EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS: Sangre Total

I. OBJETIVOS:

 Aislar ADN cromosómico de sangre periférica total de humano

 Analizar sobre la importancia del conocimiento de la molécula de la vida
en la medicina del futuro

II. INTRODUCCIÓN:

Los ácidos nucleicos son macromoléculas complejas de suma importancia

biológica, ya que todos los organismos vivos contienen ácidos nucleicos en
forma de ácido desoxirribonucleico (ADN) y ribonucleico (ARN). Sin
embargo; algunos virus sólo contienen ARN, mientras que otros sólo
poseen ADN.

Se les denomina así porque fueron aislados por primera vez del núcleo de
células vivas. No obstante, ciertos ácidos nucleicos no se encuentran en el
núcleo de la célula, sino en el citoplasma celular.

Sin duda alguna, los ácidos nucleicos son las sustancias fundamentales de
los seres vivos, y se cree que aparecieron hace unos 3.000 millones de años,
cuando surgieron en la Tierra las formas de vida más elementales. Y los
investigadores han aceptado que el origen del código genético que portan
estas moléculas es muy cercano al tiempo del origen de vida en la Tierra.
Por ello, es que gracias al arduo trabajo realizado por los científicos, han
conseguido descifrarlo, es decir, determinar la forma en que la secuencia de
los ácidos nucleicos dicta la estructura de las proteínas. Determinando así
que, tanto la molécula de ARN como la molécula de ADN tienen una
estructura de forma helicoidal. Y que la secuencia de estas moléculas a lo
largo de la cadena determina el código de cada ácido nucleico particular. A
su vez, este código indica a la célula cómo reproducir un duplicado de sí
misma o las proteínas que necesita para su supervivencia.

Por tanto, se han identificado al menos dos funciones fundamentales de los

ácidos nucleicos: transmitir las características hereditarias de una
generación a la siguiente y dirigir la síntesis de proteínas específicas.

El modo en que los ácidos nucleicos realizan estas funciones es el objetivo

de algunas de las más prometedoras e intensas investigaciones actuales.
III. FUNDAMENTO:

Todas las células, a excepción de las células anucleadas de los eritrocitos

maduros en humanos, contienen ADN en sus núcleos celulares. También
podemos encontrar ADN dentro de otros compartimentos celulares
diferentes al núcleo, como las mitocondrias y los cloroplastos. La cantidad
de ADN presente en algunos tejidos es muy pequeña; por este motivo no
representa una fuente conveniente de extracción, aislamiento y
purificación, para ser empleado en diferentes estudios de carácter genético,
biológico. y/o bioquímico. Muchos tejidos contienen alta actividad de
desoxirribonucleasa (DNAasa) que rompe la macromolécula en pequeños
fragmentos.

Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe reunir dos

condiciones: contener gran cantidad de material genético y poseer baja
actividad de DNAasa.

El tejido linfoide, y en este caso el timo y el bazo representan materiales

biológicos que son utilizados con mucha frecuencia como fuente de
cantidades considerables de ADN para diferentes estudios.

Después de extraído el ADN suele ser rápidamente desnaturalizado y por lo

tanto se debe tener mucho cuidado en su remoción, aislamiento y
purificación con el fin de obtener un producto que conserve la identidad e
integridad estructural con el ADN de la célula de la cual proviene. El estrés
o tensión mecánica o físico química, que acompañan los procesos de
purificación de las moléculas de ADN deben ser evitadas al máximo y las
nucleasas inhibidas.

Factores como los iones Ca2+ y Mg2 son importantes para la actividad del
las DNAasas .El citrato de sodio presente en las soluciones empleadas para
la extracción y purificación del ADN, atrapa estos iones e impide, de esta
forma, la acción de las enzimas que digieren estas moléculas. Con el fin de
eliminar en forma definitiva la actividad de las nucleasas, las etapas de
remoción de las proteínas deben ser llevadas a cabo tan rápido como sea
posible y en frío.

Las nucleoproteínas, son proteínas que aparecen asociadas con los ácidos
nucleicos de las células eucariotas; son insolubles en agua y en soluciones
de baja fuerza iónica pero solubles en soluciones de alta fuerza iónica;
propiedad que debe ser tenida en cuenta durante los procesos de
extracción inicial
 IV. MATERIALES Y EQUIPOS:

MATERIALES: INSTRUMENTOS Y EQUIPOS

 Sangre con anticoagulante  Micropipetas

 Solución de TE 20:5, pH 6.8  Centrifugas
 Solución de P-K 1mg/ml  Congeladora
 Solución de Sarkosyl 10%  Bañomaría
 Acetato de amonio 10N
 Etanol helado
 Puntas

V. PROCEDIMIENTO:

1. Poner 3 – 5 ml de sangre en un
tubo Falcón de 50- 15 ml y
agregar 15ml de TE 20:5,
mezclar y agitar suavemente
para homogenizar. Se puede
usar el vortex caso no requiera
fragmentos 40 Kb

2. Centrifugar a 3000 rpm por 15

min
3. Decantar suave pero
continuamente, en un solo
movimiento. El sobrenadante se
verterá en un frasco con una
solución de lejía

4. Agregar 1-2 volúmenes (300-

1000µl) de TE 20:5, mezclar y
homogenizar. Completar hasta
15 ml con TE 20:5 y centrifugar
a 300rpm por 15´
5. Si es necesario repetir los pasos
3 y 4 hasta tener un
sobrenadante claro. Queda
sedimento 1 – 1.5 ml.
6. Agregar una solución de
Sarkosyl (N- Lauroyl
sarcosine10-20% stock) a
concentración final 1% y
mezclar suavemente hasta
obtener una solución viscosa
PERO evitando formar espuma.
Generalmente se coloca 200 µl
de solución para 2ml. Si es
necesario completar con TE
20:5.

Día 2

1. Agregar acetato de amonio a

concentración final a 2.5 M y
mezclar bien. generalmente
colocar 0.5 ml de solución

2. Agregar 2.5 volúmenes de

etanol absoluto helado, mezclar
muy suavemente invirtiendo
varias veces hasta obtener una
pelusa flotante ( precipitación)

3. Pescar la pelusa con un tip o una

pipeta Pasteur curvada e
introducirla en 1 ml de una
solución de 70 % etanol
rebajado con TE 20:5 para
eliminar las proteínas
remanentes y el acetato de
amonio. Eliminar lo mas posible
de liquido
4. Agregar una solución con TE
20:5 + NaCl 0.25 M y agregar
300 a 1000µl según la
solubilidad de la pelusa,
comenzar de menos a mas. Se
puede usar baño maria o
incubadora 37 – 65 °C

5. Agregar 2.5 volumenes de

etanol manteniendo en
congelador y mezclar por
inversión hasta obtener de
nuevo la pelusa

6. Repetir el paso 3
7. Resuspender en 200 - 1000µl de
TE 20:1(de menos a mas)

8. Algunos miden la cantidad de

DNA al espectro, diluir 2µl en
998µl de TE usar solo 260nm,
no se preocupen de 260/280 ni
tampoco si la solución es
amarillenta o rosada. Con
experiencia viendo la pelusa del
6 se puede estimar la cantidad
de DNA