PRACTICA 4

Código FLA-23 V. 00
EXTRACCION DNA
ENFERMEDADES INFECCIOSAS
UNIVERSIDAD DE PAMPLONA Página 1 de 1

Objetivo General:
Conocer y realizar la extracción de DNA a partir de células animales para su posterior uso
en técnicas de biología molecular, para el diagnóstico de enfermedades infecciosas u
otros usos

Objetivos Específicos.
Conocer los diferentes métodos de extracción de DNA aplicados sobre diferentes tipos
celulares

Aplicar la técnica de Fenol-cloroformo para la extracción de ADN a partir de células

humanas

Conocer los métodos para medir la concentración y calidad del ADN

3. Marco Teórico:

La extracción de DNA es uno de los pasos fundamentales para el desarrollo de diversas

técnicas de biología molecular en la cual se incluye el diagnóstico de enfermedades
infecciosas, así como otras técnicas tales como la determinación de paternidad en
diferentes especies incluyendo caballos, bovinos y perros, pero igualmente pueden
determinarse marcadores moleculares relacionados con la producción o la calidad de la
carne o la leche, así como la resistencia a enfermedades.

Para realizar la extracción de DNA, este puede obtenerse a partir de cualquier célula viva,
a excepción de los eritrocitos que son anucleados. las preferencias se inclinan hacia las
muestras de pelo (folículo piloso) y en menor medida la sangre y tejido (músculo o
piel). Existen varias técnicas una de ellas utiliza lisis alcalina, otras incluyen la utilización
de acetato de sodio, la separación en soluciones salinas (Salting out) y el método de fenol
cloroformo, esta técnica aplica básicamente los mismos para todo tipo de célula. En primer
lugar estas se rompen ya sea por métodos mecánicos o químicos, y se extraen las proteínas
mediante incubación con una proteinasa. A continuación se separan el ADN y el ARN del
resto de constituyentes de la célula utilizando una mezcla con fenol. Los ácidos nucleicos
se distinguen de las restantes sustancias bioquímicas en que no se disuelven en fenol. Tras
la centrifugación, el fenol se separa de la fase acuosa. Las proteínas y las grasas
permanecen en el fenol, pero el ADN y el ARN se encuentran en la fase acuosa. Los restos
de fenol pueden eliminarse con cloroformo. El fenol se disuelve en el cloroformo, mientras
que los ácidos nucleicos permanecen en la fase acuosa. Posteriormente la adición de etanol
hará que el ADN se vuelva insoluble y forme un precipitado visible, semejante a un trozo de
algodón, el cual puede ser fácilmente extraído y disuelto en una solución de agua y ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA), listo para su análisis. El ADN de un peso molecular
inferior, como el de plásmidos bacterianos, no puede ser extraído de la misma manera y
debe recuperarse por centrifugación.

Finalmente se han desarrollado diversos kits que traen soluciones estandarizadas para la
extracción de ácidos nucleicos, sin embargo tienen como limitante el costo, el cual es mas
elevado que los métodos desarrollados en el laboratorio. Finalmente, La concentración de
ADN en una solución puede determinarse mediante espectrofotometría. El ADN absorbe la
luz a una longitud máxima de onda de 260 nm. Una solución de ADN de 1 mg/ml tiene una
densidad óptica a 260 nm. Las proteínas absorben la luz a una longitud máxima de onda
de 280 nm. El índice de densidades ópticas a 256 y a 280 nm es un indicador de la pureza
de la solución.

4. Materiales, Equipos e Insumos.

 Centrifuga de Tubos eppendorf
 Pipetas de 5-10
 Pipetas de 50-100
 Pipetas de 100-1000
 Tubos Eppendorf de 2 ml

5. Reactivos
 Solución A
 Fenol
 Cloroformo-Alcohol Isoamilico 24:1
 Acetato de Sodio 3M
 Etanol Absoluto
 Etanol 70%
 TE
 Agua Tipo I
 Hipoclorito 2%

6. Procedimiento

El material a utilizar debe estar nuevo, limpio y estéril. Se deben cumplir con las
normas de bioseguridad. Antes de comenzar el procedimiento de extracción de ADN
se recomienda limpiar el papel Kraft con Hipoclorito al 2%, cambiar los guantes si
tienen contacto con alguna superficie contaminada y mantener el cubilo de
extracción de ADN cerrado durante todo el procedimiento, de esta manera se
garantiza una muestra de ADN mas pura. (Ver el video adjunto)

Lisis Celular y Precipitación de proteínas

1. Tomar una muestra de sangre en un tubo con anticoagulante y llevarlo a

centrifugación a 2500 rpm por 15 minutos
2. Eliminar el suero y tomar 500 l del Buffy coat o paquete de blancos y transpasarlo
a un tubo eppendorf, lavar con 500 ul de solución A por dos veces centrifugando a
12.000 rpm durante 10 minutos, eliminar los sobrenadantes y dejar el pellete
3. Agregar al pellete 500 l de Fenol mezclar por inversion varias veces.
4. Centrifugar a 12000 rpm durante 10 min a una temperatura de 4 grados centígrados.
5. Las proteínas y restos de membrana formaran un precipitado (fase organica), el
sobrenadante (fase acuosa) que es donde se encuentra el ADN se transferirá a un
tubo eppendorf limpio.
 6. Se recomienda hacer doble extracción con Fenol para garantizar mayor cantidad de
ADN. Para ello se repiten los pasos anteriores ( 1-3).
7. Al sobrenadante extraído en los pasos anteriores se le agrega 500 l de cloroformo-
Alcohol isoamilico 24:1, se mezcla por inversión varias veces.
8. Centrifugar a 12000 rpm durante 10 min a una temperatura de 4 grados centígrados.
9. Las proteínas y restos celulares se precipitaran, el sobrenadante que es donde se
encuentra el ADN se transferirá a un tubo eppendorf limpio, procurando medir la
cantidad que se extraiga.

Precipitación del ADN

10. Al sobrenadante obtenido del paso anterior se le agrega un decimo de Acetato de

Sodio 3M. (Por ejemplo, si se obtuvieron 350 l de sobrenadante se le agregaran
35 l de Acetato de Sodio. Con esta sal el ADN cargado negativamente obtendrá
una carga positiva que facilitara su precipitación)
11. Agregar 500 l de Etanol Absoluto 99.9% (El alcohol promoverá aún más la
precipitación del ADN, ya que sustrae las moléculas de agua del ácido nucleico y
por ende lo deshidrata además de que elimina las sales).
12. Centrifugar a 12000 rpm durante 10 min a una temperatura de 4 grados centígrados.
13. Descartar todo el contenido del tubo eppendorf. (En esta etapa el ADN se ha
precipitado y deshidratado).
14. Agregar 500 l de Etanol al 70% preparado en el momento (350l de etanol absoluto
+ 150l de agua tipo I).
15. Centrifugar a 12000 rpm durante 10 min a una temperatura de 4 grados centígrados.
16. Descartar todo el contenido del tubo eppendorf. (En esta etapa el ADN precipitado
esta libre de contaminantes).
17. Dejar secar toda la noche.
18. Hidratar el ADN con solución TE.

Cuantificación del ADN total extraído

La concentración del ADN de las muestras se determinará mediante la lectura de la

absorbancia en un espectrofotómetro.

19. Se realizará una dilución 1:100 de la muestra de ADN en agua destilada.

20. Se medirá en una cubeta de cuarzo de 1 ml. La longitud de onda seleccionada será
de 260 nm (1 OD = 50 g/ml de ADN) y 280 nm para determinar su pureza,
calculándose la razón OD 260/OD 280. Valores entre 1,6 y 2 indicaron una buena
calidad del ADN.

7. Nivel de Riesgo.

Moderado

8. Bibliografía
- ZUMBO, P. Phenol-chloroform extraction. Weill Cornell Medical College. Laboratory
of Christopher E. Mason, Ph.d. Department of Physiology & Biophysics.
 - SAMBROOK, J., FRITSCH, E., MANIATIS, T. (1989). Molecular cloning a Laboratory
Manual. Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory. New York. United States.

9. Anexos

Ver video anexo.