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2015 61
Resumen
La enfermedad de Newcastle es causada por cepas virulentas de paramixovirus tipo1 (PMVA-I). El
objetivo de este estudio fue determinar la presencia del virus en las parroquias de Cazaderos, Garza
Real, Mangahurco, Paletillas y Bolaspamba en el cantón Zapotillo en la provincia de Loja. Se tomaron
350 muestras de suero sanguíneo y 140 muestras de hisopados cloacales, provenientes de aves apa-
rentemente sanas y que presentaron signos clínicos de la enfermedad. Las muestras de suero fueron
analizadas Kit de ELISA IDEXX, de las cuales un 49,7 % de las mismas resultaron positivas. A partir
de los hisopados se realizó el aislamiento viral en huevos embrionados de 9 a 11 días de desarrollo
libres de patógenos específicos (LPE). Se realizó hemoaglutinación en el fluido alantoideo para com-
probar la presencia del virus. A partir del líquido alantoideo se extrajo ARN y posteriormente se les
realizó una RT-PCR con cebadores específicos, donde se obtuvo productos de 362 pb. La presencia
viral se comprobó en 10,71% de las muestras. Para realizar la identificación de cepas patogénicas se
realizó una segunda RT-PCR en un solo paso con cebadores específicos, donde se obtuvo amplifica-
ciones de 254. Este es el primer estudio de la detección molecular del virus Newcastle en el Ecuador,
lo que contribuye al manejo de la enfermedad.
Palabras claves: Virus de Newcastle, ELISA, aislamiento viral, RT-PCR.
Abstract
The Newcastle Disease is causing by virulent strains of paramyxoviruses type 1(PMVA-I). The aim
of this study was to determine the presence of the virus in the Loja province. The places survey were
Cazaderos, Garza Real, Mangahurco, Paletillas and Bolaspamba. 350 serum and 140 cloacael swabs
samples were taken, from apparently healthy birds and showed disease clinical signs. Serum samples
were analyzed by IDEXX ELISA kit, which 49.7 % of them were positive. From the swabs it was per-
formed virus isolation in eggs specific pathogen free (SPF) of 9-11 days of development. The Hema-
gglutination probe was performed in the allantoic fluid for determined virus presence. From allantoic
fluid RNA was extracted and subsequently RT-PCR was made with specific primers, products of 362
bp were obtained. Viral presence was found in 10.71% of the samples. To make identification of patho-
genic strains a second RT-PCR was performed in a single step with specific primers, where amplifi-
cations of 254 bp were obtained. This is the first study of the molecular detection of Newcastle virus in
Ecuador, contributing to disease management.
Keywords: Newcastle virus disease, ELISA, viral isolation, RT-PCR.
Aislamiento del virus a partir de hisopados y Alle, mientras que para cepas virulentas
cloacales del virus se utilizó ALLs y AVLe (Wang et al.,
Los hisopados cloacales se inocularon en 2001). Las reacciones de PCR se llevaron a
embriones de pollo de 9-11 días de desarrollo, cabo con los mismos cebadores siguiendo las
libre de patógenos específicos (LPE). Se uti- condiciones descritas por Wang et al., 2001.
lizaron a razón de 10 embriones por muestra Los productos de PCR fueron visualizados en
geles de agarosa 1,5%.
y se inocularon por la vía de la cavidad alan-
toidea con volumen de 0.25 mL por embrión.
Los embriones fueron incubados a 370C y
diariamente se chequeó su viabilidad. A las 72 Resultados
horas post-inoculación, se cosechó el líquido
Detección de anticuerpos
alantoideo y se realizaron dos pases ciegos
en embrión de pollo. Posteriormente a partir Un total de 174 muestras fueron seropositivas
del líquido alantoideo se realizó la prueba de mediante el método de ELISA, lo que representa
hemaglutinación (OIE, 2012). un porcentaje del 49,7%, mientras que 176
resultaron seronegativas lo que representa
Extracción de ARN Técnica Reacción en Cade- el 50,3% de las muestras colectadas. En la
na de la Polimerasa – Reverso Transcriptasa figura 1 se puede observar que la parroquia
con mayor presencia de anticuerpos fue
La extracción de ARN se realizó mediante el Ki Paletillas, así como la de menor presencia fue
Viral RNA/DNA mini Kit (Invitrogen). Se realizó la parroquia Bolaspamba.
la cuantificación del ARN viral en un equipo
Nano Drop (2000). La RT-PCR se llevada a En el Cuadro 1 se muestran los resultados
cabo con SuperScript® III One-Step RT-PCR de la prueba x2 donde se observa que
System with Platinum® Taq DNA Polymerase solamente existen diferencias significativas
(Invitrogen). Los cebadores utilizados para en la Parroquia Paletillas entre el número de
determinar la presencia de NDV fueron ALLs muestras positivas y negativas.
Figura 1. Presencia de anticuerpos contra el Virus de Newcastle en gallinas criollas en parroquias del cantón Zapotillo.
Aislamiento del virus a partir de hisopados Los resultados del aislamiento viral después
cloacales de 3 pases sucesivos realizados en embrión
de pollo revelaron que en 15 de las muestras
Cuadro 1. Comparación de los casos positivos y negativos por en las parroquias del cantón Zapotillo mediante prueba x2.