UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

BIOQUÍMICA GRUPO LABORATORIO

FERMENTACION

03 DE JULIO DE

OBJETIVO
Detectar la presencia de Piruvato, como intermediario en el proceso de fermentación de
Glucosa por Levadura.
Examinar y discutir el proceso de fermentación láctica en tejido animal.

ALCANCE
El estudiante al finalizar la práctica estará en capacidad de discutir sobre las rutas
metabólicas de obtención de energía en ausencia de Oxígeno.

GENERALIDADES

INTRODUCCIÓN

Se ha sugerido que la vida se desarrolló en unas condiciones en las que no se disponía de

Oxígeno y los microorganismos obtenían la energía por descomposición de azúcares o
fermentación, por lo que el término (der. del latín, fervimentum, de fervere, hervir) se hace
equivaler a “vida sin oxígeno”. Actualmente, se reconocen varios productos de
fermentación y por tanto diferentes procesos fermentativos, entre ellos, la producción de
Etanol en Levadura y la formación de Ácido Láctico en tejido animal.

En ausencia de Oxígeno o con muy baja concentración de éste, la Levadura fermenta la

Glucosa hasta Etanol. Un intermediario en el proceso es Piruvato que es descarbonizado
hasta Acetaldehído y éste, a su vez, reducido a Etanol. Se requiere de condiciones ácidas
para que la enzima responsable de la descarboxilación, la Piruvato Descarboxilasa, actúe.

Si se modifica el pH del medio, a través de la adición de un tampón alcalino, la enzima se

inhibirá y el piruvato se acumulará. En tal caso, es posible detectarlo mediante su reacción
con 2,4-Dinitrofenilhidrazina, con la que forma, rápidamente, una hidrazona. El color rojizo
de ésta incrementa notablemente con la adición de NaOH.

RESUMEN

La práctica de laboratorio se desarrolló en dos fases; La primera se caracteriza ser la

conversión de la glucosa en piruvato, en la que se procede utilizando solución de glucosa y
suspensión de levadura en dos condiciones (alcalina y acida). Esta prueba requirió 1 hora.
La segunda trata de la detección del piruvato en la que se toman los tubos de ensayo con las
sustancias utilizadas en el primer proceso y se agrega una sustancia que permite, por medio
de la reacción expresada en el cambio de la coloración, detectar la cantidad de piruvato.

PROCEDIMIENTO

1) Conversión de la glucosa en piruvato.

2) Detección del piruvato.

DISCUSION DE LOS RESULTADOS

1) CONVERSION DE LA GLUCOSA EN PIRUVATO

Al crear la solución de glucosa y levadura ligeramente alcalina o acida en el tubo A y B

respectivamente, y al incubarlos durante una hora a 37ºC se observó que las soluciones
seguían siendo transparentes sin ningún otro cambio. Se llevaron los tubos a la incubadora
para proporcionarles el medio en el que se efectuaran las reacciones referentes al proceso
del glucolisis. Posteriormente se agitaron las sustancias contenidas en los tubos y se nivelo
el volumen de sustancia para que fuera igual en los dos sacando unos mililitros y
depositándolos en otros tubos de ensayo.

El proceso que se lleva a cabo en esta práctica se llama fermentación. Este se efectúa
partiendo del glucolisis que consiste en una serie de reacciones en la que se involucran
varios intermediarios. La reacción completa de una molécula de glucosa produce dos
moléculas de piruvato, dos moléculas de ATP y dos moléculas de NADH. Este último es un
cofactor que se encuentra en cantidades catalíticas (es necesario desoxidarlo para que no se
suspenda el proceso), y es utilizado por la cadena respiratoria para la obtención del ATP
produciendo de esta forma NAD+.

La glucolisis proporciona una cantidad de piruvato que puede tomar dos rutas metabólicas
anaerobias, eso depende del tipo de células que intervengan. Para este caso de la práctica de
laboratorio, se utilizaron soluciones alcalinas y acida de levadura respectivamente las
cuales a causa de su pH determinaron la cantidad de productos que se obtuvieron. En este
caso se presenta un proceso de fermentación el cual se caracteriza por ser una reacción de
obtención de energía en ausencia de oxígeno en el que el reactivo inicial es la glucosa y se
obtienen como productos una cantidad de piruvato y otra cantidad de etanol que se deriva
de la reacción del ácido pirúvico reducido a acetaldehído y que finalmente produce este
alcohol.

La fermentación alcohólica se caracteriza por que el ácido pirúvico formado por el

glucolisis se convierte de manera anaerobia en etanol. En este caso se libera dióxido de
carbono y se oxida el NADH reduciéndose a acetaldehido.la fermentación láctica por su
parte es un proceso al que recurren celulas como la musculares la cuales presentan
deficiencia en la obtención del oxígeno. Otras celulas como los glóbulos rojos también
recurren a la obtención de energía por este medio ya que no poseen mitocondrias que
realicen el proceso de respiración y obtenciones oxígeno. En esta reacción el NADH se
oxida y el ácido pirúvico se reduce transformándose en ácido láctico.

¿En cuál caso espera que se haya acumulado el piruvato? ¿por qué? A causa de que en
esta fase no se ha agregado un reactivo a las soluciones para determinar la cantidad de
piruvato acumulado en cada tubo, se deduce que la mayor cantidad se encuentra en el tubo
A ya que este contiene la solución alcalina de levadura y el piruvato tiende a concentrarse.
Para poder conseguir la acumulación del ácido pirúvico y poderlo detectar, la fermentación
se lleva a cabo en condiciones ligeramente alcalinas para inactivar la enzima piruvato
descarboxilasa. (En la fase 2 se explica con mayor detalle este proceso).
 2) DETECCION DEL PIRUVATO

Se utilizaron los tubos de ensayo A y B con las respectivas sustancias que se trabajaron en
la primera fase. Seguidamente se adiciono 1ml de 2,4-dinitrofenilhidrazina mezclándose
fuertemente. Posteriormente se añadió a cada tubo un 1ml de NaOH y se observó una
coloración naranja en cada tubo seguida de turbidez y una precipitación que se dio minutos
más tarde cuando esto se encontraban en reposo. En el tubo A que contenía la levadura en
condiciones acidas se precipito el piruvato que poseía un color naranja oscuro quedando el
etanol en gran proporción con un color naranja muy tenue. En el tubo B que contenía la
levadura en condición básica o alcalina el piruvato se precipito en mayor cantidad,
presentado un color naranja oscuro y el etanol se presentó en la superficie en una cantidad
menor en comparación a la primera sustancia con una coloración naranja muy tenue. En
este proceso es claro que la identificación de la acumulación de piruvato se hace por medio
de una prueba cualitativa de color.

Las observaciones anteriores se deben a que los intermediarios metabólicos como el

piruvato se encuentran presentes en bajas concentraciones, por lo tanto, para demostrar su
existencia como intermediarios en el proceso metabólico es necesario que se impida que
sean transformados en otro compuesto. Este procedimiento se realiza por medio del
bloqueo de la enzima que cataliza la conversión del compuesto por medio de inhibidores
como el pH. También se pueden cambiar las condiciones fisiológicas para que la enzima
funcione a baja velocidad con referencia a su actividad máxima usando un agente que
atrape el intermediario y que forme un compuesto que no pueda metabolizarse. La enzima
piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas como la de la
levadura que se agregó en el tubo A de esta manera el piruvato se acumula y su presencia se
demuestra por la reacción de la 2,4dinitrofenilhidrazina.
 3) OTRA RUTA FERMENTATIVA.

¿Dónde hay mayor producción de ATP: durante la producción de lactato o

durante la de etanol y CO2?

En las dos rutas metabólicas de la fermentación se producen 2 moléculas de ATP. Lo

que se observa en las reacciones globales de la refinación alcohólica y láctica
respectivamente:

En estas la molécula de glucosa reacciona y como resultado se obtienen los productos

entre los en que encuentran las moléculas de ATP presentándose un rendimiento neto.

¿Qué papel desempeña el NAD+ y el NADH durante las fermentaciones láctica y

alcohólica?

En el proceso de conversión de lactato interviene el NADH como una coenzima la cual

es un cofactor orgánico no proteico, termoestable que unida a una enzima conforma su
forma catalíticamente activa. De igual forma se presenta en la fermentación alcohólica.

El NAD+ se reduce a NADH cuando acepta dos electrones agotándose la energía.

Cundo el NADH libera sus electrones se recupera el NAD+, que de nuevo puede actuar
como coenzima.

El NAD+ se regenera para producir NADH utilizado en la glucolisis.

DISCUSION DE GRAFICOS

GRAFICO 1: Este grafico explica las 10 reacciones que utiliza la glucolisis para
producción de piruvato, las cuales se agrupan en dos fases: Fase1 de gasto energético de
hexosas, se caracteriza por ser degradativa, no es oxidativa y tampoco se produce ATP, por
el contrario, se consumen dos moléculas de ATP por cada glucosa. La fase2 de obtención de
energía o fase de las triosas es una etapa oxidativa en la que se oxida el NAD+ que se
transforma en NADH, formándose de esta manera cuatro moléculas de ATP por
transferencia de grupos fosfato al ADP.

GRAFICO 2: Reacción global de la glucolisis en la que se muestra como 1 molécula de

glucosa en presencia de 2 moleculas de ADP (10 reacciones enzimáticas), 2 moléculas de
NAD+ y 2 moleculas de Piruvato produce 2 moleculas de piruvato, 2 moleculas de ATP, 2
moleculas de NADH, 2 H+ y 2 moleculas de H2O.

GRAFICO 3: Reaccion del piruvato en el proceso de fermentacion láctica en el que el

piruvato en presencia del NADH y H+ por medio de la enzima lactato deshidrogenasa
produce lactato y NAD+. En esta reacción el NADH se oxida y el ácido pirúvico se reduce
transformándose en ácido láctico.

GRAFICO 4: Este grafico muestra la reacción de fermentacion alcohólica a partir del

piruvato producido en la glucolisis. En este proceso 1 molécula de glucosa en presencia de
2 ADP y 2 moleculas de PI produce 2 moleculas de etanol, 2 moleculas de CO2 y 2 ATP.
Este proceso se desarrolla en medio acido.

CONCLUSIONES

 La fermentacion alcohólica es un proceso necesario en la obtención del

etanol para la fabricación de vino y otras bebidas alcohólicas. El CO2 que se
obtiene como producto en es útil en la industria del pan ya que permite que la masa
se expanda.

 Mientras mayores sean las condiciones

anaerobias. Mayor será la calidad de la fermentación.

 La fermentación de los líquidos azucarados

produce alcohol. El grano de la cebada se fermenta en presencia de levadura y se
crea cerveza.

 La fermentación es propia solamente de los

microorganismos y de algunas levaduras.

 Se produce la fermentación en la mayoría de las

células de los animales, excepto en las neuronas que mueren rápidamente si no
pueden realizar la respiración celular.

 La fermentación es poco rentable si se compara

con la respiración aerobia, ya que a partir de una molécula de glucosa solo se
obtienen 2 moléculas de ATP, mientras que en la respiración se producen 36.

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