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MALASPINA 2010:
CAMBIO GLOBAL Y EXPLORACIÓN
DE LA BIODIVERSIDAD DEL OCÉANO GLOBAL
VERSIÓN 2.0
DICIEMBRE 2010
1
Índice de contenidos
Equipo de trabajo………………………………………………………………………....2
Bloque 1. Coordinación…………………………………………………………......…3
- Muestreo de aerosoles……………………………………………………..…288
- Muestreo de cocolitóforos………………………………………………….…318
- GPP-18O…..…………………………………………………………………….344
EQUIPO DE TRABAJO:
2
BLOQUE 1
COORDINACIÓN
3
Maniobras Expedición Malaspina-2010
Ciclo de estaciones: Dia 1: A... Día 2: A...Día 3: B...Día 4: A...Día 5: A... Día 6:
C (i.e. 2 estaciones A seguidas de una estación B, y una C en vez de una B
cada seis días; y repetición del ciclo).
Se muestreará una estación por día. El Jefe Científico, en consulta con los
investigadores y el coordinador del proyecto, podrá decidir saltase alguna
estación por causas de fuerza mayor, o añadir alguna estación cuando el
tiempo ganado lo permita.
Estaciones A:
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7:30 - 8:40 Seis lances de Botellones de 30 L a 3 m de profundidad (bloques
biogeoquímica: 2 botellones; bloque fitoplancton: 2 botellones; bloque
microheterótrofos: 2 botellones; científico responsable de maniobra: personal
designado por cada bloque implicado). Responsable de botellones:
Biogeoquímica.
Total: 7 h 30’
Estaciones B:
9:00 - 10:30 Pescas Verticales (30’ fitop; 30’ contaminantes; 30’ zooplankton,
científico responsable de maniobra: personal designado por cada bloque
implicado.
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11:00 - 11:30 Radiómetro (bloque fitoplanton, científico responsable de
maniobra: persona designada por bloque fitoplanton)
Total: 8:00 h
Estaciones C:
9:00 - 10:30 Pescas Verticales (30’ fitop; 30’ contaminantes; 30’ zooplankton,
científico responsable de maniobra: personal designado por cada bloque
implicado.
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En la Arrancada: en proa torpedo muestreo de metales (10’, científico
responsable de maniobra: persona designada por bloque biogeoquímica) y en
el pórtico lateral de popa una red de neuston (científico responsable de
maniobra: persona designada por bloque zooplancton).
Total: 11 h 00’
2. Maniobras adicionales:
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2.Maniobras a bordo del Sarmiento de Gamboa.
Día Tipo:
El esquema de maniobras de un día tipo es el que sigue, si bien es necesario
tener en cuenta que las horas son aproximadas, pues dependerán de cuando
se
llegue a la posición (ver tabla adjunta), y además el número de estaciones
por día puede oscilar dependiendo de su profundidad, desde las 5 por día en
las zonas de plataforma a las 2 por día en la zona de la dorsal atlántica.
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Volúmenes de agua y profundidades en la roseta de 4000 metros
BP, BA,
nutr, nutr org, CARD-FISH,
DOC, enzimas,
CDOM/FDOM, biologs, pesca
gases, DIC, DNA+RNA, invento
salinidad POM, isótopos etc botella
Profundidad Profundidad (m) Niskins Vol total (L) FÍSICA ???? Fito (L) Biogeo (L) Micro (L) Zoo (L) ContaminantesAgua
(L) remanente
DSL = Deep Scattering Layer (profundidades determinadas por responsable de sondas del grupo zoo)
Total botellas 24
Nota de Pep El acuerdo entre Micro y BGQ es que tomaremos los volúmenes de agua de la forma siguiente:
* estaciones B (Micro 264)
* estaciones C (BGQ 264)
* estaciones D (Micro 132 BGQ 132)
Así aseguramos que que se coge suficiente cantidad para la colección de DNA+RNA (stns B) y UDOM+POM (stns C)
y que tendremos estaciones en las que caracterizaremos la diversidad microbiana y quimica (stns D)
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27-10-10 13:15:16 Local *** POINT SETUP *** WGS-84 Geographic Page 1
NO NAME LATITUDE LONGITUDE RADIUS SYM TEXT
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DISTRIBUCIÓN DE ESPACIOS A BORDO
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Incubaciones, en toldilla
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18
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UDOM-POM
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Bloques 5 y
6: Contador
centello
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La Expedición Malaspina 2010 tiene, por su carácter de campaña continua de
circunnavegación, en la cual durante la estancia en puerto se efectuaran visitas y ruedas de
prensa, y produciéndose un cambio de científicos participantes de forma regular, un
carácter especial que requiere que se regule la presencia de personal científico y técnico a
bordo en la mar y en puerto, a fin de asegurar las mejores condiciones de habitabilidad
posibles y su coordinación con las actividades del proyecto. A este fin, el Comandante del
BIO Hespérides. CF. Juan Antonio Aguilar Cavanillas, el director de la UTM, J. J. Dañobeitia y
el coordinador del proyecto Expedición Malaspina 2010, Prof. Carlos M. Duarte Quesada,
han acordado unas normas de habitabilidad y convivencia , que serán de obligado
cumplimiento para todo el personal científico‐técnico que participe en el Proyecto de
Circunnavegación Malaspina 2010.
I. NORMAS EN PUERTO:
1) Todos el personal científico y técnico cuya participación en el proyecto
Malaspina concluya en un puerto intermedio, abandonará el buque la mañana
de llegada a puerto, antes de las 1200 del mediodía, hora local. (cuando la
llegada se produzca a las 0800 habituales), o en un plazo de cuatro horas si la
llegada a puerto tuviese lugar más tarde de las 0800, siempre en horario diurno.
2) Todo el personal científico‐técnico cuyo trabajo a bordo se inicie en un puerto
intermedio, ocupará su camarote a partir de la noche anterior a la salida del
buque a la mar, nunca antes.
3) El Jefe Científico y el Jefe de la UTM embarcados, máximos responsables de que
se cumplan las normas de convivencia indicadas por parte del personal
científico‐técnico, nombrarán una “Persona de Contacto” a la cual dirigirse,
para todo lo referente al cumplimiento de estas normas, así mismo, será el
responsable de transmitir las necesidades del personal científico‐técnico, que no
se hayan podido atender antes de la entrada en puerto al personal de la
dotación designado al efecto (Jefe de Aprovisionamiento y Suboficial de
Alojamientos y Servicios). Dicha persona de contacto, estará localizable en todo
momento durante el horario de trabajo/visitas.
4) El personal científico‐técnico cuyo trabajo a bordo continúe en la siguiente
etapa del Proyecto, seguirá manteniendo la condición de personal embarcado
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durante la estancia del buque en un puerto intermedio y podrá mantener
ocupado su camarote si así lo desea, con las restricciones que se señalan a
continuación:
• Durante la estancia en puerto únicamente se servirán comidas al
personal científico‐técnico que esté a bordo para atender las visitas al
buque relacionadas con el Proyecto (ya sean de medios de comunicación
o de autoridades), o para realizar tareas de reparación de equipos y
recepción de material científico‐técnico. El Jefe Científico y el Jefe de la
UTM o a través de su Persona de Contacto, entregarán una lista con el
personal, que cumpliendo las condiciones anteriormente expuestas,
comerá a bordo. Dicha lista será entregada al Oficial de Servicio, o en su
defecto al Suboficial de Guardia siempre antes de las 0900 horas del día
en cuestión, siendo aconsejable entregarla con 24 horas de antelación.
• El Servicio de Lavandería, permanecerá cerrado durante la estancia en
puerto para todo el personal científico‐técnico al igual que para el resto
de la dotación, salvo casos excepcionales.
• Durante las escalas en puerto, todo el personal científico‐técnico que
pernocte a bordo del buque, sin excepción, deberá ausentarse del
buque durante las horas fijadas para la limpieza, normalmente el día de
llegada, dejando los camarotes listos a tal fin. El personal científico‐
técnico, dejará los espacios comunes arreglados, despejados de objetos
y listos para la limpieza a las 0900 horas del día en que se haya
contratado el servicio de limpieza. En el caso de que alguien desee
limpiar personalmente su camarote, deberá indicarlo y comunicarlo con
antelación suficiente al responsable de las limpiezas en ese puerto, al
objeto de que los camarotes queden señalizados durante las limpiezas.
La responsabilidad de la verificación del servicio de limpieza realizado
recaerá exclusivamente sobre la persona designada como responsable
de las limpiezas de zonas de personal científico‐técnico.
• Durante el horario de actividades relacionadas con el Proyecto y que
tengan lugar en puerto a bordo del buque (visitas o ruedas de prensa),
solamente permanecerán en los espacios comunes del buque, aquellos
científicos‐técnicos que vayan a participar en estas actividades, o
quienes estén involucrados en la reparación y recepción a bordo de
equipos y material científico. El resto del personal científico‐técnico solo
podrá permanecer en su camarote; de circular por el buque, sólo lo hará
para entrar o salir. Las puertas de los camarotes se mantendrán cerradas
en todo momento durante el desarrollo de las actividades relacionadas
con el Proyecto.
• Cuando se celebre a bordo una rueda de prensa, el personal científico‐
técnico que no intervenga deberá, en la medida de lo posible,
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ausentarse del buque durante la misma. Si decide permanecer en su
camarote, lo hará con la puerta cerrada hasta el fin de la misma, para no
perturbar el acto, que tendrá lugar en la Cámara de Oficiales y
Científicos Nº1.
5) La limpieza de la cámara, pasillos y office de la zona de científicos será
responsabilidad del personal científico‐técnico. Estas áreas tendrán que estar
recogidas y limpias a las 0900 horas de cada día. La/s persona/s de contacto
designadas por el Jefe Científico y el Jefe de la UTM, se preocuparán del
cumplimiento de las normas, así como de comprobar que en todo momento
disponen del material necesario, comunicando con antelación suficiente, antes
de la entrada en puerto, cualquier necesidad de material de limpieza.
6) El Jefe Científico y el Jefe de la UTM presentarán al Segundo Comandante antes
de la entrada a cada puerto, un listado de movimientos de personal (se
adjuntará modelo), identificando a las personas que desembarcan, embarcan o
continúan a bordo, así como a aquellos que participarán en las visitas al buque
relacionadas con el Proyecto. En dicho listado se facilitará la siguiente
información:
• Nombre y Apellidos
• Nacionalidad
• DNI ó Pasaporte
• Número de Camarote
El Segundo Comandante proporcionará las llaves de los camarotes al Jefe
Científico y al Jefe de la UTM para el personal que continuando a bordo, así lo
desee. El día de la salida a la mar serán devueltas al Segundo Comandante.
7) El barco preparará antes de la llegada a cada puerto un Calendario de
actividades a realizar durante la estancia en puerto y entregará una copia al Jefe
Científico y al Jefe de la UTM. Al mismo tiempo el Jefe Científico y el Jefe de la
UTM facilitarán al Segundo Comandante, un Calendario de
Trabajos/actividades de su Personal en puerto, poniendo especial énfasis en
aquellos que puedan requerir la participación de miembros de la dotación del
buque (movimiento de carga, recepción de material, etc.…).
II. NORMAS EN LA MAR:
1) Separación de basuras. A bordo se realizará en todo momento la separación de
las basuras. Es muy importante efectuar esta separación también en los
laboratorios, utilizando para ello los contenedores disponibles y rotulados para
cada tipo de basura. Tanto en los laboratorios como en el comedor y en las
distintas cámaras, hay contenedores para basura de los siguientes tipos:
• orgánica (se tritura antes de arrojarse al mar)
• papel (se quema)
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• envases (se compactan)
Existen además contenedores para el almacenamiento de:
• aerosoles (cubierta de vuelo)
• pilas (Central de Máquinas)
2) Comportamiento de respeto en zonas comunes
• Respeto y cumplimiento de las zonas de seguridad. Es importante
respetar estas zonas durante el trabajo en cubierta, sobre todo el área
de seguridad de los chigres y grúas. Se cumplirán en todo momento las
indicaciones dadas por el personal de la dotación en cubierta. Se
respetaran igualmente las zonas de trabajo designadas y el material
asignado a cada zona de muestreo.
• Todo el personal que se encuentre en cubierta participando en los
trabajos de toma de muestras deberá llevar el vestuario apropiad que
incluirá los equipos de protección individual (EPI´s), compuesto por el
chaleco salvavidas, casco, calzado de seguridad, guantes y todo artículo
que fuese considerado necesario por el personal del buque responsable
de la seguridad, de acuerdo con las circunstacncias.
• Zona de fumadores. Solamente se podrá fumar en las zonas
específicamente indicadas para ello tanto de interiores (solamente
habilitadas en caso de mal tiempo) como en exteriores, para evitar en
todo momento la contaminación de las muestras.
• Las personas responsables de las visitas guiadas al buque durante su
estancia en puerto, deberán respetar los horarios de visitas,
presentándose con la antelación requerida al objeto de ultimar los. El
jefe de campaña les informará de los horarios y de las instrucciones
específicas de cada puerto.
• Puntualidad a la hora del muestreo. Se extremará la puntualidad a la
hora de efectuar los muestreos. En caso de que el personal designado
para dicho muestreo no se encuentre en supuesto de trabajo a la hora
correspondiente, ese muestreo será cancelado.
• Se recuerda la prohibición de consumir bebidas alcohólicas de alta
graduación a bordo.
• Celebraciones durante las navegaciones: En cada navegación se prevé
organizar dos celebraciones colectivas (siempre en horario diurno), las
cuales serán aprovechadas para conmemorar cualquier tipo de
onomástica, cumpleaños o celebración de cualquier otra índole y de tipo
particular, absteniéndose por tanto los participantes en cada campaña
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de solicitar permisos extraordinarios para celebrar fiestas de cualquier
otro tipo fuera de las mencionadas.
• Buenas prácticas de imagen: Para realizar fotos al personal de la
dotación del buque que vayan a ser publicadas en los medios, se avisará
con una antelación de 24 horas al Segundo Comandante, acordándose el
lugar, la hora y el personal implicado en el reportaje fotográfico que se
desea realizar. Para fotografiar a cualquier persona a bordo del buque en
momentos de ocio, se le solicitará previamente su autorización para
poder efectuar la toma de imágenes.
3) Aspectos científicos
• Los participantes que vayan a necesitar recarga de nitrógeno líquido,
deberán ponerse en contacto con el responsable a bordo (miembro de la
UTM) con la antelación suficiente, para que se pueda confirmar con una
semana de antelación a la entrada en puerto, el pedido a la empresa
suministradora. Los bidones a recargar se sacarán el día de llegada a
puerto.
• No se introducirán reactivos tóxicos en la cámara congeladora (‐18º C),
ya que será necesario compartir esta cámara con almacenamiento de
víveres.
• Todos los participantes en cada etapa de la campaña deberán conocer a
los responsables a bordo de los asuntos que afecten a su actividad
científica (responsable de frío, residuos, etc.)
4) Normativa de visados:
Procedimiento a seguir a la hora de tramitar la entrada o salida del país en cada uno
de los puertos:
• En primer lugar, los jefes científicos de cada tramo de campaña
remitirán con antelación suficiente los datos personales de los miembros
de cada una de las campañas (según modelo adjunto).
• Todo el personal que embarque en el Hespérides habrá efectuado su
entrada en el país correspondiente por vía aérea. En el control de
seguridad del aeropuerto les sellarán en su pasaporte la entrada al país
como a cualquier turista (puede que en algunos casos os entreguen una
especie de certificado, que sería aconsejable no perder). Atentos a las
peculiaridades de la entrada en USA. Habrá que obtener el permiso on‐
line y comprobar que el tipo de pasaporte es válido.
• Muchos aprovecharán la oportunidad para presentarse unos días antes y
recorrer el país. Es muy importante que antes de que el barco salga a
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navegar se presentasen con antelación suficiente para entregarnos su
pasaporte y tramitar su salida sellando su pasaporte, lo cual haremos a
través del agente logístico que nos haya asignado la Armada. También
pueden hacerlo a nivel particular, presentándose en la oficina
correspondiente, pero siempre puede surgir algún inconveniente (sobre
todo en determinados países) y siempre es mejor hacerlo de forma
oficial, contando con el respaldo del agente logístico y de las autoridades
locales.
• El procedimiento con el personal que desembarca en cada puerto, será
similar. Una vez que lleguemos a puerto, el agente logístico contratado
por la Armada, subirá a bordo. El Habilitado le entregará los listados de
personal embarcado (tanto militar como civil para certificar su entrada
en el país). A parte se le entregará una lista con el personal que
desembarca. En ese instante se entregarán los pasaportes que
previamente habrán recabado del personal científico‐ técnico, para que
sellen la entrada (en función del nivel de exigencia de cada autoridad
portuaria, es posible que soliciten información de los vuelos en los que el
personal abandonará el país). La salida del país la sellarán en el
aeropuerto correspondiente, como es habitual.
• Puede suceder que la autoridad migratoria solicite que todo el mundo se
presente personalmente en las oficinas para sellar su pasaporte, aunque
no es el procedimiento habitual, ya que se suelen sellar a bordo a la
llegada del buque a puerto, ya sea porque embarque la autoridad
pertinente, o bien se encargue de ello el agente logístico.
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BLOQUE 2
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1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Procesado de muestras
2. Titulo de la técnica
Adquisición y procesado de datos CTD SBE911+
5. Equipamiento necesario
El sistema CTD de medición en tiempo real debe ir instalado en una roseta oceanográfica
y conectarse a través de un chigre a la unidad de cubierta y al PC. El sistema CTD incluye
sensores de temperatura y conductividad modulables, estables y precisos, así como un
sensor digital de presión.
La adquisición de datos CTD se controla desde el PC a través de la aplicación informática
SEASOFT-WIN 32, con la que se realiza la instalación, la configuración y la obtención y
procesado de datos. Los programas que componen este paquete son tres: SeaTerm,
Seasave-V7 y SBEDataProcessing-Win 32.
SeaTerm se utiliza para configurar los equipos cuando son utilizados por primera vez o
para su posterior modificación.
SeaSave-V7 se utiliza para la adquisición de los datos en tiempo real.
SBEDataProcessing-Win32 se utiliza para realizar la preparación inicial y el procesado
preliminar de los datos, siendo la herramienta necesaria para que éstos puedan ser
analizados con mayor profundidad con programas tipo Matlab.
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Sistema CTD.
7. Calibración
Los sensores del equipo CTD han de ser calibrados en la propia casa de
manufacturación.
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8. Descripción de la Técnica
8.1. Adquisición de datos con el CTD
8.1.1. CONEXIONES FÍSICAS: CARRUSEL/ROSETA Y CTD SBE 911PLUS - (SBE 32+SBE 9+SBE
11PLUS)
Encender el SBE 11plus y presionar RESET, aparecerá la ventana del programa con la
siguiente información.
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Esto indica que la comunicación con el PC es correcta. Por último, cerramos el programa
SeaTerm.
Clicar en REAL-TIME DATA → START. Aquí tendremos que marcar “Begin archiving data
immediately” y en el botón de SELECT OUTPUT DATA FILE NAME, seleccionar el
archivo .hex. Después clicaremos START.
8.1.3. DISPLAY
El siguiente paso consiste en crear o modificar el escritorio colocando aquellos displays
que queremos que nos representen los datos. SeaSave-V7 puede mostrar tantas
ventanas de datos como queramos. Las ventanas pueden ser montadas para mostrar
datos en tiempo real (conductividad, Tª, presión, etc.) o calcular parámetros (salinidad,
etc.). Los 3 tipos de ventanas que existen son: Fixed, Scrolled y Plot.
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Fixed Display: Tiene una lista de los parámetros seleccionados en la izquierda y
muestra los valores actuales en la derecha.
Los archivos .psa contienen toda la información con la que se ha trabajado, guardándose
las modificaciones en archivos temporales. La única manera de guardar todos los
cambios en el programa de configuración (.psa) es seleccionando FILE → SAVE SETUP
FILE AS o SAVE SETUP FILE, dependiendo de si queremos generar un nuevo .psa o
sobrescribir el actual. Tendremos que dar un nombre a la configuración.
Los DISPLAY pueden mostrarse en diversos tamaños y cantidades. Se pueden configurar
de tal modo que representen determinados valores de variables en intervalos, de tiempo o
presión, que nosotros le indiquemos. Todo esto lo encontramos en la BARRA DE
HERRAMIENTAS.
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8.1.4. FICHERO DE CONFIGURACIÓN
Una vez definido lo que queremos representar en tiempo real, el siguiente paso es
configurar el archivo de configuración del instrumento (.con). Se define qué sensores
están integrados con el instrumento, qué canales van a ser usados por los sensores y los
coeficientes de calibración de los sensores.
Se abre en la barra del menú, CONFIGURE INPUTS
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Esta pantalla describe nuestro sistema CTD y debemos definir introduciendo los nombres
y las ubicaciones en función de los canales a los que estén conectados. Nos permite
sacar un informe de la configuración (REPORT).
Configuraciones de entrada
NOTA: La configuración de todos los parámetros de CONFIGURE INPUTS está incluida
en el archivo .psa. Para guardar esta configuración FILE → SAVE SETUP FILE, antes de
salir del SeaSave
En el menú CONFIGURE INPUTS podemos definir las características de otras
configuraciones cambiando de pestaña: SERIAL PORTS, WATER SAMPLER, TCP/IP
PORTS, MISCELLANEOUS, AND PUMP CONTROL.
WATER SAMPLER: Para definir las características de la Roseta podemos lanzar las
botellas de muestras de agua por una orden desde SeaSave, de forma autónoma
(basándonos en una imposición predefiniendo las presiones o profundidades), una mezcla
de órdenes y autónoma o desde un PC remoto vía un puerto TCP/IP.
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Configuraciones de salida
NOTA: La configuración de todos los parámetros de CONFIGURE OUTPUTS (excepto
Diagnostics) está incluida en el archivo .psa. Para guardar esta configuración FILE →
SAVE SETUP FILE, antes de salir del SeaSave
En el menú CONFIGURE OUTPUTS podemos definir las características de configuración
de salida: SERIAL PORTS, SHARED FILE OUTPUT, MARK VARIABLES, TCP/IP
OUTPUT, TCP/IP PORTS, SBE 11PLUS ALARMS (solamente para configuraciones
911plus/917plus CTD), PC ALARMS, HEADER FORM Y DIAGNOSTICS.
HEADER FORM: Podemos establecer aquí las líneas de cabecera de los ficheros finales.
Tenemos hasta 12 líneas para introducir parámetros que queramos incluir en los ficheros
finales.
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En este punto, seleccionamos el archive .con adecuado a nuestra configuración, el
nombre del fichero de datos en el que almacenamos los datos (.dat o .hex) y su ubicación
(C:\Ctd\Raw\Sbe911_sn0702).
En esta pantalla podemos elegir la forma de almacenamiento de los datos (DATA
ARCHIVING OPTIONS) y la comprobación de datos. En este último, TIME IN SECONDS
AT STARUP hace referencia al tiempo permitido antes de que se reciba la primera
comprobación de datos desde el instrumento (No iniciar la adquisición hasta que el CTD
halla atemperado, 5 minutos) y TIMEOUT IN SECONDS BETWEEN SCANS al intervalo
máximo permitido entre comprobaciones tras recibir la primera desde el instrumento.
Para empezar la adquisición y visualizar los datos → START. A partir de aquí puede
ocurrir que:
Si configuramos en HEADER FORM → PROMPT FOR HEADER INFORMATION,
aparecerá el cuadro de dialogo para que lo rellenemos (Ver instrucciones adjuntas
encima del PC) → OK.
Si configuramos WATER SAMPLER, SeaSave enviará un Reset al muestreador y
esperará hasta 60s por confirmación (Disparar las botellas desde el ordenador
según las profundidades en folio sobre la Deck Unit).
Si seleccionamos NMEA POSITION DATA ADDED en el archivo .con, comenzará
aquí la comunicación.
Si seleccionamos CHECK SCAN LENGTH en el menú OPTIONS, se comprobará
el archivo .con. Si aparece mensaje de error, comprobar que se usa el archivo .con
correcto o que se han guardado las modificaciones posteriores
Aparecerá este mensaje:
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Si, antes de que termine la cuenta atrás, esta ventana se cierra automáticamente quiere
decir que tenemos conexión con la Unidad de Cubierta y con la Roseta-el CTD y se puede
comenzar el perfil de muestreo.
Si no se reciben datos dentro del periodo de TIMEOUT IN SECONS STARUP, el software
se podrá en time out, y se deberá ir al apartado de Troubleshooting del manual del
SeaSave para ver qué está pasando.
Ahora podremos ver en los DISPLAY cómo van apareciendo y son representados los
datos recogidos por los sensores.
Disparo de las botellas:
Existen diferentes maneras, si hemos escogido hacerlo por órdenes a través del
SeaSave:
En el menú REAL-TIME CONTROL → FIRE BOTTLE CONTROL. Aparecerá el cuadro de
dialogo BOTTLE FIRE. Si hemos elegido la forma SEQUENTIAL o TABLE DRIVEN, se
mostrará el siguiente cuadro:
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Clicar START para comenzar el procesado y la visualización de datos.
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9. Cuadro sinóptico de la técnica
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10. Calculo de los resultados.
10.1. Procesado de los datos del CTD: SBEDataProcessing-Win32
PASO 1
Creamos una carpeta con el nombre de la campaña
PASO 2
Dentro de la carpeta con el nombre de la campaña, creamos 2 subcarpetas que serán
(Guardar siempre en C:/):
RAW: Aquí es donde vamos a tener todos los datos brutos: metemos los .hex, .dat, .psa,
el archivo de configuración .con y los BATCH. Creamos aquí dentro otra carpeta que se
llama PROCESANDO que es donde vamos a tener sólo los datos que estemos
procesando en ese momento.
CNV: Aquí metemos los .cnv finales después de pasarlos por BATCH 1 y BATCH 2.
Evitar que los nombres de carpetas y archivos lleven “ñ”, espacios o guiones medios, ya
que Matlab no los lee. Si se usan guiones, que sean bajos.
PASO 3
Corregimos los BATCH 1 y 2 poniendo las rutas adecuadas en la ubicación de nuestros
datos:
La línea de comandos para procesar SBE25 ampliable a 911+ es:
La secuencia es:
1º El ejecutable (sbebatch.exe) con su ruta entre comillas espacio
2º El fichero de comandos con su ruta (sin comillas).
3º La ruta de lectura y escritura (sin comillas).
Batch 1:
"C:\Archivos de programa\Sea-Bird\SBEDataProcessing-Win32\SBEbatch.exe"
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando\sbe911batch1_ctd.txt
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando
Los filtros que se pasan son: datcnv, wildedit, wfilter
Batch 2:
"C:\Archivos de programa\Sea-Bird\SBEDataProcessing-Win32\SBEbatch.exe"
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando\sbe911batch2_ctd.txt
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando
Los filtros que se pasan son: filter, alignctd, celltm, loopedit, derive, binavg, rossum
PASO 4
Creamos los .psa de cada uno de los filtros que vamos a correr posteriormente en los
BATCH:
Para ello abrimos el software SBE Data Processing Win 32 y al dar al botón RUN, nos van
a ir saliendo cada uno de los filtros que vamos a aplicar.
PASO 5
Corremos el BATCH 1:
Copiamos la siguiente rutina adaptada a nuestros datos en INICIO → EJECUTAR →
ACEPTAR
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"C:\Archivos de programa\Sea-Bird\SBEDataProcessing-Win32\SBEbatch.exe"
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando\sbe911batch1_ctd.txt
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando
BATCH 1:
datcnv /i%1\*.hex /c%1\RAPROCAN0209_sn0702.con /p%1\DatCnv.psa /o%1
wildedit /i%1\*.cnv /p%1\WildEdit.psa /o%1
wfilter /i%1\*.cnv /p%1\W_Filter.psa /o%1
PASO 6
Borramos el periodo de atemperamiento del CTD en los .cnv, una vez que hemos pasado
el BATCH 1. Establecemos como inicio aquel en el que la presión sube de forma
progresiva.
NOTA: no eliminar datos en los .hex (SBE25) o .dat (911+), ya que el fichero puede
quedar corrupto.
PASO 7
Corremos el BATCH 2:
Copiamos la siguiente rutina adaptada a nuestros datos en INICIO → EJECUTAR →
ACEPTAR
"C:\Archivos de programa\Sea-Bird\SBEDataProcessing-Win32\SBEbatch.exe"
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando\sbe911batch2_ctd.txt
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando
BATCH 2:
filter /i%1\*.cnv /p%1\Filter.psa /o%1
alignctd /i%1\*.cnv /p%1\AlignCTD.psa /o%1
celltm /i%1\*.cnv /p%1\CellTM.psa /o%1
loopedit /i%1\*.cnv /p%1\LoopEdit.psa /o%1
derive /i%1\*.cnv /c%1\Raprocan0209_sn0702.con /p%1\Derive.psa /o%1
binavg /i%1\*.cnv /p%1\BinAvg.psa /o%1
rossum /i%1\*.ros /c%1\Raprocan0209_sn0702.con /p%1\BottleSum.psa /o%1
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1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Procesado de muestras
2. Titulo de la técnica
Adquisición y procesado de datos LADCP
3. Autores del documento y filiación
Marta Nuez – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Eugenio Fraile – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Pedro Vélez – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Federico López Laatzen – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
4. Finalidad. Campo de aplicación
El sistema LADCP (Lowered Acoustic Doppler Current Profiler) es un perfilador de
corrientes, basado en el Efecto Doppler. El perfilador forma parte del bloque CTD/Roseta
y conlleva un esfuerzo operacional relativamente pequeño en relación a la información
obtenida.
5. Equipamiento necesario
El sistema LADCP se compone de 2 cabezales Workhorse ADCP, dispuestos sobre la
misma vertical, pero orientados en sentido contrario y funcionando de forma síncrona.
Montados en la roseta, uno de los cabezales ADCP actúa como MASTER (mirando hacia
abajo, downlooking) y el otro como SLAVE (mirando hacia arriba, uplooking). Esta
denominación hace referencia a cual de ellos se encarga de sincronizar la emisión de los
pings con el fin de evitar interferencias en las señales de los instrumentos.
A través del chigre se conecta el sistema LADCP a un ordenador de a bordo, con el cual
iniciaremos y detendremos la adquisición de datos.
60
5.1. Puesta en el agua del sistema LADCP
El sistema LADCP es un sistema autónomo, lo que quiere decir que una vez iniciada la
estación hidrográfica (el cast), este adquirirá datos gracias a unas baterías que también
deberán de ser montadas en la roseta.
Nótese que esto es lo contrario al sistema CTD + botellas, las cuales son controladas y
alimentadas con corriente desde el barco mediante el ordenador y/o unidad de superficie
SBE 11 plus CTD Deck Unit.
5.1.1. MONTAJE
El procedimiento detallado para el montaje está ilustrado en las siguientes fotos. El
SLAVE mirando para arriba y el MASTER mirando para abajo:
SLAVE
La distribución de estas piezas es simple. En todos los casos cuentan con tres puntos de
unión a la estructura de la roseta, consistentes en pares de espigas que con una horquilla
61
y tuercas amordazan los tubos de la roseta. El MASTER y las cajas estancas de baterías
van sujetos a estas estructuras con unas abrazaderas. El SLAVE descansa en una jaula,
no tiene abrazaderas para fijarlo. Una placa constituye el anclaje, y cuenta con cuatro
agujeros que coinciden con los de la caja estanca del instrumento. Entre el ADCP y el
anclaje se colocara la protección y una lámina de neopreno. Todo se asegura bien con
tornillos pasantes. En este momento, es bueno intentar que MASTER y SLAVE queden
alineados tomando como referencia el beam 3 que tiene un puntito al lado del haz y
teniendo en cuenta que el SLAVE queda fijo y el MASTER el que se gira. Como se indica
después, una vez hecho el cableado se puede realizar una comprobación con un perfil en
seco.
ES IMPORTANTE QUE ENTRE TODAS LAS SUPERFICIES DE CONTACTO ENTRE
LAS CAJAS ESTANCAS Y LAS ESTRUCTURAS DE ANCLAJE SE COLOQUE UNA
LÁMINA DE NEOPRENO DE 5mm DE ESPESOR. Esto afianza la sujeción y asegura el
correcto funcionamiento de los instrumentos acústicos. Para facilitar el montaje es
recomendable sujetar cada una de las láminas a las abrazaderas de acero con una cinta
adhesiva (americana o aislante).
Las sujeciones o ‘cunas’ de las baterías se colocan en la base, sobre el aro inferior y la
barra que lo atraviesa diametralmente. Cada una de las dos sólo encaja en uno de los
lados, como se muestra en la siguiente foto:
62
2 cables I/O, que serán “alargadores” desde los pines P4 y P5, hasta los puertos COM1 y
COM2 del ordenador que adquiere los datos:
63
Se observa que en la parte del cable estrella en donde hay 3 cables, el del centro es
hembra y no se usará (conectado con un DUMMY PLUG). Este cable se reserva para
cuando se usen baterías propias (fabricadas por el centro / organización que utilice el
sistema LADCP).
En la adquisición usaremos un ordenador con 2 puertos COM. El terminal P1 irá al SLAVE
ADCP y el P2 al MASTER ADCP. El conector P4 (que es continuación del P1 –SLAVE-)
del cable estrella se conectará al terminal hembra del External Battery Pack “Y” Cable y el
extremo directamente opuesto a esta hembra, que será macho, irá conectado al terminal
hembra del cable “alargador” denominado formalmente como I/O Cable. Por último, el
extremo opuesto del conector hembra del I/O Cable será un conector tipo serie RS232, el
cual se conectará al puerto COMx del ordenador (siendo la x el número del puerto).
El conector P5 (que es continuación del P2 –MASTER-) del cable estrella deberá estar
conectado directamente al terminal hembra del cable “alargador” restante I/O Cable. El
extremo opuesto de este I/O Cable lo conectaremos a otro puerto COMx del (siendo la x
el número del puerto).
64
En los extremos que conectamos al ordenador de los cables “alargador” I/O Cable, habrá
un cable colgando que tendrá en su extremo un conector redondo tipo rosca. Este
conector es una toma de corriente que “enroscaremos” en su conector opuesto del
adaptador de corriente que viene en el pack del LADCP. Esto se hace con ambos cables
que van a los pines P4 y P5. Las fuentes de alimentación estarán conectadas siempre
para el caso que nos concierne.
7. Descripción de la Técnica
7.1. MASTER / SLAVE: comunicación y puesta en funcionamiento
DESPERTAR EL LADCP
Esperamos a que el BBTalk nos diga que podemos desconectar el SLAVE del PC.
65
- → SIGUIENTE. Cambiamos Baud Rate a 115200
- → SIGUIENTE. Marcamos SEND BREAK ON NEW CONNECTION → FINISH.
Esperamos a que el BBTalk nos diga que podemos desconectar el SLAVE del PC.
3. Se desconectan los cables “alargadores” del cable estrella y se colocan los dummies.
Se generará un fichero que contendrá todas las respuestas que dan ambos ADCP al
envío de los ficheros de configuración (.log). Estos se guardarán en
“C:\adcp\Xladcp.log” donde “X” será “M” para MASTER y “S” para SLAVE.
4. Antes de iniciar la inmersión de los aparatos, se comprobará que los ADCP están
funcionando, acercándonos a las “lentejas” (los 4 círculos de color naranja) y escuchando
el pingeo, o bien con la ayuda de un walkie. Tras comprobar que ambos emiten, ya
podemos iniciar el CAST.
66
Sincronización de Relojes → Muy importante en el inicio de la campaña
A. Primer uso de los ADCP en la campaña → Tras establecer la comunicación y si es la
primera vez que usamos el ADCP en la campaña, se tiene que sincronizar el RELOJ
INTERNO del ADCP con el del ordenador. Para ello debemos comprobar que el
ordenador tiene la hora correcta y dentro del BBTalk con la ventana del ADCP
correspondiente ACTIVA (SLAVE primero), hacemos un
CTRL + T
B. En las siguientes estaciones tras la sincronización inicial → Es recomendable ir
comprobando que la hora del ADCP corresponde con la del ordenador. Escribiendo
en el intérprete de comandos el comando “TS?”, nos devuelve la hora de los ADCP.
Si esta hora no coincide con la del ordenador, hay que repetir el paso A.
67
8.1 Puesta en el agua del LADCP
68
8.2. Descarga de datos del LADCP
69
9. Calculo de los resultados.
9.1. Descargar de datos del sistema LADCP
NOTA → Una vez que la roseta vuelve a la cubierta, se seca minuciosamente con un
papel los conectores P4 del External Battery Pack “Y” Cable y el P5 del cable estrella y
nos aseguraremos que no entra agua al quitarle los dummies.
Se vuelven a conectar los cables “alargadores” I/O Cables que interconectan el sistema
LADCP con el ordenador. Para evitar equivocaciones, se marcarán los cables con algún
distintivo para que siempre se conecten de la misma forma:
Nos aparecerá la pantalla de la siguiente figura, indicándonos que la descarga del fichero
se está realizando. No hay que darle importancia a los caracteres ilegibles que aparecen
en el intérprete de comandos.
La duración de la descarga de datos varía dependiendo del tiempo en el que han estado
recogiendo datos, teniendo relación directa con la profundidad de la estación realizada.
Un perfil de 4000 metros puede tardar en descargarse unos 20 minutos.
70
2. CONTINUAMOS con el ADCP SLAVE:
- Abrimos BBTalk
- FILE → NEW CONNECTION
- Marcamos: ADCP Type = WorkHorse y COM Port = COMx (SLAVE)
- → SIGUIENTE. Cambiamos Baud Rate a 115200
- → SIGUIENTE. Marcamos SEND BREAK ON NEW CONNECTION → FINISH.
Anotar el estadillo, hora y nombre del archivo. Al finalizar la descarga, quitar los cables del
cabezal y poner los dummies.
Cuando se hayan descargado los dos ADCP, se creará una carpeta con la nomenclatura
XXX, donde X será el número de la estación en la que se recogieron esos datos. Dentro
colocaremos los ficheros del MASTER y del SLAVE (Se recomienda hacer copia de
seguridad de los datos en otra carpeta del propio ordenador así como en otro medio
extraíble).
NOTA → Se recomienda descargar primero los datos del MASTER, ya que como el
SLAVE es guiado por el MASTER, éste parará de tomar datos al iniciar la conexión con el
MASTER
71
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Técnicas analíticas
2. Titulo de la técnica
Análisis de muestras de salinidad. Salinómetro de laboratorio Autosal 8400B
5. Equipamiento necesario
Salinómetro de Laboratorio Guildline Modelo 8400B “Autosal”
7. Calibración
Este procedimiento hay que realizarlo cada vez que se comienza una tanda de medidas o se
interrumpe el análisis.
7.1. Estandarización
72
2. Se limpia el circuito con agua destilada. Para ello introducimos el capilar en la
botella. Con el selector FUNCTION en ZERO, accionamos PUMPS ON y giramos
la palanca de la bomba peristáltica una posición a la derecha. Con el botón FLUSH
presionamos y soltamos varias veces para limpiar bien el circuito. No girar la
palanca de la bomba peristáltica a su posición dos, que si es verdad que succiona
más rápido, se pueden colar burbujas en el circuito. Llenamos y vaciamos varias
veces.
3. Controlar que no quedan burbujas en el circuito. En su caso, jugar con la bomba
(succionamos agua y aire) y el botón FLUSH hasta que la burbuja desaparezca.
4. Se coloca la botella de agua estándar en el soporte, introduciendo el tubo de
succión dentro de la botella y cuidando que la botella quede bien sujeta.
5. PUMPS ON.
6. Se enciende la bomba peristáltica girando la palanca un punto hacia la derecha.
7. Cuando esté llena la célula, se vacía tapando la válvula FLUSH con el dedo. Se
repite otras dos veces.
8. Se gira la palanca de la bomba peristáltica a la izquierda para desconectarla y
seleccionamos PUMPS OFF.
9. Se coloca el selector FUNCTION en la posición READ.
10. Con el selector SUPPRESSION se ajusta la lectura hasta que dejen de parpadear
los números del display.
11. Con el botón STANDARDIZE, se quita la pestaña de seguridad y se mueve poco a
poco hasta que el valor del display sea dos veces la K15 de la botella de agua
estándar. Se vuelve a colocar la pestaña de seguridad.
12. Se anota el STD (Rs) en el estadillo, que es el valor que hemos puesto en el paso
anterior.
13. Se coloca el selector FUNCTION en ZERO.
14. PUMPS ON FLUSH BOMBA PERISTÁLTICA ON llenado de la célula
cuidando de que no queden burbujas en el circuito.
15. BOMBA PERISTÁLTICA OFF PUMPS OFF.
16. Colocamos el selector FUNCTION en READ. Anotamos en el estadillo.
17. Repetimos los pasos 13 a 16 hasta que nos den tres valores idénticos en el display.
Nos tenemos que fijar que en el display siempre se muestre [valor+ valor], en el
caso de que parpadee o de un signo menos, jugaremos con el selector
SUPPRESSION.
73
8. Descripción de la Técnica
8.1. Esquema Autosal
1. Llenar el salinómetro con agua destilada (NUNCA CON AGUA DE MAR). Para ello
colocamos un tubo de silicona donde pone DRAIN/ FILL y otro donde pone
OVERFLOW y abrimos donde pone TANK DRAIN al máximo. Echamos agua hasta
que rebose por OVERFLOW y entonces cerramos la llave del TANK DRAIN.
74
2. Enchufar el baño termostático y el transformador a la corriente. El transformador irá
conectado a la bomba peristáltica.
3. Encender el Autosal 24 horas antes del análisis de las muestras, para que el baño
se caliente hasta la temperatura ambiental, mediante el botón de encendido de su
parte trasera.
4. Se debe ajustar el selector SET ºC al valor mas cercano de la temperatura del
laboratorio. La temperatura del salinómetro siempre debe ser inferior a la
temperatura ambiente. El baño estará caliente cuando las lámparas del baño se
enciendan y se apaguen en intervalos constantes
5. Quitamos los dos tubos y situamos uno de ellos en CELL DRAIN. El drenaje debe
ir, mediante un tubo de silicona, a parar a un recipiente en el que el tubo de drenaje
no llegue a tocar con la superficie de agua drenada.
6. En el momento de comenzar a utilizar el aparato, es necesario apuntar en el
estadillo correspondiente: Campaña, barco, remesa agua STD, Tª inicial del
laboratorio, Guideline (modelo y nº referencia del salinómetro), cero inicial, SBY
inicial (el selector FUNCTION lo giramos a la posición de STANDBY y su valor será
la temperatura más un número), nombre del observador, fecha, 2xK15 (K15 viene
anotado en la botella de agua de mar estándar OSI), STD(Rs) (es el valor que
ponemos en el botón STANDARIZE para que la lectura sea dos veces el K15 de la
botella de agua estándar).
NOTA → Es mejor medir muestras de salinidad parecida, para así evitar los cambios
bruscos de salinidad de una muestra a otra. Es más es deseable seguir un orden
alternativo en la profundidad de las muestras, de modo que la salinidad de cada muestra
sea similar, en lo posible, a la muestra anterior y posterior.
1. Se agita bien la botella de muestra.
2. Anotamos: orden, muestra, profundidad, razón de conductividad y cualquier otra
observación.
3. Se destapa con mucho cuidado de que no entren restos de sal del tapón dentro de
la botella y se coloca en el soporte, fijándolo bien
4. El selector FUNCTION debe estar en la posición ZERO.
5. Se enjuaga la célula de conductividad 3 veces con la muestra, vaciándola tapando
la válvula FLUSH con el dedo cuando esté completamente llena.
6. Se deja la muestra entre 1- 2 minutos para que se estabilice.
7. Se lava de nuevo el circuito 3 veces.
8. Se coloca el selector FUNCTION en la posición READ.
9. Con el selector SUPPRESSION se ajusta la lectura hasta que dejen de parpadear
los números del display o para cambiar el signo a positivo (ojo con esto).
10. Se anota la lectura en el estadillo correspondiente
11. Se repiten los pasos 5 a 9 una o dos veces, según los resultados obtenidos, hasta
que nos de una medida muy similar.
75
8.4. Procedimiento final
76
9.2. Estandarización del Autosal
77
9.3. Análisis de salinidad en muestras de agua
78
9.4. Apagado del Autosal
79
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Procesado de muestras
2. Titulo de la técnica
Calibración de datos de CTD
5. Equipamiento necesario
5.1. Instrucciones para el cuidado y limpieza de las celdas de conductividad
Esta parte es muy importante, ya que repercute directamente en la lectura del sensor de
conductividad. Los electrodos de la celda que puedan estar contaminados por
aceites/petróleos, bio-organismos o cualquier otro material extraño, van a causar lecturas
de conductividad más bajas. Por este motivo, es de especial importancia las
recomendaciones de enjuague y limpieza que especificamos a continuación:
80
Respecto al almacén de la celda de conductividad, se recomienda guardarla en seco
(antes se recomendaba guardar en húmedo, pero ya se ha desechado), si bien antes
debe ser aclarada con agua dulce y después limpiarse cuidadosamente los restos de
agua para eliminar posibles cristales de sal.
3. Cuando se vuelva a utilizar, rellenar la celda con una solución al 0.1% de Triton X-100
durante 1 hora antes de la utilización. Escurrir la solución Triton X-100, sin necesidad
de enjuagar la celda.
81
NOTA → Rodear la celda o sus extremos con un tubo Tygon, añade el beneficio de evitar
que se introduzcan contaminantes volátiles dentro de la celda (abundantes en la mayoría
de los barcos).
5.1.3. Precauciones
7. Descripción de la Técnica
Donde:
slope = intervalo de conductividad real / intervalo de lectura de conductividad del
instrumento
82
Cuando el offset es mayor que ±0.0002 S/m por año, es síntoma de un mal
funcionamiento del sensor.
Por este motivo, se recomienda corregir la deriva en la conductividad asumiendo que no
hay error de offset, a menos que exista una clara evidencia de lo contrario o sea una
necesidad especial.
Ejemplo:
Conductividad real = 3.5 S/m
Lectura de conductividad del instrumento = 3.49965 S/m
slope = 3.5 / 3.49965 = 1.000100
83
11. Calculo de los resultados.
11.1. Correcciones en la deriva de la conductividad basándonos en Botellas de
Salinidad recogidas en el mar
En este caso, los coeficientes de calibración (sensor calibrado y antes de ser usado en
campaña) son usados para calcular la conductividad y la salinidad de los CTD. Las
muestras de salinidad se obtienen usando botellas de muestreo durante los perfiles CTD,
y las diferencias entre la salinidad del CTD y la salinidad de las botellas se utilizan en la
determinación de la deriva en la conductividad.
NOTA → Al usar este método para corregir la salinidad, es importante tener en cuenta
que las diferencias entre la salinidad de los CTD y de las botellas hidrográficas se deben a
errores en las medidas de conductividad, temperatura y presión (tanto como a errores al
obtener y analizar los valores de salinidad de las botellas). Típicamente, para los sensores
que son calibrados regularmente, entre el 70 - 90% del error de salinidad de los CTD se
debe a la deriva en la calibración de la conductividad, entre el 10 - 30% a la deriva en la
calibración de la temperatura, y entre el 0 - 10% a la deriva en la calibración de la presión.
Todos los errores de temperatura y presión en los CTD y los errores en las botellas deben
ser corregidos primero, antes de atribuir las diferencias de la salinidad restante a errores
en la conductividad del CTD o a procedimientos con las correcciones de conductividad.
Ejemplo:
3 botellas de salinidad que son recogidas durante un perfil CTD; asumiendo que el
análisis en el barco de las botellas de salinidad es perfecto. La incorrección de los datos
CTD (desde SEASAVE) y las botellas de salinidad es:
Presión
Profundidad Temperatura Conductividad Salinidad Salinidad
CTD en
aproximada CTD en bruto CTD en bruto CTD en en la
bruto
(m) (°C) * (S/m) bruto Botella
(dbar)
Las diferencias de salinidad incorrecta (salinidad CTD en bruto – salinidad en las botellas)
es de aproximadamente -0.007 PSU. Para determinar la deriva de conductividad, primero
hay que corregir los datos de temperatura y presión CTD. Imaginar que el error en la
temperatura es de +0.0015 °C uniformemente en todas las temperaturas, y el error en la
presión es de +0.5 dbar uniformemente en todas las presiones (las derivas de offset se
84
obtiene al proyectar el histórico de derivas de ambos sensores desde las calibraciones
pre-campaña). Introducir estos offset en el archivo .con para calcular la presión y
temperatura CTD corregidas, y calcular la salinidad del CTD usando esta presión y
temperatura CTD corregida. Este método de corrección asume que el coeficiente de
presión para la célula de conductividad es correcto. Los datos CTD con la temperatura y
presión corregidas serán:
Salinidad
Presión CTD Temperatura Conductividad
CTD Salinidad en
corregida CTD corregida CTD en bruto
[T,P las botellas
(dbar) (°C) (S/m)
corregidas]
85
Al usar los datos de arriba, el coeficiente de corrección del slope para conductividad en
esta estación es:
Siguiendo las recomendaciones del equipo, se asume un error del offset de conductividad
de 0.0.
86
BLOQUE 3
87
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
Marta Álvarez
IMEDEA (CSIC-UBI), Esporles, Mallorca.
4. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
6.1. Muestreo
88
- tubo de tygon o de silicona para el muestreo: asegurarse que se
puede fijar al pistón de la botella niskin y que sea lo suficientemente
largo para que entre hasta el fondo del matraz del muestreo y asegure
la comodidad en el mismo.
6.2. Análisis
7. Descripción de la Técnica
7.1. Muestreo
7.1.1 Introducción
89
- cerrar la niskin
- inmediatamente añadir el cloruro manganoso (1 ml) y la disolución de
sosa (1 ml), la punta de los dispensadores se introduce como 1 cm
dentro de los matraces de muestreo.
- cerrar el matraz con su tapón y agitar fuerte
- comprobar que no hay burbujas dentro de la muestra fijada.
- seguir muestreando el resto de niskin
- reagitar todas la muestras una segunda vez, después de que se haya
formado el precipitado
- almacenar en zona fresca y oscura hasta que se valoren, cubrir con
una bolsa de basura oscura, las muestras deben estabilizarse durante
unas 24 horas
7. 2. Valoración potenciométrica
90
Valorarlas (ver sección 7.2.4), si se ven burbujas en la línea del tiosulfato,
dar golpecitos a la misma para que se muevan.
Donde:
VolS2O3 = volumen de tiosulfato gastado (ml)
Volbla = volumen del blanco (ml) La normalidad y la molaridad del
tiosulfato son equivalentes, al realizar los análisis a temperatura de
laboratorio estable todos los volúmenes de la fórmula (1) están referidos
a la misma y la molaridad a la temperatura de laboratorio es igual a la
de 20ºC que se introduce en la fórmula (2).
91
Una vez las muestras están estabilizadas a la temperatura del laboratorio
se procede a su análisis. Después de acidificar la muestra con 1 ml de
ácido sulfúrico (5M) y agitar, se toma una alícuota de la muestra con la
pipeta knudsen de volumen exacto 50ml a 20ºC.
La alícuota se analiza mediante una valoración en vaso cerrado con
una disolución de tiosulfato de sodio con una concentración nominal
de 0.025 M. El punto final se detecta potenciométricamente con un
electrodo de Pt/O2 y un valorador tipo "Titrino Metrohm". Los mililitros
gastados de tiosulfato se convierten a O2 en μmol kg-1 con la siguiente
fórmula:
V x * Vbot
( − Vblc ) * N S 2O3 * 5598 − 1000 * DOreg (2)
V Alic
O2 ,( mL / L ) =
(Vbot − Vreac )
(3)
O2 ( mL / L ) * 44.66
O2 ,( μmol / kg ) =
ρ ( Sal , Tlab) / 1000
Donde:
Vx = volumen gastado de tiosulfato, normalizado a 20ºC (ml)
Vbot = volumen aproximado de la botella (100 ml)
Vblc = volumen de tiosulfato gastado en el blanco, normalizado a 20ºC
(ml)
NS2O3 = normalidad a 20ºC del tiosulfato
DOreg = contenido en O2 de los reactivos de fijación añadidos (0.0017
ml según Murray et al. 1968)
Vreac = volumen añadido de los reactivos (2 ml)
ρ(Sal, Tlab) = densidad en kg/m3 del agua de mar a 1 atm de presión
con la salinidad (Sal, psu) de la muestra y la temperatura del laboratorio
(Tlab, ºC).
Todos los volúmenes se refieren a 20ºC usando la siguiente ecuación:
92
- tiosulfato de sodio: preparar como en Dickson (1995) pero a una
concentración de 0.025 M
- yoduro potásico: se puede preparar como en Dickson (1995) pero con
una concentración de 0.01 N o si no comprarla en OSIL SeaWater
Solutions
http://www.seawatersolutions.com/iodate-standards-73-c.asp
9. Calibración
Ver el apartado 7.
Ver el apartado 7.
13. Referencias
93
Murray, C.N., J. P. Riley, T. R. S. Wilson (1968). The solubility of oxygen in
Winkler reagents used for the determination of dissolved oxygen. Deep-
Sea Research 15, 237-238.
Dickson, A.G. (1995). Determination of dissolved oxygen in sea water by
Winkler titration. WOCE Operations Manual. Part 3.1.3 Operations &
Methods, WHP Office Report WHPO 91-1.
94
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
Pelejero, C.
ICREA y Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.
Calvo, E.
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.
Fernández-Vallejo, P.
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.
Movilla, J.
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.
Álvarez, M.
Instituto Mediterráneo de Estudios Avanzados, CSIC-UIB, Esporles,
Mallorca
4. Conceptos generales
95
específicas, que permiten conocer el pH del agua de mar. Este método
es superior en precisión y exactitud a las técnicas potenciométricas,
pudiéndose conseguir precisiones de hasta 0.0004 unidades de pH y
exactitudes de hasta 0.002 unidades de pH (Millero, 2007).
6. Equipamiento necesario
6.1. Muestreo
6.2. Análisis
96
antes del análisis se sacará la botella para que adquiera la temperatura
ambiental del laboratorio.
8. Descripción de la Técnica
8.1. Muestreo
97
8.2. Análisis por espectrofotometría
98
9. Calculo de los resultados.
99
11. Referencias
Del Valls, T.A., Dickson, A.G., 1998. The pH of buffers based on 2-amino-2-
hydroxymethyl-1,3-propanediol ("tris") in synthetic sea water. Deep Sea
Research Part I: Oceanographic Research Papers 45, 1541-1554.
Dickson, A.G., Sabine, C.L.; Christian, J.R. (Eds.) 2007. Guide to best
practices for ocean CO2 measurements. PICES Special Publication 3, 191
pp.
Millero, F.J., 2007. The marine inorganic carbon cycle. Chemical Reviews
107, 308-341.
100
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
Pelejero, C.
ICREA y Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.
Calvo, E.
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.
Fernández-Vallejo, P.
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.
Movilla, J.
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.
Álvarez, M.
Instituto Mediterráneo de Estudios Avanzados, CSIC-UIB, Esporles,
Mallorca
4. Conceptos generales
A = [HCO- ,3] + 2[CO2-,3] + [B(OH)- ,4] + [OH-] + [HPO2-,4]+ 2[PO3-,4] + [H3SiO- ,4]
+ [NH3] + [HS-] + … - [H+] - [HSO ,4] - [HF] - [H3PO4] …
-
101
existen en tan pequeñas cantidades que pueden considerarse
despreciables.
6.1. Muestreo
102
6.2. Análisis
103
casi llenar el matraz, y enrasaremos a 5l o muy cerca (zona de divisiones
de ml marcadas), apuntando el volumen exacto.
- Mediremos la temperatura con el termómetro de varilla, y la
apuntaremos. Con este dato y el del volumen se podrá calcular,
durante el análisis de datos (hoja excel y macros ya preparados), la
concentración exacta de HCl teniendo en cuenta los cambios de
dilatación debidos a la temperatura.
- Agitaremos bien la solución y la dejaremos reposar, preferiblemente un
día como mínimo.
- En el caso concreto de la campaña Malaspina, suponiendo que
analizamos 14 profundidades de la columna de agua, por duplicado,
añadiendo 3 CRMs y 10 aguas substandard, y consumiendo unos 5 ml
de solución de HCl por valoración, implica que los 5 l de solución
alcanzarán para unos 25 días (200 ml de solución por día). En cada leg,
por lo tanto, se deberán preparar aproximadamente dos veces las
soluciones de HCl.
- Podemos apurar el HCl hasta el final, pero es importante no terminarlo
durante el análisis de una tanda. Por lo tanto, si ya queda poco, mejor
hacer de nuevo antes de empezar la tanda. De hecho, ya que hay que
dejarlo reposar durante al menos un día, preveer con antelación la
cantidad de ácido que se va a necesitar para procesar la siguiente
tanda de muestras.
104
L, para poder llenar un segundo con tiempo para que se equilibre
cuando hagamos cambio de bidón.
8. Descripción de la Técnica
8.1. Muestreo
105
- Antes de empezar los análisis deberemos sacar el tampón de pH 4.4 de
la nevera para que se estabilice a temperatura ambiente (unos 20
minutos).
- Dejaremos inicialmente el electrodo del titrando sumergido en el
tampón viejo del día anterior unos 15 minutos. Abriremos antes el
taponcillo del electrodo (al final del análisis deberemos acordarnos de
cerrarlo de nuevo).
- Una vez el tampón nuevo esté estabilizado a temperatura ambiente,
dejaremos el electrodo del titrando sumergido en el tampón de pH 4.4
unos 20 minutos para que se estabilice.
- Apuntaremos la temperatura del laboratorio.
- Encenderemos el ordenador portátil, conectaremos el Titrando al
portátil por USB, y abriremos el programa TIAMO.
- Iremos a la opción [Method]. En “File”, “open”, buscaremos el método
“CAL”.
- Iremos a la opción [Workplace]. Introduciremos la identificación y el
método “CAL”.
- Con el electrodo sumergido en el tampón de pH 4.4, le daremos al
“Start” en el programa de calibración.
- Obtendremos el valor de la temperatura, el pH y el potencial. El
programa ya tiene memorizada la tabla de la relación pH vs T, obtenida
a partir de la ecuación publicada por Pérez et al (2000), pHNBS = 4.413 –
0.00059· ( T-25 ).
8.2.2. Valoración
106
de la bomba, para evitar turbulencias y burbujeos durante la extracción
de muestra (es importante abrir la llave poco a poco).
- Cuando introduzcamos la muestra succionada en la pipeta dentro del
matraz de valoración, tocaremos la pared superior del matraz (no la
muestra), y esperaremos siempre el mismo tiempo al final (e.g. 1
segundo). Es conveniente que el llenado se realice siempre de la misma
manera, para tener volúmenes lo más reproducibles posible.
- Una vez depositada la muestra, limpiaremos la punta de la pipeta con
papel de laboratorio.
- Entre muestra y muestra, nunca lavaremos el electrodo.
- Para empezar a valorar la solución en el matraz, provisto de un imán, le
daremos al botón ‘start’.
- Las primeras valoraciones las haremos con agua del continuo
(podemos llenar una botella de agua mineral de 1.5 l, despacio
evitando el burbujeo), hasta que corte bien, y obtengamos una buena
reproducibilidad en los volúmenes de HCl utilizados para llegar a los dos
puntos finales. Durante estas primeras valoraciones, aprovecharemos
para eliminar cualquier burbuja de aire que haya podido quedar
atrapada en el sistema de succión de HCl, tocando un poco los tubos
para que vayan saliendo. Opcionalmente, también existe una función
para realizar un lavado de la bureta mediante la expulsión de una
cantidad de HCl (en “workplace”, abrir la pestaña “Tools”, ir a “Manual
control”, “Dosing device 1”, “prepare” y presionar “START”. Poner la
bureta en una jarrita, dejar que complete 2 ó 3 ciclos y presionar
“STOP”).
- Para que corte bien y haga la valoración entre 2 y 3 minutos, puede
ser importante cambiar el volumen inicial de HCl que añade el titrando,
que se puede modificar mediante el software del equipo (‘Main
conditions’, ‘Start conditions’, cambiar el valor y, muy importante,
‘grabar’!). Dependiendo de la alcalinidad de cada zona oceánica,
puede que debamos cambiar este volumen inicial a lo largo de la
campaña o de cada transecto. De hecho, a veces es incluso necesario
ajustarlo en la misma estación, cuando hay mucha diferencia entre
aguas profundas y superficiales). Como indicación, el pH resultante
después de añadir el volumen inicial debe ser próximo a 5.
- Es importante observar el valor de pH que nos da el electrodo cuando
empieza la valoración. Si, por equivocación, estamos valorando una
muestra ya valorada, lo veremos así rápidamente. En este caso, parar
‘Stop’ inmediatamente, ya que el sistema continuaría añadiendo HCl sin
parar, al no alcanzar el punto final (según como se haya programado
en sistema, puede saltar una pantalla avisándote si pones una muestra
ya valorada).
- Una vez corte bien, valoraremos cuatro muestras de agua substandard
del bidón de 25L y, si obtenemos buena reproducibilidad, pasaremos ya
a los CRMs. Si no, podemos pasar alguna muestra más de agua
substandard hasta obtener buenos resultados.
107
- Valoraremos tres CRMs, para lo cual, seguramente, no bastará solo
con una botella.
- Valoraremos las muestras de la estación.
- Al final de la secuencia, valoraremos de nuevo 3 muestras de agua
substandard del bidón, para poder corregir posibles derivas.
- Si, por alguna razón, tenemos que parar a media tanda, es
conveniente pasar siempre 4 o 5 muestras de agua substandard del
bidón, para hacer los cálculos de deriva al final. Y antes de continuar los
análisis después de la pausa, también pasaremos 4 o 5 muestras del
agua substandard (es conveniente hacer turnos y evitar así paradas
largas, siempre que las condiciones lo permitan).
- Si analizamos dos estaciones seguidas, también pasaremos 2 ó 3
muestras de agua del bidón entre estación y estación.
- Después de valorar cada muestra, vaciaremos el contenido del matraz
vigilando no perder el imán, para lo cual nos ayudaremos con otro
imán.
- Al terminar la tanda de análisis, si no hay peligro de derrame por el
movimiento del barco, podemos dejar el electrodo sumergido en la
solución tampón hasta la próxima tanda de análisis, con el tapón
cerrado para que no se evapore el electrolito.
108
10.1. Determinación de la exactitud de las medidas.
11. Referencias
Dickson, A.G., Sabine, C.L.; Christian, J.R. (Eds.) 2007. Guide to best
practices for ocean CO2 measurements. PICES Special Publication 3, 191
pp.
Pérez, F.F., Fraga, F., 1987. A precise and rapid analytical procedure for
alkalinity determination. Marine Chemistry 21, 169-182.
Pérez, F.F., Ríos, A.F., Rellán, T., Álvarez, M., 2000. Improvements in a fast
potentiometric seawater alkalinity determination. Ciencias Marinas 26,
463-478.
109
Álvarez, M. et al., 2009. Estimating the storage of anthropogenic carbon
in the subtropical Indian Ocean: a comparison of five different
approaches. Biogeosciences 6, 681-703.
110
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Título de la técnica
Muestreo de carbono orgánico volátil (VOC)
3. Autores y filiación
Sergio Ruiz Halpern. Insitut Mediterani d´Estudis Avançats (IMEDEA).
Consejo superior de investigaciones científicas - Universitat Illes
Balears (CSIC-UIB)
5. Conceptos generales:
Fwa= k (Cw-Cg/H’)
H’=Cgeq/Cweq
Fwa,oc= k (EDOC-GOC/H’)
111
Asimismo, ciertos compuestos orgánicos gaseosos, contienen nutrientes
(nitrógeno y fósforo) y se pueden estimar los flujos netos de nutrientes de
la misma manera.
6. Equipamiento necesario
8. Calibración
No es necesaria
9. Descripción de la técnica
MUESTREO DE GOC:
112
PROCEDIEMIENTO:
Colocar un filtro (GF/F 25mm, sin muflar) en un tubo de teflón largo
mediante un porta filtros, colocar el extremo del tubo de teflón por
donde entrará el aire en un lugar ventilado y protegido de fuentes de
contaminación.
Aire fresco:
Burbujear durante 30 mins
A un flujo de 500-600 ml min-1 (Equivalente burbujas de pequeño
tamaño, que no hagan subir el nivel del agua ultrapura)
50 ml de agua ultrapura acidificada CON 50 µl de H3PO4, para GOC
50 ml de agua ultrapura SIN acidificar, para Nutrientes asociados
1: Portafiltros con filtro Whatman GF/F 25mm (no necesita ser muflado)
2: Difusores (uno para GOC otro para nutrientes asociados*
*(Si el flujo es desigual entre los dos difusores, se puede colocar una llave
de tres vias en cada difusor y regular un poco el flujo. Si no se toman
nutrientes asociados solo hace falta conectar un difusor)
113
3: Interruptor de puesta en marcha y potenciometro para regular el nivel
de burbujeo. (el burbujeo ha de ser mínimo, 500-600ml min-1, pocas
burbujas que no hagan subir el nivel del agua ultrapura)
4: Bateria de acido plomo 12V (cargar regularmente)
5: Bomba de vacio
6: toma de aire. Colocar en lugar ventilado libre de fuentes de
contaminación.
***COSAS IMPORTANTES
La bomba de vacio ha de colocarse al final del circuito y que actúe
desde ahí. Así se evita que el aire no pase por la bomba antes de pasar
por los difusores (se minimiza el riesgo de contaminación)
114
Figura 2. Detalle de sellado de las ampollas
MUESTREO DE EDOC:
115
Figura 3. Circuito para muestreo de EDOC
***COSAS IMPORTANTES
116
Notas sobre el muestreo de nutrientes
117
usadas. Para las trampas de agua ultrapura, se recomienda enjuagar
varias veces con el agua que se vaya a usar para equilibrar la muestra
(con ácido para GOC-EDOC o sin ácido para nutrientes ), antes de
burbujearla. Jamás mezclar difusores para EDOC con difusores para
nutrientes (el fósforo residual de acidificar el agua ultrapura contamina
las muestras de nutrientes). También es conveniente lavar todo el
material (vidiro, tubos, portafiltros, etc) con HCl al 3,7% y enjuagarlo en
agua ultrapura.
Vis =1.002*10^((1.3272*(20-Tw)-0.001053*(Tw-20)^2)/(Tw+105))
D =0.000000074*(2.6*18)^0.5*(Tw+273)/(vis*120^0.6)
118
Sc= vis/D * 0.01 (adimensional)
KGOC = Kwco2*(Sc/600)^-0.5 (m d-1)
Fvol= KGOC * EDOC (mmol C m-2 d-1)
Fab= -KGOC * (GOC/H’) (mmol C m-2 d-1)
Faw= Fvol + Fab (mmol C m-2 d-1)
Si Faw<0; ABS (Fab) > ABS (Fvol); flujo neto aire-aguaÆ deposición neta
de OC
Si Faw>0; ABS (Fab) < ABS (Fvol); flujo neto agua aire Æ volatilización
neta de OC
U SST EDOC GOC/H' Vis D Sc=Vis/D Kwco2 KGOC Fvol Fab Faw
mmol m- mmol m- mmol m-
m s-1 ºC µmolL-1=mmol m-3 Adimensional m d-1 m d-1 2 d-1 2 d-1 d-1
Vis : =1,002*10^((1,3272*(20-B3)-0,001053*(B3-20)^2)/(B3+105))
D: =0,000000074*(2,6*18)^(0,5)*(B3+273)/(E3*120^(0,6))
Sc=Vis/D: =(E3/F3)*0,01
KwCO2: =(0,24*(A3)^2+0,061*(A3))*24/100
KGOC: =H4*(G3/600)^(-0,5)
Fvol: =I3*C3
Fab: =-I3*D3
Faw: =J3+K3
119
U: velocidad del viento en m s-1
SST: temperatura del agua en grados centígrados
EDOC: concentración de EDOC
GOC/H’: concentración de GOC
Vis: viscosidad del agua
D: coeficiente de difusión molecular
Sc: número de Schmidt
Kwco2: velocidad de pistón
KGOC: coeficiente de transferencia de masa (m d-1)
Fvol:f lujo bruto de volatilización (mmol C m-2 d-1)
Fab: flujo bruto de absorción (mmol C m-2 d-1)
Faw: flujo neto difusivo de carbono orgánico (mmol C m-2 d-1)
13. Referencias
120
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
Muestreo de nutrientes disueltos
5. Conceptos generales
Los elementos nutritivos están implicados en la producción de materia
orgánica mediante fotosíntesis en la capa superficial de los océanos. Su
disponibilidad y distribución en formas inorgánicas y orgánicas juega un
papel esencial en los flujos y exportación de carbono.
6. Equipamiento necesario
Sistema de filtración Millipore.
Bomba de filtración
Nevera portátil.
Reactivos
(1) Ácido clorhídrico.
121
(3) Aclarar con abundante agua milli-Q.
Mantener en solución ácida después de cada utilización y repetir el
paso 3 antes de cada muestreo.
Ácido clorhídrico Abundante agua
10% bides tilada
24h
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
(01) Todo el material debe lavarse en ácido diluido y aclararse 3 veces
con agua milli-Q al inicio del tramo.
(02) Para evitar al máximo la posibilidad de contaminación, las botellas
de muestreo estarán numeradas y se usarán siguiendo el mismo orden.
Entre muestreos consecutivos se aclararán 3 veces con agua milliq.
(1) Conectar la cápsula de filtración a la Niskins mediante un tubo de
silicona.
(2) Dejar pasar unos 200 ml de muestra.
(3) Aclarar la botella de muestreo (Nalgene de 1L) 3 veces con la propia
muestra.
(4) Recoger la muestra. Evitar el contacto de la botella de muestreo con
superficies sucias (no depositar directamente en el suelo).
(5) Mantener las muestras protegidas de la luz natural y refrigeradas (en
nevera portátil) durante el muestreo de la Rosette.
(6) En el laboratorio, recoger las submuestras para las distintas
determinaciones. Los recipientes deben aclararse dos veces con la
muestra antes de llenarse. Mantener siempre los tubos y botellas en
posición vertical. No tocar con los dedos el interior de las botellas y
tapones. Se recogerá una botella Nalgene de 60 ml y se congelará
inmediatamente hasta la comprobación de todos los resultados. El resto
de muestras se recogerán como se indica a continuación:
122
SRP (método manual). Llenar 2 botellas de vidrio de tapón de rosca
blanco con 50 ml. Las muestras se mantendrán refrigeradas hasta el
momento de su análisis que no se demorará más de 2 h.
DOP Se analiza a partir de la determinación del fósforo total (TP),
después de la oxidación de la muestra y posterior análisis del SRP por el
método manual. Llenar 2 botellas pyrex de 50 ml de tapón de rosca y
junta de teflón con 30 ml. Las muestras se mantendrán refrigeradas
hasta el momento de su análisis, al cabo de unas pocas horas.
DON Se analiza a partir de la determinación del nitrógeno total (TN),
después de la digestión de la muestra y posterior análisis del NO3, a
través de autoanalizados. Llenar 2 botellas pyrex de 50 ml de tapón de
rosca y junta de teflón con 10 ml. Las muestras se mantendrán
refrigeradas hasta el momento de su análisis, al cabo de unas pocas
horas.
DIN Llenar 3 tubos de polipropileno de 12 ml estériles. Analizar
inmediatamente uno de los tubos, mediante autoanalizador, y congelar
los otros dos a -20 ºC hasta que se hayan verificado todos los resultados.
Congelar Llenar una botella Nalgene de 60 ml y congelar
inmediatamente.
En caso de que no sea posible el análisis inmediato, las muestras se
recogerán en botellas de polietileno o policarbonato y se congelarán
inmediatamente.
Adaptación de la técnica para medios pobres en elementos nutritivos.
En estos casos es conveniente no filtrar las muestras, de manera que el
procedimiento se iniciará en el punto 3.
Muestreo:
Tubo de
silicona
Aclarar (x2) Llenar C/N
Niskin
Filtro
200micras Garrafa 20l P
Botellas
Nalgene 123
Recoger submuestras:
50 ml 1l
muestra
Llenar
50ml Nalgene
30 ml 60ml
SRP x Muestra
Llenar
Pyrex
CONGELA
50ml 10 ml
muestra
DOP x 2
Pyrex
50ml DIN x 3
124
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
Filtración en rampa con presión positiva.
5. Conceptos generales
La actividad biológica lleva a la incorporación de carbono, nitrógeno y
fósforo en los organismos. La concentración de carbono, nitrógeno y
fósforo de la fracción particulada se relaciona con las características
tróficas del medio.
6. Equipamiento necesario
Rampa de filtración conectada a botella de nitrógeno con soportes de
filtros y botellas de filtración (ver foto).
125
DIAGRAMA DEL MATERIAL
Manòmetro
Tubos de silicona
N2
Llaves
Botella de N2 Botellas
C/N P Nalgene
Rampa de
filtración
Filtro Whatmann GF/F
Soporte de filtro
Tubos de silicona
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
(01) Usar filtros Whatmann GF/F, previamente calcinados a 450 ºC
durante 4 h.
126
(02) Todo el material mantenido en ácido diluido y aclarado 4 veces con
agua milli-Q.
(1) Aclarar la garrafa de muestreo 3 veces con la propia muestra.
(2) Recoger todo el volumen de una Niskin a través de un tubo de
silicona acabado en un prefiltro de 200 micras y que se conecta
directamente a la Niskin.
(3) Montar los filtros en sus soportes.
(4) Mezclar suavemente el contenido de la garrafa (4 veces) antes de
llenar las botellas de filtración, para homogenizar su contenido.
(5) Llenar las botellas de filtración con un volumen determinado de
muestra.
(6) Colocar las botellas de filtración en la rampa, abrir las llaves de paso
y eliminar cuidadosamente las burbujas del circuito.
(7) Verificar que la presión es inferior a 5atm.
(8) Comprobar la estanqueidad del circuito.
(9) Proceder a la filtración (abriendo las llaves de salida del agua
filtrada, recogerla en alguna botella para hacer los blancos).
(10) Para filtrar volúmenes adicionales sobre el mismo filtro, desenroscar
el tapón con el soporte de filtro, llenar nuevamente la botella (no olvidar
tapar la espita de conexión al aire), repitiendo los pasos a partir de (4).
Debe evitarse la exposición del filtro al aire.
(11) Acabada la filtración, sacar los filtros de su soporte con las pinzas,
depositar en un vial (previamente lavado en ácido y calcinado) y
congelar rápidamente en N líquido. Posteriormente los filtros pueden
trasladarse a una cámara de congelación a -20 ºC.
(12) Preparación de blancos de filtración. Filtrar agua previamente
filtrada y recoger el filtro para su posterior análisis. Se debe de filtrar un
mínimo de 2 L.
N2 N2
127
2. Abrir las llaves de paso y eliminar las burbujas 3. Filtración:
N2
Conservación:
N líquido
Vial
128
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Procesado de muestras
2. Titulo de la técnica
Determinación de nitrógeno orgánico disuelto por el método de la
oxidación con persulfato en medio alcalino.
5. Conceptos generales
El nitrógeno orgánico disuelto es un producto de la actividad biológica.
Por consiguiente, tiende a acumularse en las capas superficiales de los
océanos. La proporción de nitrógeno en forma orgánica disuelta es
variable y se relaciona con las características tróficas. Las formas
orgánicas disueltas pueden canalizar una parte sustancial de la
exportación de nitrógeno a las aguas profundas del océano.
6. Equipamiento necesario
Autoclave.
Reactivos
(1) Hidróxido de sodio (NaOH)
(2) Ácido bórico (H3BO3)
(3) Peroxodisulfato de potasio (K2S2O8).
(4) Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate; EDTA disódica
(372.24 g/mol)
129
(5) Nitrato de potasio (KNO3; 101.1 g/mol)
130
(4.1) Solución madre: disolver 202.2 mg de KNO3 en agua milli-Q, en
matraz aforado y enrasar a 0.1 L. La solución tiene una concentración
de 10 mM. Guardar en la oscuridad, refrigerada en botella de vidrio. La
solución es estable durante meses.
(4.2) Solución de referencia. Añadir 1 ml de la solución anterior a un
matraz aforado que contiene 5 L de agua de mar de baja
concentración de nutrientes (reactivo 4, del método de determinación
de SRP). La solución tiene una concentración de 4 μM de N-NO3.
Repartir la solución en botellas de policarbonato de 60 ml (Nalgene) y
congelar.
Referencia orgánica:
186.2mg EDTA
[10 mM]
Solución
MQ Refrigerar
madre
0.1l
Matraz aforado
[4 μM N-
EDTA]
Solución
referencia Agua de mar a Congelar
baja
[nutrientes]
5l
Botellas Nalgene
Matraz aforado 60ml
202.2mg KNO3
Referencia inorgánica:
[10 mM]
Solución
MQ Refrigerar
madre
0.1l
Matraz aforado
[4 μM N-
EDTA]
Solución
referencia Agua de mar a Congelar
baja
[nutrientes]
5l 131
Botellas Nalgene
Matraz aforado 60ml
8. Calibración
(1) Se utiliza la misma serie patrón, a partir de nitrato de potasio (KNO3),
que para el método de análisis de nitrato mediante autoanalizador, con
la salvedad de que, previamente, las soluciones se han sometido al
proceso de oxidación.
(2) En cada tanda de oxidación se incluirán 1 referencia de nitrógeno
orgánico (EDTA) de concentración 4 μM N-EDTA y 1 referencia de nitrato
4 μM N-NO3.
(3) Se procederá también a la oxidación y análisis de la solución
oxidante cada vez que se prepare una nueva solución.
9. Descripción de la Técnica
Oxidación.
A cada muestra 10 ml (en botella de pyrex de tapón rojo):
(1) Añadir 10 ml de solución oxidante.
(2) Cerrar herméticamente y autoclavar a 120 ºC durante 0.5 h.
(3) Enfriar el autoclave hasta temperatura ambiente antes de abrir.
(4) Comprobar que los tapones de las botellas siguen firmemente unidos
y que no ha habido variaciones de volumen. Dejar enfriar. Una vez
digeridas, el análisis de nitrato puede demorarse 1-2 días.
(5) Analizar las concentraciones de nitrato mediante autoanalizador.
13. Referencias
Grasshoff, K., K. Kremling and M. Ehrhardt, 1999. Methods of seawater
analysis. Wiley-VCH.
132
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Técnicas analíticas
2. Titulo de la técnica
Análisis de la concentración de fósforo reactivo soluble por el método
de la formación del complejo azul de fosfomolibdato.
5. Conceptos generales
El fósforo reactivo soluble alude al fósforo disuelto en el medio en forma
de ortofosfato, además de la fracción orgánica e inorgánica que
resulta liberada a la solución debido a las condiciones ácidas de la
reacción.
6. Equipamiento necesario
Placa de agitación magnética
Espectrofotómetro
133
Reactivos
(1) Ácido sulfúrico(1.835 g cm-3, 96 %).
(2) Ácido ascórbico (C6H8O6).
(3) Heptamolibdato amónico tetrahidrato ((NH4)6Mo7 O24 4H2O).
(4) Tartrato de antimonio y potasio (K(SbO)C4H4O6, con o sin 1/2 H2O).
(5) Dihidrógeno fosfato de potasio (136.09 g/mol).
134
Ácido ascórbico: Reactivo mixto:
8. Calibración
(0) El material deberá lavarse en baño ácido y aclararse 3 veces con
agua milliq previo a su uso.
(1) Preparación de patrones de dihidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4)
(1.1) Solución madre de fosfato de concentración 10 mM. Disolver
136.09 mg en agua milli-q a la que se ha añadido 0.2 ml de ácido
sulfúrico (reactivo 1), enrasar en matraz aforado de 100 ml. Guardar en
botella de vidrio pyrex refrigerada. La solución es estable durante meses.
(1.2) Solución de patrón primario. Se prepararán dos soluciones, para las
series de concentraciones bajas y altas, respectivamente.
Serie A (para concentraciones bajas): Diluir 1 ml de la solución
madre con agua milli-Q en matraz de vidrio aforado y enrasar a 1
L. Guardar en botella de vidrio pyrex, o policarbonato,
refrigerada. La solución tiene una concentración de 10 μM P-PO4.
Serie B (para concentraciones altas): Diluir 1 ml de la solución
madre con agua milli-Q en matraz de vidrio aforado y enrasar a
0.1 L. Guardar en botella de vidrio pyrex o policarbonato,
refrigerada. La solución tiene una concentración de 100 μM P-
PO4.
(1.3) Series patrón. Se preparan a partir de la solución de patrón primario
correspondiente A o B, en matraces de vidrio aforado de 100 ml. Se
preparan en agua de mar de baja concentración de nutrientes
(reactivo 4). El detalle de la preparación de las distintas soluciones se
indica en la tabla a continuación.
135
Patrón MQ (ml) [PO4]
primario (ml) (enrasar)
0.1 100 0.01
Solución 0.2 100 0.02
A 0.5 100 0.05
[10μM] 1 100 0.1
2 100 0.2
0.5 100 0.5
Solución 1 100 1
B 2 100 2
[100μM] 4 100 4
136.09mg
K H 2P O 4
[10 mM
P-PO4] S olución
MQ + 0.2ml madre
s ol.1 (ácido
s ulfúrico)
0.1l
Matraz aforado
S erie A S erie B
(concentraciones bajas ) (concentraciones altas )
[10 μM [100 μM
P-PO4] P-PO4] S olución
1ml 1ml
s olución patrón
s olución
madre madre primario
1l 0.1l
… …
[0.02 μM] [0.05 μM] [0.5 μM]
0.2ml 0.5ml [1 μM]
0.5ml 1ml patrón
patrón patrón patrón S erie
primario primario primario
primario patrón
0.1l 0.1l 0.1l primario
0.1l
136
solución tiene una concentración de 0.3 μM P-PO4. Repartir la solución
en botellas de policarbonato de 60 ml (Nalgene) y congelar. .
5ml solución B [100μM]
Referencia [0.3μM]
Congelar y usar 1 botella con
Agua de mar con cada serie de análisis.
baja [nutrientes]
5l
Matraz aforado Nalgene 60ml
50ml solución B
[100μM]
Referencia Congelar y usar 1 botella con
[1μM] cada serie de análisis.
Agua de mar con
baja [nutrientes]
5l
Matraz aforado Nalgene 60ml
(4) Calibración.
(4.1) Se llevará a cabo una calibración del equipo al inicio y final de
cada tramo, mediante el análisis de las dos series A y B de patrones.
(4.2) En cada tanda de muestras se analizarán 1 referencia de cada
concentración (0.3 y 1 μM).
137
9. Descripción de la Técnica
A cada muestra de 50 ml:
(1) Añadir 1 ml de la solución de Ascórbico, agitar y esperar 1 minuto.
(2) Añadir 1 ml de reactivo mixto y agitar.
(3) Esperar 10 minutos.
(4) Verter en una cubeta de 10 cm de paso de luz y leer en
espectrofotómetro a 880 nm.
138
13. Referencias
Grasshoff, K., K. Kremling and M. Ehrhardt, 1999. Methods of seawater
analysis. Wiley-VCH.
139
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Procesado de muestras
2. Titulo de la técnica
Determinación de fósforo orgánico disuelto y particulado por el método
de la oxidación en persulfato ácido.
5. Conceptos generales
El fósforo orgánico disuelto y particulado es un producto de la actividad
de los organismos. Por consiguiente, tiende a acumularse en las capas
superficiales de los océanos. El fósforo orgánico disuelto constituye un
recurso nutritivo de especial relevancia en el océano oligotrófico.
6. Equipamiento necesario
Autoclave.
Espectrofotómetro.
Centrífuga.
Reactivos
(1) Ácido sulfúrico (1.835 g cm-3, 96 %).
(2) Peroxodisulfato de potasio (K2S2O8).
(3) Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate (551.14 g/mol).
140
Preparación de los reactivos:
(01) Todo el material debe lavarse en ácido diluido y aclararse 3 veces
con agua milli-Q previo a su uso.
(02) Para evitar al máximo la posibilidad de contaminación, las botellas
de análisis estarán numeradas y se usarán siguiendo el mismo orden.
(1) Solución de ácido sulfúrico de concentración 4.5 mol dm-3 (reactivo
1 del método de análisis de SRP). Añadir 500 ml del ácido concentrado
a unos 1.5 L de agua milli–Q. Dejar enfriar y diluir a 2 L en matraz
aforado. Guardar en botella de polietileno. Una botella de 2L se gasta
aproximadamente en un leg, por lo que sería bueno prepararla antes
de salir de puerto.
(2) Solución oxidante de persulfato de potasio. Diluir 25 ml de ácido
sulfúrico 4.5 M con agua milli–Q hasta 500 ml, (medidos en probeta).
Disolver 25 g g de peroxodisulfato de potasio (K2S2O8). Guardar esta
solución saturada a temperatura ambiente en una botella de polietileno
de 0.5 L y protegida de la luz directa, durante una semana. Será
necesario preparar solución cada 2 AABs y también antes de salir de
puerto, puesto que caduca a la semana.
500ml
141
concentración de nutrientes (reactivo 4, del método de determinación
de SRP). La solución tiene una concentración de 0.3 μM de P-ATP.
Repartir la solución en botellas de policarbonato de 60 ml (Nalgene) y
congelar.
(4) Preparación de referencias de PO4
Diluir 3 ml de la solución A de patrón primario de fosfato (10 µM de P-
KH2PO4, tal y como se explica en la ficha de análisis del SRP) hasta 100
ml de agua de mar de baja concentración de nutrientes (reactivo 4 del
método de SRP). La solución tiene una concentración de 0.3 µM de P-
PO4.
Esquema de preparación de referencias de DOP
Referencia orgánica:
275.57mg ATP
[1.5 mM]
Solución
MQ Refrigerar
madre
1l
Matraz aforado
[0.3μM P-ATP]
Solución Agua de mar a
referencia baja Congelar
[nutrientes]
5l
Botellas Nalgene
Matraz aforado 60ml
Referencia inorgánica:
3ml Solución A
Patrón primario
de fosfato
[0.3μM]
Agua de
mar a baja Refrigerar
[nutr]
100ml
Matraz aforado
142
8. Calibración
(1) Se utiliza la misma serie patrón, a partir de dihidrógeno fosfato de
potasio, que para el método de análisis de SRP, con la salvedad de que,
previamente, las soluciones se han sometido al proceso de oxidación.
(2) En cada tanda de oxidación se incluirán 1 referencia de fósforo
orgánico (ATP) de concentración 0.3 μM P-ATP y 1 referencia de fosfato
0.3 μM P-PO4 .
(3) Se procederá también a la oxidación y análisis de la solución
oxidante cada vez que se prepare una nueva solución.
9. Descripción de la Técnica
Oxidación del fósforo total (TP).
A cada muestra de 30 ml (en botella de pyrex de tapón rojo):
(1) Añadir 2.4 ml de solución oxidante.
(2) Cerrar herméticamente y autoclavar a 120 ºC durante 1.5 h.
(3) Enfriar el autoclave hasta temperatura ambiente antes de abrir.
(4) Comprobar que los tapones de las botellas siguen firmemente unidos
y que no ha habido variaciones de volumen. Dejar enfriar. Una vez
digeridas, el análisis de fosfato puede demorarse 1-2 días.
(5) Transferir todo el volumen (32.4 ml) a las botellas de borosilicato de 60
ml para el posterior análisis del fósforo reactivo soluble.
2,4ml solución
Determinación de fósforo total (TP).
oxidante
30ml
muestra
Dejar enfriar a
temperatura
Autoclave ambiente Verificar
ajuste de
120ºC tapón y Análisis de
1,5h volumen fosfato
Pyrex
50ml 32.4ml
Oxidación 143
Determinación de fósforo orgánico particulado (POP).
2,4ml solución
Filtro POP
oxidante
30ml MQ
Dejar enfriar a
temperatura
Autoclave ambiente Verificar
ajuste de
120ºC tapón y Centrifugación Análisis de
1,5h volumen fosfato
Pyrex
50ml
Oxidación
13. Referencias
Grasshoff, K., K. Kremling and M. Ehrhardt, 1999. Methods of seawater
analysis. Wiley-VCH.
144
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento: Técnicas analíticas
5. Conceptos generales
El DMS (CH3SCH3) es un gas producido por la redes tróficas marinas a
partir de su precursor DMSP ((CH3)2S+CH2CH2COO−), un compuesto
intracelular multifuncional del fitoplancton. El DMS es emitido en gran
cantidad del océano a la atmósfera, donde participa en la formación
de aerosoles y de núcleos de condensación de nubes, potencialmente
afectando al balance radiativo del planeta.
6. Equipamiento necesario
Muestreo (material que nos llevamos a cubierta)
− 1 vial de vidrio de 120 mL
− 1 vial de vidrio de 40 mL
− 2 tapones-septum de goma gris con recubrimiento interior de Teflon
− 1 tubo de silicona
− 1 malla de Nylon de 50 µm de luz
− Guantes (opcionales: no se conocen posibles contaminaciones de la
muestra)
− 1 bandeja u otro recipiente (para transportar el resto de material)
145
7. Reactivos u otro material fungible
− Hidróxido de sodio (NaOH). Sigma Aldrich (reagent grade, pellets,
anhidrous).
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
Antes de empezar
− Lavar la malla de 50 µm con agua del continuo en el laboratorio
− Asegurarse de que otros gases más volátiles que el DMS (O2) han sido
muestreados, en caso de que nos corresponda la misma botella.
− El DMS es volátil: es importante evitar burbujeos y flujos de agua
turbulentos y con salpicaduras al llenar los viales de muestreo (dentro
de lo posible). Además, de esta forma vamos a evitar artefactos en
la medida de DMS y DMSP causados por la rotura de células.
146
precipitado blanco; es normal. La addición de NaOH va a provocar
la hidrólisis alcalina del DMSP, formando DMS + acrilato, y además va
a conservar la muestra. De esta forma, el DMSP va a ser analizado
como DMS. El sistema de cierre es estanco (gas tight) evitando la
pérdida del DMS.
− Guardamos la muestra en la oscuridad, a temperatura ambiente
(por ej., dentro de un armario), adecuadamente etiquetada con la
fecha, el número de estación y la profundidad.
147
Figura 2. De arriba a abajo y de izquierda a derecha: conjunto formado por el
sistema de purga y trampa criogénica, el cromatógrafo, y el integrador;
generador de hidrógeno; y horno de permeación, con el display mostrando la
temperatura, y los caudalímetros del patrón (no confundir con los de la purga!).
La ruedecilla a la derecha de los caudalímetros es el potenciómetro, por donde
se regula la temperatura del horno de permeación.
148
Figura 3. Izquierda: sistema de purga y trampa criogénica. Los caudalímetros
de la izquierda corresponden al aire y al He de la purga. Los termos contienen,
de izquierda a derecha, agua caliente (calentada con un hervidor tipo “kettle”),
agua fría (ambiente) y nitrógeno líquido. Derecha: detalle del vial donde se
realiza la purga. El gas de la purga (He) entra por la aguja IN (larga),
burbujeando a través del agua y arrastrando con él los volátiles de la muestra,
que salen por la aguja OUT (la corta; no tiene que llegar NUNCA al agua).
149
Figura 4. De arriba a abajo y de izquierda a derecha: submuestreando del vial
de 120 mL; eliminando burbujas; enrasando a 5 mL; filtrando hacia el vial de 20
mL usado para la purga (con su septum gris al lado, a punto para taparlo).
150
Figura 5. Enciendendo la llama del detector.
151
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
5. Conceptos generales
152
6. Equipamiento necesario
N/A
8. Calibración
N/A
153
9. Descripción de la técnica
154
Mantenimiento del micro–dispensador1
Puesta en funcionamiento
● Ponerse guantes de polietileno o nitrilo.
● llenar ¾ del depósito del micro–dispensador con acido fosfórico
(H3PO4) al 25%.
● Ajustar el micro–dispensador para dispensar 500 μL y proceder al
llenado y vaciado del émbolo 5 veces, para enjuagarlo con la
disolución de ácido fosfórico (H3PO4) al 25%.
● Ajustar el micro–dispensador para dispensar 50 μL (ya esta listo para
acidificar las ampollas).
● Colocar el dispensador en un vaso de precipitados de plástico fijado a
la poyata del laboratorio con “Velcro” o sistema similar (protección
contra rotura).
● Antes de dispensar cada serie de ampollas, desechar 3 dosis de 50 μL,
comprobando que no quedan burbujas en la punta del micro–
dispensador.
Al terminar la campaña
● Ponerse guantes de polietileno o nitrilo.
● Vaciar el acido fosfórico (H3PO4) al 25% del depósito del micro–
dispensador.
● Lavar el depósito del micro–dispensador con agua Milli–Q abundante,
llenándolo y vaciándolo 5 veces.
● Con el depósito lleno de agua Milli–Q, ajustar el micro–dispensador
para dispensar 500 μL y proceder al llenado y vaciado del émbolo 5
veces, para enjuagarlo abundantemente.
● Separar el micro–dispensador del depósito y proceder al llenado y
vaciado del émbolo del micro–dispensador 5 veces, para evacuar
toda el agua milli–Q que quede en su interior. Poner el depósito a
secar.
● Empaquetar el micro–dispensador y el depósito en su caja
correspondiente.
155
10. Cuadro sinóptico de la técnica
N/A
156
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Título de la técnica
5. Conceptos generales
157
6. Equipamiento necesario
158
- 1 Bidón de 20L para mezclar la sosa y el ácido después del lavado, y
así neutralizarlos.
- 1 Jarra (5L) de plástico.
- 2 Embudos de plástico.
- 1 Cubo.
- 25 Filtros Pall Acropak 1500 0.8/0.2 µm.
- 1 Soporte Millipore (316 Stainless Sanitary 293 mm Filter Holder, YY30
293 16).
- 1 Llave para apretar/aflojar los cierres del soporte Millipore.
- 50 Filtros GF/F de 293 mm, calcinados durante 4 horas a 450ºC.
- 2 Cubas grandes de plástico (300 L) para la muestra de agua de mar
(“CONTROL”) y la porción de bajo peso molecular (“LMW”).
- 2+2 Conexiones de teflón para extraer el agua de las cubas de
plástico.
- 2+1 Bombas peristálticas.
- 2 Bidones de 20 L con grifo y dos orificios en la parte superior para
conectar al sistema de ultrafiltración.
- 30 Botellas de teflón de dos litros para contener la fracción de alto
peso molecular (“HMW”) de las muestras una vez ultrafiltradas. Las
botellas estarán etiquetadas, taradas e incluidas en el fichero de
inventario y seguimiento.
- 70 Botes Kartell® de plástico de 50 mL para muestras de nutrientes.
- 70 Botes de vidrio de 50 mL para muestras de DO13C.
- Disolución de HgCl para conservar las muestras de DO13C.
- 2 Pipetas de plástico para añadir la disolución de HgCl.
- Cajas para muestras de nutrientes y de DO13C.
- 1 Desecador de plástico.
- 3 Botes de silica gel.
- 50 Trozos de papel de aluminio (29x40cm) calcinados (12h, 450ºC)
para guardar los filtros.
- 3 Bidones de 10 L (con marcas de 5 y 10 L) para ácido, sosa y agua
destilada/milli-Q de lavado.
- 1 L HCl (ácido clorhídrico, para preparar ácido diluido para lavar el
sistema, 5 mL de HCl concentrado por cada 5 L de agua destilada).
- Probeta de 10 mL para medir el HCl.
- 50 Viales con 2 g de NaOH (para preparar sosa diluida para lavar el
sistema, añadiéndolos a 5 L de agua destilada).
- Papel de medida de pH.
Carbono orgánico disuelto2
- 300 Ampollas de vidrio de 10 mL tapadas con papel de aluminio y
calcinadas a 450 ºC durante 24 horas.
- 300 Etiquetas de 20 mm x 20 mm (para identificar las muestras
recogidas en las ampollas).
- Rotuladores finos para etiquetar ampollas.
159
- 25% H3PO4 (ácido fosfórico) en dos frascos de vidrio de 250 mL con
tapón de teflón.
- Micro-dispensador de 25% H3PO4.
- Micropipeta para dispensar 50 µL con puntas apropiadas y limpias
(lejía y 10% HCl).
- Gradillas de plástico para muestreo con ampollas.
- Quemador bombona butano (para sellado de ampollas).
- Bombona butano (para sellado de ampollas).
- Bandejas de aluminio flexible (para sellado de ampollas).
- Pinzas de acero inoxidable de 25 cm (para sellado de ampollas).
- Gafas de seguridad (para sellado de ampollas).
- Mechero (para sellado de ampollas).
- Trozos de espuma agujereada y cajas de plástico (para
almacenamiento de ampollas).
CDOM3
- 5 Frascos de vidrio con tapón de vidrio de 250 mL.
- 2 Cubetas prismáticas con paredes de cuarzo de 10 cm para
absorbancia.
- 2 Cubetas de cuarzo de 1 cm para fluorescencia.
- 1 L HCl concentrado (37%) para preparar 1% HCl (que se usará para
lavar frascos de vidrio y cubetas).4
- Probeta de 100 mL (para medir el volumen de 37% HCl).
- NaHCO3 (que se usará para neutralizar el 1% HCl una vez usado).5
- Metanol (que ser usará para lavar la cubeta de fluorescencia en
caso de que el 1% HCl no sea suficiente).
- Caja plástico con tapa para sumergir frascos de vidrio en 10% HCl.
- 10 Cajas de KimWipes (para secar y limpiar las paredes de las
cubetas).
8. Calibración
160
9. Descripción de la Técnica
1. Sistema:
El sistema de ultrafiltración mide un metro y medio de alto. Se
colocará encima de un soporte en el suelo del laboratorio, al lado
de un mesado donde se colocará un bidón de plástico de 20 L con
soporte, y cercano a un espacio abierto donde se puedan colocar
las dos cubas de plástico de 300L (ver Esquema 1). Asimismo se
necesitará un espacio para guardar los 15 bidones de 20 L, el sistema
de filtración de material particulado y material variado como un
cubo, jarras, bidones de disoluciones de lavado, etc. Un total de 2 m
de poyata debería ser suficiente. Es importante colocar la cuba de
plástico para el LMW cerca de un desagüe para agua de mar, ya
que, eventualmente, ese volumen de agua de mar se descartará.
sistema
de ultrafiltración
manómetro
bomba
peristáltica 1
bomba
peristáltica 2
150
cm
conc
116
cm LMW CONTROL
50 llave
cm de 3 vías HMW
65 cm
a) b)
161
Esquema 1. Ultrafiltración, y detalle de la tapa superior (a) y de la tapa
inferior (b).
162
sistema
de ultrafiltración
manómetro
bomba
peristáltica 1
bomba
peristáltica 2
150
cm
conc
116
cm LMW CONTROL
50 llave
cm de 3 vías HMW
65 cm
Esquema 2. Recirculación.
163
a) b)
164
Esquema 4. Llave de mano, para apretar y aflojar los cierres del sistema
de filtración de POM.
165
sistema
de ultrafiltración
manómetro
bomba
cápsula de peristáltica 1
filtración PAL
POM: sistema
(0.8/0.2 µm) bomba de filtración
peristáltica 2
Millipore
(GF/F 293mm)
conc
LMW CONTROL
llave
de 3 vías
SW
bomba
cápsula de peristáltica 1
filtración PAL
POM: sistema
(0.8/0.2 µm)
de filtración
Millipore
(GF/F 293mm)
CONTROL
SW
166
6.b) en el momento en el que el líquido comience a salir por ella. La
cápsula de filtración también tiene una pequeña llave en la parte
superior que se debe abrir hasta eliminar el aire del interior (Esquema
6.c).
a) b) c)
167
vidrio de 250 mL etiquetado como “CONTROL” y se llena del agua de
bidón “conc” utilizando la bomba perstáltica 2 y la salida de la llave
de tres vías en la posición mostrada en el esquema 3.b. Se lava 2-3
veces y se llena completamente el frasco, el cual se conserva en
nevera y oscuridad hasta el final de la ultrafiltración, para su medida
conjunta con el bajo peso molecular (“LMW”). Una vez llenado se
vuelve a poner la llave de tres vías en la posición de paso horizontal
(Esquema 3.a) y con ambas bombas encendidas se comienza la
ultrafiltración. En la bomba 2 regulamos el flujo para que el
manómetro (situado en le parte superior del sistema) indique una
presión entorno a 5 psi (regulador de velocidad en posición quasi
horizontal, Esquema 7), lo que equivale a un flujo en la salida del bajo
peso molecular entre 70 y 100 mL por minuto. La bomba 1 se debe
poner siempre a menos velocidad que la 2 (Esquema 7) y es la que
se cambia a lo largo de la ultrafiltración, para regular el volumen del
bidón “conc” (para que no desborde ni se vacíe). En la libreta de
notas, se hace el seguimiento de la ultrafiltración, anotando la hora y
la presión del manómetro. También se mide (y anota) el flujo en la
salida del “LMW”, utilizando una probeta y un cronómetro (a la
misma altura que la salida, y devolviendo la muestra a la cuba, por lo
que hay que ser muy limpio al hacerlo). Esto se controlará y anotará
más frecuentemente al principio o cuando las condiciones del
sistema cambien. Además se controlará el flujo de entrada desde la
bomba 1 haciendo marcas en el bidón “conc” en una cinta
adhesiva que se colocará para cada muestra. Se intentará que el
sistema funcione lo más compensadamente posible.
bomba bomba
peristáltica 2 peristáltica 1
168
A medida que la muestra se va concentrando, el material de bajo
peso molecular se va depositando en la cuba “LMW”. El bidón
“conc” donde se concentra la muestra se va rellenando con el agua
de mar procedente de la cuba “CONTROL” con la bomba
peristáltica 1. Lo que se intenta es que la velocidad de esta bomba
sea lo más parecida a la velocidad de salida del material de bajo
peso molecular, para que el sistema pueda ser quasi autónomo.
Al final, cuando el volumen de muestra es reducido a menos de dos
litros (marca “final” en el bidón “conc”), se para la ultrafiltración (hay
que prestar especial cuidado en vigilar la ultrafiltración al final para
que no se nos acabe el agua y bombeemos aire al sistema). Se vierte
la muestra en un bote de teflón (utilizando la llave de tres vías en la
posición del esquema 3.b, para recoger tanto la porción de muestra
del bidón “conc” como la porción que se encuentra dentro del
sistema de ultrafiltración, volumen mayoritario y que cae muy
lentamente, por lo que se debe dejar vaciando pdurante al menos
15-20 mins). Este bote (“HMW”) se sella con cinta de teflón, se
introduce en dos bolsas de plástico con zip, se etiqueta la bolsa con
el nombre de la campaña, la etapa (“leg”), la estación y “HMW-UF”,
por ejemplo: MALASPINA-leg1 STN-1, HMW-UF, y se congela a -20ºC.
Para muestrear el “LMW” se utiliza una bomba peristáltica para,
después de homogeneizar el contenido de la cuba “LMW” coger
una muestra en un frasco de vidrio de 250 mL etiquetado como
“LMW” (lavando dos veces). El gran volumen restante de agua de
mar en la cuba “LMW” se descarta hacia la cubierta del barco o
hacia un fregadero apto para agua de mar, a través del grifo inferior
y una manguera. El líquido remanente en la cuba deberá ser
extraído con la bomba peristáltica.
• Muestras/medidas a bordo: de los dos frascos de vidrio
(“CONTROL” y “LMW”) se toman muestras para: nutrientes, DO13C,
DOC y CDOM.
NUTRIENTES
- Utilizar botes kartell de plástico de 50 mL. Cada bote se
etiqueta previamente con el nombre de la campaña, la
etapa (“leg”), la estación y el tipo de muestra (NUT-
CONTROL o NUT-LMW), por ejemplo:
MALASPINA-leg1
STN-1, NUT-CONTROL
- Llenar hasta 40 mL, colocar en caja de cartón y congelar
a -20ºC.
DO13C
- Utilizar botes de vidrio de 50 mL. Cada bote se etiqueta
previamente con el nombre de la campaña, la etapa
(“leg”), la estación y el tipo de muestra (13C-CONTROL o
13C-LMW), por ejemplo:
MALASPINA-leg1
STN-1, 13C-CONTROL
169
- Llenar hasta 50 mL, añadir unas gotas de la disolución de
cloruro de mercurio y colocar en una caja para su
almacenamiento y transporte.
DOC6
- Acidificar ampollas para DOC (5 por muestra) con 50 μL
de 25% H3PO4 (ácido fosfórico). Las ampollas se etiquetan
previamente con el nombre de la campaña, la etapa
(“leg”), la estación y el tipo de muestra (DOC-CONTROL o
DOC-LMW) y número de réplica, por ejemplo:
MALASPINA-leg1
STN-1, DOC-CONTROL_01
- Llenar las ampollas 5 mm por debajo de la línea de corte
de la ampolla.
- Sellar las ampollas al fuego (comprobando al cabo de 15
minutos si hay pérdidas).
- Colocar las ampollas en la espuma con agujeros dentro
de cajas de plástico y conservarlas en nevera (4 ºC).
CDOM7
- Analizar las muestras siguiendo el protocolo general de
CDOM (absorción y fluorescencia), adjuntándolas al resto
de las muestras del día.
- La nomenclatura a seguir para nombrar el fichero de
cada muestra al usar el FLUOROMAX es:
M(leg)(stn)(tipo)
donde tipo = control o lmw (por ejemplo M1_001control o
M1_177lmw).
170
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
Procesado de muestras
Técnicas analíticas
2. Título de la técnica
5. Conceptos generales
171
La materia orgánica disuelta cromófora modifica las propiedades
ópticas de los océanos, influyendo en su transparencia tanto a la
radiación UV como visible y, por tanto, afectando a la actividad
biológica (protección contra el efecto dañino de la radiación UV,
reducción de la producción primaria, etc…). Además, los procesos
tanto fotoquímicos como microbiológicos alteran las propiedades
ópticas de la materia orgánica disuelta cromófora de manera que la
absorbancia y fluorescencia pueden usarse para trazar la intensidad de
dichos procesos.
6. Equipamiento necesario
172
● Probeta de 100 mL (para medir el volumen de 37% HCl)
● Bicarbonato sódico comercial, que se usará para neutralizar el 1% HCl
una vez usado añadiendo bicarbonato hasta que se acabe el
burbujeo (aprox. 8 g /litro de 1% HCl).
● Papel indicador de pH
● Metanol, para lavar la cubeta de fluorescencia en caso de que el 1%
HCl no sea suficiente
● Caja de plástico pequeña con tapa, para sumergir cubetas en 1% HCl
● Caja de plástico con tapa, para sumergir frascos de vidrio en 1% HCl
● Tisúes, para secar y limpiar las paredes de las cubetas (KimWipes)
8. Calibración
Absorbancia
Fluorescencia
173
o Esperar 1 minuto.
o Encender el ordenador.
o Esperar 30 minutos a que la lámpara se caliente.
o Usar cubetas con las 4 caras de cuarzo. NUNCA tocar las cubetas
con los dedos, usar SIEMPRE guantes de vinilo o polietileno.
2. Iniciación del programa
o Abrir la hoja excel “DAILY fluoroLOG.xls” – en la que se registrará
diariamente información sobre el estado del instrumento,
inicialmente escribir fecha, usuario y horas de trabajo de la
lámpara al comienzo de la sesión (en el lateral derecho del
instrumento), el resto se irá completando a lo largo del apartado 3.
o Hacer doble clic en el icono FLUORESSENCE.
o Hacer clic en “M” para iniciar el programa (tarda unos segundos,
esperar sin tocar nada).
3. Comprobaciones diarias del estado del instrumento
● Comprobación de la Excitación
o El objetivo es comprobar la estabilidad de la intensidad de la
lámpara de xenón día a día.
o Hacer clic en “Spectra”.
o En “Experiment Type”, seleccionar “excitation”.
o Usar el “experiment file” por defecto, “DfltSpectralExcitation.xml”.
o Comprobar que la configuración es Ex 200–600 nm, Em 350 nm, Ex y
Em “slits” 1 nm.
o Hacer clic en “Detectors” y comprobar que el tiempo de
integración es 0,1 s y que la señal R1 está seleccionada y aparece
en el cuadro de “formulas”.
o Asegurarse de que la cámara del porta cubetas está vacía y bien
cerrada.
o Hacer clic en “Run” para realizar el espectro.
o Para poder visualizar los resultados, el programa preguntará por el
nombre que se quiere dar al proyecto. Introducir la fecha como
nombre del proyecto y un subíndice por si se hace más de una
sesión por día (eg. “081104_a” para la primera sesión del 4 Nov
2008). El proyecto se debe guardar en la carpeta “C:\Program
Files\Jobin Yvon\Data\MALASPINA”.
o Cuando se haya realizado el espectro, hacer clic en el 14º botón
contando desde la derecha (”Data Reader”, apariencia de visor).
Acto seguido, hacer clic en el pico más alto, que debiera
encontrarse a 467 nm con una intensidad de unos 0.1000
MicroAmps.
o Este espectro se grabará como “DfltEx1”.
o Registrar la posición (X) e intensidad (Y) del pico en el fichero
“DAILY fluoroLOG.xls” y en el cuaderno.
174
o Se pueden hacer espectros adicionales seleccionando el botón
justo a la derecha de “M”. En ese caso, los espectros adicionales se
grabarán con los nombres DfltEx 2, DfltEx 3, etc.
● Comprobación de la emisión
Espectro Raman de la cubeta sellada con agua milli–Q
o Esta prueba permite comprobar la deriva de la lámpara.
o Hacer clic en “M”.
o Hacer clic en “Spectra”.
o En “Experiment Type”, seleccionar “emission”.
o Cargar un nuevo “experiment file” llamado “Emission check
25.xml”.
o La configuración debiera ser Ex 350 nm, Em 365-450 nm, Ex y Em
“slits” 5 nm.
o Hacer clic en “Detectors” y comprobar que el “integration time” es
0,25 s y que los modos S1/R1 y S1c/R1c estén seleccionados y
aparezcan en el cuadro de “formulas”.
o Cambiar el nombre del fichero (en “Data Identifier”) a
M(leg)_(stn)sMQ_a (por ejemplo M1_001sMQ_a, para el primer leg,
primera estación y primer Raman del día)y así el espectro se
guardará como M(leg)_(stn)sMQ_a1.
o Usando guantes, limpiar las paredes de la cubeta sellada con
agua miili-Q con tisue y colocarla en el porta cubetas, con las letras
mirando hacia nosotros.
o Hacer clic en “Run” para registrar el espectro.
o Cuando el espectro termine, hacer clic en el pico más alto de
ambos modos. El máximo del pico Raman debiera aparecer a
397±1 nm y la intensidad debiera ser alrededor de 530000 CPS en
ambos modos.
o Si el pico Raman está dentro de este rango, calcular el área bajo el
pico. Para ello, ir a “Analysis” en el menú principal Æ “Calculus” Æ
“Integrate”. El área aparecerá en un pequeño recuadro blanco en
la esquina inferior derecha de la pantalla. Registrar la altura y área
del pico en ambos modos en el fichero “DAILY fluoroLOG.xls” y en
el cuaderno de campaña.
Espectro del bloque de p–terfenilo
o Esta prueba permite comprobar la deriva de la lámpara en la
región donde fluorescen los amino ácidos / proteínas aromáticos.
o Hacer clic en “M”.
o Hacer clic en “Spectra”.
o En “Experiment Type”, seleccionar “emission”.
o Cargar un nuevo “experiment file” llamado “Terphenyl check.xml”.
o La configuración debiera ser Ex 295 nm, Em 310-600 nm, Ex y Em
“slits” 5 nm.
175
o Hacer clic en “Detectors” y comprobar que el “integration time” es
0,25 s y que los modos S1/R1 y S1c/R1c estén seleccionados y
aparezcan en el cuadro de “formulas”.
o Cambiar el nombre del fichero (en “Data Identifier”) a
M(leg)_(stn)Tph_a (por ejemplo M1_001Tph_a, para el primer leg,
primera estación)y así el espectro se guardará como
M(leg)_(stn)Tph_a1.
o Usando guantes limpios/nuevos, limpiar las paredes del bloque de
p–terfenilo con tisúe y colocarlo en el porta cubetas, con el número
3 de la parte superior colocado hacia nosotros para que se lea al
derecho.
o Hacer clic en “Run” para registrar el espectro.
o Cuando el espectro termine, hacer clic en el pico más alto de
ambos modos. El máximo del pico de p–terfenilo debiera aparecer
a 338±1 nm y la intensidad debiera ser alrededor de 61600000 CPS
en ambos modos.
o Si el pico de p–terfenilo está dentro de este rango, calcular el área
bajo el pico. Para ello, ir a “Analysis” en el menú principal Æ
“Calculus” Æ “Integrate”. El área aparecerá en un pequeño
recuadro blanco en la esquina inferior derecha de la pantalla.
Registrar la altura y área del pico en ambos modos en el fichero
“DAILY fluoroLOG.xls” y en el cuaderno de campaña.
Espectro del bloque de p–tetrafenilbutadieno
o Esta prueba permite comprobar la deriva de la lámpara en la
región donde fluorescen las sustancias húmicas.
o Hacer clic en “M”.
o Hacer clic en “Spectra”.
o En “Experiment Type”, seleccionar “emission”.
o Cargar un nuevo “experiment file” llamado “TPButadiene
check.xml”.
o La configuración debiera ser Ex 348 nm, Em 365-600 nm, Ex y Em
“slits” 5 nm.
o Hacer clic en “Detectors” y comprobar que el “integration time” es
0,25 s y que los modos S1/R1 y S1c/R1c estén seleccionados y
aparezcan en el cuadro de “formulas”.
o Cambiar el nombre del fichero (en “Data Identifier”) a
M(leg)_(stn)But_a (por ejemplo M1_001But_a, para el primer leg,
primera estación)y así el espectro se guardará como
M(leg)_(stn)But_a1.
o Limpiar las paredes del p–terfenilo y colocarlo en el porta cubetas,
con el número 4 de la parte superior colocado hacia nosotros para
que se lea al derecho.
o Hacer clic en “Run” para registrar el espectro.
o Cuando el espectro termine, hacer clic en el pico más alto de
ambos modos. El máximo del pico de p– tetrafenilbutadieno
debiera aparecer a 422±1 nm y la intensidad debiera ser alrededor
de 19600000 CPS en ambos modos.
176
o Si el pico de p–tetrafenilbutadieno está dentro de de este rango,
calcular el área bajo el pico. Par ello, ir a “Analysis” en el menú
principal Æ “Calculus” Æ “Integrate”. El área aparecerá en un
pequeño recuadro blanco en la esquina inferior derecha de la
pantalla. Registrar la altura y área del pico en ambos modos en el
fichero “DAILY fluoroLOG.xls” y en el cuaderno de campaña.
177
o Hacer clic en “M”.
o Hacer clic en “Spectra”.
o En “Experiment Type”, seleccionar “emission”.
o Cargar un nuevo “experiment file” llamado “Emission check
25.xml”.
o La configuración debiera ser Ex 350 nm, Em 365-450 nm, Ex y Em
“slits” 5 nm.
o Hacer clic en “Detectors” y comprobar que el “integration time” es
0,25 s y que los modos S1/R1 y S1c/R1c estén seleccionados y
aparezcan en el cuadro de “formulas”.
o Cambiar el nombre del fichero (en “Data Identifier”) a
M(leg)_(stn)raman_a (por ejemplo M1_001raman_a, para el primer
leg, primera estación y primer Raman del día)y así el espectro se
guardará como M(leg)_(stn)raman_a1.
o Hacer clic en “Run” para registrar el espectro.
o Cuando el espectro termine, hacer clic en el pico más alto de
ambos modos. El máximo del pico Raman debiera aparecer a
397±1 nm y la intensidad debiera ser alrededor de 530000 CPS en
ambos modos.
o Si el pico Raman esta dentro de de este rango, calcular el área
bajo el pico. Para ello, ir a “Analysis” en el menú principal Æ
“Calculus” Æ “Integrate”. El área aparecerá en un pequeño
recuadro blanco en la esquina inferior derecha de la pantalla.
Registrar la altura y área del pico en ambos modos en el fichero
“DAILY fluoroLOG.xls” y en el cuaderno de campaña.
9. Descripción de la Técnica
178
● Almacenar las muestras en la oscuridad, en un lugar fresco y alejado
de compuestos orgánicos volátiles hasta el momento de medir su
fluorescencia y absorbancia. Debe esperarse a que la temperatura de
las muestras se equilibre con la del laboratorio antes de comenzar a
medir. Las medidas deben hacerse en < 2 horas desde que se recojan
las muestras.
● Una vez que la absorbancia y fluorescencia de las muestras se ha
medido, lavar los frascos de vidrio de 250 mL con agua milli–Q (3
lavados sucesivos con 25 mL). Cada 3 días, sumergir los frascos en 1%
HCl durante 24 horas y lavarlos con agua milli–Q abundante (3 lavados
sucesivos con 25 mL de milli–Q). Renovar el ácido 1% HCl al cabo de 5
lavados, es decir, cada 15 días.
179
● Ponerse guantes de vinilo.
● Llenar la cubeta de referencia con agua milli–Q recién producida
evitando el desarrollo de burbujas. Secar completamente las paredes
de la cubeta con tisue y colocarla en el porta cubetas de referencia.
● Llenar la cubeta de medida con agua milli–Q recién producida
evitando el desarrollo de burbujas y hacer un blanco de absorbancia.
Tener cuidado de colocar la cubeta en la misma posición siempre que
hagamos una medida. Secar completamente las paredes de la
cubeta con tisue y colocarla en el porta cubetas de medida.
● Enjuagar la cubeta de medida tres veces con agua de muestra y
llenarla evitando el desarrollo de burbujas (tomando el agua del
sistema de filtración en caso de que se trate de una muestra de la
roseta superficial o directamente del frasco de vidrio de 250 L en caso
de que se trate de una muestra profunda). Tener cuidado de colocar
la cubeta en el espectrofotómetro en la misma posición siempre que
hagamos una medida. Secar completamente las paredes de la
cubeta con tisue y colocarla en el porta cubetas de medida. Realizar
el espectro y grabarlo en formato compatible con Excel (ej. ascii). Abrir
un directorio por estación y anotar en la libreta y el estadillo la
equivalencia entre el número del fichero y la muestra correspondiente.
● Al principio, mitad y final de cada sesión de análisis hacer un espectro
del agua milli–Q para comprobar la deriva del espectrofotómetro.
● Al terminar la secuencia de análisis, sumergir las cubetas de 10 cm en
1% HCl durante al menos 2 horas y lavarlas con agua milli–Q
abundante (3 lavados sucesivos con 25 mL de milli–Q) antes de usarlas
de nuevo.
180
o Comprobar que la configuración es Ex 240–450 a intervalos de 10
nm, Em 300–560 nm a intervalos de 2 nm, Ex y Em “slits” a 5 nm, y no
“Rayleigh masking checked”.
o Hacer clic en “Detectors” y asegurarse de que el tiempo de
integración es 0,25 s y que amos modos S1/R1 y S1c/R1c están
seleccionados y aparecen en el cuadro de “formulas”.
o Cambiar el nombre del fichero (en “Data Identifier”) a uno del tipo
M(leg)_(stn)blank_a, por ejemplo el primero sería M1_001blank_a.
La letra final (a, b, c…) se utiliza para diferenciar los distintos
blancos hechos en una misma estación.
o Hacer clic en “Run” para iniciar la EEM.
o Para el ejemplo, las EEM se grabarán como
“M1_001blank_a1_S1R1” (sin corregir) y “M1_001blank_a2_S1cR1c”
(corregida) y los ficheros con los datos se grabarán con los
nombres “M1_001blank_ad1” y “M1_001blank_ad2” (pueden
encontrarse en la lista de ficheros si se hace doble clic en “data”).
● Espectros 3–Dimensionales (EEMs) – muestras
o Enjuagar la cubeta de 1 cm tres veces con agua de muestra y
llenarla evitando el desarrollo de burbujas (tomando el agua del
sistema de filtración en caso de que se trate de una muestra de la
roseta superficial o directamente del frasco de vidrio de 250 L en
caso de que se trate de una muestra profunda).
o Hacer clic en el botón justo a la derecha de “M” (es el dibujo de un
espectro) y se llama “Previous experiment setup”.
o Así se cargará el mismo “experiment file”, es decir,
“EEMnew25.xlm”.
o No cambiar la configuración, EXCEPTO en el cuadro “Data
Identifier” donde debe escribirse el nombre de la muestra:
M(leg)_(stn)(cast)(bottle), donde leg = 1 a 7, stn = 001 a 177, cast = s
(superficie) o d (“deep”, profundo), y bottle = 01 a 24. Por ejemplo,
la primera muestra sería M1_001s01 y la última: M7_177d24.
o Hacer clic en “Run” para empezar la EMM.
● Corrección del pico Rayleigh
o Una vez que todas las EMMs has sido registradas, los picos Rayleigh
de primer y segundo orden deben eliminarse.
o Antes de eliminarlos, grabar el proyecto haciendo clic en “Save
Project”.
o En la lista de ficheros al final de la página, hacer doble clic en
“data” para ver los datos crudos en lugar de las EEMs.
o Hacer doble clic en el primer fichero EEM de la lista,
probablemente los blancos. Al hacer esto, debieran verse los datos
en una hoja de cálculo.
o Hacer clic primero en “M1_001blank_ad1” (la matriz registrada en
modo S1/R1).
o Seleccionar “Analysis” en el menú principal.
o Seleccionar “Rayleigh Masking”.
181
o Seleccionar “1st AND 2nd order Rayleigh” y hacer clic en “OK”.
o Una nueva matriz llamada “M1_001blank_aM1” aparecerá en el
listado de ficheros.
o A continuación, proceder con “M1_001blank_ad2” (la matriz
registrada en modo S1c/R1c).
o después, corregir cada EEMs de cada muestra en el mismo orden –
las S1/R1 primero y las S1c/R1c después.
o Una vez que el proceso se ha completado, grabar el proyecto
seleccionando “File” en el menú principal y “Save Project as” de la
barra. Grabar el proyecto en un nuevo directorio “MALASPINA” con
la misma fecha que el proyecto (habrá que crear una nueva
carpeta). Por ejemplo, para las muestras corregidas el 4–Nov–2008,
grabar el proyecto en el directorio
C:\Program Files\Jobin Yvon\Data\MALASPINA\081104\.
● Exportar datos
o Para exportar los ficheros en ascii, ir al menú principal y seleccionar
“File”.
o Seleccionar “Batch Export” y “ASCII Data” de menú.
o Seleccionar todos los ficheros a exportar y hacer clic en “Export
Data”.
o Elegir la carpeta donde grabar los ficheros exportados.
o Para el proyecto MALASPINA, grabarlos en una nueva carpeta
dentro del directorio MALASPINA con la misma fecha que el
proyecto y en un subdirectorio llamado “ascii” (p.e. para las
muestras medidas el 4–Nov–2008, grabar en:
C:\Program Files\JobinYvon\Data\MALASPINA\081104\ascii\)
o Hacer copias de seguridad.
● Corrección de “inner–filter” de las EEMs: se hace posteriormente en
MATLAB.
● Normalización al pico Raman de las EEMs: se hace posteriormente en
MATLAB.
● Substracción del blanco de agua milli–Q de las EEMs: se hace
posteriormente en MATLAB.
182
o Asegurarse de que se ha introducido toda la información necesaria
en el fichero “DAILY fluoroLOG.xls” y en la libreta de campaña.
o 1º – apagar el ordenador.
o 2o – apagar el fluorímetro y cubrirlo con plástico.
o NO REINICIAR NUNCA EL FLUORIMETRO JUSTO DESPUES DE
APAGARLO. DEBE DEJARSE QUE LA LAMAPRA SE ENFRIE DURANTE AL
MENOS 1 HORA ANTES DE ENCENDERLO DE NUEVO.
o Lavar la cubeta con agua milli–Q. Dejarla secar unos minutos.
Colocarla en su estuche.
3. Notas/Correcciones/actualizaciones
● Lavado de la cubeta
o Normalmente la cubeta se limpia únicamente con agua milli–Q o
con 1% HCl y luego milli–Q. Si este procedimiento no es suficiente,
entonces puede lavarse con metanol y luego con milli–Q. Si la
cubeta sigue sucia, puede probarse disolviendo 2 lentejas de
NaOH en 200 mL de metanol y sumergir la cubeta en esa
disolución durante 2 horas. Después, enjuagar abundantemente
con agua milli–Q (>10 veces).
● Enjuagado de la cubeta entre muestras
o Entre muestras, enjuagar la cubeta 2 veces con agua milli–Q y
luego otras 2 veces con la muestra.
● Nomenclatura de las muestras
o Nombre menores de 5 caracteres darán un error.
183
materia orgánica total cromófora. (1) y (2) recogida de la muestra en
frascos de vidrio de 250 mL directamente de la botella; (3) y (4)
enjuague y llenado de la cubeta de cuarzo de 1 cm para la mediad de
la fluorescencia; (5) secado de la cubeta de 1 cm; (6) colocación en el
porta cubetas del espectrofluorímetro; (7) y (8) enjuague y llenado de la
cubeta de 10 cm con paredes de cuarzo para la medida de la
absorbancia; (9) y (10) colocación en el porta cubetas del
espectrofotómetro.
184
absorbancia, lavando dos veces cada cubeta. A continuación se
miden las muestras como se mostró anteriormente.
Absorbancia
Fluorescencia
185
12. Control de calidad
Absorbancia
Fluorescencia
13. Referencias
186
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Técnicas analíticas
2. Titulo de la técnica
Determinación manual de urea en agua de mar
5. Conceptos generales
Toma de muestras
187
nutrientes a fin de evitar la contaminación de las muestras. También es
conveniente que la persona se lave frecuentemente las manos
(particularmente tras ir al aseo). Los baños y aseos del barco no deben
emplearse durante el muestreo de nutrientes, incluida la urea.
6. Equipamiento necesario
Espectrofotómetro, agitador-vortex, agitador magnético, micropipetas,
nevera, congelador.
Material fungible:
Guantes desechables, tubos desechables polipropileno de 50 y 20 mL,
gradillas de plástico, imanes, matraces, vasos de precipitado de
plástico, botellas de color ámbar, probetas, cubetas de vidrio óptico de
5 cm de paso de luz, frascos lavadores, puntas desechables para
micropipetas, gafas protectoras.
Reactivos:
Diacetil monoxima, tiosemicarbazida, ácido sulfúrico, cloruro férrico
hexahidratado, urea, cloruro sódico, agua Elix y MilliQ.
Preparación de Reactivos
Reactivo A.
188
- Preparar una disolución de 0.15 g de tiosemicarbacida,
NH2·NH·CS·NH2, en 15 mL de agua destilada. Preparar una
disolución para cada 3 estaciones en las que se hagan muestros
para urea. Este reactivo habrá que llevarlo prepesado desde el
laboratorio. Para ello se prepararán al menos 26 botes de unos 20
mL con tapón de rosca, cada uno de ellos conteniendo 0.15 g de
tiosemicarbacida (se pueden emplear los tubos de vidrio ambar y
tapón de rosca que se compraron). Con una pipeta de 10 mL
añadir 15 mL de agua MilliQ al bote que contiene la
tiosemicarbacida, cerrar el bote con el tapón de rosca y disolver
agitando. Conservar en nevera protegida de la luz. Emplear la
disolución durante una semana como máximo (análisis en 3
estaciones). Después volver a preparar reactivo utilizando los botes
que se llevan prepesados al barco.
Reactivo B.
189
- Preparar una disolución de cloruro férrico hexahidratado
(FeCl3·6H2O) de 0.15 gr en 10 ml de agua MilliQ. El cloruro férrico se
transportará al barco en viales prepesados de 20 mL de capacidad.
Para lo cual se pueden emplear los viales de vidrio ambar de 19 mL
con tapón de rosca que se compraron. Preparar al menos 10 botes
cada uno de ellos con 0.15 g de FeCl3·6H2O para llevar al barco
donde se prepararán las disoluciones según vaya siendo necesario.
Es necesario proteger la disolución de la luz.
190
- Este estándar contiene 10 mM de urea. Una vez preparada la
disolución, tomar alícuotas de 10 mL y congelar las alícuotas a -20ºC
en tubos con tapón de rosca. Congelar al menos 33 tubos, con
vistas a utilizar 1 tubo (10 mL) cada dos días de muestreo, con vistas
a preparar los patrones correspondientes. La urea sobrante tras el
primer uso se guardaría en nevera para el análisis siguiente (3 días
más tarde).
191
se puedan preparar las disoluciones en el barco cada vez que haya
que efectuar el análisis de urea.
8. Calibración
192
tubo de salida del dispensador. Asegurarse de sangrar el dosificador
antes de comenzar los análisis.
- Después agitar los tubos durante 5 seg y seguidamente tapar los
tubos con un tapón de rosca.
193
- Tomar los volúmenes correspondientes del resto de las muestras
de agua de mar, de dos en dos. Asegurarse de cambiar la punta
entre muestras de diferentes profundidades.
9. Descripción de la Técnica
194
520 nm. De esa forma se verifica que el monocromador del
espectrofotómetro no ha sufrido ningún desajuste por el movimiento del
barco. Esto se puede hacer registrando el espectro del patrón y
visualizando el máximo de absorción. En caso de que se detectara que
el máximo de absorbancia se ha desplazado durante la campaña a
otra longitud de onda (e.g. 500 nm o 530 nm), entonces emplear esa
otra longitud de onda donde está el máximo para realizar las medidas.
- Medir las absorbancias de las muestras, de forma que las réplicas sean
medidas de dos en dos, de forma seguida.
Lavar las cubetas bien entre medida y medida con agua MilliQ (varias veces) y
dejar escurrir bien las cubetas antes de volver a medir (durante unos minutos);
después lavar con unos 4 ml-5ml de la propia muestra que se va a medir
(cuidado de no lavar con demasiada cantidad de muestra, y asegurarse que
el volumen que queda será suficiente para la medidas).
Una vez efectuadas las medidas volver a lavar bien las cubetas con agua
MilliQ y dejarlas escurrir durante unos minutos antes de guardarlas para los
análisis en las siguientes estaciones. Guardar las cubetas en lugar donde estén
bien protegidas de posibles golpes y evitando también que éstas se puedan
contaminar o llenar de polvo o pelusa en su interior.
195
Realizar una curva de calibración cada vez que se vayan a efectuar medidas
de urea (coincidiendo con las estaciones donde se determinen consumo de
15N-urea).
Muestra Medir
Incubación 72 h
+ Agitación Reactivo B Agitación absorbancia
22ºC, oscuridad
Reactivo A 520 nm
[urea] = ( As − Ab)
a
196
lavado previo del mismo. Sólo los botes con los que se va a muestrar
desde las botellas Niskin se lavarán un par de veces con un poco de
volumen del propio agua que se quiere muestrear. El resto del material
de plástico o vidrio (probetas, vasos de pp, matraces, imanes
recubiertos de teflón, etc) habrá que limpiarlo de forma adecuada y
lavarlo con HCl diluido, con varios lavados posteriores con MilliQ.
Durante la limpieza del material emplear guantes desechables. Una vez
limpio el material, dejar secar en un sitio limpio y guardar en un sitio
donde no pueda ser contaminado (e.g en bolsas de plástico de
grandes dentro de una caja de plástico cerrada con tapa y alejada de
posibles fuentes de contaminación). Tomar todas las precauciones
posibles para evitar la contaminación de las puntas y del resto del
material empleado en el análisis y muestreo.
13. Referencias
197
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
Determinación del consumo de 15NO3-, 15NH4+ y 15urea y fijación de 15N2
5. Conceptos generales
Generalmente se acepta que en el océano global el N es el elemento
nutriente que más frecuentemente limita la producción primaria.
Aunque el NO3- es la especie dominante de N inorgánico en muchas
regiones oceánicas, gran parte de la producción primaria en el océano
es debida al consumo por el fitoplancton de formas de N reciclado
(amonio, urea y amino ácidos). La producción primaria nueva depende
de la llegada de nutrientes nuevos a la capa fótica a través de
procesos de difusión turbulenta, afloramientos, aportes de los ríos,
deposición atmosférica o fijación de N2. Por el contrario, la producción
primaria regenerada se debe al consumo por el fitoplancton de
nutrientes que son reciclados en la capa fótica a través de las redes
tróficas heterotróficas.
La capacidad del océano para secuestrar CO2 atmosférico viene en
gran medida determinada por la producción nueva, definida como la
fracción de la producción primaria soportada por la entrada de
nutrientes nuevos (habitualmente nitrato) en la zona eufótica (Eppley y
Peterson, 1979; Dugdale y Goering, 1967). En el océano la producción
nueva y, consecuentemente la exportación de C por la bomba
biológica se incrementa en regiones donde tienen lugar mezcla
turbulenta y el afloramiento de aguas profundas, debido al aporte de
nutrientes nuevos a la zona fótica. Debido precisamente al papel
regular que el océano juega sobre el clima, en las últimas décadas se
ha realizado por parte de la comunidad científica un gran esfuerzo para
cuantificar de forma global la producción nueva y regenerada en el
océano. La determinación de la f-ratio, la proporción entre producción
nueva y la producción total, permiten hacer estimaciones de la
proporción de la producción biológica que es exportada hacia el fondo
del océano en forma de materia orgánica particulada.
198
La producción nueva y la producción regenerada en la zona fótica
pueden estimarse midiendo el consumo por el fitoplancton de diferentes
formas de N disuelto. En concreto la producción nueva se mide
añadiendo concentraciones traza de 15NO3- (<10% de la concentración
inicial de NO3 presente en la muestra de agua de mar) a una muestra
de agua de mar contenida en una botella transparentes de
policarbonato. Una vez adicionado el 15NO3- , las muestras son
incubadas en determinadas condiciones de luminosidad y temperatura
durante un periodo de tiempo determinado, tras el cual las
incubaciones son finalizadas y las muestras de agua de mar filtradas. La
concentración de 15N en el filtro permitirá estimar el consumo de 15NO3-
y determinar el valor de al producción nueva. La determinación de la
producción regenerada se basa en las medidas del consumo de 15NH4+
y 15urea (Dugdale y Goering, 1967) en las mismas condiciones que las
empleadas para medir el consumo de 15NO3- .
6. Equipamiento necesario
Congelador, nevera, nevera portátil, rampas de filtración y soportes
para las botellas, bombas de vacío, estufa de desecación, soportes de
madera para bidones de 30 L.
199
200 μL, 100-1000 μL, 1000-5000 μL, puntas para micropipetas, jeringas
Hamilton gas-tight de 5-10 mL y agujas, 4 incubadores de 180 litros,
mangueras y conexiones para mangueras, 4 bidones de policarbonato
con grifo de 30 litros, filtros de densidad neutra atenuando al 60%, 20%,
10% y 1% de PAR, -,K15NO3, (15NH4)2SO4 y 15urea , 15N2, agua MilliQ,
embudos de plástico, tubos de silicona, termómetro digital, acido
clorhídrico diluido (10%), parafilm, vasos de precipitado de plástico de
varios volúmenes, probetas de plástico de varios volúmenes, filtros de
fibra de vidrio Whatman GF/F de 25 mm de diámetro precalcinados a
450ºC, pinzas, viales herméticos, gradillas para viales, gafas protectoras,
bandejas.
8. Calibración
200
9. Descripción de la Técnica
201
Fijación de 15N2
Muestreo
Los experimentos de fijación de nitrógeno se realizarán siguiendo
básicamente la metodología descrita por Montoya et al (1996). Las
muestras de agua de mar se tomarán en botellas de policarbonato
transparentes (Zehr et al., 2001) 4.0 L de capacidad nominal provistas de
tapones con septa. Las botellas habrán sido previamente lavadas con
HCl 10%, seguido de varios lavados con agua Elix y después con MilliQ
(18.2 MΩ). Finalmente las botellas serán lavadas un par de veces con
unos 200 mL del agua de mar de la profundidad a ensayar.
La muestra de agua se tomará evitando la formación de burbujas, por
ello es conveniente que el flujo de agua desde el bidón sea más lento,
y las botellas se llenarán completamente. Al cerrarlas, las botellas deben
estar en posición vertical, y hay que evitar que penetre aire en las
mismas. Para ello colocar las botellas verticalmente y llenar la botella
hasta que esté a punto de desbordar (hasta que se forme un menisco
convexo en el borde del cuello de la botella), colocar con cuidado el
tapón y cerrar bien. Finalmente comprobar que no hay burbujas de aire
en la botella y que la botella está bien cerrada. En caso de que hayan
quedado burbujas hay que tratar de eliminarlas.. En ese caso abrir la
botella, eliminar las burbujas, y añadir el agua necesaria para volver a
llenar la botella hasta el borde del cuello (como se ha descrito antes),
colocándole de nuevo el tapón con la botella en posición vertical.
Adición de sustrato (15N2)
Una vez que no queden burbujas de aire en las botellas, a cada una de
ellas se inyectará un 8 mL de 15N2 (98% átomos) utilizando una jeringa
Hamilton Gas-Tight, de forma que el enriquecimiento resultante de 15N2
sea próximo al 10 % (Capone y Montoya, 2001). El 15N2 se tomará del
cilindro conectando al mismo utilizando una bolsa de muestreo de
gases. La bolsa se llenará con una cantidad superior al 15N2 necesario
para el muestreo de cada estación (24 mL de gas por cada estación). Si
queda algún 15N2 restante en la bolsa se podrá utilizar para los
experimentos de fijación un próximo muestreo. Después de llenar la
bolsa cerrar bien las válvulas del cilindro y de la llave de acero que va
conectada a éste. La bolsa irá provista de unos tubos de silicona y una
llave para poder hacer la conexión al cilindro.
Antes de ser llenada con 15N2 la bolsa y los tubos deberán primero
vaciarse de aire, para ello se conectará la bolsa a través de los tubos de
silicona y llave de plástico a una bomba de vacío, haciendo el vacío
durante unos segundos con la bomba. Cerrar la llave de plástico con la
que van provistas las bolsas mientras la bomba está aún en
funcionamiento. A continuación se colocará en el extremo libre de la
llave un pequeño trozo de tubo de silicona, en el extremo del cual se
habrá ajustado un septa de silicona. Con la de llave plástico cerrada y
202
con una jeringa Hamilton gas-tight provista de aguja penetrar el septa
de silicona que y sacar el aire que queda en el extremo de llave,
retirando 10 mL de aire. Retirar la aguja con la jeringa y vaciar su
contenido de aire. Insertar de nuevo la jeringa con la aguja en el septa
y repetir la operación 2 veces más.
Finalmente, tras sacar la jeringa, abrir la llave de plástico. A
continuación el 15N2 se extraerá de la bolsa que lo contiene pinchando
con la aguja Hamilton gas-tight a través del septa de silicona colocado
en el extremo de la llave de plástico. El 15N2 extraído de la bolsa se
inyectará inmediatamente en las botellas de 4 L a través de los tapones
de septa de las mismas. Cambiar de aguja cada vez que se vaya a
inyectar 15N2 en una nueva botella. Ajustar bien las agujas en la jeringa.
Una vez que se haya tomado todo el 15N2 necesario para las
incubaciones, cerrar la llave de plástico que va conectada a la bolsa
que contiene el 15N2. El resto del 15N2 que quede en la bolsa se podrá
utilizar en la siguiente estación en las que se vayan a realizar
incubaciones. Guardar la bolsa protegida de cualquier objeto cortante
o punzante, o que pueda dañarña. Lo más adecuado es guardarla en
una caja cerrada separada de cualquier otro tipo de material.
Si las operaciones se efectúan en la cubierta, tomar las precauciones
necesarias para evitar que durante la manipulación, la bolsa que
contiene el 15N2 pueda romperse, perforarse o salir volando por el viento.
Incubaciones (15N2)
Tras la inyección de 15N2, las botellas se agitarán suavemente y las
muestras se incubarán en incubadores instalados en la cubierta del
buque oceanográfico durante 24 h.
Las incubaciones se realizarán en 4 incubadores (de aproximadamente
80-100 L de capacidad), uno para cada profundidad de muestreo. Los
incubadores se llenarán con agua de mar de superficie y el agua en los
incubadores se mantendrá próxima a la temperatura superficial del mar
mediante bombeo continuo de agua desde la superficie.
Durante las incubaciones la intensidad de luz en el interior de los
incubadores será ajustada para simular las condiciones lumínicas in situ
empleando para ello filtros de densidad neutra (malla de nylon de 1.5
mm de luz). En estos incubadores también se llevarán a cabo de forma
simultánea las incubaciones para determinar las tasas de consumo de
15NO -, 15NH + y 15N-Urea, como se indica más adelante.
3 4
203
Filtración
Una vez finalizado el periodo de incubación se filtrará el contenido de
las botellas (a baja presión 100-150 mm Hg) a través de filtros Whatman
GF/F de 2.5 cm de diámetro (precalcinados a 450 ºC durante 4 horas).
Los filtros serán introducidos en viales y serán secados (en el interior de
los viales) a 60ºC durante 24 horas. Finalmente los viales serán cerrados
herméticamente y se almacenarán hasta su análisis mediante
espectrometría de masas en los servicios de análisis de la Universidad de
la Coruña.
Muestreo
De cada profundidad se tomarán muestras de agua de mar en botellas
de policarbonato transparente de 2 L de capacidad nominal
(previamente tratadas con acido clorhídrico diluido y lavadas varias
veces con agua Elix, seguido de lavados con agua MilliQ y finalmente
enjuagadas dos veces con unos 150 mL del agua de mar de la
profundidad de muestreo). Aunque la capacidad nominal de las
botellas es de 2L, las mismas tienen realmente más de 2 L de
capacidad. Las botellas se llenarán hasta la marca del cuello, habiendo
sido el contenido de cada botella previamente calibrado en el
laboratorio. Cada botella deberá ser identificada para tener en cuenta
el volumen de cada una de ellas en las incubaciones. Por lo que habrá
que tomar nota de las botellas empleadas y del volumen de las mismas.
Adiciones de sustratos
Las muestras serán inoculadas con cantidades traza de 15NO3-, 15NH4+ y
15Urea (99% átomos), de forma que la concentración final de estos
204
Las adiciones de los sustratos se realizarán a partir de patrones de 15NO3-
,(K15NO3) 15NH4+ ((15NH4)2SO4) y 15urea de concentración 2 mM o 10 mM.
Del patrón concentrado de 10 mM y para cada uno de los sustratos
(K15NO3, (15NH4)2SO4) y 15urea) se prepararán 30 alícuotas de 2 mL. Para
preparar las alícuotas se emplearán tubos de plástico con tapón de
rosca de 4-5 mL de capacidad, lavados previamente con ácido. Las
alícuotas se congelarán a -20ºC, de esa forma se dispondrá de un stock
del patrón de 10 mM. Teóricamente esas alícuotas deben ser suficientes
para realizar los ensayos durante toda la campaña. En función de las
concentraciones de NO3-, NH4+ y urea en el agua de mar a cada una
de las profundidades, se empleará la disolución 2 mM y/o la disolución
10 mM para añadir la concentración de sustrato deseada a las botellas
de incubación.
Las disoluciones 2 mM se prepararán a partir de las alícuotas de
concentración 10 mM, tomado 1 mL la disolución 10 mM y añadiendo 4
mL de agua MilliQ. Tanto el patrón concentrado como el diluido deben
estar bien atemperados antes de su uso. El volumen de patrón
empleado para realizar las adiciones de sustratos a las botellas de
incubación dependerá de las concentraciones de nutrientes presentes
en el medio, de forma que la concentración añadida sea ligeramente
inferior o igual al 10% de la concentración de nutriente presente en el
medio o sea ligeramente . En los casos en las concentraciones de NO3-,
NH4+ o urea se encuentren por debajo de los límites de detección, las
adiciones de los sustratos marcados isotópicamente se realizarán para
alcanzar concentraciones finales de 0.05 μM en las botellas de
incubación.
Incubaciones
Las incubaciones se realizarán en la cubierta del buque, en los 4
incubadores que se instalarán como se ha descrito anteriormente en el
protocolo para la fijación de 15N2. Cada incubador se utilizará para
realizar los ensayos correspondientes a una determinada profundidad
de muestreo y e irá dotado del filtro de densidad neutra adecuada
para simular las condiciones de luz a cada una de las profundidades.
Filtraciones
Tras finalizar el periodo de incubación el contenido de las botellas será
filtrado a través filtros Whatman GF/F de 2.5 cm, que habrán sido
precalcinados a 450ºC durante 4 horas. Tras las filtraciones, los filtros
serán lavados un par de veces con agua de mar filtrada (GF/F), para
eliminar posibles trazas de los sustratos marcados isotópicamente. Los
filtros serán tratados de forma similar a la descrita para al fijación de 15N2
y se almacenarán hasta su envío para análisis a los Servicios
205
Centralizados de Apoyo a la Investigación de la Universidad de La
Coruña.
10. Cuadro sinóptico de la técnica
Muestreo:
Botellas Niskin
Bidón
30 L
Bidón PET
30 L
206
FILTRACIÓN:
Secar en estufa
60ºC, 24 h
Lavado de filtros
Filtración, GF/F 25 mm Ø con agua de mar filtrada (GF/F)
Cerrar herméticamente
y guardar
Fijación de 15N2
El enriquecimiento inicial en 15N (% en átomos) del N2 contenido en la
muestra tras inyectar el 15N2 se calculará para cada botella (teniendo en
cuenta el volumen de 15N2 añadido y el volumen de la botella de
incubación). Para ello se utilizará la ecuación de Weiss (1970)
(considerando que el N2 presente en la muestra se encuentra en
equilibrio con la atmósfera). El enriquecimiento en 15N del nitrógeno
orgánico particulado en la muestra al final del experimento y las tasas
de de fijación de 15N2 por la comunidad se estimarán aplicando las
ecuaciones de Montoya et al. (1996).
Para obtener mejores resultados es necesario conocer el volumen
exacto de las botellas y la temperatura del agua. Las botellas
empleadas para las incubaciones se identificaran con el fin de tener en
cuenta el volumen de cada una de ellas en los diferentes experimentos
y se tomará nota de las mismas. Para tener en cuenta el volumen de
cada botella, durante el muestreo de agua para los ensayos de fijación
de 15N2, será además necesario medir la temperatura del agua de mar
207
en cada uno de los bidones tras tomar las muestras para las
incubaciones con 15N2.
Para estimar el enriquecimiento inicial en 15N del NOP hay que emplear
otro sistema de filtración distinto del utilizado para las muestras tratadas
con marcadores isotópicos. Además conviene mantener este sistema lo
más alejado posible del sistema de filtración de incubaciones
(enriquecido en 15N) para evitar cualquier contaminación de las
muestras. Cambiar de guantes si se van a manipular muestras después
de haber manipulado patrones o muestras marcados con 15NO3-, 15NH4+
o 15urea.
208
13. Referencias
209
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Título de la técnica
Muestreo de metales y vitaminas disueltas
5. Conceptos generales
Tantos los metales traza como las vitaminas juegan un papel
fundamental en los procesos biogeoquímicos relacionados con la
producción primaria oceánica.
Su distribución y disponibilidad son clave para entender el papel que
juega en el funcionamiento de los océanos.
6. Equipamiento necesario
Para el muestreo de agua superficial usaremos el sistema de torpedo
(Figura 1), compuesto por:
- Compresor
- Bomba de diafragma de aire comprimido
- Manguera con tubo de teflón en su interior
- Torpedo
210
7. Reactivos u otro material fungible
El resto de material necesario para el muestreo consta de (Figura 2):
- Botellas de plásticos (LDPE) de 0.5 L
- Botellas de plástico opacas de 2 L
- Cartuchos de filtración
- Guantes de plástico
- Acido clorhídrico 0.5 N.
8. Descripción de la Técnica
A). Montaje del sistema (VER VIDEO): todo el sistema debería montarse
en la cubierta de proa 10 minutos antes de la hora prevista para el
muestreo. Un extremo del tubo de teflón (ubicado dentro de la
manguera) se encuentra ya conectado al torpedo mientras que el otro
debe conectarse a la bomba de diafragma. Mediante una manguera
de alta presión se conecta la bomba de diafragma al compresor y el
compresor a la corriente eléctrica.
211
Figura 3. Momento de despliegue del torpedo.
212
filtración, se deja transcurrir unos 3 minutos antes de llenar las botellas
con la muestra (Figura 4).
Para minimizar la posibilidad de contaminación, el muestreo lo
deberían de realizar siempre dos personas. Una persona (“manos
sucias”) manipula el compresor y abre las bolsas donde se encuentran
las botellas de muestreo, en ningún caso se debe tocar la botella de
muestreo sin guantes. La otra persona (“manos limpias”) siempre
provisto de guantes de plástico llena las botellas y sujeta el filtro. Si por
cualquier razón tocase con los guantes alguna superficie del barco o
material que no estuviese limpio con ácido deberá cambiar de guantes.
Las botellas se enjuagan 3 veces y se llenan (Figura 5). En cada estación
se muestrearán 2 botellas, una de 0.5 L traslúcida para el análisis de
metales y otra de 2 L opaca para el análisis de vitaminas.
Nota: las botellas de 2 L opacas se almacenarán congeladas por lo que
no deben llenarse completamente.
213
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
214
millón (ppmv), como las razones isotópica del carbono (13C/12C). El
equipo está basado en una técnica espectroscópica novedosa que
analiza el espectro de absorción de la molécula de CO2 cuando incide
un láser infrarrojo cercano. Esto permite analizar la concentración y la
composición isotópica con una gran precisión y sensibilidad, ya que no
interfieren otras especies gaseosas. Además el sistema guarda
automáticamente y periódicamente los datos en el disco duro interno
(Fig. 1).
gases
calibración
215
-bomba de membrana (A), que nos ayuda a tomar la muestra del aire
atmosférico (la toma esta en la cubierta superior del Hesperides, junto a
la sala de mandos) introducirla en el sistema de calibración, y este a su
vez introducirá en el sistema la muestra o los gases estándar que nos
permiten calibrar el equipo. Esta bomba funciona de forma continua.
216
Trampa desecante
Minimodule
8. Descripción de la Técnica
- El analizador láser.
- Ordenador y equipo de control.
- Pantalla.
- Sistema de Calibración.
217
- Bomba entrada de muestra.
- Gases de Calibración.
- Minimodule
- Trampa desecante
- Bomba para recircular el aire con el sistema minimodule
CABLE DE ALIMENTACIÓN
RATÓN
TECLADO
PANTALLA
218
- 3º Conectaremos el analizador con el ordenador mediante los
siguientes cables, el cable que nos transmite los datos del
analizador al ordenador, la toma de distribución de corriente
entre los dos aparatos, y por último la conexión de la bomba de
vacío con el analizador (Ver figura 4).
DISTRIBUIDOR CORRIENTE
219
SISTEMA ESTÁNDAR
CALIBRACION GAS
CABLE CONTROL
SISTEMA CALIBRACION
ENTRADA AL
SISTEMA DE
CALIBRACION
ENTRADA MUESTRA
220
- 6º Conectamos cada una de los estándar al sistema de
calibración. Las botellas de los gases estándar, que tienen
concentración y valor isotópico conocido están numeradas del 1
al 2, y debemos de conectarlas mediante los tubos de poliuretano
a las juntas rápidas del sistema de calibración, marcadas como IN
y con números que también van del 1 al 2. Debemos de abrir las
botellas, y asegurarnos que la presión en los reguladores es de 0.5
bares. (Ver figura 7
- 7º Conectamos el circuito de aire atmosférico en la posición “In”
3, tal como se indica en la figura 8.
- 8º Conectamos el circuito cerrado del Minimodule en la posición
“In” 4, tal como se indica en la figura 9.
- 9º Por último, enchufamos el analizador, la bomba de muestreo y
la pantalla a la corriente eléctrica, y nos aseguramos que todos
están en su posición de encendido. El analizador comenzara a
funcionar automáticamente, transcurridos unos minutos desde
que lo conectamos. Y el operario solo tiene que actuar para abrir
la ventana “tools” del programa, seleccionar la ventana “open
valve sequencer Windows”, cargar la secuencia numero 1, y
presionar la ventana “disable sequencer”, de este modo el
sistema comenzara automáticamente a tomar muestras y
estándar según la secuencia que tenemos programada.
Finalizamos la operación con una minimización de la ventana,
para poder ver el grafico que nos muestra los resultados en
tiempo real.
221
1 2
“T”
“In-
222
Sistema calibrador
y de ingreso de muestra
“T”
“In-
Continuo desagüe
9. Calibración
223
10. Cuadro sinóptico de la técnica
224
Figura 10: Ventana para abrir el sistema de calibración.
- En quinto lugar, cargar la secuencia número 1, que es la
que tenemos predefinida para esta expedición
oceanográfica (ver figura 11), y por ultimo marcar la
ventana “disable sequencer”, para que la secuencia se
ponga en marcha. (Atención, en la figura 11, los tiempos
no coincidirán con los que aparezcan en el momento de
la expedición, ya que esta foto es de otro experimento de
calibración).
11. Datos
225
Estos resultados serán corregidos con las rectas de calibrado que el
sistema realiza diariamente.
226
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
227
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
228
- Jeringa de 15 ml
- Agujas con doble punta
- Agujas 20 G
229
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
Consideraciones previas
Toma de muestra
2.- En roscar el tapón (Bloque B, Fig. 3-1). El tubo unido al tapón con la
llave cerrada, este conjunto permanece lleno de agua. El vial de vidrio
pegado al tapón permanece abierto.
3.- Por el vial de vidrio se termina de enrasar el agua hasta el límite (Fig.
3).
6.- Guardar las botellas procedentes de cada una de las botellas Niskin
en cámara frigorífica, a unos 4 o 5 ºC, hasta que le llegue el turno de la
extracción de los gases.
230
7.- Se procederá a la extracción de los gases de forma inmediata.
Comenzando por las aguas más superficiales.
231
nuevo una depresión de 50 ml, se aplican ultrasonidos, etc.
Normalmente, a la tercera vez ya costará bastante obtener más gas por
lo que termina el proceso.
15. Los viales se almacenan boca abajo, de modo que el agua quede
en contacto con el tapón. En ambiente oscuro y en cámara fría.
Debido a que el ambiente será mas frío, y se contrae el pirex y los gases,
es conveniente una vez retirada la aguja que desagua el vial, terminar
por inyectar 0,5 ml más de gas de modo que exista una pequeña
sobrepresión. Añadir para su conservación 10 microlitos de solución
saturada en HgCl.
232
10. Cuadro sinóptico de la técnica
1 2 Botella
Niskin
Botella
Niskin
Bloque
B
Bloque A
Fig. 3 Esquema de los pasos a seguir. (1) llenar la botella colocando el tubo de silicona
en el fondo para evitar la agitación del agua. (2) Una vez llena la botella colocar el
bloque B (todo el circuito esta lleno de agua, al estar la llave cerrada no se pierde ni
acumula aire en el tubo). Cerrar con firmeza el tapón de la botella (después se hará
vacío y se debe impedir la entrada de aire). Terminar de rellenar el vial, evitando que
quede burbuja. No debería quedar aire, pero es conviene dar unos golpecitos y girar
por si queda alguna burbuja, para que salga. En ese momento incluso se pude perder
algún gas (sobre todo de aguas profunda que viene con mas presión), pero es
preferible perder alguna burbuja a que quede aire ocluido en el tapón.
Alternativamente, se puede llenar la botella desde el inicio, colocando el tubo de
silicona que viene de la botella Niskin en el lugar de la jeringa.
233
3 4 5 minutos ultrasonidos
Baño
Ultrasonidos
Fig. 4 Esquema de los pasos a seguir. (3) Con ayuda de la jeringa de 60 ml se genera
vacío en la botella. Para ello se abre la llave amarilla y la jeringa se expande hasta los
50 ml (cuesta trabajo), en ese momento, y sin relajar la jeringa, se cierra la llave
amarilla. De ese modo se ha generado un vacío en la botella, que da lugar a que el
gas disuelto en el agua se libere formando burbujas que obviamente tienden a ir para
arriba y acumularse en el vial perforable. (4) Acto seguido se introduce la botella en el
baño de ultrasonidos y se sonica durante 5 minutos. Tras este paso aparecerán muchas
más burbujas.
234
Burbujas de gas
Fig. 5 Tras el tratamiento con ultrasonidos aparecen numerosas burbujas. Estas deben
conducirse girando la botella (y dando algunos golpecitos) hacia el vial perforable.
A B C
Fig. 6 Tras el tratamiento con ultrasonidos aparecen numerosas burbujas. Estas deben
conducirse girando la botella (y dando algunos golpecitos) hacia el vial perforable. A
los pocos segundos o minutos (según la practica del operador), se observa como el
gas liberado se concentra en el vial (tendencia A,B,C). Lo que permitirá su extracción
posterior.
235
Se inyecta agua 6
y se extrae el gas
A
B
8
C
Fig. 7 Una vez que el gas se ha llevado hacia el vial perforable, se extrae mediante una
jeringa de 15 ml (6). La jeringa se habrá llenado de agua miliQ ya desgasificada con
una botella similar. El proceso consiste en inyectar agua y cuando quede sobre 1 ml de
agua se extrae el gas. Previamente ya se habrá preparado un vial de 10 ml que esta
lleno de agua miliQ desgasificada (7). A continuación se inyecta el gas en el vial (8) lo
que da lugar a que se desplace el agua y se salgan tantos mililitros de agua como
mililitros de gas se han inyectado. Cuando la cantidad de gas disuelta es alta, puede
ser necesario llenar un segundo vial.
236
etc.). para analizar las diferentes razones isotópicas que se pretenden
estudiar.
13. Referencias
Schmitt, M., Faber, E., Botz, R., Stoffers, P., 1991. Extraction of methane
from seawater using ultrasonic vacuum degassing. Analyt. Chem.
63:529–531.
237
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
Granados, A. y Delgado, A.
Laboratorio de Biogeoquímica de Isótopos Estables
Instituto Andaluz de Ciencias de la Tierra (CSIC), Armilla, Granada
5. Conceptos generales
238
importancia son pocos los trabajos en los que se ha medido la
composición isotópica del vapor atmosférico en el medio oceánico
(Craig y Gordon, 1965; He et al., 2001), de ahí el interés de incorporar a
la campaña Malaspina este tipo de análisis.
6. Equipamiento necesario
239
AUTOMUESTEADOR
ANALIZADOR
SISTEMA
CALIBRACIO
“T”
“In-
240
8. Descripción de la Técnica
241
TOMA
CORRIENTE
ALIMENTACIO
N BOMBA <3.5 mm
ANALIZADOR
BOMBA VACIO
242
<3.5 mm
PRESIÓN DE SALIDA
0.5 BAR.
243
BLOQUE
CALEFACTOR
TUBO ENTRADA
MUESTRA
9. Calibración
10. Mantenimiento
Cambio de septum:
244
- En la pantalla principal, aparece la tecla para poder
entrar en la pantalla de configuración para realizar el
cambio de septum. Para ello presionamos “SETUP”; y nos
aparece una nueva pantalla con un faldón, en donde
podemos ver la ventana “CHANGE SEPTUM”. (Ver figura 5 )
245
de tener cuidado, pues la temperatura del bloque de inyección
es de unos 70°C. Eliminamos el antiguo septum, y colocamos uno
nuevo, asegurándonos que la cara del septum que tiene teflón,
queda mirando hacia la zona termica (para abajo). Para ello nos
vamos a ayudar de una aguja intercambiable, que usamos para
centrar el septum en su posición correcta. Una vez cambiado el
septum, colocamos la tuerca en el bloque calefactor y la
apretamos con firmeza, pero a mano, y sacamos y metemos
varias veces la jeringa, para asegurarnos que el septum queda un
poco perforado (facilita la entrada de la aguja fina y delicada de
la jeringa Hamilton de 1,2 microlitros). Aprovechando que hemos
quitado el septum, también vamos a realizar una limpieza del
bloque de grafito donde se produce la vaporización de la
muestra, para ello lo sacamos de su posición y lo limpiamos con
aire seco, por ultimo lo devolvemos a su posición original (Ver
figura 7).
CARA DE
TEFLON
246
correspondiente, tanto del bloque inyector como del analizador
(incluyendo el filtro), inmediatamente, le ponemos el tapón al
analizador, para asegurarnos que no le entra porquería al sistema
durante nuestra operación de limpieza. Y a continuación,
limpiamos el tubo desde la posición del analizador, con el bote de
aire seco (Fig. 8). Por último, montamos de nuevo el tubo
(asegurándonos en todo momento que queda el sistema
estanco) y marcamos en el analizador el botón, “septum
cambiado”. Entonces, el instrumento vuelve a coger vacío,
operación que tarda unos cinco minutos aproximadamente.
Pulsamos aceptar para volver al modo de configuración y, por
último, pulsamos salir, para volver a la pantalla principal.
<3.5 mm
Una vez que hemos finalizado este proceso, solo nos queda limpiar la
jeringa Hamilton de 1.2 microlitros, que es la que nos introduce las
muestras de los patrones de aguas en el sistema. Para ello, limpiamos la
aguja con agua destilada, moviendo y girando varias veces el barrilete
de la jeringa, y notaremos como se va desentrampando la misma con el
247
agua destilada. Si esto no ocurriera, podemos proceder a la limpieza de
la aguja con acetona, repitiendo la misma operación que con el agua
destilada, y terminando con una buena limpieza de agua destilada
para evitar la contaminación de la cámara de medida.
SPECTRUM
248
SETUP LASER OFFSET
DESPLAZAMOS
249
septum, limpiar el tubo, y ajustar el láser, debemos de conocer como
crear una secuencia de muestras sin problemas.
LISTA LISTA
MUESTRAS STANDAR
NUMERO
INYECCIONES
POR
MUESTRA
250
PARA PASAR LAS NUMERO DE
MUESTRAS A LA REPETICIONES
SECUENCIA DE MEDIDA
PARA COMENZAR
A MEDIR
Figura 13: Pantalla para la configuración de la secuencia de muestras.
251
NÚMERO DE
MOLÉCULAS
PARA COMENZAR
A MEDIR
12. Referencias
1703.
252
Keeling, C. D., 1961. The concentration and isotopic abundances of
carbon dioxide and marine air. Geochim. Cosmochim. Acta,
24:277-298.
Moreira, M.Z., Sternberg, L.S.L., Martinelli, L.A., Victoria, R.L, Barbosa, E.M.,
Borates, C.M., Nepstads, A.C. 1997. Contribution of transpiration to
forest ambient vapour based on isotopic measurements. Global
Change Biology 3:439-450.
Yepez, E.A., Williams, D.G., Russell, L. S., Guanghui, L., 2003. Partitioning
overstory and understory evapotranspiration in a semiarid savanna
from the isotopic composition of water vapour. Agricultural and
Forest Meteorology, 119: 53-68.
253
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
4. Conceptos generales
254
necesidad urgente de obtener un mayor número de medidas directas de ε
(Wunsch & Ferrari, 2004). Esto se ve facilitado hoy en día por la aparición en el
mercado de diferentes instrumentos que permiten obtener medidas de
microturbulencia. Entre estos equipos se encuentran los perfiladores MST (Micro-
Structure Turbulence profiler) (Prandke & Stips, 1998) y TurboMap (Wolk et al.,
2002). En este capítulo se describe la realización de medidas de tasas de
disipación de energía cinética turbulenta mediante la utilización de un perfilador
MST. Los objetivos concretos de esta actividad son:
1. Obtención de medidas directas de ε a lo largo de grandes escalas
espaciales en océano abierto.
2. Comparación entre las medidas directas de ε y las estimas realizadas
mediante cálculos empíricos.
3. Estudio de la variabilidad de Kz a lo largo de grandes escalas espaciales.
4. Cuantificación de la entrada de nutrientes hacia la capa fótica mediante
procesos de difusión turbulenta.
6. Equipamiento necesario
255
Tabla 1. Descripción de los sensores incorporados en la sonda MST (versión
estándar).
SENSORES DE MICROESTRUCTURAS
Parámetro Principio Elemento Longitud de Constant
sensible la punta del e de
sensor tiempo1
Temperatura Medida de Microtermistor Aprox. 0.3 Aprox. 10
resistencia FP 07 mm ms
(varilla de
vidrio)
Temperatura Medida de voltaje Termopar Aprox. 0.5 Aprox. 6
(alternativo) NiCr-Ni en el mm ms
interior de un
tubo de
acero de ∅
0.25 mm
SENSORES DEL CTD2
Parámetro Principio Rango Precisió Resolució Constant
n n e de
tiempo
Presión Piezoresistenci Definido +/- 0.1% 0.002% de 40 ms
a por el de la la escala
usuario escala total
total
Temperatura Pt 100 - +/-0 0.001ºC 160 ms
2…+38º 0.01ºC
C
Conductivida Celda 0…60 +/- 0.01 0.001 100 ms
d inductiva mS/cm mS/cm mS/cm
SENSOR DE CONTROL
Parámetro Principio Elemento Constante de
sensible tiempo
Perfil de aceleración Medida de la Placa de Approx. 3 ms
horizontal fuerza en una piezocerámico
masa pendular
256
2. La sonda MST también está equipada con sensores adicionales de
fluorescencia y turbidez de la empresa Alec Ellectronics, Japón. Los sensores
son calibrados internamente, con una salida máxima de fluorescencia de
200 ppb Uranina y una turbiedez máxima de 200 ppm Caolín.
1.a. 1.c.
Piezocerámico
Material aislante
Placa metálica
F
Airfoil
1 cm
1.b.
Figura 1. a. Rotor y perfilador MST en la popa del barco. b. Extremo inferior del
perfilador donde se encuentran los diferentes sensores. c. Componentes del
sensor de cizalla PNS98 y esquema de las medidas.
257
7. Reactivos u otro material fungible
8. Descripción de la Técnica
9. Calibración
258
calibración (Calibrate). Esta opción permite visualizar y modificar los coeficientes
de calibración de los sensores seleccionando Show Coefficients. Esta selección
abre una ventana de diálogo con un cuadro de listado de los diferentes sensores
que incorpora la sonda. Elegido el sensor de interés, el resto de los campos
muestran los coeficientes de calibración de dicho sensor y permiten introducir las
nuevas calibraciones (Figura 2). Cualquier cambio en los coeficientes de
calibración debe hacerse con extrema precaución, ya que influye directamente
en la conversión de los datos adquiridos (voltaje) a datos físicos.
En el caso de los sensores de cizalla PNS también es necesario ajustar la
sensibilidad. Es importante contabilizar los lances que acumula cada sensor
porque su sensibilidad disminuye con el tiempo y el uso. Las moléculas de agua
penetran a través de los materiales que se utilizan normalmente para aislar el
piezocerámico (goma de silicona, neopreno o poliuretano) reduciendo la
impedancia de esta pieza, lo que se traduce en una pérdida de sensibilidad que
afecta a las medidas. La sensibilidad se calcula y se corrige también en fábrica, y
su valor se tiene en cuenta en el cálculo de las constantes del sensor de cizalla
(ver ecuación 9 del apartado 11)
259
10. Cuadro sinóptico de la técnica
INSTALACIÓN DEL
EQUIPO
10. Endulzar todo el equipo y lavar con agua destilada todos los sensores.
260
MANDO DE CONTROL
TORNO
CAJA DE ALIMENTACIÓN
261
opciones un último cuadro de diálogo permite nombrar el archivo de datos y
elegir el directorio donde se quiere guardar.
El primer paso es confirmar la correcta adquisición de datos. Dado que los datos
válidos son aquellos registrados en caída libre del perfilador, habrá que analizar y
262
en ocasiones eliminar los registros al alcanzar el límite de longitud del cable, o
bien al dejar de largar una vez alcanzada la profundidad deseada.
La utilidad Cutgraf permite cortar el registro de datos al inicio y/o al final del perfil
del archivo de datos en bruto (*. MRD) y convertir este archivo a formato ascii (*.
TOB). En su pantalla gráfica se pueden representar un máximo de seis sensores
frente a un eje vertical que muestra el conjunto de registros y, de este modo,
localizar el posible punto de corte (Figura 6).
263
extensión *.TOB. Este nuevo archivo se guarda por defecto en la
carpeta utilities del programa DATpro.
264
cuadro de diálogo de configuración de parámetros en la parte inferior
izquierda. Para cambiar el valor o tipo de parámetro, hacer doble clic con el
botón izquierdo sobre cada entrada.
Para guardar la configuración del batch utilizar la opción “save and close”.
Se genera así un archivo con extensión *. MSB que se guarda por defecto en
la carpeta batch del programa DATpro.
Importante: Hay que tener especial cuidado con los nombres de los archivos
de entrada y salida de cada módulo. Los módulos se ejecutan
sucesivamente, y el nombre del archivo de salida de un módulo (“outputfile
*.tob”) tiene que ser igual al nombre del archivo de entrada del módulo
siguiente (“inputfile *.tob”)!
Aplicación de un "batch"
265
correspondientes.
La lista de archivos se muestra en la pestaña “input file list” de la ventana
principal.
Para seleccionar el batch que se quiere ejecutar ir al menú “run →
batch job” o pulsar sobre el icono correspondiente de la barra de
opciones.
Una vez seleccionado aparece el cuadro de diálogo “configure batch job”
con la siguiente información: título (“job title”), apartado de información
(“job info”), directorio de salida (“output directory”), y prefijo del nombre del
archivo de salida (“output file prefix”).
En este caso, tanto el directorio de salida como el prefijo identificador del
archivo de salida deben ser especificados.
Aplicar el batch e iniciar el procesado de datos de los archivos
seleccionados pulsando sobre la opción “star job”.
Importante: El nombre del archivo de salida incluirá el prefijo especificado y
el nombre del archivo de entrada. Si el nombre resultante supera los 8
caracteres, los n primeros caracteres del archivo de entrada se sobrescriben
con el prefijo de salida seleccionado.
266
11. Calculo de los resultados.
1 dA
fp = ρU 2 sen(2α ) (1)
2 dx
1
F= ρU 2 Asen(2α ) (2)
2
E = ρU 2 Ssen(2α ) (3)
du dE
= (2 2 ρGS rmsV 2 ) −1 (5)
dz dt
267
du 1 dshraw
= × (6)
dz ρV 2
dt
1
shraw = ×E (7)
(2 2SG)
E = b0 + b1 R (8)
1 b0 b1
shraw = × (b0 + b1 R) = + × R = a0 + a1 R (9)
(2 2 SG ) 2 2SG 2 2SG
donde los valores de las constantes del sensor de cizalla para la sonda MST son
b0= 4,577707e-5, b1=9,155423e-5 y G=11. Por lo tanto a0 = S-1 x 1.47133e-6 y a1 = S-1 x
2.94226e-6.
Tabla 2. Descripción de los módulos del batch con el que se inicia el procesado
de datos y se calcula la velocidad de cizalla.
268
del sensor o sensores seleccionados utilizando una
media móvil con un ancho de ventana definido. El
tamaño de ventana (N) para el cálculo de la media
debe ser menor que el número total de registros, y un
valor impar. Se aplica al sensor de presión.
Extrae el rango de profundidad útil. Por defecto 10-
400. El valor del límite inferior se recomienda que sea
el doble del calado del barco. El límite superior
variará en función del largado de cable en la
Extract
maniobra de lanzamiento, que a su vez depende del
tiempo disponible para cada lance y de las
condiciones meteorológicas. Se aplica al sensor de
presión.
Añade una constante a uno o más sensores
Addition seleccionados (en este caso los dos sensores de
cizalla) para que puedan ser representados.
Calcula un polinomio de orden n para el sensor
seleccionado (en este caso los sensores de cizalla),
creando dos canales que se nombra como shraw1 y
shraw2. Es necesario especificar las constantes (ao y a1)
Polynom
de cada sensor de cizalla para realizar este cálculo
polinómico. Dichas constantes se calculan a partir de
la sensibilidad del sensor, que es específica para
cada uno de ellos.
Añade un nuevo canal temporal (time) que contiene
marcas de tiempo en un formato específico. Estas
Addtime
marcas comienzan en el primer registro, añadiendo
sucesivamente el intervalo de muestreo (0’9765 ms).
Calcula el gradiente de los canales seleccionados
(shraw1 y shraw2) frente a un sensor específico (time)
Gradient
cuyos valores deben ser equidistantes. Genera dos
nuevos canales que se denominan dudt1 y dudt2.
Calcula la velocidad de cizalla horizontal, du/dz, en
términos de s-1, a partir de la ecuación (6),
du 1 dshraw
= × (6)
dz ρV 2
dt
Shear donde ρ es la densidad media y V es la velocidad de
caída del sensor, calculada a partir del sensor presión
(dbar) y del canal temporal (ms). Se añaden así tres
nuevos canales al archivo de entrada: shear1, shear2
y vel.
Realiza operaciones matemáticas (+, -, x y /) registro
por registro. Calcula la pesudo-cizalla (pseudo-shear)
Com_sens
dividiendo el sensor de aceleración (acc) por el
canal de velocidad de caída (vel). El nuevo canal se
269
denomina pshear y da una idea de las inclinaciones
del perfilador a lo largo de la columna de agua.
Extrae los canales y sensores especificados. El archivo
Sensextr de salida con extensión *.TOB contiene dichos
canales y sensores.
∂u i ⎛ ∂u i ∂u j ⎞
ε =ν ⎜ + ⎟⎟ (10)
∂x j ⎜ ∂x
⎝ j ∂xi ⎠
⎛ ∂u ⎞
2
ε = 7.5ν ⎜ ⎟ (11)
⎝ ∂z ⎠
donde ∂u/∂z es el perfil vertical de cizalla obtenido con los sensores de la sonda.
La ecuación isotrópica implica considerar todo el rango de longitudes de onda
relevantes para el perfil de cizalla, lo que significa que las medidas del perfilador
deben resolver el espectro completo de fluctuaciones de la velocidad turbulenta.
El espectro universal de energía cinética se divide conceptualmente en tres
regiones. El subrango de energía abarca las grandes escalas de movimiento en
las cuales tiene lugar principalmente la generación de la energía cinética,
mientras que el subrango de disipación incluye las escalas más pequeñas en las
cuales tiene lugar los procesos de disipación de energía debido a la viscosidad. Si
el rango de escalas es suficientemente grande, existe un subrango intermedio
(inercial) en el cual la forma del espectro es independiente de los procesos de
generación y disipación de la energía. Asumiendo una serie de simplificaciones
matemáticas en el subrango inercial la descripción del movimiento turbulento
puede realizarse a partir de la descripción de ε. El límite superior del subrango de
disipación está definido por la longitud de onda de Kolmogorov (kk) (Kolmogorov,
1941) y depende del nivel de turbulencia:
1
1 ⎛ ε ⎞4
kk = ×⎜ ⎟ (12)
2 ∏ ⎝ν 3 ⎠
270
Mientras que el límite superior está claramente definido, el límite inferior es más
complicado de definir. Normalmente se utiliza el valor de 2 cpm que es el número
de onda más bajo que pueden resolver los perfiladores de 1 m de longitud como
el MST (Prandke & Stips, 1996).
Tabla 3. Descripción de los módulos del batch intermedio con el que se calcula la
tasa de disipación de la energía cinética turbulenta (ε).
271
Calcula la media de dos canales o sensores que
miden el mismo parámetro (eps1 y eps2) tras
comprobar los posibles picos. Para considerar un
pico, el valor de uno de ellos debe diferir del valor del
Smooth otro un factor especificado, tomando en ese caso el
valor mínimo y rechazando el mayor. El objetivo es
eliminar valores erróneos causados por el impacto de
partículas en el perfil de la tasa de disipación. Añade
un nuevo canal, eps.
Añade una constante a los canales seleccionados
Addition
(eps y peps) para que puedan ser representados.
Calcula el logaritmo en base 10 de uno o más
Log_10
canales. En este caso se aplica sobre el canal eps.
Calcula un polinomio de orden n para el canal
seleccionado (eps), creando un canal adicional que
se nombra como epsi. Este polinomio corrige en el
Polynom1 nuevo canal la resolución espacial incompleta
debido al tamaño del propio sensor. En este módulo
se introducen los coeficientes correspondientes al
equipo que se está utilizando (Prandke, 2007)
Calcula un polinomio de orden n para el canal
seleccionado (epsi), creando un canal adicional que
se nombra como epsilo. En este módulo se introducen
los coeficientes correspondientes al número de onda
Polynom2
de corte superior. Para un perfilador con una
velocidad de caída no superior a 0.7 m s-1 se
recomienda un valor de 30 cpm para este límite.
(Prandke, 2008)
Calcula un polinomio de orden n para el canal
seleccionado (epsilo), creando un canal adicional
que se nombra como epsilon. En este módulo se
Polynom3
introducen los coeficientes correspondientes al
número de onda de corte inferior, en este caso, 2
cpm. (Prandke, 2008)
Calcula la inversa del logaritmo en base 10 de uno o
Exp_10 más canales. En este caso se aplica sobre los canales
eps y epsilon.
Calcula valores promedio de los canales en un rango
Press_av de presión definido. De este modo se normaliza la
profundidad de los perfiles a intervalos de 1 m.
Calcula el logaritmo en base 10 de uno o más
Log_10 canales. En este caso se aplica sobre el canal epsilon,
peps, eps1, eps2 y eps.
Elimina los canales seleccionados del archivo de
Delsens
entrada al módulo. Elimina en este caso epsi, epsilo,
272
shear1, shear2, pshear, Kc1, Kc2, kcp, time y ncp.
Calcula la salinidad como función de la temperatura,
la conductividad y la presión. Los datos calculados se
Salinity
añaden al archivo en un nuevo canal que se nombra
como sal.
Calcula la densidad en función de la salinidad y la
temperatura a presión cero. Los datos calculados se
Sigma_t
añaden al archivo en un nuevo canal que se nombra
como sig_t.
Calcula la escala Thorpe, LT, para el canal sig_t,
reordenando el perfil según un algoritmo de burbuja
Thorpe (BubbleSort). Es necesario establecer la dirección de
ordenación según el canal seleccionado (sigma_t:
ascendente).
Calcula la frecuencia de Brünt Väisälä en s-2,
utilizando los canales de presión y sigma_t, aplicando
la siguiente fórmula:
g dρ
BVFD N2 = −
ρ ( z ) dz
donde g=9.80665ms-2. Los datos calculados se
añaden al archivo en un nuevo canal que se nombra
como N^2.
Elimina los canales seleccionados del archivo de
Delsens entrada al módulo. Elimina en este caso el canal
thorpe del archivo de salida.
273
Tabla 4. Descripción de los módulos del batch final con el que se calculan los
coeficientes de difusión turbulenta (Kz).
274
12. Control de calidad
275
Figura 9. Ventana principal de la herramienta spectrum. En la parte izquierda de
la pantalla se representan los perfiles de cizalla registrados por los dos sensores
que incorpora el perfilador en una estación oceánica. En la parte central de la
ventana la gráfica muestra el espectro de fluctuaciones de velocidad turbulenta
correspondiente al rango seleccionado en los perfiles. En la figura se observa
cómo hasta la longitud de onda de 100 cpm las observaciones siguen el espectro
universal de Nasmyth (isolineas discontinuas).
276
de dicha partícula. Para separar la señal de turbulencia natural de este otro tipo
de señales, el perfilador va equipado con dos sensores de cizalla alineados para
medir la misma componente de cizalla. De este modo, los picos no coherentes en
cada uno de los dos perfiles registrados de forma simultánea pueden ser
identificados y eliminados.
El módulo smooth (tabla 3) se encarga de comprobar la posible existencia de
picos anómalos en los dos canales de tasa de disipación de energía cinética
turbulenta (eps1 y eps2) y calcular la media (eps). Cuando el valor de uno de los
canales es mayor que el valor del otro canal en un factor establecido
(normalmente factor n=5), rechaza el valor mayor y se queda con el valor más
bajo.
La utilidad datgraf del programa DATpro es muy útil para realizar una visualización
rápida de los perfiles de datos, tanto para comprobar la correcta elección del
factor n, como para evaluar con detalle los perfiles bajo determinadas
condiciones oceánicas (abundancia de materia en suspensión, presencia de
determinados organismos, etc.) que reducen la eficacia del módulo smooth.
Como se observa en la Figura 10, el pico que aparece en el canal eps1 a 165 m
de profundidad supera en n veces el valor de eps2 a esa misma profundidad, con
277
lo cual, el canal eps adoptará como válido el valor mínimo, y no la media de
ambos.
En la Figura 11 se observa como la abundancia de medusas en una estación
oceánica afecta al registro de datos en el sensor de cizalla situado en la posición
más externa, y por tanto menos protegido. El impacto de estos organismos en el
airfoil del sensor desvirtúa su señal de turbulencia a partir de los 60 metros de
profundidad. A pesar del filtro que supone el módulo smooth, el criterio a seguir en
estos casos es no tener en cuenta el perfil de ese sensor a la hora de calcular el
valor medio eps, porque de lo contrario se estaría sobreestimando el valor de ε.
La manera más sencilla de hacerlo es seleccionar dos veces el canal eps1 en el
cuadro de configuración de parámetros del módulo (Figura 12).
278
Figura 11. Distribución vertical de la tasa de disipación de energía cinética
turbulenta (ε) calculada a partir de los datos de cizalla registrados por los dos
sensores del perfilador en una estación oceánica con presencia importante de
medusas, y de la tasa media calculada con el módulo smooth.
13. Referencias
1. Allen, H.J., Perkins, E.W. (1952). A study effects of flow over slender inclined
bodies of revolution. U.S. National Advisory Committee for Aeronautics, Report
No.1048.
279
2. Batchelor, G.K. 1953. The Theory of Homogeneous Turbulence. Cambridge, UK:
Cambridge University Press
3. Kolmogorov, A.N. 1941. The local structure of turbulence in a incompressible
viscous fluid for very high Reynolds number. C.R. Acad.Sci.URSS 30:301-305
4. Neuman, T., Prandke, H. (1992). Entwicklung eines Sensors zur Turbulenzmessung
im Meer. University Rostock, Proceedings of the 7. Symposium Maritime
Elektronik, Arbeitskreis Messelektronik, 81-84.
5. Osborn, T.R. (1980). Estimates of the local rate of vertical diffusion from
dissipation measurements. Journal of Physical Oceanography, 10: 83-89.
6. Prandke, H. & Stips, S. 1996. Investigation of microstructure and turbulence in
marine and limnic waters using de MST profiler. European Commission, Joint
Research Centre, Space Applications Institute, Ispra, Technical note No.I.96.87
7. Prandke, H. & Stips, S. 1998. Test measurements with an operational
microstructure-turbulence profiler: Detection limit of dissipation rates. Aquatic
Sciences 60:191-209
8. Prandke, 2007. Correction of the spatial response of shear sensors in dissipation
rate computation procedure. ISW-Wassermesstechnic.
9. Prandke, 2008. Correction of the wave number cut off in dissipation rate
computation procedure. ISW-Wassermesstechnic.
10. Rahmstorf, S. 2003. The current climate. Nature 421:699-699
11. Sriver, R.L., Huber, M. (2007) Observational evidence for an ocean heat pump
induced by tropical cyclones. Nature 447:577-580.Terray, E.S., M. A. Donelan, Y.
C. Agrawal, W. M. Drennan, K. K. Kahma, A. J. Williams III, P. A. Hwang and S. A.
Kitaigorodskii. 1996. Estimates of kinetic energy dissipation under braking waves.
J. Phys. Oceanogr. 26, 792-807.
12. Wolk, F., Yamazaki, H., Seuront, L., Lueck, R.G. 2002. A new free-fall profiler for
measuring biophysical microstructure. Journal of Atmospheric and Oceanic
Technology 19:780-793
13. Wunsch. C., Ferrari, R. 2004. Vertical mixing, energy and the general circulation
of the oceans. Annual Review of Fluid Mechanics 36:281-314
280
BLOQUE 4
281
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Nombre de la técnica
Jordi Dachs
IDAEA-CSIC, Barcelona, Catalunya, España.
5. Conceptos generales
La metodología permite el muestreo de material particulado de
volúmenes de agua grandes (más de 100 L), con el fin de tener
suficiente material para los análisis de compuestos orgánicos. La
conservación de la muestra se realizar de manera que se asegura que
esta no se contamina por contaminantes presentes en la atmósfera
durante el transporte.
6. Equipamiento necesario
282
7. Reactivos u otro material fungible
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
283
El volumen se calcula intengrando el flujo por todo el periodo de
muestreo.
284
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Título de la técnica
Jordi Dachs
IDAEA-CSIC, Barcelona, Catalunya, España.
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
285
- conexiones de teflón
- bomba peristática
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
286
agua en contínuo.
10- En el caso que no hay también conectada una columna XAD, se
puede filtrar con caudales altos. Se regula la llave de entrada de
agua del continua para caudales de 0.5 l min-1.
11- Se para la filtración cuando se colmata el filtro (caudales menores
de 80 ml min-1).
12- Se abre el portafiltros y se dobla el filtro con unas pinzas
previamente lavadas con acetona.
13- Se envuelve el filtro con papel de aluminio y se pone dentro de
una bolsa zip cerrada herméticamente.
14- Se conservan los filtros congelados a -20 C.
287
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
Muestreo de aerosoles.
Jordi Dachs
IDAEA-CSIC, Barcelona, Catalunya, España.
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
288
7. Reactivos u otro material fungible
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
289
7- Los filtros envueltos se guardan dentro de bolsas de plástico y
congelados a -20C.
8- IMPORTANTE – Apuntar al final, el volumen de aire filtrado.
9- Comprobar que el “estadillo” está correctamente rellenada.
Todas las casillas de la fila de la muestra deben contener datos.
10- IMPORTANTE - Después de la campaña, las muestras deben
permanecer congeladas hasta que lleguen a Cartagena.
290
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
Jordi Dachs
IDAEA-CSIC, Barcelona, Catalunya, España.
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
291
El modo de funcionamiento de los captadores está descrito en el
correspondiente manual.
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
292
hacia dentro). Finalmente se envuelve el filtro con papel de
aluminio.
17- Los filtros envueltos se guardan dentro de bolsas de plástico y
congelados a -20C.
18- IMPORTANTE – Apuntar al final, el volumen de aire filtrado.
19- Comprobar que el “estadillo” está correctamente rellenada.
Todas las casillas de la fila de la muestra deben contener datos.
20- IMPORTANTE - Después de la campaña, las muestras deben
permanecer congeladas hasta que lleguen a Cartagena.
293
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
Jordi Dachs
IDAEA-CSIC, Barcelona, Catalunya, España.
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
294
El modo de funcionamiento de los captadores está descrito en el
correspondiente manual.
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
295
portaespumas también con acetona.
2- Se desenvuelve la espuma y se coge con la pinza grande.
3- Se inserta la espuma en el porta-espumas de vidrio, se inserta
éste en el porta espumas de PCV.
4- Se coloca el portaespumas entre el muestreador CAV y el
portafiltros.
5- Se programa el aparato para filtrar 40 m3/hora de aire durante
24 horas.
6- Al empezar, tomar nota del volumen total de aire que indica el
aparato i el número de filtro.
7- Después de 24 horas se abre el cabezal porta filtros, se saca el
filtro con las pinzas y se dobla por la mitad (con los aerosoles
hacia dentro). Finalmente se envuelve el filtro con papel de
aluminio. Se saca la espuma con la pinza previamente lavada
con acetona y se envuelve con papel de aluminio. Después se
guarda dentro de dos bolsas zip. Importante que esté cerrado
herméticamente.
8- Los filtros y espumas envueltos se guardan dentro de bolsas de
plástico y congelados a -20C.
9- IMPORTANTE – Apuntar al final, el volumen de aire filtrado.
10- Comprobar que la tabla está correctamente rellenada. Todas
las casillas de la fila de la muestra deben contener datos.
11- IMPORTANTE - Después de la campaña, las muestras deben
permanecer congeladas hasta que lleguen a Cartagena.
296
30- IMPORTANTE - Después de la campaña, las muestras deben
permanecer congeladas hasta que lleguen a Cartagena.
297
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
298
7. Reactivos u otro material fungible
Agua MQ
Cubeta de 10L con ácido (ácido al 37% diluido 100 veces con agua
MQ) para la limpieza de las piezas del colector (24 h sumergidas en
ácido antes de ser ocupadas)
8. Descripción de la Técnica
299
Se enciende el colector.
300
11. Control de calidad
301
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Título de la técnica
Jordi Dachs
IDAEA-CSIC, Barcelona, Catalunya, España.
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
- peso de 20 kg.
302
- Acetona de alta pureza (Merck)
- Pipetas pasteur previamente muflidas y guardadas en papel de
aluminio y bolsas zip.
- Papel de aluminio
- Bolsas ZIP pequeñas
- Cinta aislante (a usar como etiqueta)
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
Pesca vertical
-
1- Se limpia la red y el cubilete con agua de mar
2- Se hacen tantos lances como sea posible hasta debajo del
DCM (a DCM+ 20 m o según indique el ctd). Los lances se
hacen bajando la red a 30-40 m/min y subiendo la red a 20
m/min. Cuando las condiciones de la mar no son buenas, se
sube a velocidades más lentas.
3- En cada lance, se vierte el agua del cubilete en un jarro
previamente muflado en el laboratorio (ver arriba).
4- Se etiqueta el jarro y al final de los lances se lleva al
laboratorio.
5- Se filtra la muestra de plancton con filtros GFD previamente
muflados y pesados. Cuando se colmata se usa otro filtro.
6- Se dobla el filtro con unas pinzas previamente lavadas con
acetona y se guardan en una bolsa zip a -20C.
7- Se apunta toda la información sobre las pescas en el
estadillo.
303
11. Calculo de los resultados.
304
BLOQUE 5
305
1. Técnicas Analíticas
5. Conceptos generales
El cálculo del coeficiente de absorción de luz (a(λ)) por las partículas juega un
papel importante en la determinación de la variabilidad óptica de la columna de
agua. Entre los principales contribuyentes a los procesos de absorción de luz en la
columna de agua cabe destacar el papel del fitoplancton. Otros son la materia
inorgánica particulada y la materia detrítica. La contribución de cada uno de
ellos a a(λ) varía dependiendo de la localización, las poblaciones fitoplanctónicas
predominantes y las características de la masa de agua.
La técnica que se describe a continuación consiste en cuantificar la cantidad de
luz que es absorbida por las partículas retenidas en un filtro de fibra de vidrio.
6. Equipamiento necesario
Espectrofotómetro
Equipo de filtración
- bomba eyela
- rampa de filtración
- pinzas de sujeción
306
- soporte y columna de filtración graduada
- tapón con tubo de succión
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
Vol. Diámetro de
Fecha Estación Muestra Profundidad (ml) Filtrado(ml) filtración (mm)
24-05-2010 1 1 3 1300 15
24-05-2010 1 2 20 1500 16
24-05-2010 1 3 40 2000 15
24-05-2010 1 4 70 1500 15
24-05-2010 1 5 90 1500 16
307
Tras la filtración, el filtro se mantendrá húmedo (añadiendo unas gotas de
agua d emar filtrada) y en oscuridad hasta la lectura, lo más
inmediatamente posible, en el espectrofotómetro.
-Modo de adquirir-Espectro-Configurar-Parámetros
Elegir los siguientes parámetros
Absorbancia
Rango de registro, Bajo: 0 - Alto: 0.5
Inicio: 750 nm – Fin: 280 nm
Velocidad: rápido
Rendija: 2
Intervalo(nm) : 1
Confirmar: OK
# Obtención de datos
-crear una carpeta en UVPC.exe
-archivo - canal - guardar canal – todos – Ok
-traducción de datos – export ASC II – todo
308
-finalizar
Resultado
309
Etiquetado del tubo eppendorf:
Se escribirá en pegatinas pequeñas y con lápiz las siguientes anotaciones.
Fecha:
Estación:
Muestra:
Profundidad:
12.Limpieza
Filtración
Filtro Whatman GF/F
Millex 0.2
Muestra
310
11. Referencias
311
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Título de la técnica
Estrada, Marta
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
Botellas Niskin de la roseta (para aguas superficiales sirve cualquier otro sistema,
por ejemplo, un cubo, que permita extraer agua sin agitarla excesivamente).
- Frasco de vidrio con tapa de rosca, boca ancha, color ámbar de Afora, de 125
ml, referencia Afora # LA 80125. Obturador número Afora # LA80010)
312
- Frasco de vidrio, con tapa de rosca, boca ancha color ámbar 250 ml, ("Frasco
Merck"); Afora # LA80250. Obturador (para "Frasco Merck") Afora # LA80011
8. Calibración
No aplicable.
9. Descripción de la Técnica
No aplicable.
Hay que cuidar de fijar las muestras lo más rápidamente posible y guardarlas al
abrigo de la luz, de excesivo calor y de posibilidades de ocngelación.
313
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Título de la técnica
Estrada, Marta
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
Formol-hexamina:
Se diluye formol (aldehido fórmico al 40%) con un volumen igual de agua
destilada (se obtiene aldehido fórmico al 20%) y se añaden 100 g de
hexametilentetramina (hexamina) por cada litro de esta solución (puede quedar
polvo sin disolver en el fondo del frasco).
314
Lugol ácido:
Se disuelven 100 g de KI en 1 litro de agua destilada; se disuelven seguidamente
50 g de yodo cristalino y se añaden 100 ml de ácido acético glacial.
8. Descripción de la Técnica
Recogida de la muestra
Después del arrastre, se rociará la red con agua de mar para hacer bajar el
material adherido al tejido de la manga hacia el cubilete y se verterá el
contenido de éste en un bote de plástico o de vidrio (de 250 ml), al que se
añadirá la cantidad necesaria de fijador (véase más abajo). Es importante que
las muestras queden bien tapadas; las botellas de plástico suelen dar problemas
en este aspecto. Indicar en el frasco la fecha, la estación, el tipo de pesca y la
profundidad alcanzada.
Fijación de la muestra
No hay un fijador que vaya bien para todos los grupos de fitoplancton. Uno de los
más utilizados es el formol-hexamina. Dinoflagelados y flagelados desnudos se
conservan mejor con Lugol (pero éste, sobre todo si es Lugol ácido, va mal para
los cocolitóforos). A veces, puede ser conveniente conservar muestras duplicadas
en formol-hexamina y en Lugol.
315
Documentación fotográfica de la muestra
Arrastre
Introducción de 2.5 ml de
Fijación. muestra en la cubeta de fondo
de una cámara de
Una submuestras será fijada sedimentación y observación
con formol-hexamina y otra al microscopio invertido.
con Lugol ácido Documentación fotográfica de
la muestra
Hay que anotar el diámetro y tipo de malla de la red, el tipo de arrastre (vertical,
horizontal, oblicuo), tiempo de arrastre, velocidad del barco, longitud de cable
largado. En teoría, si se observan Nm células en v mililitros de muestra, la
abundancia in situ (Nis) se podría calcular como:
Aa
316
Arrastres verticales (a barco parado)
En la práctica, sin embargo, tales expresiones son poco útiles, porque parte del
agua que pasa por la boca de la malla acaba volviendo hacia afuera sin filtrarse.
Hay que lavar bien las redes después de cada utilización. Esto puede hacerse, en
principio, enjuagando con agua de mar, pero hay que tener en cuenta que este
sistema no elimina del todo la contaminación entre muestras. Si se pasa de una
zona rica a una pobre debería lavarse la red con detergente y agua dulce (para
más detalles véase Tangen, 1978).
El yodo de las muestras fijadas con Lugol es fotosensible y volátil. Hay que cuidar
que las muestras almacenadas queden protegidas de la luz y de temperaturas
demasiado altas o que puedan dar lugar a congelación.
12. Referencias
Tangen, K.- 1978. Nets. En: Sournia, A., (ed.), Phytoplankton Manual. UNESCO, París,
pp. 50-58.
317
1. Metodología de muestreo
2. Título de la técnica
Muestreo de cocolitóforos
Estrada, Marta
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
Rampa de filtración.
318
Filtros de soporte de ésteres de celulosa (de 3-5 μm de tamaño de poro; este filtro
se puede reutilizar).
Cápsulas de plástico para secar y para guardar los filtros. Sirven cápsulas de Petri.
En cada una de ellas se pueden acondicionar 5-6 filtros que se fijan mediante
cinta adhesiva o un trocito de Post-it enganchado en un extremo.
Agua mineral (no se puede utilizar agua destilada porque disuelve los cocolitos)
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
319
10. Cuadro sinóptico de la técnica
13. Referencias
320
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Título de la técnica
5. Conceptos generales
321
6. Equipamiento necesario
Dispositivo de filtración
8. Descripción de la Técnica
• Etiquetado de la muestra:
Fecha (dd.mm.aaaa)
Leg
Estación (número y coordenadas)
Profundidad
322
células utilizando para ello un microscopio invertido Leica dotado de una cámara
digital AVT Pike 145C y un sistema informático de alto rendimiento provisto de
Software específico para Análisis de Imagen semiautomático interactivo con el
usuario, que debe reconocer los grupos y características celulares.
323
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Técnicas analíticas
2. Titulo de la técnica
Nuria Navarro
Universidad Rey Juan Carlos (URJC)
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
324
• 2 Refrigeradores de cubierta + 2 bombas
• Mallas de distinta transparencia
• Titroprocesador (dos): Titrino 716 DMS (Metrohm) y Titrando 808 (Metrohm)
325
1. Encender el titrino en la parte posterior izquierda
2. Aparecerá una pantalla de System test, seguida de la pantalla principal de
medida. Aquí en la parte superior de la derecha aparece el método que está
cargado. Para esta campaña usar el método OXIGENUR.
326
11. Cuando la muestra esté valorada la bureta se rellenará automáticamente y
aparecerá en la pantalla los ml necesarios para la valoración del iodo y los mV.
12. Apuntar tanto en el estadillo de papel como en la hoja de cálculo los ml
utilizados.
13. Una vez terminadas las muestras y tras la colocación del dosificador y del
electrodo en su sitio, se apagará el Titrino desplazando el botón de encendido
hacia abajo (está situado en la parte posterior izquierda de la base del aparato).
TITRANDO 808
ELECTRODO
TOUCH CONTROL
327
Si es así, el sistema ya está listo.
Si no es así, ir a Load Method => Internal memory=> Main group => show files
(pantalla táctil inferior derecha) => O2 Malaspina => Load
5) Una vez que el método está correctamente cargado hay que hacer un lavado
de la bureta con el tiosulfato que se va a usar en las valoraciones. Para ello
apretar el botón de Manual =>Dosing =>Prepare. Aparecer una pantalla que dice
que hay que comprobar que el dosificador no apunte directamente al electrodo.
Si esto es así, apretar OK y el titrando hará una vaciado doble de la bureta.
Repetir este paso unas 3 ó 4 veces.
328
6) Para volver a la pantalla principal donde está el método cargado, apretar
Home.
329
• Solución de Hidróxido de Sodio Iodo (reactivo 2)
8. Calibración
Hay que valorar diariamente todas las botellas de tiosulfato que se utilicen. Se
llenan 6-71 botellas Winkler (125 mL) de agua destilada sin O2 (hervida), y se
añaden los reactivos en orden inverso, es decir:
N = (5/V) x 0.01
330
9. Descripción de la Técnica
• Incubación
• Fijación
331
Las 7 botellas iniciales transparentes por profundidad se fijan con los reactivos
como se indica a continuación. Tras el proceso conoceremos el oxígeno inicial
presente en la muestra. 24 h después, se titulan igualmente las botellas incubadas,
y así se obtiene el oxígeno presente en el agua después de un día de respiración
y fotosíntesis (botellas claras) y de sólo respiración (botellas oscuras).
Dejar que el precipitado sedimente al menos un tercio de la botella (al menos 6-8
horas). Se debe titular una vez se ha sedimentado ya que si se deja más tiempo
los errores aumentan.
• Principio teórico
La muestra se trata con excesos de sulfato manganoso y una base fuerte de iodo.
El hidróxido de manganeso que se forma reacciona con el oxígeno disuelto en la
muestra y forma un precipitado. Tras acidificación, en presencia de Ioduro, se
libera Iodo en cantidad equivalente al oxígeno disuelto originalmente presente en
la muestra. La cantidad de Iodo liberado se calcula mediante la titulación con
tiosulfato sódico.
2 I2 + 4 S2O32- Æ 4 I- + 2 S4O62-
332
10. Cuadro sinóptico de la técnica
Æ Æ
333
12. Control de calidad
Hay que revisar, antes de medir, que el electrodo está relleno de electrolito hasta
la línea roja.
334
Limpieza: Hay que limpiar los dosificadores diariamente con acido diluido en
agua destilada y después aclararlos con agua destilada.
Las botellas DOB se limpian diariamente con agua destilada y se dejan limpias
para el siguiente muestreo.
Al terminar cada tramo de campaña hay que desmontar y limpiar todos los
tituladores con agua destilada.
HERRAMIENTA
PARA
DESMONTAR
LA BURETA
13. Referencias
Knap, A, Michaels A, Close A, Ducklow H and Dickson A (eds.). (1996). Protocols for
the Joint Global Ocean Flux Study (JGOFS) Core Measurements. JGOFS Report Nr.
19, vi+170 pp. Reprint of the IOC Manuals and Guides No. 29, UNESCO 1994.
335
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
4. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
7. Descripción de la Técnica
336
Recogida de muestras. Las muestras se tomarán directamente de las botellas
Niskin. Se tomarán muestras de 5 profundidades (superficie, DCM y 3 intermedias),
preferiblemente al amanecer y con precaución para evitar la exposición de las
células a luces intensas. El muestreo
Figura 2. Sistema de filtracion en cascada con copas de policarbonato (Foto: Ana Fernández).
337
Procesado de los filtros. Para eliminar el 14C inorgánico retenido, los filtros se
exponen a vapores de HCl concentrado durante 12 horas en la campana de
gases del laboratorio de radiactividad. Luego, se colocan en viales de centelleo
de 4 mL de capacidad y se añaden 3.5 mL de líquido de centelleo. Las muestras
se almacenan al menos durante 12 horas en oscuridad previamente a su medida
en un contador de partículas beta (Fig. 3). La figura 4 muestra un esquema
general de todo el procedimiento.
Figura 3. Captura de pantalla del monitor conectado al contador de partículas beta donde se
muestran los dos criterios usados para determinar el tiempo de contaje de las muestras, tiempo
máximo de medida (180 segundos en este caso) y umbral de error en la precisión de la medida
(1%). El contaje se detiene en el momento en que se alcanza uno de estos criterios.
Tasa de producción (μg C L-1 d-1) =CID (μg C L-1) * (DPMmuestra – DPMnegra) /
DPMañadidos * tiempo incubación (1 día)
338
Figura 4. Esquema general que muestra los diferentes pasos a seguir para la determinación de la
producción primaria fraccionada por tamaños.
10. Referencias
Marañón, E., Holligan, P. M., Barciela, R., González, N., Mouriño, B., Pazó, M. J.,
Varela, M. (2001) Patterns of phytoplankton size–structure and productivity in
contrasting open ocean environments. Marine Ecology Progress Series, 216, 43-56
339
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
4. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
7. Descripción de la técnica
340
amanecer y con precaución para evitar la exposición de las células a luces
intensas.
Figura 1. Rampa de filtración circular con copas de acero y colectores de filtrados en la parte
inferior. (Foto: Ana Fernández)
341
Figura 2. Agitador orbital usado en la eliminación de 14C de los filtrados, que se realiza
en el interior de la campana de extracción de gases. (Foto: Ana Fernández)
342
8. Reactivos u otro material fungible
Tasa de producción (μgC L-1 d-1) = [Vol botella (mL) / Vol filtrado (mL)] * CID (μg C
L-1) * (DPMmuestra – DPMnegra) / DPMañadidos * tiempo incubación (1 día)
10. Referencias
Marañón, E., Cermeño, P., Fernández, E., Rodríguez, J., Zabala, L. (2004)
Significance and mechanisms of photosynthetic production of dissolved organic
carbon in a coastal eutrophic ecosystem. Limnology and Oceanography, 49,
1652-1666.
343
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
GPP-18O
5. Conceptos generales
Se basa en marcar el agua con 18O de modo que podamos detectar el nuevo O2
producido durante la fotosíntesis que procede del oxígeno del agua que ha sido
marcado. Por tanto estamos midiendo la generación de oxígeno fotosintético
producido durante el día, ya que por la noche solo se consume oxígeno (Grande
et al., 1991).
6. Equipamiento necesario
- Viales con cierre hermético que impida cualquier permeabilidad de los gases
344
8. Descripción de la Técnica
- 3 viales son marcados con H218O (25 μl; ≈ 1 μl /ml) enriquecida al 97% en 18O de
modo que el agua oceánica pase de tener un valor δ18O de ≈ 0‰ (V-SMOW)
hasta alcanzar un valor comprendido entre +300 ‰ y +500 ‰ (V-SMOW). Agitar.
1
Añadir en un vial HgCl en exceso de modo que una vez añadida el agua desionizada quede en el fondo siempre una
cantidad de precipitado blanco sin disolver. También es posible usar una solución saturada al 50% ya que con la
saturada se puede arrastrar el material sólido con la pipeta si no se tiene cuidado. ATENCION: el cloruro de mercurio es
muy toxico, usar guantes y lavar las manos después de su utilización.
345
espacio de cabeza (500 µl) se usa para el análisis isotópico del oxígeno del agua
(mediante el típico equilibrio CO2-agua).
9. Calibración
donde δ18O-O2init and δ18O-O2final son las medidas δ18O-O2 antes y después de la
incubación. δ18O-H2O es la composición isotópica alcanzada por el agua tras ser
marcada y [O2]init es la concentración de oxigeno antes de la incubación (mmol
O2 m–3).
Para ello se analizarán las razones O2/N2 y O2/Ar, por lo que se necesita medir el
δO2/N2 (masas 32/29) y δO2/Ar. Cada medida se comparará (patrón interno) con
aire sintético puro de composición conocida (Sowers et al., 1989; Emerson et al.,
1991).
346
11. Referencias.
Emerson, S., Quay, P., Stump, C., Wilbur, D., Knox, M., 1991. O2, Ar, N2 and 222Rn in
surface waters of the subarctic ocean: net biological O2 production, Global
Biogeochemical Cycles 5:49-69.
Epstein, S. y Mayeda, T.K. 1953. Variation of the 18O/16O ratio in natural waters.
Geochim. Cosmochim. Acta. 4: 213-224.
Grande, K.D., Bender, M.L., Irwin, B., Platt, T., 1991. A comparison of net and gross
rates of oxygen production as a function of light intensity in some natural
plankton populations and in a Synechococcus culture. Journal of Plankton
Research 13:1-16.
Kiddon J., Bender M.L, Marra J., 1995 Production and respiration in the 1989 North-
Atlantic spring bloom: an analysis of irradiance-dependent changes. Deep-
Sea Res I 42: 553–576.
Sowers, T., Bender, M., Raynaud, D., 1989. Elemental and isotopic composition of
occluded O2 and N2 in polar ice. Journal of Geophysical Research 94:5137-
5150.
Révész, K., Böhlke, J.K., Smith, R.L., Yoshinari, T., 1999. Stable isotope composition of
dissolved O2 undergoing respiration in a ground-water contamination
gradient, in Morganwalp, D.W. and Buxton, H.T. (Eds.), U.S. Geological Survey
Toxic Substances Hydrology Program--Proceedings of the Technical Meeting,
Charleston, South Carolina, March 8-12, 1999. U.S. Geological Survey Water-
Resources Investigations Report 99-4018C, p. 323-328.
Tobias, C.R., Böhlke, J.K., Harvey, J.W., 2007. The oxygen-18 isotope approach for
measuring aquatic metabolism in high-productivity waters. Limnology and
ceanography 52, 1439-1453.
347
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento
Técnicas analíticas
2. Título de la técnica
Estrada, Marta
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.
5. Conceptos generales
348
clorofila que correspondan a las profundidades de producción primaria se
realizarán también utilizando filtros de policarbonato de 20, 2 y 0.2 μm de tamaño
de poro y 47 mm de diámetro (según la fracción de tamaño considerada), del
mismo tipo de los utilizados para producción.
6. Equipamiento necesario
Filtros.
Acetona 90%.
Para preparar acetona al 90% mezclar 1000 ml de acetona con 110 cm3 de agua
MilliQ. En una botella nueva de acetona, queda normalmente suficiente espacio
vacío para añadir el agua MilliQ dentro de la misma botella.
8. Calibración
349
Se disuelve el standard en acetona 90% y al cabo de unas dos horas se mide su
concentración mediante un espectrofotómetro, mediante la fórmula;
Clor a (mg l-1) = (11.85 (A664 –A750) - 1.54 (A647 –A750) - 0.08 (A 630- A750))/C
9. Descripción de la Técnica
9.1 Muestreo
9.2 Filtración
350
Filtrar 200-500 ml de agua (la cantidad puede variar en función de la
concentración de clorofila y del factor del fluorómetro) a través de un filtro GF/F
de 25 mm de diámetro. Con este filtro se analizará la clorofila a total. La presión
de vacío ha de ser inferior a 100 mm Hg.
- Doblar el filtro dejando el filtrado en la parte interior (se debe evitar que el
filtrado toque el papel de plata).
- Congelar los filtros a -20º C como minimo durante 6 horas (si conviene se pueden
tener congelados durante más tiempo).
Antes de sacar los filtros del congelador hay que llenar de acetona 90%, con el
dosificador, los tubos blancos de centrifuga. El volumen de acetona debe ser de
5-7 ml (5 ml son suficientes; comprobad el volumen que sale del dosificador dos o
tres veces con un tubo graduado de vidrio hasta que el volumen salga constante
(la primera tirada siempre tiene menos volumen). Tapad siempre muy bien los
tubos (la acetona se evapora muy rápidamente). Anotad el volumen de acetona
en el estadillo.
351
- Sacad los filtros del congelador e introducidlos en los tubos cuidando de que el
filtro esté completamente sumergido en la acetona; apuntad el número de tubo
que tiene cada muestra y fracción en el estadillo.
- Lavad los tubos con agua del grifo (unas 4 o 5 veces) y con agua MiliQ (una
vez). NUNCA uséis ácido para lavar los tubos de clorofila.
Notas:
Usad siempre lápiz para cualquier anotación del análisis de clorofila (si se cayera
una gota de acetona sobre bolígrafo o rotulador, perderíais la información)
Trabajad tan a obscuras como sea posible.
Los filtros de policarbonato se manipulan mejor si se humedecen con agua de
mar filtrada.
352
10. Cuadro sinóptico de la técnica
Toma de muestras de
agua de la roseta
Congelación de los
filtros a -20ºC
6 horas (mínimo)
22-23 horas
Lectura en el
fluorómetro
353
donde F es el factor del fluorómetro, Rb la lectura de al fluorescencia antes de
acidificar, B es la lectura correspondiente al blanco de acetona 90%, Ve es el
volumen de extracto acetónica en ml y Vm el volumen de muestra filtrado en l.
13. Referencias
Knap, A., Michaels, A., Close, A. , Ducklow, H., Dickson, A. (eds.)- 1996. Protocols
for the Joint Global Ocean Flux Study (JGOFS) Core Measurements. JGOFS Report
Nr. 19, vi+170 pp.
Apéndice
Clorofila_estadillo.xls
354
1. Metodología de muestreo y Técnica analítica
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
355
8. Descripción de la Técnica
• Colocar los filtros y las torres de filtración. Para la filtración secuencial colocar 2 o
3 soportes Sartorius en serie (tener en cuenta las condiciones de balanceo del
barco cuando se quiera poner 3 soportes en serie). Colocar el filtro con poro
menor en el soporte más bajo y el de poro mayor en el soporte más alto.
Toma de la muestra
356
células que permita obtener una señal cuantificable mediante HPLC es
aconsejable comprobar la clorofila (Chl) a estimada mediante el fluorómetro
acoplado al CTD. Volúmenes de 1.5 L son suficientes para zonas productivas (>
0.25 μg/L Chl a) pero puede necesitarse 2 botellas por profundidad (hasta 4 L) en
regiones oligotróficas.
Filtración de la muestra
1.- Llenar todas las torres Millipore con agua filtrada y con las llaves de paso de
la rampa cerradas. Encender la bomba Eyela que debe contener agua
para que succione y un tubo de vaciado hasta la pica.
2.- Comprobar ahora y no durante la filtración que la presión que marca el
manómetro de la bomba Eyela oscila alrededor de 0.025 MPa. Ojo que la
regulación es poco precisa. Para evitar en lo posible la rotura de células es
aconsejable que la presión de vacío no supere 0.03 MPa. En cualquier caso,
el proceso de filtración no debe durar más de 90 min y se debe incrementar
la presión o parar la filtración (y medir y anotar el volumen no filtrado)
cuando se supere este tiempo.
3.- Colocar un tubo de los tubo/conexión en la botella de muestra.
4.- Abrir la llave de paso de la rampa.
5.- Cuando comience a succionar colocar el tapón del tubo/conexión y
asegurarse que succiona la muestra.
6.- Continuar con todas las botellas como en la Fig.1.
357
Filtración secuencial por filtros de 47 mm.
• Mantener siempre el filtro mojado. Si la columna de agua por encima del filtro es
<1 cm cerrar la llave de paso, retirar el tapón, rellenar la torre con agua de mar
filtrada, abrir la llave y colocar el tapón.
358
• Comprobar que los filtros están secos antes de retirar las copas de filtración. Las
pinzas de punta plana tipo Millipore son más cómodas para manipular los filtros,
que deberán ser doblados cuidadosamente sin tocar la parte central superior que
contiene la muestra. Una vez doblados, presionar sobre el filtro usando papel de
laboratorio hasta que no deje restos de humedad. Debe evitarse el agua residual
del filtro ya que interfiere en el proceso de extracción de pigmentos. Introducir los
filtros lo más pronto posible en los microtubos y protegerlos del exceso de luz
durante su manipulación. Es importante congelar las muestras inmediatamente
tras su recogida a -20ºC (< 2 horas), hasta que acaben de filtrarse todas las
muestras de la estación que es cuando se trasladarán de forma definitiva a -80ºC
en cada campaña.
359
9. Cuadro sinóptico de la técnica
IMPORTANTE: Evitar el exceso 3. Doblar y secar los filtros con papel de laboratorio.
de luz y temperatura durante la
manipulación y filtrado de las
muestras
10. Referencias
Zapata, M., Rodríguez, F., & Garrido, J. L. (2000). Separation of chlorophylls and
carotenoids from marine phytoplankton: a new HPLC method using a reversed
phase C8 column and pyridinecontaining mobile phases. Marine Ecology Progress
Series 195, 29–45.
360
1. Técnicas analíticas
5. Conceptos generales
361
(componente principal del microzooplancton) tienen un potencial de altas tasas
de crecimiento esta descompensacion puede aumentar con el tiempo del
experimento.
6. Equipamiento necesario
Citometro de flujo
Fluorometro Turner Designs
Tanque y sistema de incubacion en la cubierta del barco
Rampa y soportes de fitlracion
Bomba de vacio
Bomba de agua
Bomba peristáltica
Reactivos.-
Acetona 90%
Glutaraldehido (1% en muestra)
Acido clorhídrico (para lavar)
Soluciones de nutrientes: 0.5 µM N-amonio (concentración final en la muestra) y
0.03 µM de fosfato (concentración final en la muestra)
Fungible.-
El necesario para contajes de picoplancton en el citometro de flujo:
tubos Falcon, gradillas, pipetas automaticas, puntas, Beads calibracion, vortex,
etc.
Dispensador Glutaraldehido
El material necesario para Analisis de clorofila:
tubos centrifuga, cubetas de fluorometro, filtros wahtman 25 mm, acetona 90%,
pipetas pasteur, dispensador
Cartuchos de 0.2 µm
Botes de Cuarzo 2 L
Botes de Policarbonato 2 L
Garrafas de 20 L x2
Garrafas de 10 L x2
8. Calibración
No se realiza.
- Descripción de la Técnica
362
Se aplicará el método modificado de dilución (Landry 1993, Landry et al. 1994)
siguiendo los procedimientos descritos en Agawin y Agustí (2005). Para cada
experimento se muestrea agua de superficie con el botellon Niskin de 30L, de los
que se recogerán 22 L de los cuales 8 L se filtrarán por 0.2 µm. Se utilizaran 5
botellas de 2L de policarbonato Nalgene (opacas a la radiación UV), y 5 botellas
de cuarzo de 2 L (transparentes a la radiación UV), utilizando 4 y 4 de cada tipo
para las diluciones enriquecidas con nutrientes. Diferentes volúmenes de agua
filtrada y sin filtrar se dispensaran en cada botella para conseguir abundancias
aproximadas al 25, 50, 75 y 100% los contenidos ambientales, para cada serie de
botellas de cuarzo o policarbonato. A cada botella se añadirán 0.5 µM N-amonio
y 0.03 µM de fosfato (concentraciones finales). Una botella de policarbonato se
llenará de agua de mar filtrada por 0.2 µm para cuantificar las células que han
podido pasar el filtro. 1 botella de cuarzo y otra de policarbonato se llenarán de
agua de mar utilizarán como control 100% sin adición de nutrientes. Las botellas
se incubarán en cubierta en tanques con circuito de circulación de agua de
superficie y expuestas a la radiación solar. Periódicamente, se analizará el efecto
combinado de la temperatura, para lo cuál se realizará la incubación del mismo
esquema de experimento pero utilizando el doble de botellas que serán
incubadas a dos temperaturas diferentes, a temperatura ambiente y a una
temperatura 2-3ºC por encima de la temperatura ambiente del agua de
superficie, para lo que se utilizarán los enfriadores de superficie del BIO Hespérides.
363
10. Cuadro sinóptico de la técnica
364
del tiempo de incubación (24 o 48 h) y se calcula la tasa neta de crecimiento
(µDx, Ec. 1) a partir de los cambios observados entre las medidas iniciales y al final
de la incubación.
365
13. Referencias
Dolan, J. R. and McKeon, K. 2005 .The reliability of grazing rate estimates from
dilution experiments: Have we over-estimated rates of organic carbon
consumption by microzooplankton?, Ocean Sci., 1, 1–7,
Landry, M. R. (1994). Methods and controls for measuring the grazing impact of
planktonic protists. Mar. microb. Food Webs 8: 37-57
366
1. Técnicas analíticas
5. Conceptos generales
El crecimiento y la división celular del pico-fitoplancton (células ≤ 2 µm
diámetro)que domina el océano oligotrófico (ej. Agawin et al. 1998) están
sincronizadas en la naturaleza con el ciclo dia-noche (Liu et al. 1998, Vaulot and
Marie 1999). p icoplanct plancton pifinirá de forma general la variable o proceso
a la que va aplicada la metodología y su relevancia en procesos biológicos,
químicos, físicos, etc.
6. Equipamiento necesario
Sistema de incubación. Tanque, enfriador de cubierta, Botellas de 2 L Colector de
fracciones Gilson. -
Bomba peristáltica
Congelador -80ºC
Vortex
Citómetro de Flujo
367
8. Calibración
No se realiza, se utilizan los valores arbitrarios de fluorescencia verde por célula
obtenidos en el citómetro de flujo.
9. Descripción de la Técnica
La cuantificación de la tasa de crecimiento de las poblaciones de pico-
cianobacterias se estimará mediante el análisis de su ciclo de división celular. Se
analizarán con preferencia tasas en poblaciones superficiales, aunque es
probable que se incluyan también estimas de otras profundidades. Se estima
realizar las estimas con una frecuencia de una de cada tres estaciones a lo largo
de todas las campañas de la expedición Malaspina.
Muestreo e incubación. Para cada experimento, 2-L de agua de superficie se
dispensaran por duplicado en botellas de 2-L PC Nalgene bottles lavadas al
acido. Las botellas se incubarán durante 24 horas en cubierta en un tanque con
un circuito de agua de superficie para mantener la temperatura y expuestas a
iluminación solar natural.
Cada 2 horas, las poblaciones se muestrearan utilizando la bomba peristáltica y
un muestreador automático programable, y las submuestras fijadas con
glutaraldehido (1% concentración final) y congeladas a -80 ˚C hasta su análisis en
un citómetro de flujo (Agawin and Agustí 2005).
Análisis. Las muestras se descongelan a temperatura ambiente y se incuban a
37ºC durante 30 minutos en presencia de 0.1 g l-1 de solucion RNAse A y B, para
368
eliminar RNA y ácidos nucleicos ribosómicos. Posteriormente, se añade citrato
potasico (concentración final de 25 mM) y SYBR-GREEN I (concentracion final de
10-4 de la solución comercial) para tinción del ADN y se incuba durante mas de 15
minutos a temperatura ambiente en la oscuridad antes de su análisis por
citometría de flujo (Marie et al. 1997). La adquisición logaritmica o linear en el
citometro de flujo debe hacerse en función del modelo que se utilice
(FACSCalibur o FACSAria) con el análisis de los datos del ciclo en modo linear. Los
valores de fluorescencia verde por célula, son equivalentes a la concentración de
ADN celular, aumentando en 2 veces en forma linear en la fase G2-M con
respecto a la fase G1. Las poblaciones de Synechococcus y Prochlorococcus se
identifican en función de sus señales de scattering (SSC), y fluorescencias roja y
naranja comos e describe en la ficha de contajes de picofitoplancton mediante
citometria de flujo.
369
medias de crecimiento especifico de las distintas poblaciones se calcularan
siguiendo el método de Liu et al. (1997):
1 24
(Ts+ T G 2 M) ∫0
μ= ln[1 + fs(t) + fG 2M (t)]dt
13. Referencias
Agawin, N.S., Duarte C.M. and S. Agustí. 1998. Growth and abundance of
Synechococcus sp. in a Mediterranean Bay : Seasonality and relationship with
temperature. Mar. Ecol. Prog. Ser.170: 45-53
Liu, H., Landry, M.R., Vaulot, D., Campbell, L., 1999. Prochlorococcus growth rates
in the central equatorial Pacific: An application of the fmax approach. Journal of
Geophysical Research 104, 3391-3399.
Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D., 1997. Enumaration and cell cycle
Analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the
nucleic acid stain SYBR Green I. Appl.Envir.Microbiol. 63, 186-193.
Vaulot, D., Marie, D., 1999. Diel variability of photosynthetic picoplankton in the
equatorial Pacific. Journal of Geophysical Research 104, 3297-3310.
370
1. Técnicas analíticas
5. Conceptos generales
Figura 1. Cultivo de
Amphidinium carterae al
que se le ha aplicado el
método CDA (Cell Digestion
Assay) para identificar y
cuantificar la abundancia
de células vivas.
Las flechas negras señalan
células muertas que están
siendo digeridas por las
enzimas. Las flechas rojas
señalan células vivas
intactas.
371
La pérdida en la capacidad de mantener la homeostasis, resultando en un
aumento en la permeabilidad de la membrana celular, caracteriza a las células
muertas, incluyendo tanto a las células que mueren por procesos necróticos
como por apoptosis (ej. Wyllie et al. 1980, Ellis et al. 1991, Darzynkiewicz et al.
1994).
El CDA, fue adaptado para su aplicación a comunidades de fitoplancton
por Agustí y Sánchez (2002) y consiste en la adición de una serie de enzimas
digestivas (DNasa + trypsin) a las muestras, de forma que las células muertas con
una mayor permeabilidad de la membrana no pueden evitar que las enzimas
entren en la célula. Las enzimas una vez dentro de la célula la digieren
eliminándola (Figura 1). Tras la incubación con DNasa + trypsin las células que
restan en la muestra son solamente las células vivas, que poseían membranas
íntegras.
Blank sample
1000 1000
Eukaryotic
800 800
400 400
Prochlorophytes Beads
200 200
0 0
0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000
SSC FL2
400 400
Prochlorophytes Beads
200 200
0 0
0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000
SSC FL2
Figura 2. Scatter Plot del Citometro FACSCalibur de los blancos y las muestras tras aplicar
el CDA, en una muestra del Atlantco Tropical mostrando las señales de las poblaciones
de Synechococcus, Prochlorococcus y de pico-Eucariotas.
372
Además, tras el CDA las células vivas permanecen intactas, de forma que
mantienen sus propiedades morfológicas, ópticas y su fluorescencia natural,
siendo fáciles de identificar utilizando un citometro de flujo (Figura 2). La ventaja
del CDA es que al no utilizar tinciones, las señales de fluorescencia roja (FL3),
naranja (FL2) o verde (FL!) de las células vivas permanecen similares a las de las
poblaciones sin tratar, resultando inequívoca su identificación y cuantificación.
6. Equipamiento necesario
Citómetro de flujo
Baño seco
Vortex
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
373
Las soluciones de enzimas después de preparadas deben filtrarse por 0.2 µm,
distribuirse en alícuotas de pequeño volumen (ej. 2-5 ml) y guardar congeladas a -
20 o -25ºC hasta su uso.
2 MUESTRA 2 BLANCOS
Incubación durante 15
minutos a 35ºC
Añadir 0.2 ml de
solución Trypsin
Medida directa en
citómetro
Incubación durante 30
minutos a 35ºC
Parar la reacción
aplicando los tubos de
hielo
374
11. Calculo de los resultados.
- Dejar a temperatura ambiente unos minutos, tanto las muestras que acaban de
incubar a 35ºC, como las que han estado en hielo para detener las reacciones
enzimáticas. Este procedimiento conviene antes de leerlas en el citometro de
flujo para no alterar la viscosidad de la muestra que puede alterar un poco la
velocidad del flujo, y también para evitar en poblaciones de Prochlorococcus,
que su señal de SSC (Side Sacttering) puede variar si las muestras estan frias (baño
de hielo).
13. Referencias
375
Alonso-Laita, P., S. Agustí (2006) Contrasting patterns of phytoplankton
viability in the subtropical NE Atlantic Ocean. Aquatic Microbial Ecology 43: 67-78.
Darzynkiewicz Z, Li X, Gong J (1994) Assays of cell viability: Discrimination of
cells dying by apoptosis. In: Darzynkiewicz Z, Robinson JP, Crissman HA (eds)
Methods in cell biology. Academic Press, San Diego, p 5-38
Ellis RE, Yuan J, Horvitz HR (1991) Mechanisms and functions of cell death.
Annual Review of Cell Biology, 7: 663-698
Lasternas, S, S Agustí, CM Duarte (2010) Phyto- and Bacterioplankton
abundance and viability across the Mediterranean Sea. Aquatic Microbial
Ecology, In revision.
Llabrés M, S Agustí. 2008. Extending the Cell Digestion Assay to Quantify
Dead Phytoplankton Cells in Cold and Polar Waters. Limnology and
Oceanography: Methods 6: 659–666.Agustí, 2008
Wyllie AH, Kerr J.F.R., Currie AR (1980) Cell death: the significance of
apoptosis. International Review of Cytology, 68: 251-306
376
1. Técnicas analíticas.
2. Título.
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
Baño seco
Pipeta automática volumen variable 1-5 ml
Pipeta multidispensadora
Vortex
Espectrofluorimetro:
Se utilizara el equipo del Hesperides, Perkin Elmer LS . Se opreda desde el
ordenador y para colocar la cubeta debe abrirse la puerta azul situada en la
parte delantera del aparato (ver esquema).
377
En el escritorio del ordenador se selecciona el programa FL WinLab.
378
la puerta y se hace click sobre el semaforo, que pasa de verde a rojo mientras
hace la lectura, cuyo valor aparece en el recuadro negro situado a la derecha
de Intensity (en letras rojas). Se toma nota de la lectura, y se cambia la muestra,
que se vuelve a leer siguiendo el mismo procedimeinto hasta completar todas las
profundidades/replicas. Una vez finalizadas la smeustras, se cuantiifca la
intensidad de la fluorescencia del standard de fluoresceina.
379
7. Reactivos u otro material fungible
Reactivos.-
Solución 2 mM de FDA (fluoresceina-di-acetato, 0.0416 gr en 50 ml Acetona
100%)Solución 20 mM de EDTA (0.3724 gr en 50 ml agua destilada)
Fluoresceina, para calibración (ALDRICH ref# 16.630-8, MW = 376.28)
Soluciones I, II y III del medio F/2
Acido cloridrico para lavado
Material Fungible.-
Pipetas pasteur
Jeringas y Millex 0.2 µm
Tubos 15 ml (100)
Gradillas
Botes vidrio 1 L (2) y 250 ml (4)
cubetas 1 cm todos los lados claros
8. Calibración
La actividad esterasa disuelta se cuantifica como la concentración de
fluoresceína liberada en las muestras por unidad de tiempo (a 20ºC, y durante
una hora de incubación en nuestro caso). Se prepara una solución standard se
fluoresceina que debe medirse debe medirse ene le estectrofluorimetro tras cada
serie de medidas. El standard de fluoresceína se prepara en agua destilada en
concentraciones de 10 nM a 1000 nM. El standard a oscuras y refrigerado es
estable durante meses.
9. Descripción de la Técnica
380
10. Cuadro sinóptico de la técnica
381
Ec. 1
EA o
Ln ( )
EA t
µ(loss) EA (h -1 ) =
t Ec. (2)
Ec. (4)
y la tasa de lisis del fitoplancton (µL) se calcula, usando Ec. (1), remmplazando
PEAt por PEAo - EA(Prod.)
Ec. (5)
382
12. Control de calidad
13. Referencias
Agustí, S., Satta, M.P., Mura, M.P. and E. Benavent. 1998. Dissolved esterase activity
as tracer of phytoplankton lysis: Evidence of high phytoplankton lysis rates in the
NW Mediterranean. Limnology and Oceanography 43: 1836-1849.
van Boekel, W.H.M., Hansen, F.C., Riegman, R., Back, R.P.M., 1992. Lysis-induced
decline of a phaeocystis spring bloom and coupling with the microbial foodweb.
Mar Ecol Prog Ser 81, 269-276.
383
1. Técnicas analíticas
Lubián Chaichío, L. M.
Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía (CSIC)
5. Conceptos generales
La citometría de flujo es una técnica diseñada para analizar las señales ópticas
producidas al incidir sobre cada célula uno o más haces de luz láser a una
determinada longitud de onda. La sucesión de células a través de los haces de
luz se consigue mediante un sistema de fluidos en régimen laminar coaxial. Las
señales son fundamentalmente de dos tipos: dispersión de la luz, indicadoras del
tamaño y la estructura celulares, y la emisión de fluorescencia producida por los
propios componentes celulares o de compuestos añadidos para caracterizar
moléculas específicas de la célula.
6. Equipamiento necesario
Se prevé que el BIO Hespérides esté equipado para esta campaña al menos de
un citómetro de flujo FACScalibur (Beckton-Dickinson) provisto de un láser de
argón de 488 nm y un diodo rojo de 633 nm de longitudes de onda de excitación.
Agua MilliQ
Fijadores Paraformaldehido y/o Glutaraldehido
384
durar 3 días), añadir 100 ml de PBS (solución tampón de fosfato). El PBS se prepara
con 1 pastilla de Sigma P4417 disuelta en 200 ml de agua MilliQ. Añadir 20 ml de
glutaraldehido al 25%. Filtrar a través de un filtro de policarbonato de 0.2 µm.
¡OJO!: El aparato de filtración utilizado no podrá usarse ya para otra cosa.
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
Un ejemplo de las profundidades a las que se pueden tomar las muestras puede
ser (m): 5 – 10 – 25 – 50 – 75 – 100 – 130 – 160 – 200 y DCM.
385
señal se utiliza para analizar señales fluorescentes procedentes de fluorocromos
añadidos para marcar las células, ya que éstas no poseen compuestos
fluorescentes a estas longitudes de onda.
· FL2 (fluorescencia en el intervalo de 585±20 nm de longitudes de onda), que en
células del fitoplancton va a corresponder a la fluorescencia debida a la
ficoeritrina.
· FL3 (fluorescencia a ≥ 635 nm de longitud de onda), que en corresponde a la
fluorescencia debida a la clorofila
· FL4 (fluorescencia en el intervalo de 669±16 nm de longitudes de onda), que
corresponde a la fluorescencia debida a la ficocianina, si bien hay que tener en
cuenta que interfiere la fluorescencia de la clorofila.
Los “settings” a utilizar suelen ser de dos tipos ya que es difícil abarcar todos los
tamaños, uno para caracterizar las poblaciones del nanofitoplancton y otro para
las del picofitoplancton y que se podrían denominar como “nanosetting” y
“picosetting”, respectivamente. Como en esta campaña se van a usar dos
citómetros del mismo modelo, uno adquirido recientemente y el otro adquirido
hace años, hay notables diferencias en las intensidades de las señales, por lo que
hay que utilizar settings distintos, al menos para en nanofitoplancton.
nanosetting picosetting
Citómetro Citómetro
antiguo nuevo
FSC E01 E01 E00
SSC 300 225 550
FL1 660 660 752
FL2 580 450 705
FL3 400 270 625
FL4 550 300 705
Threshold 52 52 100
386
El tiempo de adquisición puede variar dependiendo de la concentración de
células entre 5 y 10 minutos. En aguas oceánicas oligotróficas se utilizaría un
tiempo de 10 minutos. El número de células analizadas estará comprendido entre
1000 y 20000.
387
4.- Conviene abrir dos ventanas más “Acquire – Counters” para saber en cada momento el régimen
de recuento de partículas, y “Cytometer” – “Status” para saber el estado del láser principal y los
contenedores de fluidos.
389
7.- Antes de analizar la muestra se
debe pulsar el la barra “Acquire –
Acquisiton & Storage” y se abrirá una
ventana en el que tendremos la opción
de escoger entre analizar la muestra
por tiempo de adquisición o por
número de eventos. Lo normal en el
análisis del fitoplancton es escoger la
primera opción. Para ello, señalamos
en “Collection Criteria” la opción
“Event Count or Time” por lo que
estaremos obligados a poner un
número de eventos en la casilla
correspondiente muy alto para
asegurarnos de que el tiempo
transcurrido en el análisis no se vea
interrumpido por la barrera del número
de eventos. El tiempo de adquisición
depende de la riqueza del fitoplancton,
como se ha señalado anteriormente
(entre 5 y 10 minutos).
390
11. Cálculo de los resultados.
Una vez obtenidos los citogramas, debemos identificar las distintas poblaciones y
marcarlas (opciones en la barra de tareas de la izquierda). Los distintos parámetros
estadísticos se obtienen en la opción “Stats” y se pueden exportar (picar en “File –
Export Statistics”) y pasarlo a un archivo excel.
Sabiendo el número de eventos registrados para cada población, el tiempo de
adquisición de muestra y el flujo utilizado, se calcula la densidad de células
existentes en cada caso.
391
nano y picofitoplancton procedentes de cultivos y nos pueden servir de
patrones, en particular del tamaño de las poblaciones analizadas procedentes
de muestras naturales. Las especies de referencia pueden ser las siguientes:
Synechococcus sp., Nannochlororis oculata, Nannochloropsis gaditana,
Isochrysis galbana, Chaetoceros gracilis, Rhodomonas salina, Tetraselmis
suecica y Gyrodinium sp.
13. Referencias
Collier, JL Flow cytometry and the single cell in phycology Journal of Phycology, 36 (4):
628-644. 2000.
Marie, D., Simon, N. and Vaulot, D. Phytoplankton cell counting by flow cytometry. In Algal
culturing techniques, vol. 27 (ed. R. Andersen), pp. 253-267: Academic Press. 2005.
Rodríguez, J., Blanco, J.M., Jiménez-Gómez, F., Echevarría, F., Gil, J., Rodríguez, V., Ruiz, J.,
Bautista, B., Guerrero, F. Patterns in the size structure of the phytoplankton
community in the deep fluorescence maximum of the Alboran Sea (southwestern
Mediterranean). Deep-Sea Research I 45, 1577–1593. 1998.
392
BLOQUE 6
393
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
5. Conceptos generales
Las bacterias aeróbicas anoxigénicas fototróficas (AAPs)
constituyen un grupo de microorganismos mixotróficos que contienen
bacterioclorofila a (Bchla). Aunque no son capaces de fijar CO2, estos
organismos pueden utilizar la luz para generar ATP lo que les aporta una
ventaja ecológica frente a otros heterótrofos cuando la disponibilidad
de C orgánico es limitada. Sin embargo, su relevancia en el océano no
está del todo clara. Durante la expedición Malaspina se recogerán
muestras para estudiar la abundancia de estos microorganismos
mediante microscopia de infrarojo (AAP-DAPIs) y para medir la
concentración de Bchla mediante HPLC (High-performance liquid
chromatography).
6. AAP-DAPIs:
394
• Pipetas
• Sistema de filtración (torre de filtración y bomba de vacío)
• Microscopio de epifluorescencia con cámara y filtros sensibles al
infrarojo
• Pinzas
• Tubos Falcon de 15 mL
• Solución de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)
• Aceite de inmersión
• Formaldehído (37%)
• Filtros de policarbonato blancos de 0.2 µm de tamaño de poro
• Filtros de acetato de celulosa de 0.8 µm de tamaño de poro
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Puntas de pipeta estériles
• Cajas para guardar portaobjetos
6.3. Descripción de la Técnica
395
microscopio tiene que estar adaptado con 3 sets de filtros: (1) DAPI, (2)
Clorofila, y (3) Infrarojo.
-Se tomarán 3 imágenes de fluorescencia con una cámara que permita
el paso del infrarojo (B/W CCD camera F-ViewII).
-Primero, se tomará una imagen en la parte azul del espectro de luz con
una exposición de 100–200 ms, para calcular el número total de
bacterias (DAPI).
-Segundo, se tomará una imagen en la parte roja, con 0.5-1 segundo
de exposición para calcular las células que emiten autoflorescencia
debido a la clorofila (Chla).
-Por último, se capturará una imagen en el infrarojo (10 s exposición)
para calcular tanto la presencia de bacterioclorofila (Bchla) como
clorofila.
-Mediante un programa de análisis de imagen (Cell F, Olympus) se
sobreponen las tres imágenes para componer una sola. Ésta nos permite
distinguir las células que tienen Bchla de las que tienen Chla, y obtener
recuentos del número total de bacterias, picocianobacterias (Chla) y
AAPs (células que emiten en el IR pero no en canal de la Chla).
-Se contarán entre 500-1000 células en un mínimo de 10 imágenes
distintas, y teniendo en cuenta el volumen de muestra filtrado y el área
de filtro contada se calcula la concentración bacterias totales,
picocianobacterias y de AAPs en la muestra original.
7. Bchla:
• Probeta
• Botella Nalgene de 2L
• Sistema de filtración (torre de filtración y bomba de vacío)
• Sistema de cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC)
396
• Pinzas
• Filtros de fibra de vidrio de 47 mm de diámetro (GF/F)
• Papel aluminio
• Metanol
• Acetato de tetrabutilamonio
• Papel secante
• Tubos de 5 ml
8. Referencias:
Koblízek M, Mazín M, Ras J, Poulton AJ, Prásil O (2007) Rapid growth rates
of aerobic anoxygenic prototrophs in the ocean. Environ Microbiol
9:2401-2406.
397
applications to the isolation and analysis of phytoplankton pigments. J
Chromatogr A 910:31–49.
398
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
Concentración de biomasa de picoeucariotas, bacterias y virus marinos
para la extracción de ácidos nucléicos
5. Conceptos generales
Los microorganismos median procesos críticos para el funcionamiento
de los ecosistemas marinos y comprenden la mayor parte de la biomasa
presente en los océanos. También sabemos que las bacterias marinas (y
en general los microorganismos marinos) encierran una enorme
diversidad, pero su pequeño tamaño, resulta imposible distinguirlos por
su morfología. Es por esto que desde los inicios de la microbiología, se
han usado otros criterios para su identificación como la capacidad de
metabolizar determinados compuestos. Estas técnicas clásicas de
identificación requieren el establecimiento de cultivos puros, y dado
que la mayor parte de las bacterias marinas no pueden cultivarse aún,
no son adecuadas para determinar la diversidad de una muestra
natural. Actualmente los métodos preferidos para determinar la
diversidad de las comunidades procarioticas marinas se basan en la
determinación de diferencias en la secuencia de uno o más genes,
normalmente el gen del ARN ribosómico 16S.
De forma similar, la estructura de las comunidades de picoeucariotas o
virus se basa en análisis moleculares adaptados para estos grupos.
Por otro lado el análisis del ARN presente en una muestra de agua
natural puede dar importantes indicaciones sobre la actividad de los
microorganismos presentes. Dada su corta vida, el ARN mensajero
refleja la expresión genética en tiempo real, de esta manera se puede
identificar la actividad determinados genes asociados a procesos de
interés biogeoquímico y en algunos casos la identidad de los
microorganismos implicados. El ARN ribosómico también puede utilizarse
como indicador de los tipos de procariotas potencialmente más activos
a nivel metabólico. Además del análisis de un gen o genes en
Malaspina abordaremos una estrategia también genómica mediante la
399
realización del metagenoma (secuenciación parcial de los genes
inherentes en una comunidad microbiana) y del metatranscriptoma
para ver la diversidad funcional de dicha comunidad.
6. Equipamiento necesario
400
rápido de ARN para realizar screeening funcional y metatranscriptómica
(metaT). También utilizaremos este sistema para la recolección de virus
precipitados con FeCl3.
Este sistema consta de una bomba peristáltica y dos soportes de
filtración de 142mm de diámetro.
Material de plástico:
• Garrafas 12 X 20L . Para la toma de muestras de ADN para
metagenómica.
• Garrafas 4X10L y 4X 20L: Para las muestras de ADN/ARN de
pequeño volumen y concentrado de virus (20L).
• Puntas de pipeta, tubos de centrífuga de 2, 15 y 50 ml.
Filtros:
Picoeucariotas y procariotas:
1)Para el sistema de filtración de pequeño volumen (4 cabezales):
• filtros de policarbonato de 47mm de diámetro y 3µm de tamaño
de poro
• filtros de policarbonato de 47mm de diámetro y 0,22µm de poro
2) Para el sistema de filtración de gran volumen:
• Filtros de policarbonato de 142mm de diámetro y 3 µm de poro
• Filtros de Millipore Express de 142mm de diámetro y 0,22 µm de
poro
• Filtros de policarbonato de 142mm de diámetro y 0.8 µm de poro
• Filtros de policarbonato de 142mm de diámetro y 0.22 µm de poro
Concentración de Virus:
• Filtros de policarbonato de 142mm de diámetro y 1µm de poro
• Filtros de soporte Pall Supor-800 filter (cat.no.60114; 142mm, 0.8µm).
401
Reactivos:
• RNALater™ : Solución comercial (Ambion)
• Solución de FeCl3 para la precipitación de virus.
(Protocolo todavía no publicado cortesía de Matt Sullivan, Arizona
University (US) colaboración con ICM)
Solución stock 10g Fe/L
FeCl3-6H2O (FW=270.3) 4.83g
Q-water 100ml
Preparar en tierra y almacenar a 4oC o temperatura ambiente.
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
Procedimiento
-Tomar las muestras de la roseta, utilizando una malla de 200µm a la
salida de la botella.
-Ajustar una malla de 20µm en el tubo de toma de muestra del sistema
de filtración de grandes volúmenes. Colocar un filtro de policarbonato
de 142 mm de diámetro y 3µm de tamaño de poro en el portafiltos
(OVNI) más cercano a la bomba peristáltica y otro filtro (Millipore Express
plus) de 142 mm de diámetro y 0.22 µm de tamaño de poro en el
siguiente portafiltros.
-Comenzar la filtración purgando el aire del sistema mediante los
tornillos de purga de ambos portafiltros.
402
-Filtra la muestra tan rápido como sea posible, pero manteniedo la
presión por debajo de los 13-15 psi, tiempo máximo de filtración 15 min.
-Recoge el volumen filtrado en una garrafa limpia para la
concentración de biomasa vírica (comprobar necesidades con la
persona a cargo de los virus).
Procedimiento:
-Tomar las muestras de la roseta y mantenter en hielo o en nevera hasta
el momento de la filtración. La prioridad son las muestras de ARN, pero
la filtración de estas muestras no debería demorarse más de uin par de
horas.
-Prepara el sistema de bombeo con una malla de 20µm en la entrada el
tubo, un filtro de policarbonato de 3µm de poro en el portafiltros más
cercano a la bomba peristáltica y otro de 2µm de poro en el siguiente
portafiltros.
-Comenzar la filtración purgando el aire del sistema mediante los
tornillos de purga de ambos portafiltros.
- Mantener la tasa de filtración a unos 50-100 ml min-1 (puede llevar una
hora)
403
Filtración de ADN para metagenómica (120-240L)
Procedimiento
-Tomar las muestras de la roseta, utilizando una malla de 200µm a la
salida de la botella, se tomarán >=100L de muestra siempre que sea
posible. Como no es posible comenzar la filtración inmediatamente ya
que primero hay que filtrar las muestas de ARN para
metatranscriptómica, se intentará mantener las muestras en hielo o
nevera.
-Ajustar una malla de 20µm en el tubo de toma de muestra del sistema
de filtración de grandes volúmenes. Colocar un filtro de policarbonato
de 142 mm de diámetro y 0.8 µm de tamaño de poro en el portafiltos
(OVNI) más cercano a la bomba peristáltica y otro filtro (Millipore Express
plus) de 142 mm de diámetro y 0.22 µm de tamaño de poro en el
siguiente portafiltros. Tener en cuenta que los 0.22 µm de Millipore
Express Filter y los de policarbonato de 0.22 µm SON DISTINTOS y se usan
para análisis distintos.
-Comenzar la filtración purgando el aire del sistema mediante los
tornillos de purga de ambos portafiltros.
-Filtra la muestra tan rápido como sea posible, pero manteniedo la
presión por debajo de los 13-15 psi. Si la tasa de filtración disminuye,
cambia de filtros (máximo dos filtros de cada tamaño de poro por
muestra). Los filtros del mismo tamaño de poro se almacenan juntos en
el mismo tubo de 15 mL. Para los filtros Express Filter guardarlos en un
tubo de 50 mL.
-Recoge el volumen filtrado en varias garrafas limpias para la
concentración de biomasa vírica.
404
Concentración de virus para metagenómica
Procedimiento:
-Tomar 80 L (cuatro garrafas de 20L) de agua filtrada por 0.22µm
procedentes de la filtración para metagenómica.
-Añadir 2 mL de la solución de FeCl3 y agitar vigorosamente.
-Dejar reposar durante al menos una hora a temperatura ambiente (o
toda la noche a 4ºC).
-Filtrar utilizando el sistema de filtración de grandes volúmenes. En este
caso se utilizará sólo un porta filtros equipado con dos filtros, primero
pondremos un filtro de soporte (Pall Suppor 142mm diámetro, 0.8µm
tamaño de poro) y directamente encima de este un filtro de 142mm de
policarbonato y 1µm de tamaño de poro.
-El precipitado se acumulará sobre el filtro de policarbonato. Cuando
baje la velocidad, se cambiará sólo el filtro de policarbonato (no es
necesario cambiar el filtro de soporte) y se almacenará en un tubo de
centrífuga de 50mL teniendo especial cuidado de no perder nada del
precipitado. Serán necesarios unos tres filtros por cada 20L, que se
pueden almacenar juntos en el mismo tubo, en total cuatro tubos
conteniendo 3 filtros cada uno. Los tubos conteniendo los filtros con el
precipitado se almacenarán a 4ºC.
-Es muy importante limpiar bien (con agua) todos los restos de
precipitado al acabar la filtración, ya que si no se hace quedarán
manchas muy difíciles de limpiar al día siguiente.
405
Figura 3 Cuadro sinóptico filtración ADN pequeños volúmenes
406
Figura 4. Cuadro sinóptico filtración ARN para metatranscriptómica
407
(Malla 200µm) Bomba peristáltica Filtrar a 11-13 psi máximo
Malla 20µm
Filtro 142 mm ø Filtro 142 mm ø
0.8 µm poro 0.22µm poro
Muestra
~100 L
! !
Filtrado
Guardar filtros en tubos 50mL
Añadir 10 mL RNALater
Congelar en N2 líquido
-20ºC
-80ºC
Almacenar a -20ºC Almacenar a -80ºC
Figura 5. Cuadro sinóptico filtración ADN para metagenómica (UTILIZAR EXPRESS PLUS
FILTER DE 0.22 um)
408
Figura 6. Cuadro sinóptico concentración de virus para metagenómica
409
11. Calculo de los resultados.
Expresiones matemáticas, cambio de unidades, macros en Excel.
No hace falta
13. Referencias
410
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Técnicas analíticas
2. Titulo de la técnica
Determinación de la diversidad funcional del bacterioplancton marino
5. Conceptos generales
Las bacterias heterotróficas juegan un papel fundamental en los
procesos biogeoquímicos de los ecosistemas acuáticos, ya que son los
consumidores principales de la materia orgánica disuelta (DOM). La
disponibilidad de esta DOM y su composición influyen enormemente en
la actividad del bacterioplancton y en la diversidad filogenética (Eiler et
al 2003), y pueden influir también sobre la diversidad funcional de la
comunidad microbiana.
El ensayo de la utilización de fuentes de carbono de la materia
orgánica se ha hecho generalmente mediante cultivos de
enriquecimiento en los que se ofrece un nutriente y se monitoriza los
cambios en la producción y/o en la concentración bacteriana durante
la incubación. Sin embargo, estos experimentos son laboriosos y
permiten el ensayo de un número limitado de substatos. Las placas
Biolog representan una miniaturización de éstos enriquecimientos y, de
manera muy simple permiten el ensayo de la utilización de casi un
centenar de substratos simultáneamente. Aunque las placas Biolog
fueron inicialmente creadas para la identificación de microorganismos
de interés médico, Garland and Mills (1991) propusieron el uso de las
placas Biolog para determinar la diversidad funcional de
microorganismos en muestras ambientales, basándose en los perfiles de
utilización de fuentes de carbono. Desde su aplicación en muestras
naturales, las placas Biologs han sido una herramienta muy útil para
detectar diferencias en la utililzación de fuentes de carbono por las
comunidades microbianas. Aunque su principal aplicación ha sido en
ecosistemas terrestres (ver revisión en Preston-Mafham et al. 2002), su
espectro de aplicación en ecosistemas acuáticos abarca ambientes
tan distintos como lagos (Grover & Chrzanowski 2000), ríos (Sinsabaugh
and Foreman 2001)y distintos ecosistemas marinos como el Mar
411
Mediterráneo (Sala et al. 2005a, 2006), el océano Antártico (Sala et al.
2005) o el océano Ártico (Sala et al. 2008, 2011)
Las placas generalmente más utilizadas han sido, junto a las Biolog-Eco,
las placas Biolog-GN2 que permiten el ensayo simultáneo de 96 fuentes
de carbono. Estas placas están principalmente indicadas para el
ensayo del uso de monómeros. Por ello, durante la campanya
Malaspina prentendemos ampliar el abanico de fuentes testadas
mediante el uso de placas MT para crear las placas Ocean (Fernández-
Gómez et al. Submitted). Las placas MT no incluyen ningún tipo de
substrato y éstos se añaden en función de las necesidades particulares.
En ocasión de la campaña Malaspina, las placas Ocean permitirán el
ensayo de 8 fuentes de carbono adicionales que han sido elegidas por
su especial relevancia en los ecosistemas marinos y/o profundos:
bicarbonato, DMSP, D-asparagina, un pentapéptido de alanina,
almidón, celulosa, quitina, ATP.
Tanto en las placas GN2 como en las placas Ocean, a medida que las
bacterias de la muestra crecen en cada uno de los pocillos, éstas van
oxidando cada substrato y se va formando NADH. El producto reducido,
formazán insoluble, aparece en forma de color púrpura que puede
medirse fotométricamente. El patrón resultante es función de la
comunidad original inoculada en los pocillos.
6. Equipamiento necesario
El equipamiento necesario es un lector de placas de absorbancia y un
ordenador con el programa.
8. Calibración
En las placas Biolog, uno de los pocillos no contiene substrato, y sirve
como blanco con el comparar los valores de absorbancia de los
substratos.
9. Descripción de la Técnica
El primer paso consiste en la preparación de las placas Ocean: placas
Biolog-MT a las que añadiremos 30 ul de 8 diferentes substratos
(concentración final 10 mM): bicarbonato, DMSP, D-asparagina, un
pentapéptido de alanina, almidón, celulosa, quitina, ATP.
Las placas son inoculadas mediante la adición de un volumen de
muestra en cada pocillo de 120 ul en las Ocean, y 150 ul en las GN2.
Una vez inoculadas, las placas se incuban en la oscuridad a
temperatura cercana a la in situ y se mide la absorbancia regularmente
412
a 590 nm con el lector de placas. Tras substraer los datos de
absorbancia del blanco, los datos serán utilizados tanto para análisisis
multidimensionales para el estudio de la diversidad como para el
estudio detallado de utilización de cada uno de los substratos.
12. Referencias
413
bacterioplankton during Alexandrium spp blooms. FEMS Microbiol. Ecol
54:257-267
Sala MM, Estrada M, Gasol JM (2006) Seasonal changes in the functional
diversity of bacterioplankton in contrasting coastal environments of the
NW Mediterranean. Aquat Microb Ecol 44:1-9
Sala MM, Terrado R, Lovejoy C, Unrein F, Pedros-Alio C (2008) Metabolic
diversity of heterotrophic bacterioplankton over winter and spring in the
coastal Arctic Ocean. Environ Microbiol 10:942-949
Sala MM, Arrieta JM, Boras JA, Duarte CM, Vaque D. (2011). The impact
of ice melting on bacterioplankton in the Arctic Ocean. En prensa en
Polar Biology
414
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
Incorporación de bromodeoxiuridina en ADN microbiano para la
detección de filotipos activos
3. Autores del documento y filiación
Jesús M. Arrieta (IMEDEA)
4. Finalidad. Campo de aplicación
El objetivo de esta técnica es el marcaje de microorganismos en
crecimiento activo, es decir capaces de replicar su ADN. Para ello se
introduce un análogo de la timidina (Bromodeoxiuridina) que será
incorporado en lugar de esta durante la replicación del ADN. La
bromodeoxiuridina incorporada en el ADN puede ser detectada
posteriormente utilizando anticuerpos específicos, que a su vez pueden
ser unidos a un soporte paramagnético de forma que el ADN sintetizado
durante el experimento puede ser inmovilizado mediante el uso de un
imán. De esta manera se puede separar el material genético de los
microorganismos que replicaron su ADN durante el experimento de
marcaje y para su posterior identificación.
5. Conceptos generales
En este protocolo se define solamente el tratamiento de las muestras a
bordo del buque. Dado que la finalidad última es la detección de los
microorganismos activos en la muestra, el proceso de incubación ha de
comenzarse inmediatamente, manteniendo las muestras a una
temperatura lo más cercana a la original en todo momento. El proceso
es sencillo, consiste en añadir bromodeoxiuridina a las muestras en una
concentración final 40nM, incubar las muestras a la temperatura original
a la que se tomó la muestra y finalmente recolectar la biomasa
utilizando los mismos sistemas de filtración que se utilizaron para la
recolección de ADN o ARN.
La bromodeoxiuridina es un mutágeno potencial, como la mayoría las
sustancias que interactúan con el ADN. Las rutas de entrada en el
cuerpo son la respiración del producto en polvo y la ingestión.
Para prevenir la exposición accidental será suficiente con utilizar
guantes y bata y mantener las precauciones habituales a la hora de
trabajar en el laboratorio (no comer ni beber). También es importante
mantener el área de trabajo limpia, limpiando los derrames
accidentales con papel absorbente seguido de agua y jabón.
6. Equipamiento necesario
• Contenedor de plástico para mantener la muestra durante la
incubación (5L).
415
• Incubador(es), tantos como temperaturas diferentes se muestreen
a la vez.
• Bomba peristáltica con filtros en línea
• Contenedor para residuos
7. Reactivos u otro material fungible
• Filtros de policarbonato de 47 mm de diámetro.
3.0µm de tamaño de poro
0.22 µm de tamaño de poro
• Solución de bromodeoxiuridina (10mM). Almacenada a -20ºC a
largo plazo (meses) o a 4ºC a corto plazo (días).
• Guantes.
8. Calibración
No procede
9. Descripción de la Técnica
1. Preparación del material
Todo el material en contacto con la muestra se limpia primero con
agua destilada para eliminar restos de sal y después por inmersión
en una solución de lejía(10% de la solución comercial) durante al
menos 30 minutos.
Justo antes del muestreo se eliminan los restos lejía enjuagando
con un pequeño volumen de muestra.
2. Toma de muestras
La toma de muestras se hará directamente de la válvula de la
botella del CTD o utilizando un tubo de silicona previamente
tratado con lejía como se describe en el punto 1. Las muestras se
deben mantener en todo momento a la temperatura original
para evitar cambiar el ritmo de crecimiento de las poblaciones
microbianas.
3. Después de tomar la muestra, y tan rápido como sea posible, se
añadirá la bromodeoxiuridina a una concentración final de 40nM.
(4µL por litro de muestra). Las muestras se incuban a la
temperatura original durante 8-10 h en el caso de muestras de
superficie (hasta 100 m) y durante 24-30h en el caso de las
muestras de profundidad. No es necesario ser extremadamente
preciso con los tiempos, ya que no es una técnica cuantitativa,
pero en cualquier caso anotaremos el tiempo real de incubación
en el cuaderno de laboratorio.
4. Una vez transcurrido el tiempo de incubación se procederá a
filtrar las muestras utilizando el sistema de filtración secuencial
descrito para la toma de muestras de ADN.
416
5. Prepara el sistema de bombeo con una malla de 20µm en la
entrada el tubo, un filtro de policarbonato de 3µm de poro en el
portafiltros más cercano a la bomba peristáltica y otro de 2µm de
poro en el siguiente portafiltros.
6. Comenzar la filtración purgando el aire del sistema mediante los
tornillos de purga de ambos portafiltros.
7. Mantener la tasa de filtración a unos 50-100 ml min-1.
8. Cuando ta tasa de filtración se ralentice, cambiar el filtro de 3µm,
si no mejora, cambia también el de 0.22µm. Máximo 2 filtros de
cada por muestra (si se hubieran colmatado dos filtros de cada
tipo por muestra, se puede desechar el resto del agua). Si has
usado más de un filtro del mismo tamaño de poro guárdalos
juntos en el mismo criovial. Anotar el volumen filtrado.
9. -Guardar los filtros por separado (0.22µn y 3µm) en 2 crioviales de 2
mL convenientemente identificados, congelar por inmersión en
nitrógeno líquido y almacenar a -80ºC. Estos filtros se guardan en
las cajas de almacenamiento de color rosa para diferenciarlos del
resto.
10. Cuadro sinóptico de la técnica
417
11. Calculo de los resultados.
418
No procede
12. Control de calidad
No procede
13. Referencias
1. Urbach E, Vergin KL, Giovannoni SJ (1999) Immunochemical detection
and isolation of DNA from metabolically active bacteria. Appl Environ
Microbiol 65:1207-13.
419
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
Muestreo para estudio de diversidad del plancton microbiano a partir
de sondas específicas y FISH
Eva Teira
Universidad de Vigo
Marta Varela
Instituto Español de Oceanografía, Centro Oceanográfico de A Coruña
Ramon Massana
ICM
4. Conceptos generales
420
simultáneamente identificar y determinar la abundancia de grupos
taxonómicos de bacterias es la Hibridación In Situ Fluorescente (FISH).
6. Equipamiento necesario
7. Descripción de la Técnica
421
Recogida y fijación de muestras de picoplancton eucariota: Las
muestras se tomarán directamente de las botellas de la roseta en
botellas de 2 L (que se podrán lavar entre muestreo y muestreo). Para
las muestras superficiales (hasta 200 m) se fijarán dos muestras de 95 ml
con 5 ml de formaldehido al 37% libre de partículas (antes del muestreo
se puede filtrar 1 litro por filtros de 0.2 µm de acetato de celulosa de 47
mm). Para las muestras profundas (más de 200 m) se fijarán dos muestras
de 475 ml con 25 ml de formaldehido al 37% libre de partículas.
Mantener la muestra en oscuridad a 4 ºC (en nevera) entre 1-24 h antes
de proceder al filtrado. Las muestras fijadas se filtrarán sobre un filtro de
policarbonato de 25 mm de ø y 0.6 µm de tamaño de poro (dos réplicas
de 100 ml para muestras superficiales; 2 réplicas de 500 ml para muestras
profundas).
422
8. Cuadro sinóptico de la técnica
Formol al 37%
Conservantes: Formaldehído al 37 %.
423
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento _
2. Titulo de la técnica
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
424
• Citómetro de Flujo FACSCalibur de Becton & Dickinson
• Vórtex
• Pipetas para dispensado de muestras
• Bidón de nitrógeno líquido.
• Sonicador
• Crioviales de 2 mL
• Tubos de citómetro
• Tinción SybrGreen I (Molecular Probes), diluída 10x con DMSO (Sigma)
• Nitrógeno líquido
• Solución de bolas de látex amarillas de 1 µm a ca. 108 ml-1
(Polysciences).
9. Descripción de la Técnica
425
- Poner en marcha el citómetro. 10 min después, poner en marcha el
ordenador.
- Poner agua MilliQ en el recipiente de la izquierda (Sheath Fluid). Cargar
la presión. Vaciar el recipiente de “Waste”
- Limpiar el filtro salino de aire.
- “Prime” el sistema (botón de la derecha). Cambiar el tubo, con MilliQ.
- Conectar el programa CellQuest. Buscar la hoja Template Bacteria.
Ponerla en marcha.
- En el menú ACQUIRE, abrie “Connect to cytometer”.
- En el menú CYTOMETER, abrir “Instrument settings”. Buscar el de
Bacterias. Darle a “Set” y luego a “Done”.
- Poner agua MilliQ en un tubo, ponerlo en posición y darle a “Run”. El
botón debe estar en verde. Escoger la velocidad “LOW”. Asegurarse
que sólo pasan < 20 partículas por segundo.
- Standard settings son: FSC: E02, SSC: 400; FL1: 511, FL2: 400, FL3: 590
(threshold a FL1: 72). Acquisition en Log.
- Standard process: 0.4 ml de muestra, a la velocidad LO (~19 µl min-1) y
con 10 µl de una solución a 106 de beads ml-1. Acabar con 10.000
particles o, más o menos, 1-2 minutes.
- Observación con una gráfica de SSC vs. FL1 y otro de FL1 vs. FL3.
- No olvideis de escribir en la libreta el volumen de muestra y de beads
usado, y los tiempos de empezar y terminar.
Proceso:
426
** Controla la velocidad de paso de muestra. Si está por arriba de 800
particles s-1, debereis diluir la muestra con MilliQ.
427
13. Referencias
Allman, R., A.C. Hann, R. Manchee and D. Lloyd. 1992. – Characterization
of bacteria by multiparameter flow cytometry. J. Appl. Bacteriol., 73:
438-444.
Button D.K. and B.R. Robertson. 1993. – Use of high-resolution flow
cytometry to determine the activity and distribution of aquatic bacteria.
In: Kemp, P.F., B.F. Sherr, E.B. Sherr and J.J. Cole, (eds.). Handbook of
methods in aquatic microbial ecology. pp. 163-173, Lewis Pub., Boca
Raton.
Button, D.K., B.R. Robertson and F. Jüttner. 1996. Microflora of a subalpine
lake: bacterial populations, size and DNA distributions, and their
dependence on phosphate. FEMS Microb. Ecol., 21: 87-101.
Davey, H.M. and D.B. Kell. 1996. – Flow cytometry and cell sorting of
heterogeneous microbial populations: the importance of single-cell
analyses. Microbiological Rev., 60: 641- 696.
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cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton
with the green nucleid acid stain SYTO 13. Limnol. Oceanogr.,41:
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Gasol, J.M., J. Felipe. 1999. How to count algae and bacteria with the
FACScalibur flow cytometer. 2nd edition. Dirección web:
ftp.icm.csic.es/pub/gasol/Manuals/FACS/Citometry.html
Gasol, J.M. and X.A.G. Morán. 1999. – Effects of filtration on bacterial
activity and picoplankton community structure as assessed by flow
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Gasol, J.M. & PA. del Giorgio. 2000. Using flow cytometry for counting
natural planktonic bacteria and understanding the structure of
planktonic bacterial communities. Scientia Marina 64: 197-224
Gasol, J.M., U.L. Zweifel, F. Peters, J.A. Fuhrman and Å. Hagström. 1999. –
Significance of Size and Nucleic Acid content Heterogeneity as
measured by Flow Cytometry in Natural Planktonic Bacteria . Appl.
Environ. Microbiol., 65: 4475-4483
Guindulain, T., J. Comas and J. Vives-Rego. 1997. – Use of nucleic acid
dyes SYTO-13, TOTO-1, and YOYO-1 in the study of Escherichia coli and
marine prokaryotic populations by flow cytometry. Appl. Environ.
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Haugland, R.P. 1999. – Handbook of fluorescent probes and research
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Jellett, J.F., W.K.W. Li, P.M. Dickie, A. Boraie and P.E. Kepkay. 1996. –
Metabolic activity of bacterioplankton communities assessed by flow
cytometry and single carbon substrate utilization. Mar. Ecol. Prog. Ser.,
136: 213-225.
428
Lebaron, P., N. Parthuisot and P. Catala. 1998. – Comparison of blue
nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in
aquatic systems. Appl. Environ. Microbiol., 64: 1725-1730.
Lebaron, P., P. Servais, M. Troussellier, C. Courties, J. Vives-Rego, G.
Muyzer, L. Bernard, T. Guindulain, H. Schäfer & E. Stackebrandt. 1999.
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Li, W.K.W., J.F. Jellett and P.M. Dickie, P M. 1995. – DNA distributions in
planktonic bacteria stained with TOTO or TO-PRO. Limnol. Oceanogr.,
40: 1485-1495.
Li, W.K.W., P.M. Dickie, B.D. Irwin and A.M. Wood. 1992. – Biomass of
bacteria, cyanobacteria, prochlorophytes and photosynthetic
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Marie, D., F. Partensky and D. Vaulot. 1996. – Application of the novel
DNA dyes YOYO-1, YOPRO-1 and Picogreen for flow cytometric
analysis of marine prokaryotes. Appl. Environ. Microbiol., 62: 1649-1655.
Robertson B.R. and D.K. Button. 1989. – Characterizing aquatic bacteria
according to population, cell size and apparent DNA content by flow
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Shapiro, H.M. 1995. Practical flow cytometry. Third Edition. Wiley-Liss
Steen, H.B. 1990. –Flow cytometric studies of microorganisms. In: Melamed,
M.R., T. Lindmo and M.L. Mendelsohn (eds.). Flow cytometry and sorting.
2nd. pp. 605-622. Ed. Wiley-Liss Inc., NY
Troussellier M., C. Courties, P. Lebaron and P. Servais. 1999. – Flow cytometric
discrimination of bacterial populations in seawater based on SYTO 13
staining of nucleic acids. FEMS Microbiol. Ecol., 29: 319-330.
Troussellier, M., C. Courties and S. Zettelmaier. 1995. – Flow cytometric
analysis of coastal lagoon bacterioplankton and picophytoplankton :
Fixation and storage effects. Est. Coast. Shelf Sci., 40: 621-633.
Vazquez-Dominguez, E., F. Peters, J.M. Gasol and D. Vaqué. 1999. –
Measuring the grazing losses of picoplankton: Methodological
improvements to the use of fluorescently labeled tracers combined to
flow cytometry. Aquat. Microb. Ecol., 20: 119-128.
Vives-Rego, J., T. Guindulain, E. Vazquez-Dominguez, J.M. Gasol, R.
López-Amorós, D. Vaqué and J. Comas. 1999. – Assessment of the
effects of nutrients and pollutants on coastal bacterioplankton by flow
cytometry and SYTO-13 staining. Microbios, 98: 71-85.
429
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
Ramon Massana
ICM
5. Conceptos generales
430
6. Equipamiento necesario
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
a) Fijar la muestra
- Fijar con 10% glutaraldehido frío (1% concentración final): 4.5 ml
de muestra con 0.5 ml de fijador
- “Flash freeze” los crioviales en nitrógeno líquido
- Guardar los crioviales a -80°C hasta su procesado en el ICM
431
10. Calculo de los resultados.
12. Referencias
Rose, J.M., D.A. Caron, M.E. Sieracki & N. Poulton. 2004. Counting heterotrophic
nanoplanktonic protists in cultures and aquatic communities by flow cytometry. Aquat.
Microb. Ecol. 34:263-277
Zubkov, M.V., P.H. Burkill & J.N. Topping. 2007. Flow cytometric enumeration of DNA-
stained oceanic planktonic protists. J. Plankton Res. 29:79-86
432
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
Estudio de la cuantificación de CID por el plancton procariota
mesopélágico.
Marta Varela
Instituto Español de Oceanografía, Centro Oceanográfico de A Coruña
Eva Teira
Universidad de Vigo
En colaboración con:
Gerhard Herndl
Universidad de Viena
4. Conceptos generales
433
6. Equipamiento necesario
7. Descripción de la Técnica
434
formaldehido al 37% libre de partículas (utilizando una jeringuilla y un
filtro de 0.2 micras desechable) hasta una concentración final del 2-4%.
Formol al 37%
Incubación
Temperatura in situ
14
C-Bicarbonato
435
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Técnica analítica
2. Titulo de la técnica
436
• La utilización de concentraciones diferentes de substrato permite
determinar características cinéticas de los enzimas estudiados,
representadas por los parámetros cinéticos Km y Vmax.
• La técnica implica la utilización de períodos de incubación
variables, a fin de obtener incrementos significativos en el nivel de
fluorescencia de la muestra.
5. Conceptos generales
437
• la actividad β-glucosidasa, que rompe carbohidratos con enlaces
tipo β entre los azúcares, como por ejemplola celulosa. La
actividad de estos enzimas se analizará con el análogo 4-methyl-
umbelliferyl –β-D-glucopyranoside (MUF-G).
• la quitinasa, que hidroliza los enlaces de la quitina, un
polisacárido estructural producido por muchos organismos
marinos. La actividad de estos enzimas se analizará con un
análogo fluorogénico de la quitina, el 4-methyl-umbelliferyl –N-
acetyl-β-D-Glucosamine (MUF-C).
6. Equipamiento necesario
1. Material fungible
o Botellas de muestreo de policarbonato de 500 ml de
capacidad, con tapón.
o Contenedores de policarbonato de 125 ml de capacidad, con
tapa.
o Reservorios para pipeteado multicanal, con tapa.
o Microplacas de 96 pocillos negras con tapa, estériles
o Pipeta automática multicanal de 12 canales de 20-300 μl.
o Pipeta automática multicanal de 12 canales de 5-20 μl.
o Pipetas automáticas en el rango 10-5000 μl.
o Puntas de pipeta estériles.
o Jeringas estériles de 20 ml.
o Filtros de jeringa de baja adsorción proteica, de 0,1 μm de
tamaño de poro, estériles.
438
o Crioviales de 2 y 5ml de capacidad, de rosca externa, estériles.
o Gradillas para crioviales
o Cajas de congelación para crioviales.
o Guantes sin polvo
2. Reactivos
o Agua destilada de calidad MilliQ
o L-leucine-7-amide-4-methyl-coumarin hydrochloride (MCA-L)
o 4-methylumbelliferyl-phosphate (MUF-P)
o 4-methylumbelliferyl-β-D- glucopyranoside (MUF-G)
o 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D- glucosaminide (MUF-C)
o 7-amino-4-methylcoumarinyl (MCA)
o 4-methylumbelliferone (MUF)
o Metanol absoluto
o HCl 35%
439
Preparación: disolver la cantidad correspondiente del
producto en el volumen de metanol absoluto
correspondiente. Agitar hasta su completa disolución.
Añadir la cantidad de agua MilliQ necesaria. Alicuotar
en crioviales y congelar a -20ºC hasta su uso.
MCA‐L MUF‐P
Preparation Preparation
Final conc Final conc
Conc WS Stock 50 MilliQ w Conc WS Stock 10 MilliQ w
in sample Name WS in sample Name WS
(uM) mM (ul) (ul) (uM) mM (ul) (ul)
(uM) (uM)
1000 HC‐Leu 25000 400 400 200 HC‐P 5000 400 400
250 LC‐Leu 6250 100 700 10 LC‐P 250 20 780
MUF‐G MUF‐C
Preparation Preparation
Final conc Final conc
Conc WS Stock 10 MilliQ w Conc WS Stock 10 MilliQ w
in sample Name WS in sample Name WS
(uM) mM (ul) (ul) (uM) mM (ul) (ul)
(uM) (uM)
200 HC‐G 5000 400 400 200 HC‐C 5000 400 400
10 LC‐G 250 20 780 10 LC‐C 250 20 780
440
MCA‐L MUF‐P
Preparation Preparation
Final conc Final conc
Conc WS Stock 50 MilliQ w Conc WS Stock 10 MilliQ w
in sample Name WS in sample Name WS
(uM) mM (ul) (ul) (uM) mM (ul) (ul)
(uM) (uM)
500 C1‐L 12500 300 900 100 C1‐P 5000 300 900
MUF‐G MUF‐C
Preparation Preparation
Final conc Final conc
Conc WS Stock 10 MilliQ w Conc WS Stock 10 MilliQ w
in sample Name WS in sample Name WS
(uM) mM (ul) (ul) (uM) mM (ul) (ul)
(uM) (uM)
100 C1‐G 5000 300 900 100 C1‐C 5000 300 900
MCA MUF
Preparation Preparation
Final conc Final conc
Stock 4.8 MilliQ w Conc WS Stock 2.4 MilliQ w
in sample Name WS Conc WS (uM) in sample Name WS
uM (ul) (ul) (uM) uM (ul) (ul)
(nM) (nM)
96 MCA‐C1 2.4 400 400 48 MUF‐C1 1.2 400 400
24 MCA‐C2 0.6 100 700 12 MUF‐C2 0.3 100 700
6 MCA‐C3 0.15 25 775 3 MUF‐C3 0.075 25 775
o 0 MCA‐C4 0 0 800 0 MUF‐C4 0 0 800
8. Calibración
Para cada muestra de agua analizada, se calibrará la relación entre las
Unidades de fluorescencia y la concentración de los dos productos que
pueden ser generados, en función del sustrato utilizado. Estos dos
productos son MCA y MUF.
Cada calibración generada se aplicará a los resultados específicos de
esa muestra.
Las concentraciones de los dos productos que se utilizarán para las
calibraciones son:
• MCA: 96nM, 24nM, 6nM y 0 nM.
• MUF: 48nM, 12nM, 3nM, 0nM.
9. Descripción de la Técnica
9.1. Muestreo.
Las muestras de agua se recogerán de las botellas Niskin en botellas de
policarbonato lavadas con ácido (HCl 3,5% 24 horas, aclaradas 3 veces
con agua destilada y dos veces con agua MilliQ), de 500 ml de
capacidad. Las botellas estarán previamente identificadas como
“TOTAL SAMPLE”, con el número de estación y profundidad.
Un volumen adecuado de la muestra será filtrado a través de 0,1 μm, a
fin de eliminar todo el material particulado de la misma. El filtrado se
recogerá en una botella identificada como “FILTERED SAMPLE”, con el
número de estación y profundidad.
441
9.2. Preparación de sustratos y productos.
Las soluciones Standing Stock (SS) de los sustratos y productos deben ser
descongeladas a temperatura ambiente. A partir de estas soluciones SS,
se obtendrán volúmenes adecuados de las soluciones de trabajo (WS)
mediante dilución en agua MilliQ. Las soluciones de trabajo se
distribuirán en pocillos de una microplaca denominada “master plate”,
que será mantenida a 4ºC hasta su uso.
442
9.4. Medida de la fluorescencia de la muestra.
Una vez preparada la placa, se realizará la primera medida de
fluorescencia en los pocillos mediante el lector de microplacas Synergy
2. Una vez realizada la medida, las placas se incubarán a la
temperatura adecuada hasta las siguientes medidas de fluorescencia,
que se realizarán al cabo de 12h, 24h y 48 h.
443
• Salvar el experimento con el mismo nombre que la microplaca a
analizar. Salvarlo en la carpeta designada para esa estación.
• En la pantalla aparecerá:
444
10. Cuadro sinóptico de la técnica
445
4. Seleccionar “System Test”. El aparato realiza un autochequeo del
motor, lámpara y varios subsistemas. Tarda unos 3 minutos.
5. Al término del test, aparece en la pantalla un cuadro de diálogo,
requiriendo información adicional. Introducir el nombre del usuario
y cualquier dato que se considere relevante
6. El informe aparece en la pantalla. Dirigirse hacia el final del
informe, donde aparecerá:
a. “System Test Pass”. En test es correcto.
b. “System Test Error: xx error detected”. En este caso,
i. Buscar el tipo de error indicado en el Manual, e
intentar solucionarlo
ii. Repetir el System Test
iii. Si se mantiene el error, contactar conel servicio de
asistencia técnica de Biotek (teléfono 802 655 4740, e-
mail: TAC@biotek.com)
7. Salir de Gen 5.
QC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A LC-L LC-L LC-L LC-L MCA-C1 MCA-C1 MUF-C1 MUF-C1
B LC-P LC-P LC-P LC-P MCA-C2 MCA-C2 MUF-C2 MUF-C2
C LC-G LC-G LC-G LC-G MCA-C3 MCA-C3 MUF-C3 MUF-C3
D LC-C LC-C LC-C LC-C MCA-C4 MCA-C4 MUF-C4 MUF-C4
E
446
f. Clicar el icono Plate 1 (Æ 1) Aparece en la pantalla un
esquema de la placa
g. Clicar el icono “READ” (Æ 3). Escriba cualquier observación
que desee en el diálogo que aparece
h. Clicar “READ”. Se abre la portilla del lector.
i. Colocar la microplaca. Quitar la tapa.
j. Clicar OK
k. Las medidas finalizan cuando la portilla se abre de nuevo.
l. Retirar la microplaca, y colocar su tapa. Cierre la portilla
pulsando el “carrier eject button” dellector.
m. Salvar el experimento (Æ 5)
n. Clicar Power Export (Æ 4), y salvar el archivo Excel resultante
con el mismo nombre que el experimento, y en la misma
carpeta.
En el Excel aparecerá el resultado de tres Tests:
• Test de preparación de sustratos: chequea la correcta
concentración de los mismos. Color verde: OK. Color rojo:
preparación incorrecta, deberían ser preparados de nuevo.
• Test de manipulación de muestras: chequea la correcta
manipulación de las alícuotas. Color verde: OK. Color rojo:
manipulación incorrecta, revisar pipetas, puntas, etc…
• Test de productos: chequea la correcta preparación de los m
ismos. Color verde: OK. Color rojo: preparación incorrecta,
deberían ser preparados de nuevo.
13. Referencias
447
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
Ramon Massana
ICM
5. Conceptos generales
448
picoeucariontes heterotróficos, sólo pueden obtenerse fielmente por
microscopía de epifluorescencia. Ésta es una técnica clásica en
ecología microbiana (Porter & Feig, 1980; Sherr & Sherr 1993) y es
ampliamente utilizada por la mayoría de laboratorios que trabajan en
microbiología marina.
6. Equipamiento necesario
8. Calibración
449
9. Descripción de la Técnica
a) Fijar la muestra
- Fijar con 10% glutaraldehido frío (1% concentración final). En
superficie, 27 ml de muestra y 3 ml de fijador; en mar profundo 180
ml con 20 ml
- Guardar las muestras fijadas a 4°C en oscuridad entre 1-24 horas
antes de preparar los filtros
450
11. Calculo de los resultados.
13. Referencias
Porter, K. G. & Y. S. Feig. 1980. The use of DAPI for identifying and counting aquatic
microflora. Limnol. Oceanogr. 25:943-948.
Rose, J.M., D.A. Caron, M.E. Sieracki & N. Poulton. 2004. Counting heterotrophic
nanoplanktonic protists in cultures and aquatic communities by flow cytometry. Aquat.
Microb. Ecol. 34:263-277
Sherr, E.B. & B.F. Sherr. 1993. Preservation and storage of samples for enumeration of
heterotrophic protists. In: P.F. Kemp, B.F. Sherr, E.B. Sherr & J.J. Cole (eds.), Handbook of
Methods in Aquatic Microbial Ecology, Lewis Publishers, Boca Raton, pp. 207-212
Zubkov, M.V. & G.A. Tarran. 2008. High bacterivory by the smallest phytoplankton in the
North Atlantic Ocean. Nature 455:224-227
451
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento _
2. Titulo de la técnica
5. Conceptos generales
452
6. Equipamiento necesario
• Eppendorfs de 1.2 mL
• Solución de TCA 50% (sigma)
• Solución de leucina radioactiva, a 120-150 mCi mmol-1, llevada a 1 µM
con MilliQ. Esta solución puede diluirse al 10% con MilliQ para ahorrar.
• Tips estériles
• Cajas para material potencialmente radioactivo
• Racks para los eppendorfs
• Solución de TCA al 5%
• Cocktail de centelleo Optisafe HiSafe (Wallac-PerkinElmer)
• Bandejas, bolsas de plástico, etc necesario para trabajar con
radioactividad y guardar los residuos sólidos.
8. Descripción de la Técnica
453
9.1- Recogida de muestra e incubación
- Se toman 6 veces 1.2 ml de la muestra y se depositan en 6 eppendorfs,
marcados con un num, y las letras de la a a la f. Se fijan las réplicas e y f
con 120 µl de la solución de TCA50%.
- Se ponen en cada eppendorf 24 µl de Leucina 1 µM (conc. Final, 20
nM). La solución puede ser “caliente” (sin diluir en MilliQ) o “tibia” diluída
p.ej. 10% en MilliQ.
- Se cierran las muestras y se vortexan.
- Se incuban entre 1 h y 10 horas a la tempreatura in situ. Anotar tiempo
de comienzo de la incubacion y temperatura escogida.
- Terminada la incubación, se pone 120 µl de TCA 50% en las muestras a
a d.
- las muestra se guardan congeladas.
454
Smith & Azam's Leucine method
1 Put 1.2 ml of sample in 6 eppendorfs (labelled a through f)
Add 120 μl TCA 50% to controls (e & f)
Add 40 nM *leucine to all of them (48 μl of 1μM solution)
(add leucine concentration depending on saturation curve)
Vortex
Incubate (1 to 4 h) initial time
Write
{ incubation temp.
amount of leucine added
leucine batch name
sample volume
3 Add 1 mL TCA 5%
Vortex
Spin 10 min. 12000 g
Aspirate
4 Add 1 mL of cocktail
Vortex
Place in 22 mL vial and put to count (Program #3)
mmols Leu L-1 h-1 = (4.5 10-13) * (dpm sample - dpm blank) * (SA)-1 * (T)-1 *
(V)-1
mgC L-1 h-1 = Leu (mmols Leu L-1 h-1) * 131.2 * (%Leu)-1 * (C:Protein) * ID
455
- %Leu proporción de leucina en la proteïna total, se asume que es
0.073 (Simon & Azam 1989).
- C:Prot relación de C a proteína. Se asume que es 0.86 (Simon & Azam
1989).
- ID: Dilución del isótopo. Se asume que es 1 en aguas oligotróficas, y 2
en aguas mesotróficas.
(de Arístegui et al. 2009). Dividir producción por 12 para tenerlo en mols
C.
12. Referencias
Allman, R., A.C. Hann, R. Manchee and D. Lloyd. 1992. – Characterization
of bacteria by multiparameter flow cytometry. J. Appl. Bacteriol., 73:
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Ducklow, H W, Kirchman, D L, Quinby, H L. 1992. Bacterioplankton cell
growth and macromolecular synthesis in seawater cultures during the
456
North Atlantic spring phytoplankton bloom, May, 1989. Microbial
Ecology. 24: 125-144.
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and the incorporation of thymidine, L-leucine, and other substrates by
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production by heterotrophic bacteria. pp. 509-512 In: Kemp, PF, Sherr,
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Appl. Environ. Microbiol. 45: 169-178.
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matter in the subarctic Pacific. Mar. Ecol. Prog. Ser. 62: 47-54
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subarctic Pacific: application to estimating bacterial production. Mar.
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Simon, M and Azam, F.1989. Protein content and protein synthesis rates
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Simon, M, Welschmeyer, N A, Kirchman, D L. 1992. Bacterial production
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Pacific. Deep-Sea Res. 39: 1997-2008
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Microb. Food Webs 6: 107-114.
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(3H)leucine incorporation in Vibrio spp. grown in nutrient limited
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coastal marine environments using leucine: application of a kinetic
Approach to correct for isotope dilution. Mar. Ecol. Prog. Ser. 102: 97-
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Wicks, R J, Robarts, R D. 1988. Ethanol extraction requirement for
purification of protein labeled with [3H]Leucine in aquatic bacterial
production studies. Appl. Environ. Microbiol. 54: 3191-3193.
458
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestro
2. Titulo de la técnica
Respiración mediante cambios in vitro de la concentración de O2
3. Autores del documento y filiación
Ignacio P. Mazuecos e Isabel Reche. Departamento de Ecología
Facultad de ciencias, Universidad de Granada.
Javier Arístegui. Instituto de Oceanografía y Cambio Global, Universidad
de Las Palmas de Gran Canarias.
Evaristo Vázquez-Domínguez* y Josep M. Gasol. Departamento de
Biología Marina y Oceanografía, Instituto de Ciencias Marinas – Centro
Mediterráneo de Investigaciones Marinas y Ambientales (ICM-CMIMA),
CSIC.
Eva Ortega-Retuerta Laboratoire d’Oceanographie Microbienne,
Banyuls/mer (France).
4. Conceptos generales
Fotosíntesis ->
6CO2 + 6H20 <-> [C6H12O6] + 6O2
<- Respiración
459
5. Finalidad. Campo de aplicación
Aunque la determinación de oxígeno disuelto en muestras de
agua fue descrita por primera vez en el siglo XIX (Winkler 1888), las
medidas de metabolismo planctónico basadas en cambios en la
concentración de oxígeno no fueron introducidas hasta el inicio del siglo
XX por Gardner & Gran (1927). Esta técnica está basada en que las
muestras de agua son cuidadosamente introducidas en botellas DBO
(Demanda Biológica de Oxígeno). Varias de estas botellas son usadas
para establecer la concentración inicial de oxígeno (Botellas Iniciales;
Bi), mientras que otra serie de botellas son incubadas bajo condiciones
in situ durante aproximadamente 24 - 72 h (Botellas Oscuras: Bo). En los
experimentos de respiración, las botellas son incubadas en oscuridad y
las medidas de respiración son obtenidas, bien mediante la diferencia
en la concentración de oxígeno entre el tiempo inicial y final del
experimento, o mejor como la pendiente de la recta de regresión de la
disminución de oxígeno a lo largo del tiempo. Para evitar problemas de
interacción entre la fase acuosa y la atmósfera es muy importante que
las botellas estén completamente sumergidas en agua (por encima del
tapón) durante la incubación. Si no, podría haber intercambio de gases
entre el aire y el agua de la botellas (por diferencias en la presión
parcial de los gases), creándose burbujas de aire que alterarían la
concentración de oxígeno, o el volumen real de líquido a analizar.
La concentración de oxígeno disuelto en agua marina es definida
como el número de micromoles de di-oxígeno (O2) por kg de agua
marina (µmol kg-1).
6. Equipamiento necesario
Desde que Winkler (1988) describiese un método químico para la
determinación de oxígeno disuelto, este método ha sido uno de los más
usados, no solo por su simplicidad y bajo coste sino también debido a su
precisión. Durante la campaña Malaspina se utilizará para el análisis de
oxígeno disuelto un sistema micro-Winkler comercial (DOA Sis),
460
automatizado, con detección colorimétrica del punto final, basado en
el sistema descrito por Williams & Jenkinson (1982), y las
recomendaciones ofrecidas por Carpenter (1965) y Carrit & Carpenter
(1966). El método Winkler está basado en que el oxígeno de las
muestras de agua marina oxida el ion yoduro a yodo y la cantidad de
yodo generado es determinado mediante titración con una solución
estándar de tiosulfato sódico. El punto final de la titración se determina
mediante el método colorimétrico, y la cantidad de oxígeno disuelto es
calculada a partir del volumen de tiosulfato añadido durante la titración
hasta alcanzar el punto final.
2.- Fotomultiplicador
3.- Controlador
461
7. Descripción de la Técnica
Las reacciones que tienen lugar para la determinación de la concentración
de oxígeno disuelto son las siguientes:
Una vez añadidos el reactivo 1 -sulfato de manganeso o cloruro de
manganeso (MnSO4 o MnCl2)- y el reactivo 2 -solución alcalina de yoduro sódico
(NaOH + NaI), las botellas son cerradas cuidadosamente (evitando aparición de
burbujas) y vigorosamente agitadas (para facilitar la reacción). El oxigeno disuelto
químicamente reacciona con Mn(OH)2 en un fuerte medio alcalino resultando en
un precipitado marrón de Mn(OH)3. Después de la fijación y precipitación
completa del oxígeno, las botellas permanecen en reposo (bajo el agua) unas
horas antes de su análisis. Previamente al análisis, la muestra son acidificada a pH
2.5 – 1.0. Esto hace que los hidróxidos precipitados sean disueltos, liberando Mn+3.
Los iones Mn+3 oxidan el yoduro (I-) a yodo (I2). El yodo forma un complejo con el
exceso de los iones yoduro. Entonces el yodo es determinado mediante titulación
con tiosulfato (S2O3-2). Donde el yodo es reducido a yoduro (cambiando de color
de amarillo a transparente) y el tiosulfato es oxidado a tetrationato (S4O6-2).
462
8. Calibración del volumen de las botellas DOB
Para determinar el volumen exacto de las botellas de borosilicato DBO, se
deben pesar vacías y llenas de agua milli-Q (controlando la temperatura del
agua) en una balanza de alta precisión (300 ± 0.0001g). El volumen se determina
a partir de la diferencia de ambos pesos, corrigiendo para el coeficiente de
expansión de borosilicato, obtenido a partir de la densidad del agua (Kell, 1975).
La calibración del volumen de las botellas DBO debe ser realizado de forma muy
precisa, ya que la precisión del método depende de ello.
463
IO3- + 8I- +6H+ 3I3- + 3H2O
I3- + 2S2O3-2 3I- + S4O6-2
Cada vez que se preparan reactivos nuevos, el tiosulfato también se debe
estandarizar con yodato potásico. Para la estandarización se añaden los
reactivos en orden inverso: primero añadir H2SO4, seguido por la solución alcalina
de yoduro potásico (reactivo 2) y por último se añade el sulfato de manganeso
en agua milli-Q o agua marina (reactivo 1). Después se añade la solución
estándar de yodato potásico. El yodo es valorado con la solución de tiosulfato
apropiada y la molaridad es calculada como sigue:
Mt = (Vi x Mi x 6) / Vt
Donde Mt: molaridad del tiosulfato (M), Vt: volumen de tiosulfato añadido
(nl), Vi: volumen de estándar de iodato potásico añadido (ml) y Mi: molaridad del
estándar del iodato (M).
11. Blancos
Para probar que los reactivos están en buenas condiciones, se debe valorar
algún blanco alternando con las muestras. Para los blancos, los reactivos son
añadidos de forma inversa, similar a la anterior excepto el estándar de yodato
potásico. Los resultados de la titulación deberían ser ~ 0, de lo contrario su valor
debe ser restado al valor de las muestras.
464
Referencias
- Carrit, D.E. & Carpenter J.H. Comparison and evaluation of currently employed modification of the
winkler method for determining dissolved oxygen in sea-water. J. Mar. Res. 24: 286-318 (1966).
- Carpenter, J.H. The Chesapeake Bay Institute. Technique for the winkler oxygen method. Limnology
& Oceanography. 10: 141-143 (1965).
- Grasshoff K., Ehrhardt M. & Kremling K. Methods of Seawater Analysis. Grasshoff K., Ehrhardt M. &
Kremling K. eds Verlag Chemie GmbH. 419 pp.
- Kell G.S. Density, Thermal Expansivity, and Compressibility of Liquid Water from 0" to 150°C:
Correlations and Tables for Atmospheric Pressure and Saturation Reviewed and Expressed on 1968
Temperature Scale. Journal of Chemical and Engineering Data 21: 91-105 (1975).
- Strickland J.D.H. & Parsons T.R. Determination of dissolved oxygen in A Practical Handbook of
Seawater Analysis. Fisheries Research Board of Canada, Bulletin, 167: 71-75 (1968).
- Weast R.C. 1973. Handbook of chemistry and physics, 59th Edition 1978-1979. CRC Press.
- Williams P.J.leB. & Jenkinson N.W. A transportable microprocessor-controlled precise Winkler titration
suitable for field station and siphboard use. Limnology & Oceanography, 27 (3): 2843-2855 (1982).
Winkler L.W. Die Bestimmung des in Wasser gelösten Sauerstoffen. Berichte der Deutschen
Chemischen Gesellschaft. 21: 2843 – 2855 (1888).
465
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento
Técnicas analíticas
2. Titulo de la Técnica
5. Conceptos generales
466
asociados a afloramientos de fitoplancton (Passow & Alldredge 1994; Passow
2000). Sin embrago, el papel de procariotas (bacterias) parece más complejo,
ya que estos son a la vez productores y consumidores tanto de TEPs como de
sus precursores.
De este modo, las TEPs contribuyen de forma significativa en el flujo
descendente de materia orgánica en sistemas marinos, ya que debido a su
alta adherencia actúan como una matriz intersticial generando agregados
macroscópicos, formados por compuestos orgánicos e inorgánicos que son
conocidos como “nieve marina”. La formación y sedimentación de nieve
marina es una ruta principal de retirada de carbono de la superficie del
océano hacia aguas profundas (Alldredge et al. 1993, Passow et al. 2001;
Passow 2002).
6. Equipamiento necesario
- Tubo de silicona.
- Botellas Nalgene 2L (de polipropileno).
- Bomba de vacío.
- Rampa de filtración.
- Kitasato de seguridad (de polipropileno) con tapón perforado para
conectar a la bomba.
- Filtros de policarbonato de 0.4 μm de tamaño de poro (Ø 25 mm).
- Pinzas para filtros.
- Pipetas de 1 y 5 ml.
- Botes de vidrio de 20 ml o algo similar para la extracción.
- Espectrofotómetro.
- Cubetas desechables de 1 cm.
- Botes de polipropileno para preparar disoluciones de trabajo y stock
de azul alcián.
- Balanza muy precisa para la calibración (precisión de 0.0001 mg).
- Ionizador.
- Vasos de precipitado 500 ml.
467
- Probeta de 500 ml.
- Filtros de jeringa de 0.2 μm de tamaño de poro.
- Jeringas 10 y 20 ml.
- Frasco lavador para el agua milli-Q.
- Guantes.
- Crioviales de 2 ml para introducir los filtros.
- Cajas de plástico para almacenar los crioviales en el congelador.
- Estadillo de recogida de muestras.
- Libreta de incidencias.
- Material de librería (rotuladores, bolígrafos, lápices,…).
- Bandeja.
- Triturador de tejidos para preparar soluciones patron.
Reactivos:
i. Solución de azul alcián para la tinción de TEPs:
a. Azul alcián
b. Ácido acético
ii. Ácido sulfúrico (80 %) para extracción de azul alcián
iii. Goma de xanyán y ácido algínico para preparación de
curvas de calibración.
Preparación de reactivos
468
filtrará la solución de trabajo por filtros de 0.2 µm desechables (el volumen
aproximado que se necesite para cada día).
8. Calibración
9. Descripción de la técnica
Los TEPs son teñidos con azul alcián. Alcián blue es un grupo de
colorantes básicos polivalentes derivados de la ftalociania que son solubles en
agua. El color azul es debido a la presencia de cobre en la molecula. En una
solución con ácido acético 3 % (PH 2.5), el azul alcián tiñe a los grupos
carboxilados y ester-sulfato de los mucopolisacáridos ácidos. Para los cuales es
uno de los colorantes catiónicos más ampliamente usados. Las partes teñidas
son de color azulado y se crre que forman enlaces salinos con los grupos
ácidos.
Los TEPs son retenidos en filtros de policarbonato de 0.4 µm de tamaño
de poro y entonces son teñidos con una solución de trabajo de azul alcián.
Seguidamente, la concentración de TEP es determinado colorimétricamente
con el espectrofotómetro. Pasos a seguir:
469
b. Recoger el agua (de la botella Niskin) en botellas de 2 L para cada
profundidad.
c. Filtrar 200-300 ml de muestra (según saturación del filtro) a través de
filtros de policarbonato de 0.4 µm de tamaño de poro. Tres filtros
(réplicas) por profundidad (600-900 ml). Recomendable usar presión
no muy alta (~ 150 mm de Hg) con ritmo constante.
d. Tinción: Teñir el filtro con 0.5 - 1 ml de solución de trabajo de azul
alcián (que cubra completamente). Dejar unos 5 segundos. Volver a
filtrar. Enjuagar con agua milli-Q filtrada por 0.2 µm.
Nota: en este paso los filtros se pueden congelar a – 20 ºC.
e. Por último, los TEPs se analizarán espectrofotométricamente. A los
filtros teñidos con azul alcián se añadirá 5 ml de H2SO4 al 80 % y
después de 2- 3 h se extraerá la absorbancia a 787 nm.
Añadir 0.5 – 1 ml de
solución de trabajo de
azul alcián
Añadir 5 ml H2SO4 80 %
470
11. Calculo de los resultados.
471
El límite de detección del método es de 2.2 µg de equivalentes de
goma de xantán por litro y el coeficiente de variación es del 13 %.
13. Referencias
472
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Fijación y Procesado de muestras
2. Titulo de la técnica
Determinación de abundancia de virus por citometria de flujo
5. Conceptos generales
• Boras JA, Sala MM, Arrieta JM, Sa EL, Felipe J, Agustí S, Duarte CM, Vaqué
D (2010). Effect of ice melting on bacterial carbon fluxes channelled by viruses
and protists in the Arctic Ocean. Polar Biol DOI 10.1007/s00300-010-0798-8.
• Boras JA, Sala MM, Baltar F, Arístegui J, Duarte CM, Vaqué D (2010). Effect
of viruses and protists on bacteria in eddies of the Canary Current region
(subtropical Northeast Atlantic). Limnol Oceanogr 55:885–898.
6. Equipamiento necesario
473
• Citómetro de Flujo FACSCalibur de Becton & Dickinson
• Vórtex
• Pipetas para dispensado de muestras
• Bidón de nitrógeno líquido.
• Sonicador
• Baños termostatizados (37ºC y 80ºC)
9. Descripción de la Técnica
474
Mientras se mezcla con una barra magnetica, ajustar a pH=8, añadiendo
lentamente by NaOH
•Limpiar el FC – Poner el tubo con legia y hacerlo correr unos minutos. Cambiar
por un tubo con MilliQ y dejarlo correr otros pocos minutos
Comprobar con MilliQ si el FCM esta limpio: poner un tubo con Milli-Q, y
correr a velocidad MED.
475
Abrir un “modelo” documento para virus y todas las ventanas (“Cytometro”:
“Detectores”,
“umbrales”, “Status”; “Acquire”: “descripción de parámetros”, “contadores”;
“Settings del Instrumento”, escoger los setting para virus, que para nuestro
FCM son:
SSC=625, FL1=530).
En “Acquisition & parameters” seleccionar el tiempo (60) y incrementar el
número de eventos a100 000 para evitar que los recuentos paren antes que
el tiempo escogido/ fijado.
Nombrar el Directorio y el fichero. Si es posible marcar las muestras en orden
continuo.
•Comprobar si el TE utilizado para diluir las muestras esta limpio: poner en un tubo
0,5 ml de TE, y RUN a velocidad MED. “Los eventos por segundo”
normalmente estaran entre 0-15.
476
•Filtrar la solución autoclavada de TE-buffer por filtros de 0.2 μm antes de usar.
-Procesamiento de Muestras
• Coger 8 muestra del congelador. Las muestras se temperaran en las manos o en
un baño a ~ 37ºC. • El proceso de atemperar la muestra ha de ser rápido, 1-2
minutes para crioviales de 2 ml.
• La muestra no deberia sobrecalentarse.
• Después de atemperar la muestra la medida de la abundancia de virus ha de
ser rápida (la concentración de virus disminuye rápidamente después de
descongelarse).
•Escribir el código de los tubos en una hoja de papel (número del tubo-código de
la muestra).
•Marcar los tubos de trabajo.
•Diluir las muestras en TE. Generalmente las diluciones utilizadas para el recuento
de virus son: 50-100x pero depende del tipo de muestras que se tenga
(frecuentemente puede ser 5-10x).
•Preparar las diluciones de 50x y100x en los siguientes pasos:
a) Dilution I: 450 μl of TE + 50 μl de muestra (10x)
b) Dilution II: 400 μl of TE + 100 μl de “Dilucion I” (50x)
c) Dilution III: 450 μl of TE + 50 μl de “Dilution I” (100x)
• Añadir 5 μl deSYBR Green I a cada tubo. agitar.
• Incubar los tubos 10 min en el baño a 80ºC. Dejarlo 5 min in en la oscuridad a
temperatura ambiente y dejarlo enfriar
• Mezclar la muestra en el tubo e instalarla en el FCM (evitar las gotas del sistema
de inyección).
• Esperar hasta que el voltaje sea estable (en Status window) mas o menos 10
segundos y solamente ENTONCES apretar ACQUIRE. La muestra correrá por 60
seg a la velocidad MED. La media de eventos por segundo debería ser alrededor
de 300-600. Nunca debería ser <75 y >800. Si no es posible alcanzar estos valores,
deberemos cambiar la dilución de la muestra.
• Anotar en la forma impresa después de cada muestra: la velocidad utilizada, el
promedio de eventos por seg, el número total de eventos y los setting utilizados.
477
10. Cuadro sinóptico de la técnica
—Final
•Apagado del citómetro:
a) En“Acquire”: “desconectar desde el citometro”
b)“File”: “Quit”,“Do not save”
c) Poner un tubo con agua MilliQ en el FC, apretar “STANDBY” y TURN OFF la
presión del contenedor de fluido. NUNCA dejar el tubo en Standby con la presión
ON.
478
13. Referencias
Boras JA, Sala MM, Vázquez-Domínguez E, Weinbauer MG, Vaqué D (2009) Annual
changes of bacterial mortality due to viruses and protists in an oligotrophic coastal
environment (NW Mediterranean). Environ Microbiol 11:1181–1193
Boras JA, Sala MM, Arrieta JM, Sa EL, Felipe J, Agustí S, Duarte CM, Vaqué D
(2010). Effect of ice melting on bacterial carbon fluxes channelled by viruses and
protists in the Arctic Ocean. Polar Biol DOI 10.1007/s00300-010-0798-8.
Boras JA, Sala MM, Baltar F, Arístegui J, Duarte CM, Vaqué D (2010). Effect of
viruses and protists on bacteria in eddies of the Canary Current region (subtropical
Northeast Atlantic). Limnol Oceanogr 55:885–898.
479
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Analítico-experimental, tratamiento mediante inoculación de análogos
bacterianos
2. Titulo de la técnica
Determinación de la depredación bacteriana debida a protistas, mediante la
desaparición en el tiempo de bacterias marcadas con un compuesto
fluorescente (FLB)
5. Conceptos generales
-El bucle microbiano
En los sistemas marinos oligotroficos las comunidades de procariotas están
constituidas principalmente por bacterias heterótrofas y autótrofas
(Synechococcus y Prochlorococcus) y algunas Arqueas. Las bacterias
heterótrofas representan un elevado porcentaje de la biomasa respecto a otros
organismos planctónicos (fitoplancton, protozoos, zooplancton, Gasol et al. 1997)
y juegan un papel muy importante en el reciclaje de la materia orgánica disuelta
en el mar. Así, captan el carbono orgánico disuelto excretado por el fitoplancton
y lo convierten en particulado entrando a formar parte de la dieta básica de
protozoos, constituyendo el bucle microbiano. En cambio las bacterias autótrofas
utilizan CO2 y nutrientes inorgánicos disueltos en el agua necesarios para la
fotosintesis y su crecimiento. Estos microorganismos también forman parte del flujo
de carbono que pasa a niveles tróficos superiores, principalmente protozoos
(nanoflagelados heterótrofos). El papel que juegan los protozoos como
reguladores de la biomasa de procariotas empieza a ser reconocido en la
década de los 80's. El continuo avance en el desarrollo de técnicas que se utilizan
para determinar: (i) abundancia de procariotas y protozoos por microscopia de
epifluorescencia (Porter and Feig 1980) y citometria de flujo (Gasol y del Giorgio.
2000); (ii) producción de procariotas: uso de isotopos radiactivos (Kirchman 1993);
(iii) tasas de depredación de protozoos sobre procariotas, mediante técnicas de
dilución (Landry et al. 1984), fraccionamiento (Kuuppo-Leinikki y Kuosa, 1990), uso
de trazadores fluorescentes (Sherr et al. 1987, Pace et al. 1990, Vaqué et al. 1994,
Vazquez-Dominguez et al. 1999. Todo ello ha contribuido y contribuye a mejorar el
conocimiento y función microorganismos integrantes de las redes tróficas
480
microbianas y a cuantificar los flujos de carbono que se establecen entre los
distintos microorganismos en los sistemas marinos.
6. Equipamiento necesario
•Sistema de filtración para filtros de 25 mm
•Bomba de vacío y trampa
8. Calibración
En los experimentos se calibran mediante un control, que consiste en una muestra
de agua a la que no continen detyredadores (previamente filtrada por 0.8 µm)
depredadores.
9. Descripción de la Técnica
481
•Rotar cuidadosamente las botellas (unas 20 veces) para homogeneizar bien las
muestras con las FLBs.
c) Determinación de abundancias
•Abundancia de ciliados
-Dispensar 100ml de cada triplicado en botellas de vidrio. Fijar con 2ml de lugol
acético (2% concentración final). Conservar en un lugar fresco y oscuro hasta su
llegada al centro de investigación, donde se observarán en un microscopio
invertido.
•Abundancia de bacterias heterotróficas/FLBs y nanoflagelados
- Preparar glutaraldehído 10% (600ml de MQ y 400ml de glutaraldehído 25%).
- Conservar a 4°C.
- Dispensar 50ml de réplicas y control en 4 botellas de tapón estrella.
- Fijar con 5ml de glutaraldehido al 10% (concentración final 1%).
- Mantener a 4ºC al menos 1 hora, o hasta que se proceda al protocolo de DAPI.
482
•DAPI de nanoflagelados
-Proceder de la misma forma que para bacterias heterotróficas pero con un filtro
negro de 0.6 µm de policarbonato. El volumen filtrado será en este caso de entre
25 y 40ml.
d) Producción bacteriana
12. Referencias
Boras JA, Sala MM, Vázquez-Domínguez E, Weinbauer MG, Vaqué D (2009) Annual
changes of bacterial mortality due to viruses and protists in an oligotrophic coastal
environment (NW Mediterranean). Environ Microbiol 11:1181–1193
Boras JA, Sala MM, Arrieta JM, Sa EL, Felipe J, Agustí S, Duarte CM, Vaqué D (2010).
Effect of ice melting on bacterial carbon fluxes channelled by viruses and protists
in the Arctic Ocean. Polar Biol DOI 10.1007/s00300-010-0798-8.
Boras JA, Sala MM, Baltar F, Arístegui J, Duarte CM, Vaqué D (2010). Effect of
viruses and protists on bacteria in eddies of the Canary Current region (subtropical
Northeast Atlantic). Limnol Oceanogr 55:885–898.
Gasol JM, del Giorgio PA, Duarte CM.(1997) Biomass distribution in marine
planktonic communities. Limnology and Oceanography 42: 1353-1363.
483
Gasoil JM, del Giorgio PA (2000) Using flow cytometry for counting natural
planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial
communities. Scientia Marina 64: 197-224.
Porter KG, Feig YS (1980) The use of DAPI for identifying and counting aquatic
microflora Limnol Oceanogr. 25:943-948
Sherr BF, Sherr EB, Fallon RD (1987) Use of monodispersed, fluorescently labeled
bacteria to estimate in situ protozoan bacterivory. Appl Environ Microbiol 53: 958–
965.
484
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Analítico-experimental, reconstrucción y reconstrucción de las muestras
2. Titulo de la técnica
Determinación de la producción de virus debida a la lisis bacteriana
5. Conceptos generales
-Virus, su papel en el bucle microbiano
En el mar los virus presentan abundancias entre 106-108 cels ml-1 (suttle 2007), de
20 a 200 nm de longitud, constituidas por material genético (DNA ó RNA de
cadena sencilla o doble), rodeados por una cubierta de proteinas y algunos
poseen lípidos. No tienen metabolismo propio y funcionan como parásitos
utilizando la maquinaria celular de la célula hospedadora. Los virus son "las
particulas vivas" mas abundantes del plancton marino. Su supervivencia y
reproducción se basan en la infección tanto de microorganismos procariotas
(bacterias) como eucariotas (fitoplancton). Hay básicamente tres tipos de
reproducción vírica: (1) Infección lítica, el virus entra en contacto con la célula
hospedadora y le inyecta su ácido nucleico, el cual determina la producción de
una numerosa progenie de virus. En un momento dado, la célula hospedadora
explota, los virus salen al exterior y el ciclo empieza de nuevo. (2) Infección
crónica, cuando la progenie de virus liberados no es letal y la célula hospedadora
excreta los virus por extrusión, o se desarrollan dentro de la misma durante varias
generaciones. (3) Lisogenia, el ácido nucleico del genoma del virus pasa a formar
parte del genoma de la célula hospedadora y se reproduce como material
genético de la misma (profago). En el caso que las células hospedadoras se
encuentren en condiciones de estrés la infección puede convertirse en lítica. La
lisogenia parece ser la forma infectiva mas frecuente en sistemas oligotróficos,
debido a la menor abundancia bacteriana de estos sistemas, lo que disminuye la
probabilidad de encuentro entre virus y célula hospedadora, comparado con los
eutróficos. Es una manera hábil de mantenerse amparado por la célula
hospedadora hasta el momento propicio (estrés, incremento de la abundancia
bacteriana) en que se convierten en líticos y salen al exterior a infectar nuevas
células). Por tanto, la infección virica del procariotas se ha de tener en cuenta en
el funcionamiento del bucle microbiano. Los virus pueden catalizar la
transformación de materia orgánica particulada (e.g. bacterias) en materia
485
orgánica disuelta que proviene del contenido de los organismos hospedadores
durante la lisis celular. La actuación de los virus favorecerá las cadenas tróficas
dominadas por pequeños organismos con poca exportación y retención de mas
nutrientes en la zona fótica. Paradogicamente, la presencia de virus a la vez que
incrementará las tasas de mortalidad bacteriana, también favorecerá su
producción y respiración, debido a los nuevos aportes de materia orgánica
6. Equipamiento necesario
• Bomba peristática
•Portafiltros de 47 mm
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
a) Diseño experimental
•Preparación de la Mitomicina C: disolver el contenido de un vial de 2mg de
Mitomicina C con 1 ml de MQ filtrada por 0.2um. Añadir este volumen a 19ml de
MQ igualmente filtrada. Alicuotar y conservar a -20ºC.
•Obtener 200ml de agua de mar libre de virus (=ultrafiltrado), mediante filtración
tangencial con una membrana de 30KDa (Ver protocolo correspondiente).
486
•Concentración de bacterias: filtrar 1L de agua de mar por 0,8μm y
seguidamente reducirlo a 100ml de concentrado de bacterias, mediante
filtración tangencial con una membrana de 0.2µm (Ver protocolo
correspondiente).
•Mezclar los 100ml de concentrado de bacterias con 200ml de agua de mar libre
de virus. La idea es tener la misma concentración inicial de bacterias que en la
muestra natural, pero habiendo eliminado la mayor parte de los virus.
•Tomar 6 tubos y repartir a cada uno 50ml de la mezcla preparada previamente.
En tres de ellos añadir 0.5 ml de la solución de trabajo de Mitomicina C
(concentración final 1 µg ml-1), para obtener la producción de virus total
(infección lítica y lisogénica).
•Al finalizar se procedera al lavado de los Cartuchos de 0.2 µm y 30 Kda, tal y
como está descrito en el protocolo de ultrafiltración tangencial
487
11. Calculo de los resultados.
Las tasas de producción de virus que a partir de ellas podremos estimar las tasas
de lisis bacteriana se calcularan según está descrito en Boras et al. (2009, 2010 a,
2010b)
12. Referencias
Boras JA, Sala MM, Vázquez-Domínguez E, Weinbauer MG, Vaqué D (2009) Annual
changes of bacterial mortality due to viruses and protists in an oligotrophic coastal
environment (NW Mediterranean). Environ Microbiol 11:1181–1193
Boras JA, Sala MM, Arrieta JM, Sa EL, Felipe J, Agustí S, Duarte CM, Vaqué D (2010).
Effect of ice melting on bacterial carbon fluxes channelled by viruses and protists
in the Arctic Ocean. Polar Biol DOI 10.1007/s00300-010-0798-8.
Boras JA, Sala MM, Baltar F, Arístegui J, Duarte CM, Vaqué D (2010). Effect of
viruses and protists on bacteria in eddies of the Canary Current region (subtropical
Northeast Atlantic). Limnol Oceanogr 55:885–898.
Winget DM, Williamson KE, Helton RR, Wommack KE (2005). Tangential flow
diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production.
Aquat Microb Ecol 41: 221–232.
488
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Recogida de muestras para ADN vírico
2. Titulo de la técnica
Determinación de la composición de la comunidad vírica
5. Conceptos generales
Los virus son los entes mas abundantes en los sistemas acuáticos, y una gran
mayoria tienen a las bacterias como hospedadores (Furhman 1999). Aunque en la
actualidad se están realizando grandes avances en estudios que versan sobre la
diversidad de los virus, como es el uso de técnicas como la implementación de la
metagenómiica (Paul and Sullivan 2005). Aúnque esta es la técnica ideal y ya se
utilizará en la campaña Malaspina en profundidades discretas. Nosotros vamos a
realizar de forma sistemática en muchas estaciones y profundidades la
determinación de la composición de la comunidad de virus mediante la técnica
de Fingerprint RAPD-PCR (Weinbauer et al. 2009)
6. Equipamiento necesario
•Bomba persitáltica Watson-Marlow
489
•Lejia
•Etanol 5%
8. Calibración
Se realizará mediante la utilización de distintos cebadores sobre distintas muestras.
Los resultados en los geles se compararan con los de los patrones
9. Descripción de la Técnica
-Recogida de Muestras
Cada tres días, se recogeran muestras de un perfil completo de profundidades.
Para muestras profundas se filtrarán entre 10 y 20 litros, mientras que para muestras
superficiales serán suficientes 2 litros de agua prefiltrada por 0.8 y 0.2 µm. A partir
de aquí los virus se concentararn mediante filtración tangencial sobre cartuchos
(VIVAFLOW)de 30 Kda . Además, una vez por semana, coincidiendo con las
estaciones consideradas para realizar experimentos se concentrarán dos
muestras de superficie y una de máxima profundidad.
490
•Poner la muestra en el vaso de 5L limpio. (Si vamos a filtrar más de 4L, iremos
añadiendo muestra medida que se vacíe el vaso).
•Poner el sistema en MODO FILTRACIÓN.
•Filtrar la muestra (= agua de mar prefiltrada por 0,2μm). Durante el proceso de
filtrado, deben guardarse a parte 500 ml de ultrafiltrado, que se usarán más tarde.
•Fase final de la filtración: cuando queden tan sólo 100ml de muestra en el
recipiente original, parar la bomba y trasvasarlos a un falcon estéril, junto con los
tubos 1 y 2.
•Utilizaremos 200ml del ultrafiltrado recogido previamente para lavar 3 veces el
vaso que contenía la muestra, con el fin de arrastrar los virus enganchados a las
paredes del vaso.
•A medida que se absorbe la muestra del falcon, le vamos añadiendo el volumen
de dichos lavados.
•Parar la bomba cuando queden <5ml de muestra en el falcon, y en todo caso,
ANTES de que el tubo aspire aire.
•Poner el sistema en MODO REVERSO. Es importante cerrar el paso del tubo 3.
•En el mismo falcon recogeremos 20ml del concentrado de virus que expulsa el
tubo #1. Rotular bien, asegurar el tapón con parafilm y guardar a 4ºC.
491
10. Cuadro sinóptico de la técnica
MODO FILTRACIÓN
TUBO 3
TUBO 2
Membrana
30KDa
TUBO 1
BOMBA
PERISTÁLTICA
MUESTRA
492
MODO
RECIRCULACIÓN
TUBO 3
TUBO 2
Membrana
30KDa
TUBO 1
BOMBA
PERSITÁLTICA
255 RPM
MQ o
Sol. limpieza
493
MODO REVERSO
TUBO 3
X TUBO 2
Membrana
30KDa
TUBO 1
BOMBA
PERISTÁLTICA
155 RPM
ULTRA-
CONCENTRADO FILTRADO
DE VIRUS
494
MODO LIMPIEZA
TUBO 3
TUBO 2
Membrana
30KDa
TUBO 1
BOMBA
PERISTÁLTICA
Residuo
s 255 RPM
MQ o sol.
limpieza
495
11. Obtención de resultados.
12. Referencias
Paul JH, Sullivan MB (2005). Marine phage genomics: what have we learned?
Environmental biotechnology. 16:299–307
Winget DM, Williamson KE, Helton RR, Wommack KE (2005). Tangential flow
diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production.
Aquat Microb Ecol 41: 221–232.
496
BLOQUE 7
497
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
González-Gordillo, J.I.
Sánchez García, R.
CACYTMAR, Universidad de Cádiz.
4. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
498
7. Descripción de la Técnica
Toma de muestras:
Se tomará una sola muestra por cada perfil de roseta. En aquellos puntos de
muestreos terminados en 0 o 5 (10, 15, 20, etc.) la muestra será utilizada
499
íntegramente para genómica; en el resto de los puntos las muestras se usarán
para taxonomía. Las muestras se tomarán desde la máxima profundidad a la que
baje la roseta hasta los 2000 m. No obstante, la columna de agua muestreada
debería ser siempre mayor de 1000m, pues menos distancia no daría,
seguramente, una muestra representativa. Por tanto, en sondas menores a los
3000 m no se tomarían muestras.
Conservación de muestras:
Muestra para genómica:
Para la recogida de la muestra se extrae el tapón del colector y el contenido se
vierte directamente en un vaso de filtración provisto de un filtro GF/F colocados
en un kitasato. Tras una filtración muy suave (para no romper los organismos y
perder su ADN) se extrae el filtro y se coloca enrollado en un tubo de plástico de
5ml al que se le añade etanol absoluto con una jeringa. Durante todo el proceso
debe tenerse especial cuidado de no contaminar la muestra con ADN extraño
(restos de organismos, etc.)
500
Estadillo de datos:
Muestreador: BOTTLE-NET
Prof. Inicio Hora inicio
Vol. Bottle-Net Hora inicio roseta Prof max Perfil
Filtrado filtrado (UTC)
Prof. Fin filtrado Hora fin filtrado (UTC) Hora fin roseta
Volumen
Código digital muestras asoc Observaciones
alícuota
Puntos Aprox. 3 ml
terminados etanol absoluto
en 0 y 5
5 ml formol
al 40%
tamponado
50 ml
12 ml Lugol
50 ml
100 ml
501
9. Reactivos y material de laboratorio
Conservantes:
Formaldehído al 40 % tamponado con Bórax.
Lugol Acético
Otro material:
Frascos para muestras de 120 ml de vidrio y color topacio (especialmente cuando
se usa Lugol). El vidrio del frasco aporta sílice a la muestra y ayuda a la
conservación de las diatomeas.
Jeringuilla de 50 ml
Filtros desechables para jeringuilla
Jarras graduadas 1 l
Material de etiquetado
Estadillo de datos
10. Calibración
502
simultanea a la realización de perfiles de CTD con rosetas oceanográficas, sin
necesidad de usar redes de plancton convencionales largadas hasta miles de
metros o de efectuar numerosas recogidas de agua con rosetas oceanográficas,
metodologías que de cualquier forma siempre implican un consumo de tiempo
importante en cualquier campaña oceanográfica.
14. Referencias
Gifford, D.J. and Caron, D.A. 2000. Sampling, preservation, enumeration and
biomass of marine protozooplankton, Cap. 5: 193-221. In: Harris, R.P.; Wiebe, P.H.;
Lenz, J.; Skjoldal, H.R.; Huntley, M. (Eds). ICES Zooplankton Methodology Manual.
Academic Press, 684 pp.
503
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
González-Gordillo, J.I.
Sánchez García, R.
CACYTMAR, Universidad de Cádiz.
4. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
7. Descripción de la Técnica
Recogida de muestras: Las muestras se tomarán a partir del grifo de salida del
termosalinómetro continuo instalado en el barco. El grifo se mantendrá abierto
siempre y en la misma posición, con la idea de mantener un caudal constante
durante el muestreo. Este caudal se calibrará antes y después de cada muestra
mediante el llenado de un cubo aforado. El agua saliente del grifo se hará pasar
por un juego de tamices de 200 y 20 µm colocados uno encima del otro. La
muestra que se recogerá será la retenida en el tamiz de 20 µm.
Se tomarán 2 muestras diarias, una en cada fase del día (día y noche), y cada
una de ellas durante 1 hora. Las muestras se tomarán intentándolas hacerlas
coincidir con la mitad del día (12:00) y mitad de la noche (23:00),
504
respectivamente. Debido a la logística general de la Campaña, la muestra diurna
corresponderá al punto de muestreo en el que se esté realizando el
correspondiente perfil de CTD, mientras que la muestra nocturna corresponderá al
transecto navegado entre dos puntos de muestreo.
505
Estadillo de datos:
Latitud inicio
Longitud inicio
Estado cielo
Latitud final
Longitud final
Observaciones
Volumen
Código digital muestras asoc Observaciones
alícuota
Conservantes:
Formaldehído al 4 % tamponado con Bórax.
506
Lugol acético
Material laboratorio:
Frascos para muestras de 125 ml de vidrio y color topacio. El vidrio del frasco
aporta sílice a la muestra y ayuda a la conservación de las diatomeas.
Jeringuilla de 50 ml
Filtros desechables para jeringuilla
Jarras graduadas 1 l
Material de etiquetado
10. Calibración
El caudal del continuo debe ser calibrado antes y después de cada muestra
mediante el llenado de un cubo aforado. El dato se obtiene midiendo el tiempo
que tarda en llenarse el recipiente aforado. Realizar varias réplicas para obtener
una mejor estima. Pasar los datos a L/min y anotar en el estadillo.
Es importante asegurarse que no existe ningún tipo de filtro en los conductos del
termosalinómetro que puedan impedir la entrada del plancton.
Deberá controlarse el funcionamiento del sistema mientras que las primeras
muestras se estén tomando, ajustando la apertura del grifo a la cantidad de
plancton que se recoge con la idea de que no se colmaten los tamices.
Este tipo de muestreo no debería utilizarse para el estudio cuantitativo de
organismos mayores de 200 micras pues los valores de abundancia estarían
subestimados.
507
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
508
• Columna de tamices de distintos tamaños para Actividad Enzimática y
para Isótopos Estables de C/N
• Rampa de filtración
• Filtros de fibra de vidrio Whatman
• Placas de Petri
• Envases herméticos de plástico
• Silica-gel
• Botella con Nitrógeno líquido
• Formaldehído al 40% tamponado con Borax
• Etanol absoluto
• Redes de repuesto
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
Profundidades de muestreo:
Se realizará un lance de MULTINET diario alcanzando una profundidad máxima de
1000m, en los que obtendremos muestras de los rangos de profundidad:
1000-900, 900-800, 800-700, 700-600, 600-500, 500-400, 400-300, 300-200, 200-0.
Puntualmente (muestreos tipo C), se realizarán lances profundos hasta una
profundidad máxima de 4000m, recogiéndose muestras de los rangos de
profundidad: 4000-3500, 3500-3000, 3000-2500, 2500-2000, 2000-1500, 1500-1000,
1000-500, 500-200, 200-0.
509
nº 1ª, el nº 2 al 2ª colector, y así sucesivamente. Hay que tener cuidado con la
cantidad de agua que se pone en el tanque pues al meter las jarras puede
rebosar y entrar agua en éstas.
510
El procesado de macroplancton comienza sacando la jarra de 5000 µm,
asegurándose que los organismos menores de 5000 micras han pasado por el
tamiz y se quedan en la jarra cerrada. Lavar cuidadosamente el tamiz con la
ayuda de un pulverizador.
El contenido de esta jarra-tamiz se verterá en una bandeja con un poco de agua
filtrada (10 µm), separando con una pinza los organismos no gelatinosos e
introduciéndolos en un frasco de 50ml tapón de estrella. La muestra se etiquetará
para taxonomía y se conservará en formol al 4%, excepto aquellas de los puntos
de muestreo terminados en 0 o 5, cuyas muestras se etiquetarán para genética y
se conservarán en etanol absoluto. Si aparece material gelatinoso se volverán a
colocar en la jarra-tamiz de 5000 µm y se re-colocará en el lugar correspondiente
del Tanque 2. Los organismos gelatinosos permanecerán en este tanque durante 1
hora para que se depuren. El posterior tratamiento de estas muestras se
específica en procedimiento aparte (ver procedimiento para el procesado de
muestras de gelatinoso).
Tras el pre-procesado de las muestras de plancton realizado anteriormente
tendremos 9 muestras en el tanque 1 y de 0 a 9 muestras en el tanque 2,
dependiendo si hay zoo gelatinoso.
511
o Repetir el proceso para los tamices de 500 y 200 µm.
o Se introducen los crioviales en una media y a continuación en
Nitrógeno líquido para congelación inmediata. La media se queda
dentro de la lechera de N2.
o Cuando están todas las muestras procesadas se recuperan los
crioviales y se colocan dentro de la caja de congelación de cartón.
Después se llevan a la cámara congeladora de -80ºC para
almacenaje definitivo.
o
- Muestras para Genética:
o Se vierten 250ml sobre un tamiz de 200µm
o Se concentra la muestra con un pulverizador de agua de mar filtrada
(10 µm).
o Se lleva la muestra a un frasco de 50ml (tapón estrella) arrastrándola
con Etanol absoluto y la ayuda de un embudo pequeño.
- Taxonomía:
o Se vierten los 250ml de la alícuota directamente al frasco de 250 ml
(tapón estrella).
o Se añaden 25ml de formaldehído al 40% tamponado con Bórax con
la ayuda de una jeringa provista de un filtro desechable.
Recogida de material:
Lavar bien todas la redes con agua dulce después de cada uso. Inspeccionarlas
por si existe alguna rotura. Cubrir las redes con una loneta o plástico para
protegerlas de suciedad o posibles quemaduras.
Al final de cada etapa las redes deberían limpiarse en profundidad
introduciéndolas una noche en un tanque con agua dulce y un poco de lejía. En
caso de estar muy estropeadas cambiarlas por una nueva.
512
Estadillo de datos:
Muestreador: MULTINET
Prof. de Hora inicio Hora fin Vol. Filtrado
Observaciones
muestreo (UTC) (UTC) (m3)
Variable: MESOPLANCTON
Volumen Peso seco
Código digital muestras asoc Observaciones
alícuota filtro
Variable: MACROPLANCTON
Volumen
Código digital muestras asoc Observaciones
alícuota
Peso
Nº de Código Observacio
Código digital muestras asoc Taxón fresco
organis. foto nes
(sólo CNH)
513
10. Cuadro sinóptico de la técnica
MACROZOO
TAXON Comenzar por estas muestras, para NO SI
evitar perder organismos apresados
por gelatinosos
OMÍA
Añadir 5ml de
Formaldehido y
5000µm enrasar con Agua
GELATINOSOS BOTE 50ml
Arrastrar con
Etanol a
BOTE 50ml
DEPURAR 1
HORA
5000µm
cerrada Protocolo
TANQUE 1:
9 CONJUNTOS
Organismos
TANQUE 2:
DE J ARRAS: 9 Gelatinosos
CONJUNT OS
DE J ARRAS:
CERRADA S
Enrasar a 1000ml
ISOTOPOS
q
¿M anga 200 -0 m? AÑADIR 25ml
cerrada Filt rar FORMALDEHIDO
n
cada
(4 0%)
ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA FRACCIONAR LA MUESTRA EN 4 SI
PARTES IGUALES (250ml x 4)
Col umna d e t amices
- 1000 µm BOTE
- 500 µm AÑADIR 2 5ml
FORMALDEHIDO BOTE 50ml Guardar 5 0ml 250ml
- 200 µm
y añadir 5 ml
fo rmol
BOTE 50ml
Pasar el resto
CONCENTRAR LA (200ml) por
MUESTRA (arrastrando columna de
con H2O FILTRADA) tamices
GENÉTICA
BOTE 250ml
tamaño
Enrasar cad a
CONGELAR
p CON
ETANOL
IN MEDIATAM ENTE EN
NIT RÓGEN O LÍQUIDO
Guardar filtro en placa petri
correspondiente. Secar a 50-
60ºC. Almacenar en caja
514
hermética con silica-gel
ALMA CENAR
CONG ELADO A -80 ºC
11. Calculo de los resultados.
No hay cálculos que realizar. Los volúmenes filtrados para cada pesca se
obtienen directamente del software de control de la multinet.
Así mismo, cada tipo de muestra se va a conservar de distinto modo por lo que
resulta imprescindible identificar correctamente el reactivo o líquido contenido o
utilizado con los diferentes envases: botes, frascos lavadores, tamices, etc.
Se debe tener especial cuidado a la hora de arrastrar las muestras para llevarlas a
otro bote o tamiz. UNICAMENTE se utilizará líquido diferente al agua de mar
filtrada en el caso de las muestras destinadas a estudios de genética, puesto que
si la arrastrásemos con agua la concentración de conservante (etanol) disminuiría
pudiendo perjudicar la fijación de la muestra. El tamiz utilizado con etanol, estará
debidamente diferenciado del resto, marcado con una cinta de color verde.
515
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
5. Conceptos generales
6. Equipamiento necesario
Reactivos:
• Agua de mar filtrada (al menos por 40 µm)
516
• Agua desionizada ultrapura Milli-Q o similar (DDW)
• Ácido clorhídrico (para preparar diluciones con DDW al 5%)
• Gel de sílice con indicador (Silicagel)
Material:
• Tamices plásticos (jarras) de malla de 40, 200, 500, 1000 y 2000 µm
• Embudos de plástico de boca ancha (capacidad 500-1000 ml)
• Nevera de plástico (para llenar de agua de mar filtrada y lavar los tamices)
• Jarra plástico de 2 l graduada
• Pulverizador (tipo matabi)
• Probetas de plástico (250, 1000 ml)
• Pinzas para filtros
• Frascos lavadores
• Filtros de fibra de vidrio (GF; ej. Whatman GFC). Cada filtro estará prepesado y
guardado en cajas de Petri de plástico con el peso anotado en la tapa de
cada placa.
• Placas Petri de plástico (con los filtros)
• Recipientes de plástico herméticos (tipo Tupperware)
• Papel de filtro de laboratorio (para hacer bolsitas en las que se mete Silicagel)
• Botes de plástico de 60 ml tapón de estrella
• Guantes de látex o vinilo (sin talco)
• Cinta adhesiva (para cerrar las placas)
• Material de etiquetado
• Estadillo
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
Hacer una pesca vertical entre la superficie y por debajo del máximo de clorofila
(150-200 m en aguas oceánicas). No lavar la red con ninguna manguera de agua
marina mientras está en el cable con el colector. Desmontar y llevar al interior del
laboratorio con cuidado que no se vuelque el colector.
517
El contenido del colector se dividirá en dos partes iguales, una parte será para el
grupo de fitoplancton y la otra para el de zooplancton.
La muestra para zooplancton (1/2 muestra total) se vierte a una probeta de 500
ml, se enrasa a 250ml (foto 1), se homogeneiza por volteo tapando la parte
superior con la mano enguantada (fotos 2,3).
Si la muestra es >250ml se pasa por el tamiz más pequeño (40µm) y de ahí a una
jarra medidora de 2 L para reconcentrarla en 250ml (Foto 4). Se volvería a repetir
la homogeneización en la probeta (fotos 2,3).
Guardar el filtro en la caja Petri (foto 8). Anotar los datos correspondientes al
número de filtro (correlativo), peso seco del filtro y etiqueta de la placa en el
estadillo y el volumen filtrado si se filtran menos de los 250 ml.
Secar el filtro en su placa (abierta) en estufa (60 ºC, 24-48 h) (foto 9) y después
guardar la placa cerrada con cinta adhesiva en caja hermética (tipo
tupperware) con bolsitas de papel de filtro con Silicagel (foto 10).
Nota: Estas bolsitas de Silicagel hay que meterlas a la estufa cada 3-4 días para
que recuperen su efecto desecador.
518
Pasar el contenido de cada tamiz a jarra medidora de 2L con la ayuda de un
pulverizador y enrasar a 250 ml (foto 4). Si es posible, filtrar todo el contenido de la
muestra por un filtro GF de 47 mm prepesado (foto 7). Si hay mucho plancton ir
filtrando alícuotas de 100 ml (medir con las marcas de la copa de filtración
cortando el vacio) hasta que el filtro esté completamente tupido y la velocidad
de filtración sea lenta (Nota: agitar bien la jarra antes de echar las alícuotas).
Guardar el filtro en la caja Petri (foto 8). Anotar los datos correspondientes al
número de filtro, peso seco del filtro, la fracción de tamaño correspondiente y
etiqueta de la placa en el estadillo, así como el volumen filtrado si se filtran menos
de los 250 ml enrasados. Secar el filtro en su placa (abierta) en estufa (60 ºC, 24-48
h) y después guarda la placa cerrada con cinta adhesiva en caja hermética con
bolsitas de papel de filtro con Silicagel (fotos 9,10).
Al retirar los filtros con su placa de la estufa, empaquetar juntas todas las placas
de cada estación/día (incluyendo la de la red de 40 µm).
519
520
Estadillo de datos:
Muestreador: RED DE 40 µm
Hora Columna
Latitud Longitud Hora inicio
fin muestreada
Observaciones
Variable: MICROPLANCTON
Muestra formol
Volumen
Código digital muestras asoc Observaciones
alícuota
Muestra isótopos
Volumen
Código digital muestras asoc nº filtro peso filtro Observaciones
alícuota
2/5
Muestreador: MULTINET
Prof. de Hora inicio Hora fin Vol. Filtrado
Observaciones
muestreo (UTC) (UTC) (m3)
Variable: MESOPLANCTON
Código digital muestras fracción Volumen nº filtro peso filtro Observaciones
asoc alicuota
2000 1/5
1000 1/5
500 1/5
200 1/5
521
10. Cuadro sinóptico de la técnica
522
523
11. Calculo de los resultados
14. Referencias
524
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
2. Titulo de la técnica
5. Conceptos generales
Esta ficha contiene un guión simple, adaptativo y orientado a cubrir los siguientes
aspectos:
525
taxonómica.
3) La medición del contenido en carbono y del peso fresco, con el objeto de
poder hacer estimas de actividad fisiológica, y para reconstruir el origen
filogenético de la estrategia gelatinosa.
6. Equipamiento necesario
Redes de plancton
Congelador -80ºC
Balanza de 0.1gms de precisión
Estufa a 60ªC
Cámara DSLR (canon Mark III)
Objetivo macro 100mm
Mesa de reprografía Kaiser Re PRO con columna
Juego de Flashes de Estudio de 600W
Brazos articulados para flashes
Placa-stand de policarbonato
Ordenador Macintosh IMAC 21,5 pulgadas (para el control remoto de la cámara)
Disco RAID 4TB
Software de manejo remoto de la cámara y de administración de archivos
fotográficos
Software de respaldo automático de información
Cables USB
Cables firewire 800
Cable Syncro
Supresor de picos de energía eléctrica
Reactivos:
Agua de mar filtrada
526
Silicagel para muestras secas de CNH
Etanol Absoluto 96%
Formol al 4%
Cristales de mentol
Nitrógeno líquido
Material:
Baño para mantener muestras frescas
Jarra de filtración con tamiz de 5mm
Placas petri de vidrio (con escala de tamaño en el fondo)
Frascos lavadores
Lámpara de alcohol o mechero bunsen
Pinzas
Coladores de distintos tamaños
Red de NYTAL
Bandejas de aluminio de diferentes tamaños
Botes plásticos de precintado (volúmenes: 180,280, 500, 800 ml.)
Dispensador de volumen fijo para formol
Dispensador de volumen fijo para etanol absoluto
Papel para etiquetas de muestras de sistemática
Marcadores indelebles
Tubos de centrifuga de polipropileno de 15 ml (para muestras de barcode)
Pesos de referencia para calibración
Balanza con precisión 0.2mg
8. Calibración
9. Descripción de la Técnica
527
vuelve o se dirige a puntos específicos del proceso. Se describen también los
procesos de etiquetado y preparación del equipo fotográfico .
p1.4. Dejar a los organismos en el agua filtrada del baño isotérmico durante 1 h
para que defequen.
p 1.5. Hacer una pesada de todo el material gelatinoso contenido en cada una
de las jarras. Retirar el agua excedente utilizando una malla de NYTAL y pesar
el material en una bandeja de aluminio de tamaño proporcional a la
cantidad de material gelatinoso recolectado. Anotar en estadillo.
p1.6. Trillar la muestra de una de las jarras utilizando pinzas, garcilla, o coladores
de acuario, poniendo cada individuo en un bote con agua filtrada. Los botes
estarán previamente numerados y los individuos recolectados en cada jarra
deberán irse adicionando a los botes ordenados por taxones, considerando
cuantos individuos de cada taxón han sido recolectados de acuerdo al
siguiente orden de prioridades:
1 Individuo –Muestra para sistemática
2 Individuos-Muestra para sistemática y para DNA barcode
3 ≥ individuos – Muestra sistemática, DNA barcode y el resto para biomasa y
CHN
p1.7. Anotar el número de cada uno de los botes en los cuales se fueron
guardando los organismos recolectados
528
p 1.8. Hacer una pesada de el material gelatinoso residual o restante que no ha
logrado separarse (por ejemplo organismos incompletos y material gelatinoso
que no se logre distinguir claramente). Anotar en estadillo.
529
p2. FOTOGRAFÍA DE ZOOPLANCTON GELATINOSO
530
p3. MUESTREO PARA SISTEMÁTICA.
P3.3. Rellenar con las cantidades adecuadas de formol al 40% tamponado con
bórax y agua de mar filtrada para obtener una concentración final de formol
al 4%, utilizando las jeringuillas destinadas a este fin.
P3.6. ¿Quedan mas organismos del mismo taxón? Ir a P.4 para muestreo de DNA
Barcode.
531
P4. MUESTREO PARA DNA BARCODE.
P4.1 Para esta finalidad se requieren dos ejemplares, sin embargo si solo se
dispone de uno además del ejemplar de sistemática el segundo se utilizara para
barcoding
p4.2. Si el animal entra en el bote de barcoding (criovial de 15ml) y deja 90% del
volumen interior libre ir a 3.5. Si el animal no entra en el bote o no deja 90% de
su interior libre, pasar a p3.4.
p3.6. Pasar el bote de barcoding por nitrógeno líquido usando una media y
almacenar en el congelador a -80ºC. Guardar en el contenedor designado
para las muestras de DNA Barcoding en el congelador.
p3.8 Si queda alguna otro frasco con otro taxón (uno o varios individuos), volver a
empezar en la sección P3. Si no quedan más taxones, el muestreo ha
finalizado. Apagar el equipo según sección P.8.
Si quedan mas organismos en los botes pasar a la sección de biomasa y CHN. Si
quedan organismos en otras jarras correspondientes a otro colector ir a p1.8. Si no
quedan mas individuos apagar de acuerdo a la sección P.8.
532
P5. MUESTREO PARA CONTENIDO EN CARBONO.
P5.2. Se retira el exceso de agua a los organismos con papel secante y una tela
de NYTAL. Esta operación se realiza utilizando los diferentes tipos de coladores
y la tela de NYTAL.
P5.5 Registrar los datos de las cinco pesadas correspondientes a cada individuo y
el peso total en el estadillo. Calcular la media y desviación típica de las
medidas y anotar estos valores en la celda correspondiente del estadillo. en
sección p8.
533
p.6 SECADO DE ZOOPLANCTON GELATINOSO
534
P7. ETIQUETADO DE MUESTRAS DE SISTEMÁTICA Y BARCODING
Crear cada etiqueta por separado, una vez que se tiene el frasco con el
organismo, con el programa de generación de etiquetas Malaspina Label,
teniendo en cuenta que todos frascos generados a partir de una sola muestra y
para la misma finalidad (taxonomía, genética o CNH) serán considerados
replicados entre sí. Si la muestra es para taxonomía meter una etiqueta de papel
vegetal en el bote con el código digital del frasco. Colocar la etiqueta en el
frasco o bandeja protegida por cinta adhesiva transparente.
En el caso del frasco de 15 ml (criovial), no etiquetar pues irá a N2, rotular el
correspondiente código digital.
535
10. Cuadro sinóptico de la técnica
No hay cálculos
Por motivos relacionados al movimiento del barco existe cierta variación en los
resultados del peso húmedo. Por lo que se realizan 5 pesajes y se considera el
valor de la media. Se contempla el uso de pesas de referencia para calibrar
constantemente la balanza.
14. Referencias
Dawson M.N, K.A. Raskoff, & D.K. Jacobs. 1998. Preservation of marine invertebrate
tissues for DNA analyses. Molecular Marine Biology and Biotechnology 7: 145-
152
Larson RJ 1986 Water content, organic content, and carbon and nitrogen
composition of medusae from the northern pacific. Journal of Experimental
Marine Biology and Ecology 99:107–120
Postel L., H. Fock and W. Hagen 2000 Biomass and Anbundance. In R. P. Harris, P. H.
Wiebe, J. Lenz, H. R. Skjoldal, and M. Huntley, editors. Zooplankton
Methodology Manual. Academic Press, San Diego, California 83-174pp.
Purcell J.E. & Strudevant M.V. 2001 Prey selection and dietary overlap among
zooplanktivoros jellyfish and juvenile fishes in Prince William Sound, Alaska.
Marine Ecology Progress Series 210: 67-83
536
Richardson A, Bakun A, Hays G, Gibbons M. 2009. The jellyfish joyride: causes,
consequences and management responses to a more gelatinous future.
Trends in Ecology and Evolution 24:312-322
537
Esquema de caracteres diagnósticos de los principales taxones de zooplancton
gelatinoso.
538
p1.1.
¿Hay
ZG
en
alguno
de
los
colectores
de
la
red
mulCnet
o
red
de
X
9
SECCIÓN
p1:
TRATAMIENTO
INICIAL
neuston
de
la
pesca
en
el
baño
de
agua
de
mar
fría
y
filtrada?
no
si
FIN
DEL
MUESTREO
p1.2.
Pasar
el
contenido
de
un
colector
con
ZG
por
una
copa
o
jarra
de
filtración
con
malla
de
5
mm
Luz
de
malla5mm
p1.3. Colocar la malla dentro del baño frio para ZG si
no
p1.
5.
Dejar
a
los
organismos
en
el
agua
filtrada
durante
1
h
para
que
defequen.
p1.
6.
Cuando
se
vaya
a
comenzar
el
procesado,
encender
el
enchufe
general
(alimenta
la
cámara,
la
mesa
de
reprogra[a,
el
sistema
de
iluminación
y
el
disco
duro
externo).
p2.3.
De
los
botes
de
sistemáCca
disponibles,
seleccionar
uno
en
el
que
el
animal
esté
holgado
(p.e.
que
ocupe
un
10%
a
lo
más
del
volumen
interior
del
bote).,
y
poner
el
espécimen
en
su
interior.
p2.4.
Rellenar
con
las
canCdades
adecuadas
de
formol
puro
(4%)
y
(4%)
CH2O
+
(96%)
H2O
filtrada
agua
de
mar
filtrada
(96%),
uClizando
los
dispensadores.
p2.5.
EKquetar
de
acuerdo
con
la
sección
8.
Poner
eCqueta
con
papel
en
el
interior
de
la
muestra
y
por
fuera
del
bote
p2.6.
Sellar
bote
con
sistema
de
precintado
y
almacenar
en
el
contenedor
dispuesto
para
las
muestras
de
sistemáCca
almacenadas
en
formol
no
no
si
p2.9.
¿Queda
algún
colector
con
ZG?
si
Vuelve
a
p1.7
no
p3.3.
El
espécimen
¿entra
en
el
tubo
de
barcoding
y
deja
más
de
un
90%
de
espacio
libre
en
su
interior?
no
SI
p3.4.
Tomar
un
pedazo
de
tejido
preferentemente
de
los
brazos
o
de
el
margen
de
la
campana.
Es
necesario
uClizar
pinzas
esterilizadas
en
una
lámpara
de
alcohol.
Pinzas
estériles
p3.5.
Introducir
el
fragmento
o
el
individuo
un
bote
de
barcoding.
Rellenar
con
etanol
puro
usando
un
frasco
lavador.
p3.6.
EKquetar
de
acuerdo
con
SECCIÓN
8.
Pasar
la
muestra
por
el
nitrógeno
líquido
usando
una
media
y
almacenar
en
el
congelador
a
-‐80.
Puntos
adecuados
para
cortar
tejido
p3.7.
Pasar
la
muestra
por
el
nitrógeno
líquido
usando
una
media
y
almacenar
en
el
congelador
a
-‐80.
no
p4.1.
Seleccionar
una
bandeja
de
aluminio
tarada
que
se
adapte
al
tamaño
del
individuo
más
grande
que
quede
del
trillado.
En
la
base
de
todas
las
charolas
está
escrito
su
peso.
p4.3.
Se
reCra
el
exceso
de
agua
a
los
organismos
con
papel
secante
y
una
tela
de
NYTAL.
Esta
operación
se
realiza
uClizando
los
diferentes
Cpos
de
coladores
y
la
tela
de
NYTAL
p4.4.
Añadir
el
espécimen
a
la
bandeja
de
aluminio
tarada
y
pesarla
en
la
balanza
con
precisión
de
0,1
g.
si
p4.5.
Apuntar
datos
especimen
en
el
estadillo
ECquetar
de
acuerdo
si
Se
reCra
el
exceso
de
agua
con
la
red
de
NYTAL
y
colador
plano
con
DIAGR.
DE
ETIQUETADO(SECCIÓN
7).
p4.6. ¿Pesa la bandeja de pesada más de 10 g?
no
no
p4.8.
EKquetar
la
bandeja
de
pesada
de
acuerdo
con
DIAGR.
DE
ETIQUETADO(SECCIÓN
8.
p4.9.
Poner
la
bandeja
a
secar
de
acuerdo
con
la
sección
5
Se
tara
en
la
balanza
bandeja
de
Al
no
no
60o
C
p5.1
Verificar
que
la
temperatura
de
la
estufa
este
a
60ºC
p5.2
Cerciorarse
de
que
la
bandeja
de
aluminio
tenga
registrado
su
numero
de
registro
en
el
estadillo
p5.4
Pasado
el
Cempo
de
secado
y
evaporación
en
la
estufa
sacar
las
bandejas
con
las
muestras
de
la
estufa
cortarlas
y
doblarlas
en
forma
de
sobre
1)
p5.6
Almacenar
en
el
siCo
designado
para
muestras
de
CNH
Bandeja
lista
para
almacenarse
FIN
DEL
MUESTREO
VIENE
DE
SECCIONES
p2,
p3,
y
p4
p6.1.
Asegurarse
de
que
el
cable
conector
de
la
cámara
al
ordenador
está
conectado
p6.2.
Encender
la
cámara
de
la
mesa
de
reprogra[a
(la
Canon
EOS
Mark
Encendido
cámara
y
mesa
de
rperogra[a
III).
p6.3.
Debe
acCvarse
el
programa
de
control
de
la
cámara
("EOS
UClity")
y
el
programa
de
administración
de
archivos
fotográficos
("Digital
photo
professional").
p6.4
Si
el
sorware
de
control
de
la
camara
no
se
acCva.
Seguir
la
siguiente
secuencia:
1)
Ir
a
el
buscador
de
archivos
o
finder
y
abrir
la
carpeta
aplicaciones
Sorware
de
administración
de
archivos
fotográficos
“Digital
photo
professional”
2)
Abrir
la
carpeta
canon
uCliCes
3)
Hacer
doble
click
en
la
en
el
icono
EOS
uClity
y
Digital
Photo
Professional
4)
Si
no
se
hay
comunicación.
Verificar
los
cables.
Apagar
y
enecender
la
camara
p6.6 Asegurarse de la cámara está en modo AV y en modo C1
Sorware
de
control
de
la
cámara
“Eos
UClity”
en
modo
AV
y
C1
p6.7
Asegurarse
de
que
la
posición
del
flash
es
correcta
p6.7
Fin
preparación
mesa
reprogra[a.
Seguir
en
7.1
Para
tomar
fotografias
p7.1.
Coger
el
individuo
que
esté
en
mejor
estado,
ponerlo
sobre
una
placa
de
petri
que
contenga
una
escala
espacial
del
tamaño
adecuado;
con
agua
de
mar
filtrada
con
mentol
que
se
saca
de
frasco
rociador
.
Si
es
una
medusa,
orientar
los
tentáculos
hacia
arriba.
SECCIÓN
p7:
FOTOGRAFÍA
ZG
p7.3.UClizando
la
función
de
enfoque
del
sorware
de
control,
enfocar
el
organismo,
verificar
que
este
enfocado
todo
el
organismo
especialmente
los
caracteres
necesarios
para
su
correcta
determinación.
(VER
ESQUEMA
DE
CARACTERES)
p7.
5
Hacer
un
disparo
de
prueba
para
verificar
que
el
organismo
se
encuentra
enfocado
p7.7.
Apuntar
el
código
de
foto
en
estadillo
(Ver
sección
.8
para
codigos
del
estadillo)
Si
es
sistemaCca
ir
a
p2.2.
p7.8
Fin
de
la
fotogra[a
de
animales
con
la
mesa
de
reprogra[a.
Si
es
barcoding
ir
a
p3.3.
Volver
al
origen.
Si
es
CNH
ir
a
p4.3
Cámara
enfocada
adecuadamente
desde
el
sorware
y
disparo
de
prueba
SECCIÓN
p8:
DIAGRAMA
DE
ETIQUETADO
SistemáCca:
ECqueta
dentro
de
la
muestra
y
en
la
pared
del
bote
de
sistemáCca
A)
Medusas B)
C)
Salpas
D)
F) G) H)
Apendicularias Sifonoforos
E)
Referencias de fotos y esquemas: A) M N Dawson, http://scyphozoan.ucmercedlibrary.info/wiki/Methods
B, D, E, G, H) http://www.jellieszone.com/photography.htm, C)Bone Q. I. Editor. The biology of pelagic tunicates. Oxford University Press P.13,
Fig. 1.14. ; F) Guide of the marine zooplankton of the SE Australia: http://www.tafi.org.au/zooplankton/imagekey/appendicularia/index.html#image
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
4. Conceptos generales
Red planctónica para neuston. Este equipo básicamente consiste en una red de
plancton montada sobre un armazón rígido, al que se le acoplan unos flotadores
que hacen que el conjunto navegue por la superficie del mar sin hundirse.
545
La boca de la red debe ser rectangular para delimitar mejor el estrato que se
pretende muestrear. La red deberá estar provista de un flujómetro para
cuantificar el volumen muestreado. Este debe colocarse por debajo de la boca
de la red y unos 20 cm separado de ésta, para que su funcionamiento no se vea
perjudicado por las turbulencias del armazón de la red. Otros equipos, como un
pequeño CTD, podrían ser acoplados a la estructura para obtener datos
hidrológicos del transecto muestreado.
7. Descripción de la Técnica
546
El tiempo de muestreo será de unos 15 min, aumentándose este tiempo si la
cantidad de organismos colectados es pequeña. Debe tenerse en cuenta que la
muestra será dividida en tres, una para taxonomía, otra para isótopos y otra para
genética.
Recogida de muestras:
La limpieza de la red se realiza fácilmente con ésta colgada desde el chigre y
una manguera a presión de agua de mar (generalmente se usa la manguera
contra-incendios del barco), quedando todo el material filtrado concentrado en
el colector final.
Conservación de muestras:
Todo el material colectado se pasa a un conjunto de jarra-tamiz, compuesto por
una jarra de fondo cerrado y otra con fondo malla de 5000 µm, con la ayuda de
un pulverizador con agua de mar filtrada para separar organismos grandes del
resto, especialmente los gelatinosos. Antes de pasar a conservar el material es
importante comprobar si existe material gelatinoso. Organismos como los
ctenóforos se deshacen al contacto con el formol y hacen que la muestra se muy
difícil de analizar.
547
Muestra para isótopos: se utilizan filtros Whatman GF/F de 47 mm pre-pesados
(peso seco). La muestra se filtra mediante una bomba de vacío + kitasatos.
Anotar peso filtro seco en estadillo. Tras la filtración llevar el filtro+muestra a la
estufa (60 ºC, 24 h). Una vez seco, pesarlo, anotar peso en estadillo, doblarlo
cuidadosamente por la mitad e introducirlo de nuevo en su sobre. El sobre se
almacenará en una caja plástica hermética junto con todos los de la misma
etapa.
Recogida de material:
Lavar bien la red y colectores con agua dulce después de cada uso.
Inspeccionarlas por si existe alguna rotura. Cubrir la red con una loneta o plástico
para protegerla de suciedad o posibles quemaduras.
Al final de cada etapa la red debería limpiarse en profundidad introduciéndola
una noche en un tanque con agua dulce y un poco de lejía. En caso de estar
muy estropeada cambiarla por una nueva.
548
Estadillo de datos:
Hora fin (UTC) Latitud final Longitud final Fluj. Fin Vel viento (Kn) Estado del cielo
Observaciones
Variable: MESOPLANCTON
Volumen Peso seco Peso seco
Código digital muestras asoc Observaciones
alícuota filtro filtro + muestra
Variable: MACROPLANCTON
Volumen
Código digital muestras asoc Observaciones
alícuota
Peso
Nº de Código Observacio
Código digital muestras asoc Taxón fresco
organis. foto nes
(sólo CNH)
549
8. Cuadro sinóptico de la técnica
Protocolo gelatinosos
Puntos
terminados
5000 en 0 y 5 Taxonomía
mm 5ml Formol
Resto
Puntos Genética
Etanol
600 ml
10. Calibración
550
rápida velocidad de muestreo. Ambas circunstancias podrían evitarse realizando
muestreos preliminares.
siendo, A el área de la boca de la red; Dig2, la lectura final del flujómetro; Dig1, la
lectura inicial del flujómetro; C, constante suministrada por el fabricante referente
al valor (longitud) a que equivale un revolución del flujómetro. No obstante debe
tenerse en cuenta que no toda la boca de la red queda sumergida por lo que
debería restarse en los cálculos el área de la boca que se estima que queda
fuera del agua
551