FACULDADE MAURICIO DE NASSAU

CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA

DISCIPLINA BIOLOGIA MOLECULAR
DOCENTE: Drª. VALESKA S. DE SENA PEREIRA

ATIVIDADE PRÁTICA ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Considere os sítios de restrição abaixo para o desenvolvimento da atividade.

Corte a faixa de papel com a sequência de DNA ao longo de suas bordas. Esta faixa representa uma
molécula de DNA de fita dupla. Cada sequência de letras representa a cadeia fosfodiéster, e as linhas
verticais entre os pares de base representam as pontes de hidrogênio entre as bases.

1. Você vai simular a atividade da EcoRI. Verifique ao longo da sequência do DNA 1 até você encontrar o
sítio da EcoRI. Faça cortes através da cadeia fosfodiéster justamente entre a G e a A do sítio de restrição
em ambas as fitas (não corte através de toda a faixa, lembre-se que a EcoRI corta a cadeia de cada fita de
DNA separadamente).

2. Agora separe as pontes de hidrogênio entre os sítios de corte, cortando através das linhas verticais.
Separe os dois pedaços de DNA. Escreva EcoRI nos finais cortados. Reserve. Analise os finais produzidos
pela EcoRI. Eles são cegos ou coesivos?

3. Repita o procedimento com a faixa 2, desta vez simulando a atividade da SmaI. Encontre o sítio da SmaI
e corte através do esqueleto fosfodiéster nos sítios indicados acima. Marque os novos finais com SmaI e
reserve. Há alguma ponte de hidrogênio entre os sítios de restrição? Os finais novos são coesivos ou
cegos?

4. Simule a atividade da HindIII com a faixa 3. Marque os novos finais com HindIII e reserve os fragmentos.
Estes finais são coesivos ou cegos?

5. Repita o procedimento com a faixa 4, simulando a EcoRI novamente.

6. Pegue o “fragmento de DNA inicial” da faixa 4 (um fragmento) EcoRI e o “fragmento final” da HindIII da
faixa 3. Ambos os fragmentos têm “caudas” em fita simples de 4 bases. As sequências de bases dos finais
produzidos pela EcoRI e HindIII são complementares?

7. Tire o fragmento da HindIII e pegue o fragmento final da faixa 1 (cortado com EcoRI). Compare os finais
de fita simples do fragmento produzido pela EcoRI na faixa 1 com o fragmento produzido pela EcoRI na
faixa 4. Eles são complementares?

8. Imagine que você cortou um fragmento de DNA completamente desconhecido com EcoRI. Você acha
que os finais de fita simples destes fragmentos serão complementares àqueles produzidos nas faixas 1 e 4?

9. Uma enzima chamada DNA ligase refaz as pontes fosfodiéster entre nucleotídeos. Para a DNA ligase
trabalhar, dois nucleotídeos devem se aproximar com a orientação apropriada para a ponte (o final 5’ de um
deve estar próximo ao final 3’ do outro). Você acha que seria mais fácil para a DNA ligase reconectar dois
fragmentos cortados pela EcoRI ou um fragmento cortado pela EcoRI com outro cortado pela HindIII?
Explique.
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DISCIPLINA BIOLOGIA MOLECULAR
DOCENTE: Drª. VALESKA S. DE SENA PEREIRA
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DOCENTE: Drª. VALESKA S. DE SENA PEREIRA

10 - Considere o fragmento de DNA:

5´-AAGAATTGCGAATTCGACTTAAGGGCCGCGCCGAAGCTTTAAAGGTTATATTTCC-3’

Quantos fragmentos resultarão da clivagem com as seguintes enzimas e indique o número de pb de cada
fragmento?

EcoRI: ( G AATTC): _________________________________________________________

HaeIII: ( GG CC): ___________________________________________________________
NotI: (GC CCGG): ___________________________________________________________
Com as três enzimas juntas: ____________________________________________________
Represente, no gel abaixo esquematizado, em que locais seriam esperadas bandas de DNA, considerando
o marcador informado:

M (pb) EcoRI HaeIII NotI E+H+N

55 pb

45 pb

27 pb

10 pb

M = marcador molecular