Sie sind auf Seite 1von 13

‫‪6/3/19‬‬

‫‪ Real-Time PCR‬ﭼﯿﺴﺖ و ﭼﮕﻮﻧﮫ ﮐﺎر ﻣﯽ ﮐﻨﺪ؟‬


‫• واﮐﻧش زﻧﺟﯾره ای ﭘﻠﯾﻣراز ﻓراﯾﻧد ﺗﮑﺛﯾر ﯾﮏ ﻗطﻌﮫ ﺧﺎص ‪ DNA‬اﺳت‪.‬‬
‫• ‪ Real-Time PCR‬ﯾﮏ روش اﺧﺗﺻﺎﺻﯽ اﺳت ﮐﮫ اﺟﺎزه ﻣﯾدھد ﻓراﯾﻧد ‪PCR‬‬
‫در ﺣﯾن ﭘﯾﺷرﻓت دﯾده ﺷود‪.‬‬
‫• ‪ Real-Time PCR‬اﻣﮑﺎن اﻧدازی ﮔﯾری ﻣﻘﺎدﯾر ﺑﺳﯾﺎر ﮐم ‪ DNA‬در ﯾﮏ‬
‫ﻧﻣوﻧﮫ را ﻧﯾز ﻣﯾدھد‬
‫• ‪ real-time PCR‬ﻣﺎﻧﻧد ‪ PCR‬ﻣﻌﻣوﻟﯽ ﮐﺎر ﻣﯽ ﮐﻧد‪،‬‬
‫اﻣﺎ ﺑرای داﻧﺳﺗن ﺗﻔﺎوت اﯾن دو‪...‬‬

‫ﮐ ﺎر‬
‫• ﺗﺻور ﮐﻧﯾد در ﺳﯾﮑل ‪ ٢۵‬از ‪ PCR‬ھﺳﺗﯾم‬
‫• ﻋﻼوه ﺑر ﻣﺧﻠوط واﮐﻧش‪ ،‬ﺣدود ‪١،٠٠٠،٠٠٠‬‬
‫ﻧﺳﺧﮫ از ﻣﺣﺻول دارﯾم‬
‫• در ﺳﯾﮑل ‪ ٢٣ ،٢۴‬و ‪ ٢٢‬ﭼﮫ ﺗﻌداد دارﯾم؟‬
‫• ‪۵٠٠،٠٠٠‬‬
‫• ‪٢۵٠،٠٠٠‬‬
‫• ‪١٢۵،٠٠٠‬‬

‫‪1‬‬
‫‪6/3/19‬‬

‫‪0‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪15‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪25‬‬ ‫‪30‬‬ ‫‪35‬‬ ‫‪40‬‬


‫‪2000000‬‬

‫‪1800000‬‬

‫?‬
‫‪1600000‬‬

‫ﻧﻤﻮدار ﭘﯿﺸﺮﻓﺖ واﮐﻨﺶ‬


‫‪1400000‬‬

‫‪1200000‬‬

‫‪1000000‬‬

‫‪800000‬‬
‫ﺑﺎ ﭘﯾﺷرﻓت واﮐﻧش‪ ،‬ﺗﻌداد‬
‫ﻧﺳﺧﮫ ھﺎ اﻓزاﯾش ﻣﯽ ﯾﺎﺑد‪ ،‬اﻣﺎ‬
‫ﺗﺎ ﮐﺟﺎ؟؟‬
‫‪600000‬‬

‫‪400000‬‬

‫‪200000‬‬

‫‪0‬‬

‫‪5000000‬‬

‫‪4500000‬‬

‫‪4000000‬‬

‫‪3500000‬‬
‫• ﺑﺎ ﭘﯾﺷرﻓت واﮐﻧش‪ ،‬ﭘﯾدا ﮐردن‬
‫‪3000000‬‬ ‫ﭘراﯾﻣر و ﺳﺎﯾر اﺟزای واﮐﻧش‬
‫‪2500000‬‬
‫ﺑرای ﺗﮑﺛﯾر دﺷوار ﻣﯽ ﺷود و‬
‫‪2000000‬‬
‫ﻓﺎز ﻟﮕﺎرﯾﺗﻣﯽ ﻧﯾز از ﭘﯾﺷرﻓت‬
‫ﺑﺎز ﻣﯽ ﻣﺎﻧد‪.‬‬
‫‪1500000‬‬

‫‪1000000‬‬
‫• ﭘس ﻓرض ﻣﯽ ﮐﻧﯾم ﮐﮫ ﻣﻧﺣﻧﯽ‬
‫واﮐﻧش از ﺳﯾﮑل ‪ ٢۵‬ﺑﮫ ﺑﻌد‬
‫دارای ﭼﻧﯾن ﺷﮑﻠﯽ ﻣﯽ ﺷود‪.‬‬
‫‪500000‬‬

‫‪0‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪15‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪25‬‬ ‫‪30‬‬ ‫‪35‬‬ ‫‪40‬‬

‫‪2‬‬
‫‪6/3/19‬‬

‫ﻣﻘﺎﯾﺴﮫ ﺑﯿﻦ ﻣﻘﺎدﯾﺮ در ‪ Real-Time PCR‬ﭼﮕﻮﻧﮫ اﺳﺖ؟‬


‫• ﺑﺎ ﻓرض ذﮐر ﺷده‪:‬‬
‫‪Cycle 25‬‬ ‫• ﻟوﻟﮫ ای ﮐﮫ ﻣﻘدار ‪ DNA‬آن‬
‫‪ ۵٠٠،٠٠٠‬ﻧﺳﺧﮫ اﺳت‪،‬‬
‫ﻣﻧﺣﻧﯽ آن ﯾﮏ ﺳﯾﮑل دﯾر ﺗر‬
‫‪Cycle‬‬ ‫ﻟوﻟﮫ ‪B‬‬ ‫ﻟوﻟﮫ ‪A‬‬
‫اوج ﻣﯽ ﮔﯾرد‬
‫‪23‬‬ ‫‪250,000‬‬ ‫‪1,000,000‬‬ ‫• ﻟوﻟﮫ ای ﮐﮫ ﻣﻘدار ‪ DNA‬آن‬
‫‪24‬‬ ‫‪500,000‬‬ ‫‪2,000,000‬‬ ‫‪ ٢۵٠،٠٠٠‬ﻧﺳﺧﮫ اﺳت‪،‬‬
‫ﻣﻧﺣﻧﯽ آن دو ﺳﯾﮑل دﯾر ﺗر‬
‫‪25‬‬ ‫‪1,000,000‬‬ ‫‪4,000,000‬‬
‫اوج ﻣﯽ ﮔﯾرد‬

‫ﺑﻧﺎﺑر اﯾن‪ ،‬اﮔر ﺑﺎ ﻣﻘدار ‪ DNA‬ﭼﮭﺎر ﺑراﺑر ﮐﻣﺗر ﺷروع ﮐﻧﯾم )ﻟوﻟﮫ ‪ ،(B‬دﻗﯾﻘﺎ دو ﺳﯾﮑل دﯾرﺗر ﺑﮫ ﻣﻘدار ﻟوﻟﮫ ‪A‬ﻣﯾرﺳﯾم‬

‫‪5000000‬‬

‫‪4500000‬‬

‫‪4000000‬‬

‫‪3500000‬‬
‫‪Cycle‬‬ ‫ﻟوﻟﮫ ‪B‬‬ ‫ﻟوﻟﮫ ‪A‬‬

‫‪3000000‬‬ ‫‪23‬‬ ‫‪250,000‬‬ ‫‪1,000,000‬‬

‫‪2500000‬‬
‫‪24‬‬ ‫‪500,000‬‬ ‫‪2,000,000‬‬

‫‪25‬‬ ‫‪1,000,000‬‬ ‫‪4,000,000‬‬


‫‪2000000‬‬

‫‪1500000‬‬

‫‪1000000‬‬

‫‪500000‬‬

‫‪0‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪15‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪25‬‬ ‫‪30‬‬ ‫‪35‬‬ ‫‪40‬‬

‫‪3‬‬
‫‪6/3/19‬‬

‫‪5000000‬‬

‫‪4500000‬‬

‫‪4000000‬‬

‫‪3500000‬‬
‫‪Cycle‬‬ ‫ﻟوﻟﮫ ‪C‬‬
‫‪3000000‬‬

‫‪25‬‬ ‫‪125,000‬‬ ‫‪2500000‬‬

‫‪26‬‬ ‫‪250,000‬‬
‫‪2000000‬‬

‫‪1500000‬‬

‫‪27‬‬ ‫‪500,000‬‬
‫‪1000000‬‬

‫‪28‬‬ ‫‪1,000,000‬‬ ‫‪500000‬‬

‫‪0‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪15‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪25‬‬ ‫‪30‬‬ ‫‪35‬‬ ‫‪40‬‬

‫اﮔر ﺑﺎ ‪ ٨‬ﺑراﺑر ‪ DNA‬ﮐﻣﺗر ﺷروع ﮐﻧﯾم )‪ ،(C‬ﻣﻧﺣﻧﯽ دﻗﯾﻘﺎ ‪ ٣‬ﺳﯾﮑل دﯾر ﺗر ﺑﮫ ﺷﮑل ﻟوﻟﮫ ‪ A‬در ﻣﯽ آﯾد‬

‫ﻣﺤﺎﺳﺒﮫ ی ﻣﻘﺪار‬
‫• ﻣوﻗﻌﯾﺗﯽ ﮐﮫ در آن‪ ،‬ﻣﻘدار‬
‫‪5000000‬‬

‫‪4500000‬‬

‫‪Ct Values:‬‬ ‫ﻣﺣﺻول ‪ PCR‬از ﯾﮏ ﺧط‬


‫‪4000000‬‬
‫ﻗراردادی ﻋﺑور ﻣﯽ ﮐﻧد و را‬
‫‪3500000‬‬
‫ﺳﯾﮑل آﺳﺗﺎﻧﮫ ﻣﯽ ﻧﺎﻣﯾم‪:‬‬
‫‪3000000‬‬

‫‪2500000‬‬
‫‪23‬‬ ‫‪25‬‬ ‫‪28‬‬ ‫‪Ct‬‬
‫‪2000000‬‬ ‫• اﯾن ﻋدد )‪ ،(Ct‬ﺑر اﺳﺎس ﻓرﻣول‬
‫‪1500000‬‬ ‫زﯾر‪ ،‬ﻧﺳﺑت ﻣﺳﺗﻘﯾم ﺑﺎ ﻣﻘدار اوﻟﯾﮫ‬
‫‪1000000‬‬
‫‪ DNA‬دارد‪.‬‬
‫‪500000‬‬ ‫‪Quantity = 2^Ct‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪15‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪25‬‬ ‫‪30‬‬ ‫‪35‬‬ ‫‪40‬‬

‫‪4‬‬
‫‪6/3/19‬‬

‫ﺣﺴﺎﺳﯿﺖ ‪ Real-Time PCR‬ﭼﻘﺪر اﺳﺖ؟‬


‫• از ﻧظر ﺗﺋوری ﺣﺗﯽ ﺑﺎ ﯾﮏ ﮐﭘﯽ ﻣﯽ ﺗوان اﻧﺟﺎم داد‬
‫• در ﻋﻣل‪ ،‬ﻣﻌﻣوﻻ ﺣداﻗل ‪ ١٠٠‬ﮐﭘﯽ ﺑرای ﺷروع ﻻزم اﺳت‬
‫• ﯾﮑﺻد ﮐﭘﯽ ‪ DNA‬از ﯾﮏ ژن ‪ ٢٠٠‬ﺟﻔت ﺑﺎز‪ ،‬ﻣﻌﺎدل ‪ ٢٠٠‬آﺗوﮔرم )‪ (2 x 10-17 g‬اﺳت‬

‫در ﻋﻤﻞ‪ ،‬ﻣﻘﺪار ‪ DNA‬ﭼﮕﻮﻧﮫ ﻣﺤﺎﺳﺒﮫ ﻣﯽ ﺷﻮد؟‬


‫• ﻋواﻣل ﻓﻠورﺳﻧت در ﺣﺿور ‪ DNA‬ﺗﮑﺛﯾر ﯾﺎﻓﺗﮫ‬
‫• ﻧﻣوﻧﮫ رﻧﮓ‪:‬‬
‫• ‪Ethidium bromide‬‬
‫• ‪SYBR Green I‬‬
‫• اﯾﻧﮭﺎ ﺑﮫ ‪ DNA‬دو رﺷﺗﮫ ﻣﺗﺻل ﺷده‪ ،‬ﻧور ﺑﺎ طول ﻣوج ﻣﺷﺧﺻﯽ ﺗﺎﺑش ﻣﯽ ﮐﻧﻧد‬
‫• رﻧﮓ ‪ SYBR Green I‬درﺧﺷش ﺑﺳﯾﺎر ﺑﯾﺷﺗری از اﺗﯾدﯾوم ﺑروﻣﺎﯾد دارد‬

‫‪5‬‬
6/3/19

PCR ‫ﻧﺤﻮه ﮐﺎر رﻧﮕﮭﺎی ﻓﻠﻮرﺳﻨﺖ در‬


3’ 5’
5’ 3’

3’ 5’
5’ 3’

Extension

3’
ID ID Taq 5’
5’

5’
5’ ID ID ID 3’
Taq

Apply Excitation
Intercalating Dyes
Wavelength
l l l
3’
ID Taq 5’
5’ ID ID ID ID
5’
ID ID ID ID
Taq 3’

l
l

Repeat

‫ ﻧﺸﺎﻧﺪار‬Probe ‫اﺳﺘﻔﺎده از‬


TaqMan ‫ ﭘروب‬.1
• Dual Labelled probes: 5’-Reporter and
3’-Quencher
• DNA Polymerase 5' exonuclease
activity
Molecular Beacons (MB) ‫ ﭘﺮوب‬.2
FRET ‫ ﭘﺮوب ھﺎی‬.3
Fluorescent resonance energy transfer

6
6/3/19

Real-Time ‫ﻣﺸﺨﺼﺎت دﺳﺘﮕﺎه ھﺎی ﻣﻮرد اﺳﺘﻔﺎده در‬


PCR
:‫ﻣﻌﻣوﻻ ﺷﺎﻣل ﺳﮫ ﺑﺧش اﺻﻠﯽ ھﺳﺗﻧد‬

1. Thermal Cycler (PCR machine)

2. Optical Module (to detect fluorescence in the tubes during


the run)

3. Computer (to translate the fluorescence data into


meaningful results)

• This is some actual data from a


recent real-time PCR run.
• Data like this can easily be generated
by preparing a dilution series of DNA.
Real-Time PCR

Actual Data

c366939

7
6/3/19

‫ ﭼﮫ ﮐﺎرﺑﺮد ھﺎﯾﯽ دارد؟‬Real-Time PCR


DNA
• Gene expression analysis
BRCA1
üCancer research
mRNA
üDrug research
• Disease diagnosis and management
üViral quantification Protein

• Food testing
üPercent GMO food ‫ﺑرای ﺳﻧﺟش ﭘروﻓﺎﯾل ﺑﯾﺎن ﯾﮏ ژن ﺑﮫ ﮐﺎر ﻣﯾرود‬
‫ ﮐﮫ ﯾﮏ ژن آﻧﺗﯽ ﺗوﻣور اﺳت‬BRCA1 ‫ﻣﺛﻼ ژن‬
• Animal and plant breeding
üGene copy number

Example: Determining percentage of GMO


food content
Seed
Determination of percent GMO food content
important for import / export regulations. wt DNA
Labs use Real-Time PCR to measure amount
of transgenic versus wild-type DNA. GMO DNA

Drug treatment for HIV infection often


depends on monitoring the “viral
load”. Virus
Real-Time PCR allows for direct
measurement of the amount of the RNA
virus RNA in the patient.

8
‫‪6/3/19‬‬

‫ﮐﺸﻒ ﺳﯿﺴﺘﻢ ‪CRISPR‬‬


‫ﮐﺸﻒ وﺟﻮد ﺗﮑﺮار ﺧﻮﺷﻪ ای ﻣﻨﻈﻢ ‪(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) DNA‬‬
‫‪ ،۱۹۸۷‬اوزاﮐﺎ‪ ،‬ژاﭘﻦ‪ :‬در آن زﻣﺎن ﻋﻤﻠﮑﺮد ﺗﻮاﻟﯽ ﻫﺎی ﺗﮑﺮاری ﺷﻨﺎﺧﺘﻪ ﻧﺸﺪ‬
‫‪ ۱۹۹۳‬در ﻫﻠﻨﺪ ﺑﺮ روی اﻧﻮاع ﻣﺎﯾﮑﻮﺑﺎﮐﺘﺮﯾﻮم اﯾﻦ ﺗﻮاﻟﯽ ﺗﮑﺮاری ﻣﺸﺎﻫﺪه ﺷﺪ‬
‫ﻫﻤﺎن زﻣﺎن در اﺳﭙﺎﻧﯿﺎ روی آرﮐﺌﺎ ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ ﺷﺪ )‪ CRISPR‬ﭘﯿﺸﻨﻬﺎد اﯾﻦ ﮔﺮوه ﭼﻨﺪ ﺳﺎل ﺑﻌﺪ(‬
‫ﺳﺎل ‪ ،۲۰۰۵‬ﺳﻪ ﮔﺮوه ﻣﺴﺘﻘﻞ ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ ﺗﻮاﻟﯽ ﻫﺎی ﺗﮑﺮاری ﺑﻌﻨﻮان ﺗﻮاﻟﯽ ﻓﺎژ‬
‫ﺳﺎل ‪ ،۲۰۰۵‬ﭘﯿﺸﻨﻬﺎد ﻧﻘﺶ دﻓﺎﻋﯽ ﺑﺮای ‪CRISPR‬‬
‫‪Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Soria E (February 2005). "Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats‬‬
‫‪derive from foreign genetic elements". Journal of Molecular Evolution. 60 (2): 174–82‬‬

‫ﺳﺎل ‪ ۲۰۰۷‬اوﻟﯿﻦ ﻣﻘﺎﻟﻪ ﻣﺒﻨﯽ ﺑﺮ ﻧﻘﺶ ‪ CRISPR‬در اﯾﻤﻨﯽ اﮐﺘﺴﺎﺑﯽ‬


‫ﺳﺎل ‪ ،۲۰۰۸‬ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ ﮐﻤﭙﻠﮑﺲ ‪ Cas-DNA‬ﮐﻪ ﺑﺎﻋﺚ ﺑﺮش آن ﻣﯽ ﺷﻮد‬
‫ﺳﺎل ‪ ،۲۰۱۰‬ﺑﺮش دورﺷﺘﻪ ای ‪ DNA‬ﻓﺎژ ﺗﻮﺳﻂ ‪ CRISPR-cas‬ﻧﺸﺎن داده ﺷﺪ‬
‫ﺳﺎل ‪ ،۲۰۱۳‬ﻧﺨﺴﺘﯿﻦ درﻣﺎن ژﻧﺘﯿﮑﯽ ﺑﺎ اﯾﻦ روش‬

‫ﺳﯿﺴﺘﻢ ‪CRISPR‬ﭼﮕﻮﻧﻪ ﻋﻤﻞ ﻣﯽ ﮐﻨﺪ‬

‫• ﻫﻨﮕﺎم ﻋﻔﻮﻧﺖ ﺑﺎﮐﺘﺮی ﺑﻪ وﯾﺮوس‪ ،‬ﺑﺨﺸﯽ از ژﻧﻮم وﯾﺮوس در ﺑﺎﮐﺘﺮی ذﺧﯿﺮه ﻣﯽ ﺷﻮد‪.‬‬
‫• ﺗﻮاﻟﯽ ﻫﺎی ﺑﺮﯾﺪه ﺷﺪه ﺑﺼﻮرت ﺧﻮﺷﻪ دﻧﺒﺎل ﻫﻢ ذﺧﯿﺮه ﻣﯽ ﺷﻮﻧﺪ‬

‫• از ﻫﺮ ﻗﻄﻌﻪ ‪ DNA‬ﺑﺮای ﺳﺎﺧﺖ ‪ RNA‬ﻣﺸﺎﺑﻪ آن اﺳﺘﻔﺎده ﻣﯽ ﺷﻮد‪.‬‬

‫• ﻣﻠﮑﻮل ‪ RNA‬ﺑﺮای ﺟﻔﺖ ﺷﺪن ﺑﺎ ‪DNA‬ﻫﺪف ﻧﻘﺶ راﻫﻨﻤﺎ را ﺑﺎزی ﻣﯽ ﮐﻨﺪ‪.‬‬

‫• آﻧﺰﯾﻢ ‪ Cas9‬ﯾﮏ ﻧﻮﮐﻠﺌﺎز اﺳﺖ و ﻫﺮﺟﺎ را ﮐﻪ ‪ RNA‬راﻫﻨﻤﺎﯾﯽ ﮐﻨﺪ ﺑﺮش ﻣﯽ دﻫﺪ )ﯾﮏ‬
‫ﮐﻤﭙﻠﮑﺲ ﻫﻤﮑﺎری ‪(RNA-Protein‬‬

‫‪9‬‬
‫‪6/3/19‬‬

‫‪Clustered Regularly Interspaced Short‬‬


‫‪Palindromic Repeats‬‬
‫ﺑﮫ ﻣﻌﻧﺎی ﺗﻧﺎوﺑﮭﺎ ِی ﮐوﺗﺎ ِه ﭘﺎﻟﯾﻧدرو ِم ﻓﺎﺻﻠﮫ دا ِر ﻣﻧِظم ﺧوﺷﮫ ای اﺳت‪.‬‬ ‫•‬
‫ﮐرﯾﺳﭘرﺑﺧﺷﯽ از ‪DNA‬ﭘروﮐﺎرﯾوت ﺑوده ﮐﮫ ﺣﺎوی ﺗﻧﺎوﺑﮭﺎی ﮐوﺗِﺎه ﺗواﻟﯽ ھﺎی ﺑﻧﯾﺎدﯾن اﺳت‬ ‫•‬
‫ﮐرﯾﺳﭘر ﻧوﻋﯽ ﺳﯾﺳﺗم اﯾﻣﻧﯽ ﺗطﺎﺑق ﭘذﯾر )‪ (adaptive‬در ﺑﺎﮐﺗرﯾﮭﺎ اﺳت ﮐﮫ آﻧﮭﺎ را ﻗﺎدر ﺑﮫ ﮐﺷف‬ ‫•‬
‫‪ DNA‬وﯾروس ﮐرده و ﺑﻌد ﻧﺎﺑودﺷﺎن ﻣﯾﮑﻧد‪.‬‬
‫ﺑﺧﺷﯽ از ﺳﯾﺳﺗم ﮐرﯾﺳﭘر‪ ،‬ﭘروﺗٔﯾﯾﻧﯽ ﺑﮫ ﻧﺎم ‪ Cas9‬اﺳت ﮐﮫ ﻗﺎﺑﻠﯾت ﺟﺳﺗﺟو‪ ،‬و ﺑرش زدن ‪DNA‬‬ ‫•‬
‫وﯾروس را دارد‪.‬‬
‫• ﻣﯽ ﺗواﻧد ﺑﺧش ھﺎی ﺧﺎﺻﯽ از ‪double strand‬ﻣوﻟﮑول ‪ DNA‬را ﺷﻧﺎﺳﺎﯾﯽ و ﻗطﻊ ﮐﻧد‬
‫• ﺗﮑﮫ ھﺎﯾﯽ از‪RNA‬ﮐﮫ آﻧﮭﺎ را ﺑﮫ ھدف ھداﯾت ﻣﯽ ﮐﻧﻧد ‪ (Guide RNA) gRNA‬ﻣﯽ ﻧﺎﻣﻧد‬

‫• ﺑﮫ ﭘروﺗٔﯾﯾن ھﺎی دﺧﯾل دراﯾن ﻣﻛﺎﻧﯾزم ‪Crispr associated protein‬ﮔﻔﺗﮫ ﻣﯽ ﺷود‬

‫• اﯾﻣﻧﯽ اﯾﯽ ﮐﮫ ﺑوﺳﯾﻠﮫ ی‬


‫ﮐرﯾﺳﭘر اﯾﺟﺎد ﻣﯽ ﺷود ‪2‬‬
‫ﻓﺎز اﺻﻠﯽ دارد‪:‬‬
‫‪(1‬ﻓﺎز‬
‫اﯾﻣﻧﯽ)‪:(Immunity‬زﻣﺎن‬
‫ی ﮐﮫ ﺧﺎطره ی ﺑرﺧورد‬
‫ﺑﺎ ﻓﺎژ را دارﯾم‪.‬‬

‫‪220‬‬

‫‪10‬‬
‫‪6/3/19‬‬

‫‪ (2‬ﻓﺎز اﯾﻣن ﺳﺎزی )‪(Immunization‬‬


‫‪ü‬زﻣﺎﻧﯽ ﮐﮫ ﺗواﻟﯽ ‪DNA‬ی ﻓﺎژی ﻣﮭﺎﺟم واردﺷده روی ‪ Spacer‬ﺑﺎﮐﺗری وﺟود ﻧداﺷﺗﮫ ﺑﺎﺷد‪.‬‬
‫‪ü‬ﺑﯾﺎن ﭘروﺗﺋﯾن ‪ cas1,cas2‬ﺑﮫ ﺟﺎی ﺑﯾﺎن ﭘروﺗﺋﯾن‪cas9‬‬
‫‪ü‬اﯾن ‪cas‬ھﺎ ﺑدون ﻧﯾﺎز ﺑﮫ) ‪RNA (guidRNA‬ی راھﻧﻣﺎ ‪DNA،‬ی ﺧﺎرﺟﯽ را ﺷﻧﺎﺳﺎﯾﯽ ﻣﯽ ﮐﻧد و آن را ﺑرش‬
‫ﻣﯾدھد‪.‬‬
‫‪ü‬ﻗﺳﻣﺗﯽ از ﺗواﻟﯽ ﺑرش ﺧورده را در ﺟﺎﯾﮕﺎه ﮐرﯾﺳﭘر وارد ﻣﯽ ﮐﻧد؛اﯾﺟﺎد ‪spacer‬‬
‫‪ü‬ھﻧﮕﺎم ﻣواﺟﮭﮫ ی دوﺑﺎره ﺑﺎ اﯾن ﻓﺎژ ‪ ،‬ﭘﺎﺳﺦ ﺳرﯾﻌﺗری اﯾﺟﺎد ﻣﯾﺷود)ﻓﺎز اﯾﻣﻧﯽ(‬

‫‪221‬‬

‫• اﺳﯿﺪ ﻧﻮﮐﻠﺌﯿﮏ ﻣﻬﺎﺟﻢ ﺗﻮﺳﻂ ﻣﺠﻤﻮﻋﻪ ‪Cas1-Cas2‬‬


‫ﺳﺎﺧﺘﺎر و ﻋﻤﻞ ﺳﯿﺴﺘﻢ ‪CRISPR‬‬ ‫ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ و ﺑﺮﯾﺪه ﻣﯽ ﺷﻮد‪protospacer:‬‬
‫• اﯾﻦ ﻗﻄﻌﻪ در ﮐﻨﺎر ﺗﻮاﻟﯽ ‪ leader‬ﻗﺮار ﻣﯽ ﮔﯿﺮد‪.‬‬
‫• اﻧﺪازه ﺗﻮاﻟﯽ ﻫﺎی ﺗﮑﺮاری ‪ CRISPR‬ﺑﯿﻦ ‪ ۲۸‬ﺗﺎ ‪ ۳۷‬ﺟﻔﺖ ﺑﺎز‬
‫ﻃﻮل دارﻧﺪ‪.‬‬
‫• اﻧﺪازه ﺟﺪاﮐﻨﻨﺪه ﻫﺎ ﺑﯿﻦ ‪ ۳۲‬ﺗﺎ ‪ ۳۸‬ﺟﻔﺖ ﺑﺎز )‪ ۲۱‬ﺗﺎ ‪ (۷۲‬دﯾﺪه‬
‫ﻣﯽ ﺷﻮد‪.‬‬
‫• در ﻫﺮ ﺑﺎر ﻋﻔﻮﻧﺖ‪ ،‬ﺟﺪاﮐﻨﻨﺪه ﻫﺎی ﺟﺪﯾﺪ ﻇﺎﻫﺮ ﻣﯽ ﺷﻮد‪.‬‬
‫• ﻧﺴﺨﻪ ﺑﺮداری از روی ‪ CRISPR‬اﳓﺎم ﻣﯽ ﺷﻮد و ﺗﻮﺳﻂ‬
‫‪ Cas‬ﺑﺮﯾﺪه و ‪ crRNA‬ﺳﺎﺧﺘﻪ ﻣﯽ ﺷﻮد‪.‬‬
‫• ‪ crRNA‬ﺑﺎ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ ‪ Cas‬ﲡﻤﯿﻊ ﺷﺪه‪ ،‬ﺗﺸﮑﯿﻞ ﮐﻤﭙﻠﮑﺲ‬
‫ﻓﻌﺎل را ﻣﯿﺪﻫﺪ‪.‬‬

‫• آراﯾﻪ ی ‪ CRISPR‬دارای ﯾﮏ ﺗﻮاﻟﯽ ‪ leader‬ﻏﻨﯽ از ‪ AT‬و‬

‫ﺑﺪﻧﺒﺎل آن ﺗﻮاﻟﯽ ﻫﺎی ﺗﮑﺮاری ﮐﻮﺗﺎه ﻫﺴﺖ ﮐﻪ ﺑﺎ ﺟﺪاﮐﻨﻨﺪه‬


‫)‪ ( spacer‬ﺟﺪا ﻣﯽ ﺷﻮﻧﺪ‪.‬‬
‫• ﻣﻌﻤﻮﻻ در ﯾﮏ آراﯾﻪ ی ‪ ،CRISPR‬ﺗﻮاﻟﯽ ﻫﺎی ﺟﺪاﮐﻨﻨﺪه‪-‬‬
‫ﺗﮑﺮار ﺷﻮﻧﺪه ﮐﻤﺘﺮ از ‪ ۵۰‬اﺳﺖ‪.‬‬

‫‪11‬‬
‫‪6/3/19‬‬

‫• ﺳﺎدﮔﯽ اﯾﻦ ﺳﯿﺴﺘﻢ ﺑﺎ ﻓﻘﻂ ‪ ۳‬ﻋﻨﺼﺮ )‪ ،(Cas9, crRNA and tracrRNA‬آن را ﺑﺮای ﮐﺎر آزﻣﺎﯾﺸﮕﺎﻫﯽ ﺳﺎده ﮐﺮده اﺳﺖ‪.‬‬
‫• ادﻏﺎم ‪ crRNA‬و ‪) tracrRNA‬ﺷﮑﻞ ﺳﻤﺖ ﭼﭗ( و ﺗﺒﺪﯾﻞ آن ﺑﻪ ﯾﮏ ﻣﻠﮑﻮل ﺳﻨﺘﺰ ﺷﺪه ی ‪ ،sgRNA‬ﺑﺎﻋﺚ ﺳﺎده ﺷﺪن ﺑﺸﺘﺮ اﯾﻦ‬
‫ﺳﯿﺴﺘﻢ ﺷﺪه اﺳﺖ‬

‫ﭼﮕﻮﻧﮫ ﻧﻘﺺ ژﻧﺘﯿﮑﯽ ﺑﺎ اﯾﻦ روش اﺻﻼح ﻣﯽ ﺷﻮد؟‬


‫• دارﺑﺳت ‪ RNA‬ﺑﺎ ﺑﺧش ﺧﺎﺻﯽ از ‪ DNA‬ﮐﻣﭘﻠﮑس ﺗﺷﮑﯾل داده وﺳﭘس ﺑﺧش ازﭘﯾش‬
‫طراﺣﯽ ﺷده ی آن ﺳﺑب ﻓراﺧواﻧﯽ آﻧزﯾم ‪Cas‬ﻣﯽ ﺷود‪.‬‬
‫• در ﻧﺗﯾﺟﮫ ی اﯾن اﺗﻔﺎق ‪ Cas9‬ﺑراﺣﺗﯽ در ﻣﮑﺎن ﺻﺣﯾﺢ ﺑرش ﺧود را اﻧﺟﺎم ﻣﯽ دھد‪.‬‬

‫• ‪RNA‬ی راھﻧﻣﺎ ﺑﮭﻣﯾن ﺻورت ﺑرای ژن ھﺎی ﻧﺎﻗص ﻣﮭﻧدﺳﯽ ﻣﯽ ﺷود و ﻣﯽ ﺗواﻧد ﺑﺎ‬
‫ﺗواﻟﯽ ﺧﺎﺻﯽ از ﺑﺎزھﺎی ‪DNA‬ی ﻣﯾزﺑﺎن ﻣﮑﻣل ﺷود‬
‫• ھﻧﮕﺎﻣﯽ ﮐﮫ ‪ Cas9‬ﺑﮫ ‪ DNA‬ﻣﺗﺻل ﻣﯽ ﺷود و آن را ﺑرش ﻣﯽ دھد‪ ،‬ﻣﮑﺎﻧﯾزم ﺑدن ﺑﮫ اﯾن‬
‫آﺳﯾب آﮔﺎه ﺷده و درﺻدد رﻓﻊ و ﺗرﻣﯾم آن ﺑر ﻣﯽ آﯾد‪.‬‬
‫• در ﻧﺗﯾﺟﮫ ﺑدن ﺑﮫ واﺳطﮫ ی اﯾن ﺳﯾﺳﺗم ﺷﻧﺎﺳﺎﯾﯽ ﺧود را اﺻﻼح ﮐرده و اﯾراد ژﻧﺗﯾﮑﯽ‬
‫ﺑرطرف ﻣﯽ ﺷود‪.‬‬

‫‪12‬‬
‫‪6/3/19‬‬

‫ﻣﮑﺎﻧﯿﺴﻢ ﺗﺮﻣﯿﻢ ژن‬

‫ﺗﻨﻈﯿﻢ ژن ﺑﺎ ﮐﻤﮏ ‪Cas9‬‬


‫ﭼﻮن ﺗﻐﯿﯿﺮات داﺋﻤﯽ ﺑﺎ ‪ CRISPR‬ﳑﮑﻦ اﺳﺖ‬
‫ﺑﺮای ﺳﻠﻮل ﺗﻮﮐﺴﯿﮏ ﺑﺎﺷﻨﺪ‪ ،‬ﺑﺮای ﺗﻐﯿﯿﺮ ﮔﺬرا از‬
‫ﺳﯿﺴﺘﻢ داﺑﻞ ﻣﻮﺗﺎن )ﺑﺪون ﺗﻮان ﺑﺮش( اﺳﺘﻔﺎده‬
‫ﺷﺪه اﺳﺖ‪.‬‬

‫• ﺗﻨﻈﯿﻢ ﺑﯿﺎن ژن )ﺗﻐﯿﯿﺮات ژﻧﺘﯿﮑﯽ ﮔﺬرا(‬


‫• ﻓﻌﺎل ﮐﺮدن ﯾﺎ ﺧﺎﻣﻮش ﮐﺮدن‬
‫• وﯾﺮاﯾﺶ اﭘﯽ ژﻧﻮم‬

‫‪13‬‬