,5 × 46 cm de asegurarse de que la inhibición observada no era de las enzimas de acoplamiento.
columna de exclusión de tamaño HW-40F, a continuación, se liofiliza.

FpGalNAcDeAc influencia de metal divalente. fp GalNAcDeAc se incubó con EDTA 2 mM durante 10 min
a temperatura ambiente en mM Tris / HCl pH 7,4 50; a continuación, la proteína se lavó una vez con 100 μ
GalN antígeno tipo 1 penta la síntesis de MU. Un tipo de antígeno 1 penta MU (10 mg) se incubó con 1 μ g ml - 1 fp GalNAcDeAc
M EDTA, dos veces con 100 nM EDTA, tres veces sin EDTA, todo en Tris 50 mM / HCl pH 7,4, usando
en 5 ml mM NaH 100 2 correos 4 a 37 ° C durante 30 min y después la reacción se detuvo mediante la adición Amicon Ultra-
de EDTA 1 mM. La conversión completa del sustrato se confirmó mediante TLC y la mezcla de reacción se 0,5 ml unidades de filtro centrífugo (MWCO 10 kDa; Millipore). Los tampones utilizados fueron pre-tratados con
aplicó a una columna de HF Bond Elut C18, se lava con varios volúmenes de columna de metanol al 2%, y Chelex 100 (Bio-Rad). A 1 μ g ml - 1 muestra de tratada con EDTA
luego el producto se eluyó con 10% de metanol. Después, el disolvente se eliminó a vacío. fp GalNAcDeAc se incubó con 1, 5 y 10 μ M concentraciones de cada uno de MgCl 2, MnCl 2, CaCl 2, CoCl 2, NiCl 2, CuCl
2, FeCl 2 o ZnCl 2 individualmente durante 10 min a 37 ° C. Después de la incubación, 10 μ g ml - 1 fp GalNase, 50 μ

g ml - 1 Sphex, 50 μ g ml - 1

Afca, 50 μ g ml - 1 BgaC y 50 μ MA tipo1 antígeno penta se añadieron MU. La fluorescencia (365/435 nm) se
Purificación de proteínas. Todas las proteínas y sus truncamientos fueron clonados a través de la puerta de oro monitorizó continuamente durante 1 h a 37 ° C utilizando un lector de placas de Synergy H1 (BioTek).
clonación 43 o clonación TUBO 45 en vectores pET16b o pET28a. Las secuencias de cebadores se indican en la Tabla Como controles, no de metal, EDTA y 2 mM no
suplementaria 16. fp GalNAcDeAc más 50 μ M GalN tipo1 antígeno penta Se han usado MU como sustrato.
La producción de proteínas para la caracterización extendido se realizó en células BL21 (DE3), se cultivaron en
medio de inducción de auto 200 ml ZY5052 44 durante 20 horas a 37 ° C y 220 rpm inoculado con 100 μ l de un cultivo espectroscopía de dicroísmo circular y la predicción-estructura secundaria. fp GalNAcDeAc (0,17 mg ml - 1) y fp GalNase
de LB durante la noche. Las células se recogieron por centrifugación (4.000 sol, 4 ° C, 10 min) y se resuspendieron en (0,29 mg ml - 1) se dializaron en NaH 5 mM 2 correos 4.
10 ml de tampón de lisis (50 mM Tris / HCl, NaCl 150 mM, 1% (v / v) de glicerol, imidazol 40 mM, pH 7,4, ditiotreitol 2 datos espectroscópicos de dicroísmo circular se adquirieron en un espectrofotómetro de CD Jasco J-815 con los
mM (DTT), 1 × Inhibidor de la proteasa libre de EDTA (Pierce), 2 U Benzonase (Novagen), 0,3 mg ml - 1 lisozima, MgCl siguientes parámetros: Rango de medición 190-250 nm, velocidad de 50 nm min - 1, Paso 0.5, las exploraciones de 10, la
10 mM 2), seguido por tratamiento con ultrasonidos (duración del impulso de 3 min; pulso 5 s, 10 s de pausa, 35% de temperatura ambiente. Los datos obtenidos fueron interpretados con el BeStSel herramienta web ( http://bestsel.elte.hu/index.php
amplitud) en hielo. Después de la eliminación de los restos celulares por centrifugación (14.000 sol, 4 ° C, 30 min), se ).
recogió el sobrenadante y se cargó en una columna de cromatografía de afinidad de níquel (5 ml columna HisTrap
HP (GE)) usando una bomba peristáltica. La elución se llevó a cabo y se controló en un sistema AKTApurifier (GE) ensayo de HPAE-PAD. El análisis de la liberación enzimática de galactosamina se llevó a cabo en una
con un gradiente 10-75% de Tris 50 mM / HCl, imidazol 400 mM, pH 7,4, DTT 2 mM. Las fracciones que contienen la HPAE-PAD (Dionex) sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento. actividad de escisión de las
proteína se identificaron por electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida (PAGE) y después se agruparon. El cambio diferentes proteínas fue probada en los siguientes sustratos: 7,5 μ sol μ l - 1 mucina de porcino de tipo II estómago
de tampón en Tris 50 mM / HCl, NaCl 150 mM, pH 7,4, DTT 2 mM y la concentración se realizaron en 15 en mM NaH 100 2 correos 4
Ultra-unidades Amicon centrífugas de filtro (MWCO 10 kDa; Millipore). pH 7,4; 5 mM Un antígeno de tipo 1 penta MU en mM NaH 100 2 correos 4 pH 7,4 y los glóbulos rojos (50% de hematocrito)
de +, B + y de tipo O donantes A en 1 × PBS pH 7,4. Las muestras que contienen 10 μ g ml - 1 enzima se incubaron
durante 2 h a 37 ° C y después se almacenó a
- 80 ° C para su posterior análisis. Pequeñas alícuotas de la reacción (10 μ l) se diluyeron en H 2 O (100 μ l) y
sometido a análisis en el instrumento HPAE-PAD. La separación se realizó en una columna CarboPac PA200 (150
fp GalNAcDeAc, fp GalNase y sus truncamientos se sometieron a una segunda ronda de purificación. mm) con una columna de guardia, y la detección se logró utilizando un oro desechable en el electrodo de
Amicon Ultra-15 unidades de filtro centrífugo (MWCO 10 kDa; Millipore) fueron utilizados para intercambiar los politetrafluoroetileno y una forma de onda de cuatro potencial. Las condiciones de separación fueron las
tampones antes de cargar las proteínas en una columna de cromatografía de interacción hidrófoba (10 ml siguientes: hidróxido de sodio 100 mM y un gradiente de acetato de sodio a partir de 70 a 300 mm por encima del
columna de alto rendimiento de fenil Sepharose (Pharmacia Biotech)). Carga, lavado y elución (gradiente primero 10 min de la separación. El eluyente se llevó a cabo en las condiciones finales de gradiente para 1 min y
0-100%) de la columna se manejan a través de un sistema de AKTApurifier (GE), utilizando las siguientes después volvió a las condiciones de partida durante la próxima hora. La velocidad de flujo fue de 1,0 ml min - 1 y una
condiciones de tampón: fp GalNAcDeAc; 1 vinculante × PBS, NH 800 mM 4 HPO 4, pH 7,4 y la elución 1 × PBS, pH 7,4inyección se hizo cada 27 min. Un estándar de los azúcares libres GalNAc, Gal y GalN (10 μ M) se aplicó también a
y fp GalNase; unión mM Tris 25 / HCl, 1 M NaCl, pH 7,4 y la elución 25 mM Tris / HCl pH 7,4. Las fracciones que HPAE-PAD para determinar el tiempo pico de elución para la referencia.
contienen la proteína se identificaron mediante SDS-PAGE y luego se agruparon. El cambio de tampón en Tris
50 mM / HCl, NaCl 150 mM, pH 7,4 y la concentración se llevó a cabo usando Amicon Ultra 15-unidades de filtro
centrífugo (MWCO 10 kDa; Millipore).
Los ensayos cinéticos. Todos los ensayos cinéticos utilizando 4-metilumbeliferona como el grupo saliente se
realizaron a través de la medición de fluorescencia. Para evitar errores de medición basados ​en el efecto de
filtro interno 46 , curvas estándar se utilizaron para validar el intervalo lineal de la fluoróforo.
la caracterización de proteínas. valor de pH óptimo. El intervalo de pH general de la actividad de fp GalNAcDeAc
y fp GalNase para A tipo1 antígeno penta MU y GalN tipo1 antígeno penta MU, respectivamente, se determinó mediante
el control de la formación de producto a diferentes valores de pH por análisis TLC. La reacción se realizó en 100 μ l FpGalNAcDeacetylase. parámetros de Michaelis-Menten se determinaron para un tipo de antígeno 1 penta MU en mM
escalas a 37 ° C con 50 μ sustrato M y 1 μ g ml - 1 enzima en el sistema tampón apropiado. Tampones para el rango NaH 100 2 correos 4, pH 7,4 a 37 ° C usando los ensayos acoplados descrito anteriormente 30 . El ensayo se modificó para

de pH 4 a 6 se basan en una cítrico tampón de citrato / ácido de sodio 50 mM, tampones para el intervalo de pH permitir la detección de la escisión del tipo 1 (y más tarde tipo 4) antígeno, mediante el uso de BgaC 34 en lugar de
BgaA 35
de 6-8 se basaron en un tampón de fosfato de sodio 50 mM y tampones para el rango de pH 8-10 se basan en
un tampón de hidróxido de glicina 50 mM / sodio. como el β- galactosidasa. Además, puesto que un tipo de antígeno 1 penta MU contiene un galactosa
adicional, la concentración de BgaC se aumentó a 0,2 mg ml - 1 para compensar su necesidad de escindir
tanto el Gal- β- 1,3- β- GlcNAc- β- 1,3-Gal- β- MU y Gal- β- MU. Promover, fp Galactosaminidasa se incluyó para
Para determinar el valor pH óptimo de la galactosaminidasa, fp GalNase (5 μ g ml - 1) se incubó en 100 μ l de permitir la escisión del intermedio galactosamina que contiene. Reacción configuración en 100 μ l fue de 3
tampón de fosfato de sodio 50 mM que contenía 200 μ M GalN- α- pNP en una serie de valores de pH (5,8 a 8,0). nM
La absorción (a 405 nm) que resulta de pag liberación NP se controló mediante un lector de placas de Synergy H1 fp GalNAcDeacetylase (4,52 nM fp GalNAcDeAc_D1ext, 3,55 nM fp GalNac- DeAc_D1 + 2) y 0,01
(BioTek) durante 1 h a 37 ° C y se corrigieron los resultados para el coeficiente de extinción a cada valor de pH. mg ml - 1 fp Galactosaminidasa, 0,1 mg ml - 1 Sphex, AFCA,
0,2 mg ml - 1 BgaC y concentraciones variables de sustrato (5 μ M-2,5 mM). Las reacciones se llevaron a cabo como una
serie de cuatro, con los controles (sin fp GalNAcDeacetylase) como

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duplicados. La señal de fluorescencia (365/435 nm) que resulta de la liberación MU por hidrólisis se controló en un el protocolo sugerido por el fabricante. La proteína se purificó a continuación por la columna HisTrap FF y
lector de placas de Synergy H1 (BioTek) y se convierte en unidades de concentración utilizando MU curvas de se recogió el flujo a través, un intercambio de tampón en 10 mM Tris pH 8,0 NaCl + 75 mM, y se
concentración estándar determinada en condiciones de reacción idénticas. Las velocidades iniciales ( μ Sra - 1) se concentró a 12 mg ml - 1.
determinaron y se representaron en Grafit 7,0 para determinar los parámetros cinéticos.
Cristalización. fp GalNAcDeAc_D1ext (12 mg ml - 1) se cristalizó mediante el uso del método de difusión de gota
k gato/ K METRO parámetros fueron determinados para un tipo de antígeno 1/2/4 tetra MU a pH 7,4 a 37 ° C. Las colgante usando una solución de reserva compuesta de 0,2 M CaCl 2, 0,1 M MES pH 6, 18% de PEG 4000 y
reacciones (volumen total de 100 μ l) se realizaron en negro pozos de 96 placas y como ensayos acoplados en MnCl 20 mM 2 en una relación 1: 1 de proteína / depósito. A bromuro de rápida remojo fue utilizado para
mM NaH 100 2 correos 4 ( pH 7,4) con 12 nM derivatizar cristales para la eliminación y se preparó mediante la transferencia del cristal a una solución de 1 M
fp GalNAcDeacetylase, 0,1 mg ml - 1 Sphex, BgaC (BgaA para el tipo 2), afca, a concentraciones variables de sustrato NaBr, 25% de glicerol, 18% PEG4000, CaCl 20 mM 2 y 0,1 M MES pH 6 durante 30 s y flash-congelado en
(25 μ M, 20 μ M, 15 μ M, 10 μ M, 7,5 μ M, 5 μ METRO). Las reacciones se llevaron a cabo como una serie de cuatro, con nitrógeno líquido. complejos de Crystal con el trisacárido antígeno del grupo sanguíneo B (B_tri) se prepararon
los controles (sin fp GalNAcDeacetylase) como duplicados. La señal de fluorescencia (365/435 nm) que resulta de la como análogos estables del sustrato natural, que de otro modo por hidrolizado, por preincubación de la proteína
liberación MU por hidrólisis se controló en un lector de placas de Synergy H1 (BioTek) y se convierte en unidades de (12 mg ml - 1)
concentración utilizando MU curvas de concentración estándar determinada en condiciones de reacción idénticas. Las
velocidades iniciales ( μ Sra - 1) se determinaron y se representaron en Grafit 7.0 para determinar la k gato/ K M ( s - 1 mM - 1) parámetros.
con B_tri 10 mM durante 2 h antes de la creación de gotas en las mismas condiciones que el anterior, pero
omitiendo MnCl 2. Los cristales se cryoprotected con solución de depósito suplementado con 25% de glicerol.

FpGalNase. parámetros de Michaelis-Menten se determinaron para GalN tipo1 antígeno penta MU y A tipo1 antígeno penta La recolección de datos, escalonamiento y determinación de la estructura. Los conjuntos de datos para el derivado Br
MU en mM NaH 100 2 correos 4, pH 7,4 a 37 ° C. La reacción se realizó en 100 μ volúmenes l que contienen 3,4 nM fp GalNase
y complejo B_tri de la fp cristales GalNAcDeAc_D1ext se recogieron en la línea de luz canadiense Fuente de luz
(5,31 nM fp GalNase_truncA), 0,1 mg ml - 1 Sphex, afca, 0,2 mg ml - 1 BgaC y concentraciones variables de sustrato (5 μ 08ID-1 en longitudes de onda de 0,919 Å y 0,979 Å, respectivamente. Los datos fueron integrados utilizando XDS 47 y
M-2 mM). Las reacciones se llevaron a cabo como una serie de cuatro, con los controles (sin fp GalNase) como escalado con Aimless 48 . longitud de onda de un solo ajuste de fase de dispersión anómala y solución de estructura
duplicados. La señal de fluorescencia (365/435 nm) que resulta de la liberación MU por hidrólisis se controló automatizada se realizó utilizando CRANK2 49 en el conjunto de programas CCP4i2 50 . Estructura fue comprobado y
usando un lector de placas de Synergy H1 (BioTek) y los resultados se convirtieron a unidades de concentración refinado usando ciclos alternos de Focha 51 y Refmac 52 . El complejo de estructura B_tri fue resuelto por diferencia el
utilizando MU curvas de concentración estándar determinada en condiciones de reacción idénticas. Las análisis de Fourier y el ligando se construyó manualmente en Coot como eran los iones de agua y de metal. mapas
velocidades iniciales ( μ Sra - 1) se determinaron y se representaron en Grafit 7,0 para determinar los parámetros de densidad Diferencia confirmaron la presencia de Mn 2+ en la estructura apo y Ca 2+ en la estructura liganded. Los
cinéticos. modelos fueron validados por la focha y Molprobity 53 . estadísticas de recolección de datos y el refinamiento se
resumen en el cuadro complementario 10. coordenadas atómicas y factores de estructura de la apo y complejo B_tri
han sido depositadas en el Protein Data Bank (PDB) con los números de acceso 6N1A y 6N1B , Respectivamente.
Valores de k gato/ K METRO se determinaron para GalN tipo1 antígeno / 2/4 tetra MU y B tipo1 antígeno tetra MU a pH
7,4 y 37 ° C. Las reacciones (volumen total de 100 μ l) se llevaron a cabo en placas negras de 96 pocillos como
ensayos acoplados en mM NaH 100 2 correos 4
(PH 7,4) con 8,63 nM fp GalNase, 0,1 mg ml - 1 cada uno de Sphex, BgaC (BgaA para el Tipo 2) y afca, y
concentraciones variables de sustrato (25 μ M, 20 μ M, 15 μ M, 10 μ M, 7,5 μ M, 5 μ METRO). Las reacciones se cribado array Glycan. Para el cribado array glicano, 500 μ g de fp GalNAc- DeAc_D2ext se marcó con
llevaron a cabo como una serie de cuatro, con los controles (sin isotiocianato de fluoresceína (FITC) con una relación de fluoresceína / proteína de 1 usando el kit de
fp GalNase) como duplicados. La señal de fluorescencia (365/435 nm) que resulta de la liberación MU se controló conjugación Fluorotag FITC (Sigma). El cribado se realiza a 5 y 50 μ g ml - 1 las concentraciones de proteína
en un lector de placas de Synergy H1 (BioTek) y los resultados se convirtieron a unidades de concentración utilizando Facility Interacción núcleo de proteína-glicanos de la CFG con la versión 5.3 de la matriz
utilizando MU curvas de concentración estándar determinada en condiciones de reacción idénticas. Las impreso, que consiste en 600 glicanos en réplicas de 6. Análisis de motivos de unión se realizó con el
velocidades iniciales ( μ Sra - 1) WebTools https://glycopattern.emory.edu/ .
se determinaron y se representaron en Grafit 7.0 para determinar la k gato/ K M ( s - 1 mM - 1)
parámetros.
parámetros de Michaelis-Menten se determinaron para GalN- α- pNP en claros de 96 placas a 37 ° C mutagénesis sitio activo. Sobre la base de la información estructural (Fig. 4 ) Y la alineación de
usando 863,2 nM fp GalNase (en mM NaH 100 2 correos 4, pH 7,4) o secuencias (Fig complementario. 11 y en la Tabla suplementaria 12),
369,9 nM fp GH4 (en Tris 50 mM / HCl, pH 7,4, 100 μ M NAD +, mM MnCl 1 2) fp GalNAcDeAc_D1min y fp GalNase_truncA se mutaron utilizando el protocolo QuickChange 54 , usando los cebadores
y las concentraciones de sustrato de 10 μ M a 5 mM en un volumen de 100 μ l. Las reacciones se llevaron a cabo indicados en la Tabla complementario 16. Los mutantes se purificaron a través de columnas NiNTA y de HIC como se
como una serie de tres con dos controles (sin enzima). La absorción (a 405 nm) que resulta de pag liberación NP se describe anteriormente. La integridad estructural de todos los mutantes se comprobó mediante espectroscopía de dicroísmo
controló en un lector de placas de Synergy H1 (BioTek) y las tasas fueron convertidos a unidades de concentración circular; todas las enzimas ensayadas fueron estructuralmente similar a su tipo salvaje (Conjunto de datos complementario,
utilizando Tab 2). Para los mutantes con una actividad relativamente baja, las reacciones se llevaron a cabo bajo las mismas
pag- nitrofenol curvas de concentración estándar determinada en condiciones de reacción idénticas. Las velocidades condiciones usadas para las determinaciones cinéticas completas; sin embargo, se utilizó el método de agotamiento de
iniciales ( μ Sra - 1) se determinaron y se representaron en Grafit 7,0 para determinar los parámetros cinéticos. sustrato para la determinación de k gato/ K METRO valores como se ha descrito previamente 55 . En breve, a bajas concentraciones de
sustrato donde [Sustrato] < K M ( equivalente a ~ 1 / 5-1 / 10 de K METRO), la k gato/ K METRO valor se puede aproximar en ajuste no
lineal del curso del tiempo de reacción a una curva de primer orden y dividiendo por la concentración de enzima.
El análisis cinético de GH109 con diferentes sustratos un tipo. Valores de k gato/ K METRO para A tipo1 antígeno / 2/4 tetra
MU se determinaron a pH 7,4 y 37 ° C. Las reacciones (volumen total de 100 μ l) se realizaron en negro platess
96 pocillos y se lleva a cabo como ensayos acoplados en mM NaH 100 2 correos 4, pH 7,4 con 86,02 nM bv GH109_1,

100.49 nM em GH109, ​80,52 nM bv GH109_2, 87,4 nM B GH109 y 5 μ M NAD +, junto con 0,1 mg ml - 1 cada uno mapeo filogenético GH36. secuencias de referencia de GH36 fueron descargados de la base de datos mediante
de Sphex, BgaC (BgaA para el tipo 2), afca, y concentraciones variables de sustrato (25 μ M, 20 μ M, 15 μ M, 10 secuencias de comandos CAZy cazy_extract.pl de SACCHARIS 56 .
μ M, 7,5 μ M, 5 μ METRO). Las reacciones se llevaron a cabo como una serie de cuatro, con los controles (sin α- NORTE- software filogenético basado en perfiles de proteínas, TreeSAPP (disponible en
https://github.com/hallamlab/TreeSAPP ), Se utilizó para construir tanto las secuencias de consulta árbol de referencia
acetilgalactosaminidasa) como duplicados. La señal de fluorescencia (365/435 nm) que resulta de la liberación MU GH36 y colocar en el árbol filogenético. modelos ocultos de Markov (HMMs) de dbCAN se utilizaron para extraer
se controló en un lector de placas de Synergy H1 (BioTek) y las tasas fueron convertidos a unidades de dominios de la familia de proteínas de todas las secuencias de longitud completa descargados de CAZy 57 . Estas

concentración utilizando MU curvas de concentración estándar determinada en condiciones de reacción idénticas. secuencias fueron entonces agrupadas en 70% de similitud de secuencia utilizando UCLUST para eliminar las

Las velocidades iniciales ( μ Sra - 1) se determinaron y se representaron en Grafit 7.0 para determinar la k gato/ K METRO secuencias similares y disminuir el tamaño del árbol para la colocación más rápido 58 . RAxML versión 8.2.0 se utilizó para
construir el árbol de referencia de 738 proteínas con el '-autoMRE' para decidir cuándo dejar de fumar bootstrapping
(s - 1 mM - 1) valores. antes se han realizado 1000 repeticiones, y PROTGAMMAAUTO para seleccionar el modelo de sustitución de
amino-ácido óptima 59 , 60 .
proteólisis limitada. Para investigar si más pequeños, estables de subdominios
fp GalNase podría estar formado, se realizó una proteolisis limitada. fp GalNase se trató con termolisina (10: relación A continuación se usó treesapp.py de TreeSAPP para mapear las secuencias de consulta en el árbol GH36.
de masa de proteína 1 / proteasa) a diversas temperaturas (20 ° C, 37 ° C, 42 ° C, 50 ° C, y 65 ° C) durante 1,5 h. Brevemente, las secuencias de proteínas de consulta fueron alineados con el perfil GH36 HMM construido a partir de las
Las muestras luego se corrieron en un gel de SDS-PAGE y un fragmento estable se identificó con una masa de ~ 738 secuencias de referencia utilizando hmmsearch y las regiones alineadas se extrajeron 61 . hmmalign se utilizó para incluir
70 kDa (hacia abajo desde la inicial 118 kDa) con la digestión casi completa a esta forma logrado a la temperatura las nuevas secuencias de consulta en la referencia de alineación múltiple y luego TrimAl elimina las posiciones no
de incubación 50 ° C. Este fragmento fue enviado a la facilidad de la base proteómica UBC para la identificación de conservadas desde el archivo de alineación 62 . algoritmo de colocación evolutiva de RAxML se utilizó para identificar
péptidos y se determinó que era una versión C-terminal truncado de la proteína de longitud completa con un sitio posiciones óptimas de colocación en el árbol de referencia para cada secuencia de consulta. Las colocaciones se filtraron
de escisión entre los aminoácidos 690 y 700 (Fig. Suplementaria 18). en relación en peso probabilidad y concatenan en un archivo single.Jplace antes de ser visualizado en ITOL 63 , 64 .

Cristalografía. Antes de la cristalización, fp GalNAcDeAc_D1ext fue digerido con trombina (Novagen) a ensayos de conversión de RBC. La sangre entera de donantes sanos con consentimiento se recogió en un Vacutainer
una concentración de 1 mg ml - 1 durante la noche utilizando el con citrato, usando un protocolo aprobado por la ética clínicos

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comité de la Universidad de Columbia Británica. El tubo se centrifugó a 1000 sol durante 5 min a temperatura ambiente, y Junta Ética de Investigación de la Universidad de Columbia Británica (Núm. Identificación H07-02198) y de los Servicios de
los glóbulos rojos se separó y se lavó 3 veces con 1 × PBS pH 7,4. Para los ensayos en presencia de 40 kDa de dextrano, Sangre de Canadá (REB. No 2,017.029).
se lavaron los glóbulos rojos (200 μ l, 10% de hematocrito) se colocaron en un tubo, y el sobrenadante se elimina
parcialmente y se reemplazó con 1 × PBS pH 7,4 (concentración final de 300 mg ml - 1) con y sin 40 kDa dextrano. Además, Resumen de informes. Otros datos sobre la investigación está disponible en el Resumen de Investigación de la
algunos ensayos se realizaron en plasma pobre en plaquetas autólogo. Los glóbulos rojos se mezclaron cuidadosamente Naturaleza de informes relacionado con este artículo.
y se colocan en un agitador orbital durante 30 s. soluciones de enzima diluidas se añadieron a continuación a un volumen
final de 200 μ l. Los tubos se agitaron con vórtex muy suavemente, y se colocaron en un agitador orbital durante tiempos
Disponibilidad de datos
definidos a temperaturas establecidas.
Los conjuntos de datos generados y / o analizados durante este estudio están disponibles en el autor
correspondiente en solicitud razonable. Estructura de conjuntos de datos generados durante el estudio están
disponibles en el repositorio con los números de AP
6N1A y 6N1B . la proteína do spGH36 identificado durante el estudio actual se deposita en
tarjetas MTS. Después de la reacción, los glóbulos rojos se lavaron 3 veces con un exceso de 1 × PBS pH 7,4 y se
GenBank bajo el código de adhesión MK500922 .
analizó usando MTS tarjetas (ID-MTS Gel Tarjetas de Ortho Clinical Diagnostics). Para A mecanografía, MTS
Anti-A (monoclonal murino) Card Agrupación Reactivos Blood (prod. No. MTS080014) se utilizaron y para B
Recibido: 27 Diciembre de 2018; Aceptado: 25 de abril 2019; Publicado: xx
escribiendo (prod. No. MTS080015) se utilizaron MTS Anti-B (monoclonal murino) Tarjetas de Agrupación de
Reactivos de sangre . RBCs (12 μ l, 5% de hematocrito), suspendido en diluyente (MTS), se añadieron xx xxxx
cuidadosamente a la columna de gel mini, dejando un espacio entre la sangre y el contenido de la mini gel. Las
tarjetas de MTS se centrifugaron a 156 sol referencias
1. Daniels, G. La definición molecular de antígenos de células rojas. ISBT Sci. Ser. 5,
durante 6 min a temperatura ambiente usando una centrífuga Beckman Coulter Allegra X-22R con un soporte de muestra 300-302 (2010).
modificada como se recomienda. El grado de eliminación de antígeno de la superficie de la RBC se evaluó a partir de la 2. Garratty, G. La modulación de la membrana de los glóbulos rojos para producir glóbulos rojos del donante universal / stealth
ubicación de los glóbulos rojos en el mini gel después de la hilatura, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los adecuados para la transfusión. Vox Sang. 94, 87-95 (2008).
glóbulos rojos con una concentración de antígeno de superficie alta aglutinadas en la interacción con el anticuerpo 3. Goldstein, J., Siviglia, G., Hurst, R., Lenny, L. & Reich, L. Grupo-B eritrocitos convierte
monoclonal presente en la columna de gel y no podían penetrar (MTS puntuación de 4). RBCs sin antígenos de superficie enzimáticamente a Grupo-O sobrevivir normalmente en A, B, y O individuos. Ciencia 215, 168-170
no lo hicieron aglutinan y migraron a la parte inferior de la mini gel (MTS puntuación de 0). Los glóbulos rojos que fueron (1982).
sometidos a la eliminación parcial de antígenos de superficie migrado a posiciones entre estos y fueron asignados 4. Kruskall, MS et al. Transfusion al grupo sanguíneo pacientes A y O de grupo RBCs B que han sido
puntuaciones entre 0 (no presente) y 4 (presente) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. enzimáticamente convertido al grupo O. Transfusión 40,
1290-1298 (2000).
5. Clausen, H. & Hakomori, S. Abh y antígenos del grupo histo-sanguíneo relacionados
- diferencias inmunoquímicas en isotipos de portadoras y su distribución.
ensayos de aglutinación para el antígeno H. Para analizar la conversión de un antígeno a H antígeno después del Vox Sang. 56, 1-20 (1989).
tratamiento enzimático, se lavó RBCs A-antígeno escindido (10% de hematocrito) se mezclaron en partes iguales con 6. Liu, QP et al. glicosidasas bacterianas para la producción de glóbulos rojos universales. Nat.
2 μ g ml - 1 se controló y la aparición de aglutinación dentro de un marco de tiempo de 30 min: anticuerpo anti-H (cat no Biotechnol. 25, 454-464 (2007).
ab24213 (Abcam) anticuerpo anti-Blood Group H ab antígeno (97-I).). Los glóbulos rojos que se sometieron a la 7. Anderson, KM et al. A clostridial endo-beta-galactosidasa que glycotopes escinde
aglutinación con el anticuerpo anti-H se asignaron puntuaciones entre 0 (sin aglutinación dentro de 1.800 s) y 5 ambas grupo sanguíneo A y B. J. Biol. Chem. 280,
(aglutinación dentro de los 120 s). 7720-7728 (2005).
8. Kwan, DH et al. Hacia enzimas eficientes para la generación de sangre universal a través de la
estructura de guiado evolución dirigida. Mermelada. Chem. Soc. 137,
FACS. RBCs tratada con enzima se lavaron dos veces con 1 × PBS pH 7,4 y 1% de hematocrito RBC enzimáticamente 5695-5705 (2015).
convertidos fueron tratados con 1/100 APC-anti-Un anticuerpo (Alexa Fluor 647 de ratón anti-humano de grupo 9. Handelsman, J. Metagenomics: Aplicación de la genómica a microorganismos no cultivados. Microbiol.
sanguíneo A:.. Cat no 565384 (BD Pharmingen)) durante 30 min a temperatura ambiente , y / o tratadas con 1/100 de Mol. Biol. R. 68, 669-685 (2004).
anticuerpo anti-H (anticuerpo anti-antígeno del grupo sanguíneo H ab (97-I): cat. no ab24213 (Abcam)) durante 30 min a 10. Amann, RI et al. La combinación de sondas de oligonucleótidos 16S orientados ribosomal-RNA con
4 ° C y, a continuación, se lavaron una vez con 1 × PBS pH 7,4. Para la detección del anticuerpo anti-H, un secundario citometría de flujo para el análisis de poblaciones microbial- mixtos. Appl. Reinar. Microbiol. 56, 1919-1925
Alexa Fluor anticuerpo 488-etiquetado (de cabra anti-IgM de ratón (cadena pesada) anticuerpo secundario transversal (1990).
adsorbido, Alexa Fluor 488: Cat. No A-21042 (Invitrogen)) en un 1 : 300 la concentración se aplicó a temperatura 11. Tailford, LE, Crost, EH, Kavanaugh, D. & Juge, N. La mucina de forrajeo de glicanos en el microbioma
ambiente durante 30 min. La citometría de flujo se realizó después de la reconstitución en 1 × PBS pH 7,4 (1% de intestinal humana. Frente. Gineta. 6, 81 (2015).
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X-22R centrífuga (Beckman Coulter)) para la eliminación completa de plasma rico en plaquetas, se utilizaron para D490-D495 (2014).
establecer una puerta para la recogida de datos. La estrategia gating completo se presenta en complementario Fig. 19. 13. Konwar, KM et al. MetaPathwaysv2.5: cuantitativos mejoras funcionales, taxonómicos y
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residual Una actividad de escisión antígeno. Por lo tanto, A + eritrocitos de 1 donante fueron tratados con 5 o 20 μ 16. Chapanian, R. et al. Mejora de las reacciones biológicas en las superficies celulares a través de aglomeración
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se lavaron 3 veces con un exceso de 1 × PBS pH 7,4 y se analizaron. reacción El análisis se realizó en 50 μ l 1 × PBS17. Comfort, DA et al. El análisis bioquímico de Thermotoga maritima GH36
pH 7,4 con 0,1 mg ml - 1 Sphex, afca, BgaA y 500 μ sustrato M; Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado. La alfa-galactosidasa (TmGalA) confirma el carácter común mecanicista del clan glucósido
señal de fluorescencia (365/435 nm) que resulta de la liberación MU por hidrólisis se controló en un lector de hidrolasas GH-D. Bioquímica 46, 3319-3330 (2007).
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Whole conversión bolsa de sangre. La bolsa de sangre entera se recogió el 15 de enero 2.018 mil (c0510 18 expresión de un alfa- NORTE- gen acetilgalactosaminidasa de Clostridium perfringens.
990033 A +) y se mezcla con SAGM a un volumen final de 309 ml y 60% de hematocrito. Entonces 12 ml de FEMS Microbiol. Letón. 214,
cada uno de 2 mg ml - 1 fp GalNAcDeAc y fp se añadieron GalNase y la bolsa se masajeó manualmente durante 10 77-80 (2002).
min. La bolsa se incubó durante un período de 72 horas a 4 ° C y se tomaron muestras de 10 ml a las 24, 48 y 20. GERBAL, A., Maslet, C. & Salmon, C. Aspectos inmunológicos del antígeno B adquirida. Vox Sang. 28,
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Microbiología Naturaleza | www.nature.com/naturemicrobiology


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41. Treangen, TJ, Sommer, DD, Angly, FE, Koren, S. & Pop, secuencia de montaje siguiente
Contribuciones de autor
generación M. con AMOS. Curr. Protoc. bioinformática 33,
PR lleva a cabo la mayoría de la detección y caracterización de trabajo, así como la preparación de las figuras y
11.8.1-11.8.18 (2011).
tablas y proporcionar un primer borrador del manuscrito; LS cabo todo el trabajo relacionado con tridimensional
42. Hyatt, D. et al. Pródigo: el reconocimiento y la identificación de genes procariotas traducción del
análisis estructural; HM realiza la mayoría de las pruebas con los glóbulos rojos, en conjunción con IC, y contribuyó
sitio de iniciación. BMC Bioinformatics 11, 119 (2010).
a la redacción;
43. Engler, C., Kandzia, R. & Marillonnet, S. A una olla, un paso, el método de clonación de precisión con
CM-L. realiza gran parte del análisis bioinformática; SJH proporcionado experiencia en el análisis y la supervisión
capacidad de alto rendimiento. Más uno 3, e3647 (2008).
de la bioinformática metagenomic; JNK supervisó todos los trabajos relacionados con las pruebas con los glóbulos
44. Studier, FW producción de proteínas por la autoinducción en cultivos agitando de alta densidad. Protein Expr.
rojos y editado el manuscrito; SGW concibió el proyecto, supervisó la enzimología y coordinó la redacción del
Tratamient. 41, 207-234 (2005).
manuscrito.
45. Klock, HE, Koesema, EJ, Knuth, MW y Lesley, SA Combinando el método de extensión del cebador
polimerasa incompleta para la clonación y la mutagénesis con microscreening para acelerar los esfuerzos
de genómica estructural. proteínas 71, Conflicto de intereses
982-994 (2008). La Universidad de British Columbia ha solicitado una patente relacionada con esta obra en la que PR,
46. ​Palmier, MO & Van Doren, la determinación rápida SR de la cinética enzimática de fluorescencia: JNK y SGW son nombrados como autores.
superar el efecto de filtro interno. Anal. Biochem. 371,
43-51 (2007).
47. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr. re 66, 125-132 (2010). Información Adicional
48. Evans, Relaciones Públicas y Murshudov, GN ¿Qué tan bueno son mis datos y cuál es la resolución? Acta Información suplementaria está disponible para este trabajo en https://doi.org/10.1038/ s41564-019-0469-7 .

Crystallogr. re 69, 1204-1214 (2013).


49. Skubak, P. & Pannu, NS solución estructura de la proteína automática de datos de rayos X débiles. Nat. Reprints y permisos información está disponible en www.nature.com/reprints .
Commun. 4, 2777 (2013).
La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a la SGW
50. Potterton, L. et al. CCP4i2: la nueva interfaz gráfica de usuario a la suite de programas CCP4. Acta
Nota del editor: Springer Naturaleza se mantiene neutral con respecto a las reclamaciones jurisdiccionales en los mapas
Crystallogr. re 74, 68-84 (2018).
51. Emsley, P. & Cowtan, K. Focha: herramientas de construcción de modelos de gráficos moleculares. publicados y afiliaciones institucionales. © El Autor (s), bajo licencia exclusiva a Springer Naturaleza Limited 2019

Acta Crystallogr. re 60, 2126-2132 (2004).

Microbiología Naturaleza | www.nature.com/naturemicrobiology


investigación de la naturaleza | resumen de informes
Autor correspondiente (s): Stephen G. Withers Última

actualización por el autor (s) 9 abril, 2019

Resumen de informes
Investigación de la Naturaleza desea mejorar la reproducibilidad de la obra que publicamos. Esta forma proporciona una estructura para la consistencia y la transparencia en la información. Para más información sobre las

políticas de investigación naturaleza, véase Autores y árbitros y el Lista de verificación de la política editorial .

Estadística
Para todos los análisis estadísticos, confirman que los siguientes elementos están presentes en la leyenda de la figura, leyenda de la tabla, texto principal, o la sección Métodos. n / a Confirmado

El tamaño exacto de la muestra ( norte) para cada grupo / condición experimental, dada como un número discreto y unidad de medida Una declaración sobre si las

mediciones se tomaron a partir de muestras diferentes, o si la misma muestra se midió repetidamente la prueba (s) estadístico utilizado y si son de uno o dos caras

Sólo las pruebas comunes deben describirse únicamente por su nombre; describir las técnicas más complejas en la sección Métodos.

Una descripción de todas las covariables probado

Una descripción de ninguna hipótesis o correcciones, como las pruebas de normalidad y de ajuste para comparaciones múltiples Una descripción completa de los parámetros estadísticos, incluyendo la tendencia

central (por ejemplo, medios) o otras estimaciones básicas (por ejemplo, coeficiente de regresión) y la variación (por ejemplo, desviación estándar) o asociado estimaciones de incertidumbre (por ejemplo, intervalos

de confianza) Para la prueba de hipótesis nula, la estadística de prueba (por ejemplo, F, t, r) con intervalos de confianza, los tamaños del efecto, grados de libertad y PAG valor señaló

Dar valores P como valores exactos cuando sea adecuado.

Para el análisis Bayesiano, la información sobre la elección de distribuciones previas y la configuración de Monte Carlo de la cadena de Markov para diseños jerárquicos y complejos, la

identificación del nivel apropiado para ensayos y un informe completo de los resultados Las estimaciones de los tamaños del efecto (por ejemplo, Cohen de re, Pearson r), lo que indica la

forma en que se calcularon

Nuestra colección web en estadísticas para los biólogos contiene artículos sobre muchos de los puntos anteriores.

Software y el código
información sobre la política disponibilidad de código informático

Recopilación de datos La secuenciación se realizó por el Centro de Secuenciación del UBC (Vancouver, BC, Canadá) usando un sistema de iluminación MiSeq.

Análisis de los datos El análisis de datos se realizó mediante el siguiente software y los códigos: Trimmomatic, BWA, samtools, escritura bam2fastq, Megahit, minimus2, pródigo, paquete de software v2.5
MetaPathways, escritura SACCHARIS' cazy_extract.pl, TreeSAPP, HMM de dbCAN, RAxML versión 8.2. 0, UCLUST, PROTGAMMAAUTO, Software CytExpert 2.1, Python, CCP4i2,
XDS, sin objetivo, CRANK2, focha, Refmac y iTOL. Todos los guiones están disponibles en GitHub.

Para manuscritos que utilizan algoritmos o programas personalizados que son fundamentales para la investigación, pero aún no descrita en la literatura publicada, el software debe estar disponible para editores / colaboradores. Recomendamos encarecidamente a la deposición de código en un

repositorio de la comunidad (por ejemplo GitHub). Ver la Investigación de la Naturaleza directrices para la presentación de código y software para mayor información.

Datos

información sobre la política disponibilidad de datos

Todos los manuscritos deben incluir una declaración de disponibilidad de datos . Esta declaración debe proporcionar la siguiente información, en su caso:

- códigos de adhesión, identificadores únicos, o enlaces de Internet para los conjuntos de datos disponibles públicamente

- Una lista de figuras que han asociado los datos en bruto


de octubre de 2018

- Una descripción de cualquier restricción en la disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos generados y / o analizados durante este estudio están disponibles en el autor correspondiente en solicitud razonable. Estructura de conjuntos de datos generados durante el estudio están disponibles en el repositorio de
AP con los números de 6N1A y 6N1B. Los datos de secuencia para CspGH36 se deposita como código de acceso de GenBank "MK500922". Los datos en bruto para la espectroscopia de CD y la matriz de glicanos están disponibles en el
conjunto de datos suplementario.

1
investigación de la naturaleza | resumen de informes
informes-Field específica
Por favor seleccione la de abajo que es la mejor opción para su investigación. Si no está seguro, lea las secciones correspondientes antes de hacer su selección.

Ciencias de la vida De comportamiento y ciencias sociales La ecología, evolutivos y ambientales

Para una copia de referencia del documento con todas las secciones, consulte nature.com/documents/nr-reporting-summary-flat.pdf

diseño de estudio de ciencias de la vida


Todos los estudios tienen que revelan en estos puntos, incluso cuando la divulgación es negativo.

Tamaño de la muestra La biblioteca metagenómica creado se basa en el material fecal de un participante humano.

exclusiones de datos para los ensayos de aglutinación de anticuerpo anti-H (que se muestran en la Tabla suplementaria 12) 7 muestras de un + RBC fueron excluidos. Esos 7 muestras hicieron
mostrar ya altas puntuaciones de aglutinación de 4 a 5 contra el anticuerpo Anti-H en la reacción de control que fueron saturar el límite de detección del ensayo. H antígenos y antígenos A están presentes
en todos los A RBC y su perfil de presentación de superficie es fuertemente dependiente de los donantes.

Replicación Réplicas tuvieron éxito para todos los experimentos.

aleatorización aleatorización de la muestra no es relevante en nuestro estudio.

Cegador Cegamiento no es relevante en nuestro estudio.

Reporting para materiales, sistemas y métodos específicos


Requerimos información de los autores sobre algunos tipos de materiales, sistemas experimentales y métodos utilizados en muchos estudios. En este caso, indicar si cada material, sistema o método que aparece es relevante para su estudio.
Si no está seguro de si un elemento de la lista se aplica a su investigación, leer la sección correspondiente antes de seleccionar una respuesta.

Materiales y sistemas experimentales métodos


n / a participó en el estudio n / a participó en el estudio

Los anticuerpos Flujo chip-ss citometría de

líneas celulares eucariotas neuroimagen basada en RM

Paleontología

Animales y otros organismos participantes en

la investigación Humanos Datos clínicos

Los anticuerpos

Los anticuerpos utilizados 1) Alexa Fluor 647 de ratón anti-humano del grupo sanguíneo A, BD Pharmingen, 565384, NaM87--1F6, Lot 7.136.920, Clon: M89D3, Dilución: 1/100 (de la conc 0,2
mg / ml)
2) antígeno anticuerpo contra el grupo sanguíneo H ab, Abcam, ab24213, 97-I, Lot GR169458-15, Clon: 97-I, dilución: 1/100 (de la conc 100 ug a 1 mg / ml)

3) de cabra anti-IgM de ratón (cadena pesada) Cross-adsorbida anticuerpo secundario, Alexa Fluor 488, Invitrongen, A-21042, Lote 1964383, Clon: policlonal, dilución:
1/300 (de la conc 2 mg / ml)
4) RPE-conjugado monoclonal de ratón anti-CD235a humano, glicoforina A, Dako, F7078, JC159, Lot 20007847, Clon: JC159, dilución: 1/100

5) Alexa Fluor 647 de ratón IgG3, κ Control de isotipo, BD Pharmingen, 560803, J606, Lot 7.128.550, Clon: J606, dilución: 1/100 (de la conc 0,2 mg / ml)

6) IgM de ratón [B11 / 7] - control de isotipo, Abcam, ab91545, B11 / 7, Clon: b11 / 7, dilución: 1/100 (de la conc 100 ug a 0,1 mg / ml)
7) Isotipo Reactivo ratón IgG1 / RPE, Dako, X0928, Lot 20007084, Clon: DAK-G01, Dilución: 1/100

Validación 1) Grupo Blood Alexa Fluor 647 de ratón anti-humano A, ratón IgG3 κ, Flujo Cit, información pertinente para la validación se puede encontrar aquí:
http://www.bdbiosciences.com/eu/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-human-antibodies/cell- superficie antígenos / Alexa-Fluor -grupo
de octubre de 2018

-647-ratón-anti-humano-sangre-a-nam87-1f6 / p / 565384 #, citas: a) Blanchard D, Bruneau


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Med. 1999; 9 (3): 209-217. c) Walker RH, ed. Manual Técnico de la Asociación Americana de Bancos de Sangre. Arlington VA: 1990

2) antígeno anticuerpo contra el grupo sanguíneo H ab, IgM de ratón, ELISA WB IP Flow Cyt, información pertinente para la validación se puede encontrar aquí:
https://www.abcam.com/blood-group-h-ab-antigen-antibody- 97-i-ab24213.html? productWallTab = ShowAll # top-306
3) RPE-conjugado monoclonal de ratón anti-CD235a humano, glicoforina A, IgG1 de ratón κ, Flujo Cit, información relevante puede validación

2
puede encontrar aquí: https://www.agilent.com/store/productDetail.jsp?catalogId=R707801-2

investigación de la naturaleza | resumen de informes


participantes en la investigación humanos

información sobre la política estudios con participantes humanos de la investigación

características de la población La biblioteca metagenómica creado en este estudio se basó en el material fecal de un participante en la investigación humana masculina sana con el grupo sanguíneo
participante AB + .El no comer cualquier alimento que contiene prebióticos o probióticos, ni recibió ningún antibiótico 30 días antes de la recogida de muestras.

Reclutamiento El participante en la investigación humana fue elegido en base a su tipo de sangre. La participación fue voluntaria. El participante se le informó sobre el proyecto a través de
un "Participante Formulario de Información y Consentimiento", que tuvo que firmar.

supervisión ética La colección de muestras fecales humanas fue aprobado por la Clínica Junta de Ética de Investigación de la Universidad de Columbia Británica (ID: # H15-02967). La recolección de
muestras de sangre humana fue aprobado por la Clínica Junta de Ética de Investigación de la Universidad de Columbia Británica (ID: # H07-02198) y de los Servicios de Sangre de
Canadá (REB: # 2017.029).

Tenga en cuenta que la información completa sobre la aprobación del protocolo de estudio también debe proporcionarse en el manuscrito.

Citometría de flujo

parcelas

Confirma eso:

Las etiquetas de los ejes indican el marcador y fluorocromo utilizado (por ejemplo, CD4-FITC).

Las escalas de los ejes son claramente visibles. Incluir números a lo largo de ejes únicamente para trama inferior izquierda de grupo (un 'grupo' es un análisis de marcadores idénticos). Todas las parcelas son gráficos de contorno con

valores atípicos o parcelas pseudocolor.

Se proporciona un valor numérico para el número de células o porcentaje (con estadísticas).

Metodología

preparación de la muestra tratada con enzimas glóbulos rojos se lavaron 2 veces con 1 x PBS pH 7,4. Después de diluir las células a 1% de hematocrito, la enzima convertidos-RBCs fueron tratados con 1/100
APC-anti-Un anticuerpo (Alexa Fluor® 647 de ratón anti-humano de sangre Grupo A:. Cat no 565384 [BD Pharmingen]) durante 30 min a TA , y / o tratadas con 1/100 de anticuerpo anti-H
(anticuerpo anti-antígeno del grupo sanguíneo H ab [97-I]: cat. no ab24213 [Abcam]) durante 30 minutos a 4 ° C, después se lavó 1 vez con 1 x PBS pH 7,4 . Para la detección de los
anticuerpos anti-H anticuerpo un Alexa Fluor anticuerpo 488 marcado con secundario (de cabra anti-IgM de ratón (cadena pesada) Cross-adsorbida anticuerpo secundario, Alexa Fluor 488:
Cat. No A-21042 [Invitrogen]) en un 1 / 300 concentración se aplicó a TA durante 30 minutos. La citometría de flujo se realizó después de la reconstitución de la enzima convierte RBCs en 1 x
PBS pH 7,4 (1% de hematocrito) en un flujo CytoFLEX citómetro usando CytExpert Software 2. 1 [Beckman Coulter]. RBCs Naive en 1% de hematocrito, recogidas después de la centrifugación
de la sangre entera a 1000 g durante 5 minutos (Allegra X-22R centrífuga [Beckman Coulter]) para la eliminación completa de PRP (plasma rico en plaquetas), se utilizó para establecer una
puerta para la recogida de datos .

Instrumento CytoFLEX citómetro de flujo [Beckman Coulter]

Software Software CytExpert 2.1 [Beckman Coulter]

Flow abundancia de la población de la célula citómetro de muestras se prepararon con glóbulos rojos que fueron recogidos después de la eliminación completa de plasma rico en plaquetas después de
centrifugación de sangre total a 1000 g durante 5 minutos. 100% de la población RBC se utilizó para la evaluación de citometría de flujo. Para asegurar la pureza de la población de células que se

está evaluando, se utilizaron RBCS ingenuas para fijar una puerta para la recogida de datos. Los datos se recogieron únicamente para la población de células definida por la puerta.

estrategia de apertura de puerta RBCs Naive en 1% de hematocrito, recogidas después de la centrifugación de la sangre entera a 1000 g durante 5 minutos (Allegra X-22R centrífuga [Beckman
Coulter]) para la eliminación completa de PRP (plasma rico en plaquetas), se utilizó para establecer una puerta para la recogida de datos . Para confirmar la población
de células que se está evaluando es RBCs, las muestras de RBC no tratados fueron tratados con 1/100 RPE conjugado monoclonal de ratón anti-humano CD235a,
glicoforina A, Clone JC159 (cat no: R7078 [Dako]) a 4 ° C por 30 minutos y se evaluaron en un flujo CytoFLEX citómetro [Beckman Coulter] para ajustar una puerta
para la recogida de datos. Para antígeno 'positiva' A las muestras que expresan, se usó el grupo sanguíneo A y para la 'negativo' el antígeno A las muestras que
expresan, grupo sanguíneo O se utilizó como controles. 'Controlar'

Marque esta casilla para confirmar que una figura que ejemplifica la estrategia de compuerta se proporciona en la información complementaria.
de octubre de 2018

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