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Modulo 1a.

Técnicas en biología molecular- construir una molécula recombinante

Definiciones importantes:

 Tecnología del DNA recombinante: Involucra la manipulación del secuenciado


de DNA y la construcción de moléculas quiméricas ( DNA recombinante de
diferente origen)
 Ingeniería genética: Es la aplicación de la tecnología del DNA RECONBINANTE
a problemas específicos en la agricultura, medicina, etc.
 Genómica: Es la última extensión de la tecnología del DNA RECONBINANTE e
involucra el análisis global de los ácidos nucleicos presentes en el núcleo de una
célula, un organismo o un grupo de especies relacionadas
 Clonación de DNA : Es la introducción de una sección del DNA a un genoma en
el cual puede ser reproducida muchas veces
 Clon: Es una colección de moléculas, virus, células u organismos genéticamente
idénticas.
 ORGANISMOS MODIFICADOS GENETICAMENTE (OMG): Es aquel cuyo
material genético ha sido diseñado o alterado deliberadamente

PASOS CLAVES EN LA BIOLOGIA DEL DNA RECONBINANTE

1. Enzimas de restricción que corten en sitios específicos del DNA donador del gen
de interés
2. Vectores de clonación que permitían la auto replicación del gen de interés
3. Enzima capaz de unir el fragmento de DNA que porta el gen de interés en el
vector de clonación.
4. Introducción de la molécula recombinante a una célula hospedera que le permita
replicarse (amplificarse)
5. Métodos para identificar o seleccionar aquellas células hospederas que portan
la molécula recombinante

NOTA: Los plásmidos son elementos de recombinación

ETAPAS DE CLONACION DE UN FRAGMENTO DE DNA

EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS: DNA genómico y DNA plasmidico

AISLAMIENTO DE DNA

 Para purificar el DNA se involucran cuatro etapas generales:


1. Colecta de las muestras de interés
2. Ruptura de la célula: pared celular y membrana celular en bacterias, hongos y
plantas; membrana celular en animales
3. Remoción de los detriotos celulares (proteínas, membranas, carbohidratos,
etc.) del extracto celular, excepto el DNA
4. Concentración de la solución de DNA presente en el extracto.

COLECTA DE LA MUESTRA

1. Siembra de la bacteria u hongo de interés y colecta de la muestra por


centrifugación
2. Colecta en campo del material vegetal de interés
3. Toma de muestras de sangre u otro tejido del animal de interés

RUPTURA DE LA CELULA

 El tipo de celula determina ell método a utilizar para lisar la celula


 La lisis celular (ruptura de la pared y membrana nuclear) se puede realizar por:
o Medios físicos (molienda) –plantas.
o Medio químicos:
1. Lisozima - digiere pared celular en bacterias
2. EDTA – remueve los iones magnesio y estabiliza a membrana
3. SDS – Remueve moléculas lipídicas rompiendo la bicapa de
fosfolípidos

PREPARACION DEL EXTRACTO CELLULAR

 Centrifugación del extracto celular para remover los detritos celulares


 Los detritos celulares formados en pellet (pastilla) en el fondo del tubo
 El DNA permanece soluble en la super nadante (solución cristalina)

LIMPIEZA DEL DNA DE EL EXTREMO CELULAR

 Para eliminar proteínas, se utiliza una mezcla de fenol:cloroformo


 Si hay exceso de proteínas, se trata el extracto con proteasas (proteínas K) antes
de la extracción con fenol.}
 Aunque el fenol elimina RNAm, para eliminar el RNAr es necesario tratar el
extracto con RNAasa.

CONCENTRACION DE DNA

 El método más frecuente para concentrar DNA es la precipitación con etanol


 La presencia de sales (Na+) y baja temperaturas (-20°C) mejorar la precipitación
de los ácidos nucleicos con etanol.

PREPARACION DE DNA PLASMIDICO

 Se separa e DNA plasmidico del DNA genómico bacteriano


 Se pueden utilizar métodos que los separen por tamaño o por conformación
 Separación con base al tamaño: la bacteria se lisa con EDTA, lisozima y sacarosa
25% bajo condiciones controladas
 El DNA genómico queda unido a la membrana y se precipita junto con los dentritos
celulares
ELECTROFORESIS: Método de separación de moléculas de DNA de diferente tamaño

http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm

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