UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS

Facultad de Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales

Ingeniera Agroindustrial
Laboratorio De Biotecnología
DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO Y EL EFECTO DE FACTORES
AMBIENTALES EN UN CULTIVO BACTERIANO.

Arnold Stivens Otalora Vega Cód.: 117003726 Correo: arnold.otalora@unillanos.edu.co, Jesús Camilo Devia
Navarro2 Cód.: 117003709. Correo: jesus.devia@unillanos.edu.co, Kenneth Rodríguez Mahecha 3 Cód.:
117003735. Correo: kenneth.rodriguez@unillanos.edu.co

RESUMEN

Para el desarrollo de la práctica se llevó a cabo la siembra de la bacteria Pseudomonas (el día anterior),
la cual eventualmente se sembró en tres tubos de ensayo diferentes por cada grupo para un total de
18. Estos tubos se incubaron en intervalos de 10 minutos iniciando desde el tiempo 0 y se le midió la
transmitancia a cada uno en el espectrofotómetro calibrado a 660 nm. Una vez obtenidos todos los
valores de transmitancia, se calculó la densidad óptica de cada uno de estos valores y después se
graficó. La densidad óptica obtenida se comparó con la curva de crecimiento bacteriana aportada por
la docente a la cual se le calculó su número y tiempo de generación en donde se determinó que por
cada 32,52 minutos se generaba una bacteria. Mediante la comparación de estas dos gráficas, se pudo
concluir que los resultados obtenidos en el tiempo del que se dispuso en el laboratorio, no eran
suficientes para determinar el crecimiento de una bacteria, puesto que en la gráfica se pudo determinar
que el microorganismo apenas estaba iniciando su fase exponencial, por lo que resulto imposible
calcular correctamente su crecimiento.
Palabras Claves: Bacteria, transmitancia, espectrofotómetro, densidad óptica, curva.

ABSTRACT

For the development of the practice, a seeding of the Pseudomonas bacteria (the previous day) has
been carried out, which has been planted in the different test tubes for each group for a total of 18.
These tubes are incubated at intervals of 10 minutes starting from time 0 and measured the
transmission to each one in the spectrophotometer calibrated at 660 nm. Once all the transmission
values were calculated, the optical density of each of these values was calculated and then graphed.
The optical density was compared with the curve of bacterial growth provided by the teacher while
the number and generation time were calculated where it was determined that for every 32.52 minutes
a bacterium was generated. By comparing these two graphs, you can find the results in the laboratory,
in the laboratory, there are not enough to determine the growth of a bacterium, in the graph you can
determine that the microorganism was just beginning its exponential phase, so that it is not possible
to correctly calculate your growth.
Key words: Bacteria, transmittance, spectrophotometer, optical density, curve.

1
INTRODUCCIÓN
En esta práctica se buscó estudiar el
crecimiento de una bacteria en específico.
Según (Quistián, 2014) “Se define como
crecimiento el aumento de la cantidad de
constituyentes y estructuras celulares, cuando
hay crecimiento en ausencia de división
celular hay aumento en el tamaño y peso de la
célula. Mientras que cuando el crecimiento es
seguido de división de células hay un aumento
en el número de células”.
“Las bacterias se dividen por fisión binaria, a
través de la cual una célula madre al alcanzar
un determinado volumen se divide dando dos
células hijas. El proceso de fisión binaria
consiste en la auto duplicación del material
hereditario seguido de la repartición en las dos
células hijas, las que se separan por
estrangulamiento de la membrana celular y
formación de la pared celular”. (Benintende &
Sanchez )
Hay que tener en cuenta que para que las
bacterias puedan crecer exponencialmente,
requieren de una serie de condiciones o
factores ambientales para el desarrollo celular
y conformación de poblaciones y respecto a los conceptos físicos y
comunidades. Los factores pueden
diferenciarse en abióticos, referidos a aquellos
relacionados con aspectos propios del medio
donde se desarrollan, como la temperatura, el
pH, los gases respiratorios (O2 y CO2), las
radiaciones (lumínicas, sonoras,
electromagnéticas), la presión (atmosférica,
hidrostática, osmótica) y la presencia de
nutrientes y en bióticos, referidos a aquellos
relacionados con las interrelaciones que se dan
entre las diversas poblaciones y comunidades.
Además, este crecimiento bacteriano se puede
cuantificar mediante una curva de
crecimiento, tomando solo la fase exponencial
de la bacteria, la cual según (Quistián, 2014)
“se expresa como el tiempo de generación
2
“G”, y este se define como el tiempo que tarda
una población en duplicarse, los tiempos de
generación varían ampliamente entre los
distintos microorganismos”.
Teniendo en cuenta esta información, la
practica consistió en observar el crecimiento
de una bacteria (Pseudomonas) y determinar
por ciertos intervalos de tiempo, cada cuanto
se formaba un nuevo microorganismo.
OBJETIVO
General
Implementar el equipo de espectrofotometría
con el fin de realizar una curva de crecimiento
de un cultivo bacteriano y analizar la
influencia de los diversos factores ambientales
en este.
Específicos
 Capacitar al estudiante con en el
manejo del espectrofotómetro y sus
aplicaciones en el trabajo de
laboratorio.
 Familiarizar a los estudiantes con
químicos que permiten a la
espectrofotometría ser una
herramienta de análisis en el
laboratorio.
MARCO TEORICO
Crecimiento bacteriano
“En microbiología, la palabra “crecimiento”
se define como un incremento en el número de
células o de masa celular por unidad de tiempo
de una población microbiana” (Madigan,
1997).” Si un microorganismo es cenocítico,
es decir, multinucleado, en el que las
divisiones nucleares no se acompañan de
divisiones celulares, el crecimiento produce
un incremento de tamaño, pero no del número
de células. El crecimiento ocasiona un
aumento del número de células cuando los
microorganismos se multiplican por procesos
como gemación o fisión binaria. En este caso
las células individuales se agrandan y dividen
para originar dos células hijas de un tamaño
aproximadamente igual” (Prescott, 1999).
“El crecimiento de los cultivos bacterianos, a
pesar de la inmensa complejidad del
fenómeno, generalmente obedece a leyes
relativamente sencillas, las cuales hacen
posible definir ciertas características
cuantitativas del ciclo del crecimiento,
esencialmente las tres constantes del
crecimiento: crecimiento total, tasa del
crecimiento exponencial y crecimiento latente.
Estas definiciones no son puramente
arbitrarias y corresponden a elementos
fisiológicamente distintos del ciclo de
crecimiento” (McMeekin, 2002).
Influencia de los factores ambientales sobre el
crecimiento bacteriano
“El crecimiento bacteriano está influido
notablemente por la naturaleza química y
física de su ambiente. El conocimiento de estas
influencias ambientales permite controlar el
crecimiento microbiano y estudiar la
distribución ecológica de los
microorganismos” (Prescott, 1999). “De entre
los varios factores ambientales que pueden
tener influencia sobre el crecimiento
bacteriano podemos destacar los siguientes: la
temperatura, el pH, los solutos y la actividad
de agua (aw), la concentración de oxígeno, la
presión y la radiación; Las respuestas de las
bacterias a estos factores de crecimiento son
altamente reproducibles, permitiendo que las
respuestas sean resumidas como modelos
matemáticos” (McMeekin T. A., 1993)
3
Otros factores ambientales
“A parte de la temperatura, del pH y de la aw,
existen otros factores que influyen en el
crecimiento microbiano. Entre ellos está la
concentración de oxígeno, que en función de
la necesidad de su presencia o no para el
crecimiento, los microorganismos se pueden
clasificar en aerobios, los que necesitan de
oxígeno para su crecimiento, y anaerobios, los
que crecen en ausencia de él. Estos últimos
pueden ser clasificados en anaerobios
facultativos, cuando no necesitan de oxígeno
para crecer, pero que lo hacen mejor en su
presencia; anaerobios aerotolerantes, los que
pueden crecer bien tanto en la presencia o
ausencia de oxígeno; anaerobios estrictos u
obligados, los que no toleran en absoluto el
oxígeno; y microaerófilos, los que precisan
para su crecimiento niveles de oxígeno del
orden del 2 al 10 %, pero que son dañados por
el nivel del oxígeno atmosférico (20 %)”
(Madigan M. T., 1999).
Pruebas bioquímicas
“Las pruebas bioquímicas permiten
determinar las características metabólicas de
las bacterias objeto de identificación. Algunas
de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que
evalúan la presencia de una enzima
preformada y su lectura varía entre unos
segundos hasta unas pocas horas” (Fernández
Ana, 2010).
Prueba de catalasa
“La catalasa es un enzima presente en la
mayoría de los microorganismos que poseen
citocromos. Las bacterias que sintetizan
catalasa hidrolizan el peróxido de hidrógeno
en agua y oxigeno gaseoso que se libera en
forma de burbujas. El principal objetivo de
esta prueba es separar Micrococacceae
(positiva) de Streptococcus spp. y
Enterococcus spp. (negativa)” (Fernández EQUIPOS, MATERIALES Y
Ana, 2010) . REACTIVOS
“Capacidad de destruir los derivados tóxicos
del oxígeno generados por algunas bacterias
Equipos Materiales Cantidad
mediante la enzima catalasa que descompone
el peróxido de hidrógeno” (Naidu A.S., 1999).
Cultivo
Incubadora 1
bacteriano
La reacción positiva de la catalasa, implica
desprendimiento de oxígeno.
Tubos de
Espectrofotómetro 3
2 H2O2 → 2 H2O + O2 ensayo

Prueba de coagulasa Asa

Baño de María 1
bacteriológica

“Permite determinar la capacidad de coagular

Cámara de flujo Mechero
el plasma por la acción de la enzima 1
laminar con luz UV
coagulasa. Se utiliza para diferenciar S. aureus
(coagulasa positiva) de otras especies de
Staphylococcus. La prueba de la coagulasa en
tubo se puede leer tras incubación de 4h, pero PROCEDIMIENTO
si es negativa debe incubarse hasta 24h”
(Fernández Ana, 2010).
Densidad óptica

“La Densidad óptica es la absorbancia por

unidad de longitud que recorre la luz al
atravesar la sustancia; La absorbancia es una
medida de la radiación que absorbe una
sustancia cuando sobre ésta incide las ondas
electromagnéticas generalmente en la región
visible de una determinada longitud de onda.
La absorbancia varía con la composición y la
concentración de los elementos en una
muestra, por lo que se emplea comúnmente en
la en química analítica para la caracterización
de líquidos y gases” (Salgado & Hernández.,
2014).
La medición de estos parámetros sirve para
identificar y determinar una enorme cantidad
de especies inorgánicas y orgánicas, lo que
hace de este método de medición uno de los
más importantes para el análisis cuantitativo
en laboratorios químicos (Salgado &
Hernández., 2014).

4
 ANÁLISIS DE RESULTADOS

2. Densidad Óptica = 2 − log(𝑇)

Ilustración 1. Siembra del microorganismo.
Densidad Óptica = 2 − log(93,2)

Densidad Óptica = 0,0306

3. Densidad Óptica = 2 − log(𝑇)

Densidad Óptica = 2 − log(91,2)

Densidad Óptica = 0,04

4. Densidad Óptica = 2 − log(𝑇)

Densidad Óptica = 2 − log(97,6)

Densidad Óptica = 0,0105

Tabla 1. Datos del Crecimiento Bacteriano.

5. Densidad Óptica = 2 − log(𝑇)

Transmitancia Densidad Densidad Óptica = 2 − log(95,9)

Tiempo (Min)
(%) Óptica
Densidad Óptica = 0,0182
0 100 0
20 96,3 0,0164
6. Densidad Óptica = 2 − log(𝑇)
40 93,2 0,0306
60 91,2 0,04 Densidad Óptica = 2 − log(94,7)
90 97,6 0,0105
Densidad Óptica = 0,0236
120 95,9 0,0182
130 94,7 0,0236
150 37,7 0,4236 7. Densidad Óptica = 2 − log(𝑇)
160 30,4 0,5171
Densidad Óptica = 2 − log(37,7)

Cálculos: Densidad Óptica = 0,4236

1. Densidad Óptica = 2 − log(𝑇) 8. Densidad Óptica = 2 − log(𝑇)

Densidad Óptica = 2 − log(96,3) Densidad Óptica = 2 − log(30,4)

Densidad Óptica = 0,0164 Densidad Óptica = 0

5
 Ilustración 2. Curva de Crecimiento Bacteriano

Durante la práctica, lo que se buscó fue es el porcentaje de transmitancia y a su vez su

determinar el crecimiento microbiano de una densidad óptica es mayor.
bacteria (Pseudomonas), para analizar los
Tabla 2. Recuento de crecimiento bacteriano
cambios que está sufre durante sus fases de
teórico.
latencia, exponencial, estacionaria y muerte.
Para ello, lo primero que se realizó fue la Recuento
siembra de la bacteria un día antes (Ilustración Tiempo (Min)
UFC/mL
1). Después se realizó la siembra del 0 3,E+05
microorganismo (en tres diferentes tubos de 10 4,E+05
ensayo por cada grupo, los cuales contenían 20 4,E+05
agar nutritivo) con ayuda del asa previamente 30 4,E+05
esterilizada. Posteriormente se incubaron los 40 4,E+05
tubos de ensayo con intervalos de 10 minutos 50 4,E+05
cada uno para eventualmente medir su 60 4,E+05
transmitancia en el espectrofotómetro
70 4,E+05
calibrado a 660 nm.
80 4,E+05
Una vez terminadas las mediciones de 90 4,E+05
transmitancia en cada intervalo de tiempo; se 100 5,E+05
calculó la densidad óptica de la bacteria con 110 5,E+05
dichos valores y después se graficó 120 5,E+05
(Ilustración 2). Cabe anexar que solo se 130 5,E+05
tomaron los valores de transmitancia que 140 6,E+05
tenían un orden descendente para que la 150 9,E+05
gráfica no presentara indeterminaciones, 160 1,E+06
puesto que se sabe que, a mayor tiempo, menor 170 1,E+06

6
Numero de Generaciones Recuento
teórico):
𝑟𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙
𝑛 = 3.3 log ( ) 𝐺=
𝑟𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑎𝑙
11,5𝑥105
𝑛 = 3.3 log ( ) 𝐺=
4,87𝑥105
𝑛 = 1,23145 ≅ 1
Ilustración 3. Curva de Crecimiento Bacteriano con datos suministrados por la docente.
Una vez obtenida la gráfica, se comparó con
los resultados teóricos del recuento en placa
(ya que son directamente proporcionales)
enviados por la docente tal y como se observa
en la tabla 2 e Ilustración 3.
Lo que se pudo observar es que la densidad
óptica que se obtuvo en el laboratorio en
comparación con el recuento en placa enviado
por la docente; no presentaban el mismo
crecimiento; puesto que en la Ilustración 2 se
alcanza a observar que apenas la bacteria
estaba iniciando su fase exponencial, mientras
que en la Ilustración 3 prácticamente estaba
7
Tiempo de generación (Recuento
teórico):
𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜
𝑁𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝐺𝑒𝑛𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑒𝑠
170 𝑚𝑖𝑛
1,23
40
𝐺=
1,23
𝐺 = 32,52
terminando. Por otro lado, hay que resaltar que
se calculó el número de generación y el tiempo
de generación de la tabla 2, en donde se obtuvo
un valor de 1,23 y 32,52 minutos; es decir que
cada 32,52 minutos se genera una bacteria en
la fase exponencial; pero para el caso de la
tabla 1, no se pudo realizar dicho calculo,
puesto que para ello se necesita el recuento
final e inicial de la fase exponencial, el cual no
se obtuvo durante la práctica. De esta forma se
puede deducir que el tiempo en el que se
realizó la práctica no es suficiente para medir
las fases de crecimiento de una bacteria, ya
que ni siquiera se pudieron obtener por
completo los datos de su fase exponencial.
Además, hay que resaltar que posiblemente en
la tabla 1 se presentaron esos valores
aleatorios precisamente porque los tiempos en
que se midió la transmitancia eran muy cortos
y hacían parte de su fase de latencia. Por ello
se puede decir que, para llevar a cabo un
análisis exacto de las fases de crecimiento de
una bacteria, es necesario usar intervalos de
tiempo más grandes además de un tiempo total
mucho mayor; ya que, según la docente, para
llevar a cabo este procedimiento
correctamente se requiere mucho más de 3
horas, el cual fue el tiempo disponible en el
que se realizó la práctica.
CONCLUSIONES
 Gracias a los valores obtenidos en
la tabla 1 y graficados en la
Ilustración 2, se puede deducir que
la bacteria Pseudomona, apenas
estaba iniciando su fase
estacionaria, por lo que no fue
posible calcular su número y
tiempo de generación.
 Al comparar los datos obtenidos,
con los de la docente, es posible
concluir que, para analizar el
crecimiento de un
microorganismo, se requiere de
mucho más tiempo; ya que como
se observa en la ilustración 2 y 3,
ninguna alcanzó su fase
estacionaria ni de muerte. Por ello
hay que tener en cuenta el tiempo
disponible para futuras prácticas.
 Aunque no se realizó en el
laboratorio, hay que resaltar que al
recuento en placa de la ilustración
8
3, si se pudo determinar el número
y tiempo de generación en donde
se determinó que por cada 32,52
minutos se generaba una bacteria;
lo cual nos da una idea aproximada
de cuál hubiese sido el crecimiento
de la bacteria que se trabajó en el
laboratorio.
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