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EXPEDICIÓN DE CIRCUNNAVEGACIÓN

MALASPINA 2010:
CAMBIO GLOBAL Y EXPLORACIÓN
DE LA BIODIVERSIDAD DEL OCÉANO GLOBAL

LIBRO BLANCO DE MÉTODOS,


TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS

Editado por Enrique Moreno-Ostos


(Universidad de Málaga)

Coordinado por Carlos M. Duarte


(IMEDEA-CSIC)
EXPEDICIÓN DE CIRCUNNAVEGACIÓN
MALASPINA 2010:

CAMBIO GLOBAL Y EXPLORACIÓN


DE LA BIODIVERSIDAD DEL OCÉANO GLOBAL

(CONSOLIDER INGENIO CSD 2008-00077)

LIBRO BLANCO DE MÉTODOS, TÉCNICAS Y


PROCEDIMIENTOS

VERSIÓN 2.0
DICIEMBRE 2010

1
Índice de contenidos

Equipo de trabajo………………………………………………………………………....2

Bloque 1. Coordinación…………………………………………………………......…3

- Maniobras a bordo del BIO Hespérides…………………..……………………4

- Volúmenes de agua y profundidades en la roseta de 4000 m …………...…9

- Derrota del BIO Hespérides……………………………………………………10

- Distribución de espacio a bordo del BIO Hespérides…………………….…13

- Normas de convivencia a bordo del BIO Hespérides……………………….39

Bloque 2. Cambio en las propiedades físicas del océano…………………......45

- Adquisición y procesado de datos CTD SE911+……..………………........46

- Adquisición y procesado de datos LADCP……………………………….…..60


- Análisis de muestras de salinidad. Salinómetro de laboratorio
- Autosal 8400 B………………………………………………………………......72

- Calibración de datos de CTD…………………………………………………..80

Bloque 3. Biogeoquímica del océano: Carbono, nutrientes y gases traza….87

- Muestreo y análisis de oxígeno disuelto en agua de mar……………….....88

- Determinación espectrofotométrica del pH mediante el uso de púrpura de


m-cresol…………………………………………………………………………..95

- Determinación de la alcalinidad mediante valoración rápida a doble punto


final……………………………………………………………………………...101

- Muestreo de Carbono Orgánico Volátil (VOC)………………………..……111

- Muestreo de nutrientes disueltos………………………………………….…121

- Filtración en rampa con presión positiva…………………………………....125

- Determinación de nitrógeno orgánico disuelto por el método de la oxidación


con persulfato en medio alcalino……………………………………………..129

- Análisis de la concentración de fósforo reactivo soluble por el método de la


formación del complejo azul de fosfomolibdato…………………………....133
- Determinación de fósforo orgánico disuelto y particulado por el método de
la oxidación en persulfato ácido……………………………………………...140

- Muestreo de agua de mar para el análisis de dimetilsulfuro (DMS) y


dimetilsulfoniopropionato (DMSP) por cromatografía de gases (GC)……145

- Muestreo de Carbono Orgánico Total (TOC) y Nitrógeno Total (TN)……152

- Recogida de muestras de Materia Orgánica Particulada (POM) y disuelta


ultrafiltrada (UDOM) en el océano profundo…………………………….….157

- Recogida y análisis a bordo de muestras de materia orgánica total


cromófora : abosrobancia (aDOM) y fluorescencia (FDOM)……………...171

- Determinación manual de urea en agua de mar…………………………...187

- Determinación del consumo de 15NO3-, 15NH4+ y 15urea


y fijación de 15N2......................................................................................198

- Muestreo de metales y vitaminas disueltas………………….……………..210

- Sistema para el análisis en continuo de la razón 13C/12C y concentraciones


del CO2 atmosférico y del DIC marino……………………………………….214

- Extracción de gases disueltos y su almacenamiento para análisis


isotópico……………………………………………………………………...…227

- Composición isotópica del vapor atmosférico………………………………238

- Medidas de la tasa de disipación de energía cinética turbulenta………...254

Bloque 4. Contaminantes y deposición atmosférica………………………281

- Muestreo de partículas marinas superficiales (5m)…….………………….282

- Muestreo de compuestos orgánicos en la fase disuelta y en partículas


marinas superficiales (5 m)…………………………………………………...285

- Muestreo de aerosoles……………………………………………………..…288

- Muestreo de aerosoles PM 2.5……………………………………………….291

- Muestreo de aerosoles (TSP) y compuestos semi-volátiles en la fase


gas……………………………………………………………………………….294

- Recolección de bioaerosoles atmosféricos sobre el océano……………..298

- Muestreo de compuestos orgánicos en el fitoplancton de la zona fótica de


la columna de agua (hasta el DCM)…………………………………………302
Bloque 5. Óptica, fitoplancton, producción y metabolismo en el
océano…………………………………………………………..…………….……305

- Determinación de los espectros de absorción de la luz por partículas…..306

- Muestreo de fitoplancton desde las botellas Niskin………………………..312

- Muestreo de fitoplancton utilizando redes…………………………………..314

- Muestreo de cocolitóforos………………………………………………….…318

- Toma de muestras de fitoplancton mayor de 20 μm para análisis de


imagen…………………………………………………………………………..321

- Cuantificación del metabolismo de la comunidad pelágica mediante el


método Winkler………………………………………………………………...324

- Determinación de la producción primaria fraccionada por tamaños……..336

- Determinación de la producción fotosintética de carbono orgánico


disuelto………………………………………………………………………….340

- GPP-18O…..…………………………………………………………………….344

- Determinación fluorimétrica de la concentración de clorofila a…………...348

- Toma de muestras para análisis de pigmentos mediante HPLC…………355

- Tasa de depredación y crecimiento del fitoplancton mediante técnicas de


dilución……………………………………………………………………….…361

- Tasa bruta de crecimiento del picofitoplancton mediante análisis del índice


mitótico………………………………………………………………………….367

- Cuantificación de la abundancia de células vivas y muertas de las


comunidades de picoplancton………………………………………………..371

- Tasa de lisis celular del fitoplancton…………………………………………377

- Determinación de la abundancia de nano y picofitoplancton mediante


citometría de flujo………………………………………………………………384

Bloque 6. Biodiversidad microbiana y función ecológica………………..393

- Estudio de las bacterias aeróbicas anoxigénicas fototrópicas (AAPs)…..394

- Concentración de biomasa de picoeucariotas, bacterias y virus marinos


para la extracción de ácidos nucleicos……………………………………...399

- Determinación de la diversidad funcional del bacterioplancton marino….411


- Incorporación de bromodeoxiuridina en ADN microbiano para la detección
de filotipos activos……………………………………………………………..415

- Muestreo para estudio de biodiversidad del plancton microbiano a partir de


sondas específicas y FISH…………………………………………………...420

- Determinación de abundancia y actividad individual bacteriana por


citometría de flujo………………………………………………………………424

- Muestreo para recuentos de flagelados heterotróficos por citometría de


flujo……………………………………………………………………………...430

- Estudio de la cuantificación de CID por el plancton procariota


mesopelágicos…………………………………………………………………433

- Actividad enzimática de los procariotas planctónicos…………………..…436

- Muestreo para recuentos de microorganismos por epifluorescencia…….448

- Determinación de la actividad bacteriana mediante la incorporación de


leucina radioactiva……………………………………………………………..452

- Respiración mediante cambios in Vitro de la concentración de O2………459

- Medida de Partículas Exopoliméricas Transparentes (TEP) en agua


marina…………………………………………………………………………...466

- Determinación de la abundancia de virus por citometría de flujo………...473

- Determinación de la depredación bacteriana debida a protistas, mediante la


desaparición en el tiempo de bacterias marcadas con un compuesto
fluorescente (FLB)……………………………………………………………..480

- Determinación de la producción de virus debida a la lisis bacteriana……485

- Determinación de la composición de la comunidad vírica……………...…489

Bloque 7. Distribución y función del zooplancton en el océano………...497

- Muestreo de microzooplancton profundo (> 2000 m)….…………………..498

- Muestreo de microplancton superficial………………………………………504

- Procesado de muestras de meso y macroplancton tomadas con


multinet………………………………………………………………………….508

- Procesado de muestras para el análisis de isótopos estables en


plancton…………………………………………………………………………516
- Muestreo de zooplancton gelatinoso……………………………………...…525

- Muestreo de neuston (> 200 μm)…………………………………………….545


EXPEDICIÓN MALASPINA 2010

LIBRO BLANCO DE MÉTODOS, TÉCNICAS Y


PROCEDIMIENTOS

EQUIPO DE TRABAJO:

Bloque 1 (Coordinación): Dr. Carlos M. Duarte

Bloque 2 (Cambio en las propiedades físicas del


Oceáno): Dr. Pedro Joaquín Vélez y Dr. Eugenio
Fraile Nuez

Bloque 3 (Biogeoquímica del Oceáno.Carbono,


nutrientes y gases traza): Dra. Marta Alvárez

Bloque 4 (Contaminantes y deposición atmosférica):


Dr. Jordi Dachs

Bloque 5 (Óptica, fitoplancton, producción y


metabolismo en el Océano): Dra. Nuria Navarro y
Dr. Enrique Moreno-Ostos

Bloque 6 (Biodiversidad microbiana y función


ecológica): Dr. Jesús María Arrieta

Bloque 7 (Distribución y función del zooplancton


en el Océano global): José Ignacio González
Gordillo

Editor del Libro Blanco: Dr. Enrique Moreno-Ostos

2
BLOQUE 1

COORDINACIÓN

3
Maniobras Expedición Malaspina-2010

1. Maniobras a bordo del BIO Hespérides.

(17 Abril 2010)

Ciclo de estaciones: Dia 1: A... Día 2: A...Día 3: B...Día 4: A...Día 5: A... Día 6:
C (i.e. 2 estaciones A seguidas de una estación B, y una C en vez de una B
cada seis días; y repetición del ciclo).

Las estaciones a muestrear, posiciones aproximadas y fechas aproximadas


(sobre la hipótesis de una fecha de salida fija) se adjuntan en anexo. Se
muestreará sobre la derrota prevista por hora, no por posición (a no ser que
haya un conflicto de profundidades).

La incomparecencia del científico responsable a la hora


de la maniobra dará lugar a la cancelación de la maniobra
en cuestión.

Responsable de gestión: Jefe Científico

El jefe científico confirmará al oficial de guardia en el puente la secuencia de


maniobras con al menos 12 horas de antelación y la enviará por correo
electrónico a los puestos implicados: puente, comandante, segundo
comandante, oficial de maniobra.

Cada maniobra tendrá un científico responsable que deberá comunicar


cualquier problema o dificultad cuanto antes al jefe científico. El responsable de
maniobra habrá de tener todo el material para la maniobra preparado y estar en
la vía húmeda/toldilla 10 min. antes del inicio de la maniobra provisto/a de
calzado de seguridad y guantes de trabajo.

Se muestreará una estación por día. El Jefe Científico, en consulta con los
investigadores y el coordinador del proyecto, podrá decidir saltase alguna
estación por causas de fuerza mayor, o añadir alguna estación cuando el
tiempo ganado lo permita.

Algunas estaciones se realizarán, en una versión corta, más tarde,


particularmente a la salida de puerto, para buscar aguas internacionales (ver
notas en fichero estaciones).

Estaciones A:

5:00 - 9:00 CTD a 4.000 h (científico responsable de maniobra: persona


designada por bloque microheterótrofos)

4
7:30 - 8:40 Seis lances de Botellones de 30 L a 3 m de profundidad (bloques
biogeoquímica: 2 botellones; bloque fitoplancton: 2 botellones; bloque
microheterótrofos: 2 botellones; científico responsable de maniobra: personal
designado por cada bloque implicado). Responsable de botellones:
Biogeoquímica.

9:00 - 10:30 Pescas Verticales (30’ fitop + zooplancton a 200 m; 60’


contaminantes; científico responsable de maniobra: personal designado por
cada bloque implicado.

10:30 - 11:00 CTD 200 m (distribución de agua y botellas acordada, científico


responsable de maniobra: personal designado por bloque fitoplancton).

10:40 - 10:50 Un lance de Botellón de 30 L (bloque fitoplancton, científico


responsable de maniobra: persona designada por bloque fitoplancton)

11:00 - 11:30 Radiómetro (bloque fitoplancton, científico responsable de


maniobra: persona designada por bloque fitoplancton)

11:30 - 12:30 Pesca Red Multinet (popa) (bloque Zooplancton, científico


responsable de maniobra: persona designada por bloque Zooplancton)

12:30 - Salida de estación

En la Arrancada (2 a 4 nudos): en proa torpedo muestreo de metales (10’,


científico responsable de maniobra: persona designada por bloque
biogeoquímica) y en el pórtico lateral de popa una red de neuston (científico
responsable de maniobra: persona designada por bloque zooplancton).

Total: 7 h 30’

Estaciones B:

5:00 - 9:00 CTD a 4.000 h (científico responsable de maniobra: persona


designada por bloque microheterótrofos)

7:40 - 8:40 Seis lances de Botellones de 30 L a 3 m de profundidad (bloques


biogeoquímica: 2 botellones; bloque fitoplancton: 2 botellones; bloque
microheterótrofos: 2 botellones; científico responsable de maniobra: personal
designado por cada bloque implicado).

9:00 - 10:30 Pescas Verticales (30’ fitop; 30’ contaminantes; 30’ zooplankton,
científico responsable de maniobra: personal designado por cada bloque
implicado.

10:30 - 11:00 CTD 200 m (distribución de agua y botellas acordada, científico


responsable de maniobra: personal designado por bloque fitoplancton).

10:40 - 10:50 Un lance de Botellón de 30 L (bloque fitoplanton, científico


responsable de maniobra: persona designada por bloque fitoplanton)

5
11:00 - 11:30 Radiómetro (bloque fitoplanton, científico responsable de
maniobra: persona designada por bloque fitoplanton)

11:30 - 12:00 Perfilador Turbulencia (persona designada por bloque de física).

12:00 – 12:30 CTD 200 m (Fijación de N)

12:30 - 13:30 Pesca Red Multinet (popa) (bloque Zooplancton, científico


responsable de maniobra: persona designada por bloque Zooplancton)

13:30 - Salida de estación

En la Arrancada: en proa torpedo muestreo de metales (10’, científico


responsable de maniobra: persona designada por bloque biogeoquímica) y en
el pórtico lateral de popa una red de neuston (científico responsable de
maniobra: persona designada por bloque zooplancton).

Total: 8:00 h

Estaciones C:

5:00 - 9:00 CTD a 4.000 h (científico responsable de maniobra: persona


designada por bloque microheterótrofos)

7:40 - 8:40 Seis lances de Botellones de 30 L a 3 m de profundidad


(bloques biogeoquímica: 2 botellones; bloque fitoplancton: 2 botellones; bloque
microheterótrofos: 2 botellones; científico responsable de maniobra: personal
designado por cada bloque implicado).

9:00 - 10:30 Pescas Verticales (30’ fitop; 30’ contaminantes; 30’ zooplankton,
científico responsable de maniobra: personal designado por cada bloque
implicado.

10:30 - 11:00 CTD 200 m (distribución de agua y botellas acordada, científico


responsable de maniobra: personal designado por bloque fitoplancton).

10:40 - 10:50 Un lance de Botellón de 30 L (bloque fitoplanton, científico


responsable de maniobra: persona designada por bloque fitoplanton)

11:00 - 11:30 Radiómetro (bloque fitoplanton, científico responsable de


maniobra: persona designada por bloque fitoplanton)

11:30 - 12:00 Perfilador Turbulencia (persona designada por bloque de física).

13:00 - 17:00 Pesca Red Multinet a 4,000 m (popa) (bloque Zooplancton,


científico responsable de maniobra: persona designada por bloque
Zooplancton) [ Ajustar según vayamos de tiempo…]

17:00 - Salida de estación

6
En la Arrancada: en proa torpedo muestreo de metales (10’, científico
responsable de maniobra: persona designada por bloque biogeoquímica) y en
el pórtico lateral de popa una red de neuston (científico responsable de
maniobra: persona designada por bloque zooplancton).

Total: 11 h 00’

Criterio distribución de tiempo extra

El jefe científico llevará un cómputo de tiempos, calculando adelantos y


retrasos con respecto a la posición y hora/fecha de finalización de la etapa
previstas, con un banco de tiempo extra (debido a estaciones que se salten por
falta de permisos o fondos someros, y tiempo ahorrado en CTD profundo por
fondos someros) que será utilizado para las siguientes tareas:

1. Recuperar posibles pérdidas de tiempo por averías, etc. Esta utilización es


prioritaria.

2. Maniobras adicionales:

Más CTD profundos (1/4 del tiempo)


Pescas Multinet más profundas (1/4 del tiempo)
Más Pescas verticales (1/4 parte del tiempo)
Más lances de perfilador de turbulencia (1/4 parte del tiempo)

Evidentemente el tiempo de maniobras adicionales debido a ganancias hacia el


final de etapas se ha de asignar antes de que estas ganancias ocurran.

Criterios de recuperación de tiempo perdido

El jefe científico llevará un cómputo de tiempos, calculando adelantos y


retrasos con respecto a la posición y hora/fecha de finalización de la etapa
previstas, en caso de que el banco de tiempo pase a negativo (i.e. retraso en el
avance anticipado a lo largo de la derrota) las decisiones serán las siguientes:

Pérdidas debidas a fallos técnicos, condiciones de la mar, averías, etc.

1) Reducir la profundidad de las maniobra profundas a 3,000 m (i.e. ganancia


de 1.15 h cada día).

si esto no fuese suficiente:

1. Reducir en 15’ las pescas verticales (proporcionalmente entre bloques;


ganancia de 15’ cada día).

si esto no fuese suficiente:

3) Saltarse alguna estación A completa, pero nunca más de 1 estación seguida.


(ganancia 7.5 h).

7
2.Maniobras a bordo del Sarmiento de Gamboa.

Día Tipo:
El esquema de maniobras de un día tipo es el que sigue, si bien es necesario
tener en cuenta que las horas son aproximadas, pues dependerán de cuando
se
llegue a la posición (ver tabla adjunta), y además el número de estaciones
por día puede oscilar dependiendo de su profundidad, desde las 5 por día en
las zonas de plataforma a las 2 por día en la zona de la dorsal atlántica.

- 03:00 - 07:00 CTD hasta el fondo, 4.000 h (científico responsable de


maniobra: Jefe Turno)

- 07:00 - 07:30 Pescas Verticales (30’ zooplankton, científico responsable


de maniobra: personal designado por cada bloque implicado)

- 11:00 - 16:00 CTD hasta el fondo, 4.000 h (científico responsable de


maniobra: Jefe Turno)

- 19:00 - 23:00 CTD hasta el fondo, 4.000 h (científico responsable de


maniobra: Jefe Turno)

8
Volúmenes de agua y profundidades en la roseta de 4000 metros

Roseta 4000 m Perfiles

BP, BA,
nutr, nutr org, CARD-FISH,
DOC, enzimas,
CDOM/FDOM, biologs, pesca
gases, DIC, DNA+RNA, invento
salinidad POM, isótopos etc botella
Profundidad Profundidad (m) Niskins Vol total (L) FÍSICA ???? Fito (L) Biogeo (L) Micro (L) Zoo (L) ContaminantesAgua
(L) remanente

DSL (upper) Prof 11 4 48 1 10 37 0


DSL (lower) Prof 12 4 67 1 10 56 -19 **ojo**
1000-1500 Prof 13 4 67.75 0.75 1 10 56 -19.75 **ojo**
2500-3000 Prof 14 4 47.75 0.75 1 10 36 0.25
4000 Prof 15 4 47.75 0.75 1 10 36 0.25
prof X 1 11.75 0.75 1 10 0.25
prof XX 1 11.75 0.75 1 10 0.25
prof XXX 1 11.75 0.75 1 10 0.25
Zoo pesca 1 pesca
24

DSL = Deep Scattering Layer (profundidades determinadas por responsable de sondas del grupo zoo)

Nota Carlos Ajustar 1 o 2 botellas en Deep Scattering Layer

Roseta 4000 m Colecciones

Estaciones B, C y D la secuencia será AAB AAC AAD …

CTD PROFUNDO Colecciones


CADA 3 DÍAS núm botellas comentarios tareas
BGQ+ Micro 1 prof 264 L 23 UDOM+POM (+colección), DNA+RNA (+colección)
Zoo pesca 1 pesca invento botella

Total botellas 24

Nota de Pep El acuerdo entre Micro y BGQ es que tomaremos los volúmenes de agua de la forma siguiente:
* estaciones B (Micro 264)
* estaciones C (BGQ 264)
* estaciones D (Micro 132 BGQ 132)

Así aseguramos que que se coge suficiente cantidad para la colección de DNA+RNA (stns B) y UDOM+POM (stns C)
y que tendremos estaciones en las que caracterizaremos la diversidad microbiana y quimica (stns D)

9
27-10-10 13:15:16 Local *** POINT SETUP *** WGS-84 Geographic Page 1
NO NAME LATITUDE LONGITUDE RADIUS SYM TEXT

1 15DIC 35°46.880'N 8°29.640'W 0.00 m 1314(K)


2 16DIC 35°01.800'N 10°45.600'W 0.00 m 1314(K)
3 17DIC 33°45.450'N 13°07.500'W 0.00 m 1314(K)
4 18DIC 31°51.500'N 15°05.400'W 0.00 m 1314(K)
5 19DIC 29°57.500'N 17°00.800'W 0.00 m 1314(K)
6 20DIC 28°03.600'N 18°54.100'W 0.00 m 1314(K)
7 21DIC 25°57.200'N 20°22.700'W 0.00 m 1314(K)
8 22DIC 23°50.900'N 21°49.800'W 0.00 m 1314(K)
9 23DIC 21°44.500'N 23°15.400'W 0.00 m 1314(K)
10 24DIC 19°38.200'N 24°39.800'W 0.00 m 1314(K)
11 25DIC 17°28.000'N 25°59.900'W 0.00 m 1314(K)
12 26DIC 14°57.000'N 25°59.900'W 0.00 m 1314(K)
13 27DIC 12°26.000'N 25°59.900'W 0.00 m 1314(K)
14 28DIC 9°55.000'N 25°59.900'W 0.00 m 1314(K)
15 29DIC 7°24.000'N 25°59.900'W 0.00 m 1314(K)
16 30DIC 4°53.000'N 25°59.900'W 0.00 m 1314(K)
17 31DIC 2°22.000'N 25°59.900'W 0.00 m 1314(K)
18 01ENE 0°09.000'S 25°59.900'W 0.00 m 1314(K)
19 02ENE 2°25.900'S 27°03.700'W 0.00 m 1314(K)
20 03ENE 4°42.700'S 28°07.700'W 0.00 m 1314(K)
21 04ENE 6°59.600'S 29°11.800'W 0.00 m 1314(K)
22 05ENE 9°16.400'S 30°16.300'W 0.00 m 1314(K)
23 06ENE 11°33.300'S 31°21.200'W 0.00 m 1314(K)
24 07ENE 13°50.100'S 32°26.600'W 0.00 m 1314(K)
25 08ENE 16°07.000'S 33°32.600'W 0.00 m 1314(K)
26 09ENE 18°24.400'S 34°39.400'W 0.00 m 1314(K)
27 10ENE 20°41.200'S 35°47.100'W 0.00 m 1314(K)
28 11ENE 22°58.100'S 36°55.900'W 0.00 m 1314(K)
29 18ENE 24°00.600'S 38°00.700'W 0.00 m 1314(K)
30 19ENE 24°31.517'S 35°08.933'W 0.00 m 1314(K)
31 20ENE 25°02.436'S 32°16.532'W 0.00 m 1314(K)
32 21ENE 25°33.366'S 29°23.319'W 0.00 m 1314(K)
33 22ENE 26°04.267'S 26°29.488'W 0.00 m 1314(K)
34 23ENE 26°35.191'S 23°34.756'W 0.00 m 1314(K)
35 24ENE 27°06.057'S 20°39.581'W 0.00 m 1314(K)
36 25ENE 27°36.973'S 17°43.279'W 0.00 m 1314(K)
37 26ENE 28°07.849'S 14°46.372'W 0.00 m 1314(K)
38 27ENE 28°38.766'S 11°48.405'W 0.00 m 1314(K)
39 28ENE 29°09.659'S 8°49.622'W 0.00 m 1314(K)
40 29ENE 29°40.520'S 5°50.213'W 0.00 m 1314(K)
41 30ENE 30°11.419'S 2°49.665'W 0.00 m 1314(K)
42 31ENE 30°42.033'S 0°11.811'E 0.00 m 1314(K)
43 01FEB 31°12.829'S 3°13.706'E 0.00 m 1314(K)
44 02FEB 31°43.745'S 6°17.367'E 0.00 m 1314(K)
45 03FEB 32°14.591'S 9°21.629'E 0.00 m 1314(K)
46 04FEB 32°45.441'S 12°26.813'E 0.00 m 1314(K)
47 05FEB 33°16.383'S 15°33.824'E 0.00 m 1314(K)
48 13FEB 35°08.055'S 25°37.153'E 0.00 m 1314(K)
49 14FEB 34°42.800'S 28°26.400'E 0.00 m 1314(K)
50 15FEB 34°22.300'S 31°49.200'E 0.00 m 1314(K)
51 16FEB 34°01.800'S 35°11.200'E 0.00 m 1314(K)
52 17FEB 33°41.300'S 38°32.400'E 0.00 m 1314(K)
53 18FEB 33°20.700'S 41°52.700'E 0.00 m 1314(K)
54 19FEB 33°00.200'S 45°12.300'E 0.00 m 1314(K)
55 20FEB 32°39.700'S 48°31.100'E 0.00 m 1314(K)
56 21FEB 32°19.200'S 51°49.100'E 0.00 m 1314(K)
57 22FEB 31°58.700'S 55°06.400'E 0.00 m 1314(K)
58 23FEB 31°38.200'S 58°23.000'E 0.00 m 1314(K)
59 24FEB 31°17.700'S 61°38.900'E 0.00 m 1314(K)
60 25FEB 30°57.200'S 64°54.000'E 0.00 m 1314(K) 10
61 26FEB 30°36.700'S 68°08.400'E 0.00 m 1314(K)
27-10-10 13:15:16 Local *** POINT SETUP *** WGS-84 Geographic Page 2
NO NAME LATITUDE LONGITUDE RADIUS SYM TEXT

62 27FEB 30°16.200'S 71°22.200'E 0.00 m 1314(K)


63 28FEB 29°55.600'S 74°35.300'E 0.00 m 1314(K)
64 01MAR 29°52.700'S 77°49.400'E 0.00 m 1314(K)
65 02MAR 29°49.700'S 81°03.400'E 0.00 m 1314(K)
66 03MAR 29°46.800'S 84°17.400'E 0.00 m 1314(K)
67 04MAR 29°43.900'S 87°31.200'E 0.00 m 1314(K)
68 05MAR 29°40.900'S 90°44.900'E 0.00 m 1314(K)
69 06MAR 29°38.000'S 93°58.600'E 0.00 m 1314(K)
70 07MAR 29°35.000'S 97°12.100'E 0.00 m 1314(K)
71 08MAR 29°58.400'S 100°24.100'E 0.00 m 1314(K)
72 09MAR 30°21.800'S 103°36.900'E 0.00 m 1314(K)
73 10MAR 30°45.300'S 106°50.400'E 0.00 m 1314(K)
74 11MAR 31°08.700'S 110°04.800'E 0.00 m 1314(K)
75 12MAR 31°32.100'S 113°19.900'E 0.00 m 1314(K)
76 18MAR 35°20.100'S 113°56.000'E 0.00 m 1314(K)
77 19MAR 35°59.100'S 117°23.700'E 0.00 m 1314(K)
78 20MAR 36°38.000'S 120°53.100'E 0.00 m 1314(K)
79 21MAR 37°17.000'S 124°24.300'E 0.00 m 1314(K)
80 22MAR 37°55.900'S 127°57.400'E 0.00 m 1314(K)
81 23MAR 38°34.900'S 131°32.300'E 0.00 m 1314(K)
82 24MAR 39°13.900'S 135°09.100'E 0.00 m 1314(K)
83 25MAR 39°52.800'S 138°48.000'E 0.00 m 1314(K)
84 26MAR 40°31.800'S 142°29.000'E 0.00 m 1314(K)
85 28 MAR 38°37.500'S 150°25.000'E 0.00 m 1314(K)
86 29MAR 36°36.955'S 151°01.172'E 0.00 m 1314(K)
87 17ABR 34°22.096'S 175°37.972'E 0.00 m 1314(K)
88 18ABR 31°52.590'S 176°40.974'E 0.00 m 1314(K)
89 19ABR 29°01.500'S 177°51.000'E 0.00 m 1314(K)
90 20ABR 26°42.500'S 179°25.500'E 0.00 m 1314(K)
91 20ABR BIS 24°24.602'S 178°46.345'W 0.00 m 1314(K)
92 21ABR 21°55.252'S 177°30.110'W 0.00 m 1314(K)
93 22ABR 19°25.968'S 176°15.245'W 0.00 m 1314(K)
94 23ABR 16°56.586'S 175°01.486'W 0.00 m 1314(K)
95 24ABR 14°27.053'S 173°48.638'W 0.00 m 1314(K)
96 25ABR 11°56.742'S 172°39.109'W 0.00 m 1314(K)
97 26ABR 9°25.500'S 171°32.000'W 0.00 m 1314(K)
98 27ABR 6°54.213'S 170°25.621'W 0.00 m 1314(K)
99 28ABR 4°23.100'S 169°19.548'W 0.00 m 1314(K)
100 29ABR 1°51.693'S 168°13.569'W 0.00 m 1314(K)
101 30ABR 0°39.490'N 167°07.784'W 0.00 m 1314(K)
102 01MAY 3°10.853'N 166°01.870'W 0.00 m 1314(K)
103 02MAY 5°41.759'N 164°56.023'W 0.00 m 1314(K)
104 03MAY 8°13.271'N 163°49.612'W 0.00 m 1314(K)
105 04MAY 10°44.476'N 162°42.900'W 0.00 m 1314(K)
106 05MAY 13°15.599'N 161°35.657'W 0.00 m 1314(K)
107 06MAY 15°46.618'N 160°27.744'W 0.00 m 1314(K)
108 07MAY 18°07.872'N 159°23.490'W 0.00 m 1314(K)
109 14 MAY ALOHA 23°45.000'N 158°00.000'W 0.00 m 1314(K)
110 15MAY 23°06.599'N 155°00.090'W 0.00 m 1314(K)
111 16MAY 22°28.177'N 152°00.951'W 0.00 m 1314(K)
112 17MAY 21°49.773'N 149°02.737'W 0.00 m 1314(K)
113 18MAY 21°11.373'N 146°05.323'W 0.00 m 1314(K)
114 19MAY 20°32.951'N 143°08.607'W 0.00 m 1314(K)
115 20MAY 19°54.539'N 140°12.677'W 0.00 m 1314(K)
116 21MAY 19°16.104'N 137°17.364'W 0.00 m 1314(K)
117 22MAY 18°37.692'N 134°22.841'W 0.00 m 1314(K)
118 23MAY 17°59.263'N 131°28.912'W 0.00 m 1314(K)
119 24MAY 17°20.832'N 128°35.606'W 0.00 m 1314(K)
120 25MAY 16°42.395'N 125°42.885'W 0.00 m 1314(K)
121 26MAY 16°03.960'N 122°50.763'W 0.00 m 1314(K) 11
122 27MAY 15°25.535'N 119°59.243'W 0.00 m 1314(K)
27-10-10 13:15:16 Local *** POINT SETUP *** WGS-84 Geographic Page 3
NO NAME LATITUDE LONGITUDE RADIUS SYM TEXT

123 28MAY 14°47.105'N 117°08.235'W 0.00 m 1314(K)


124 29MAY 14°08.648'N 114°17.620'W 0.00 m 1314(K)
125 30MAY 13°30.221'N 111°27.622'W 0.00 m 1314(K)
126 31MAY 12°51.771'N 108°37.984'W 0.00 m 1314(K)
127 01JUN 12°13.318'N 105°48.770'W 0.00 m 1314(K)
128 02JUN 11°34.882'N 103°00.046'W 0.00 m 1314(K)
129 03JUN 10°56.432'N 100°11.654'W 0.00 m 1314(K)
130 04JUN 10°17.975'N 97°23.598'W 0.00 m 1314(K)
131 05JUN 9°39.550'N 94°36.025'W 0.00 m 1314(K)
132 06JUN 9°01.102'N 91°48.681'W 0.00 m 1314(K)
133 07JUN 8°24.744'N 89°10.704'W 0.00 m 1314(K)
134 08JUN 6°55.932'N 82°45.835'W 0.00 m 1314(K)
135 20JUN 12°31.200'N 73°49.691'W 0.00 m 1314(K)
136 21JUN 13°26.060'N 71°06.185'W 0.00 m 1314(K)
137 22JUN 14°20.901'N 68°22.101'W 0.00 m 1314(K)
138 23JUN 15°15.760'N 65°37.285'W 0.00 m 1314(K)
139 24JUN 16°10.600'N 62°51.800'W 0.00 m 1314(K)
140 25JUN 17°10.872'N 60°07.551'W 0.00 m 1314(K)
141 26JUN 18°11.142'N 57°22.402'W 0.00 m 1314(K)
142 27JUN 19°11.424'N 54°36.256'W 0.00 m 1314(K)
143 28JUN 20°11.684'N 51°49.140'W 0.00 m 1314(K)
144 29JUN 21°11.959'N 49°00.890'W 0.00 m 1314(K)
145 30JUN 22°12.214'N 46°11.534'W 0.00 m 1314(K)
146 01JUL 23°12.461'N 43°20.970'W 0.00 m 1314(K)
147 02JUL 24°12.708'N 40°29.105'W 0.00 m 1314(K)
148 03JUL 25°12.962'N 37°35.843'W 0.00 m 1314(K)
149 04JUL 26°13.221'N 34°41.119'W 0.00 m 1314(K)
150 05JUL 27°13.442'N 31°44.974'W 0.00 m 1314(K)
151 06JUL 28°13.705'N 28°47.086'W 0.00 m 1314(K)
152 07JUL 29°13.935'N 25°47.606'W 0.00 m 1314(K)
153 08JUL 30°14.160'N 22°46.352'W 0.00 m 1314(K)
154 09JUL 31°14.404'N 19°43.161'W 0.00 m 1314(K)
155 10JUL 32°14.617'N 16°38.086'W 0.00 m 1314(K)
156 11JUL 33°17.400'N 13°22.900'W 0.00 m 1314(K)

12
DISTRIBUCIÓN DE ESPACIOS A BORDO

13
Incubaciones, en toldilla

14

domingo, 31 octubre 2010


Lab apertura de muestras Bloque 3: CO2 y H2O

15

domingo, 31 octubre 2010


Lab vía húmeda popa Bloque 4: POPs

16

domingo, 31 octubre 2010


Lab vía húmeda popa
Bloque 5: Filtración Óptica + manipulación experimentos

17

domingo, 31 octubre 2010


Lab vía húmeda popa
Común: LADCP y Descarga de datos de
instrumentos

18

domingo, 31 octubre 2010


Electrónica Proa
Común / Fotógrafo Bloque 7: Ecosonda

19

domingo, 31 octubre 2010


Electrónica Popa
Bloque 2: Control y procesado CTD

20

domingo, 31 octubre 2010


Vía Húmeda
Boques 4 y 3: Continuo 7: Zooplankton Fregadero: Común

UDOM-POM

21

domingo, 31 octubre 2010


Vía Húmeda
Bloque 7: Zooplancton

22

domingo, 31 octubre 2010


Vía Húmeda Proa
Bloque 3: Filtración POC/DOM

23

domingo, 31 octubre 2010


Vía Húmeda Proa
Bloque 5: Filtraciones

24

domingo, 31 octubre 2010


Vía Húmeda Proa
Bloque 5: Metabolismo

25

domingo, 31 octubre 2010


Vía Húmeda Popa
Bloque 4: Volátiles + Toma muestras
Común: Manipulación
experimentos

26

domingo, 31 octubre 2010


Electrónica Popa Bloque 2/3: Procesado + Turbomap
Bloque 7: Multinet

27

domingo, 31 octubre 2010


Apertura de Muestras
Bloque 5: Citómetro y Flurímetro Óptica

28

domingo, 31 octubre 2010


Apertura de Muesras
Común: Espectrofluorímetro (NH4, Esterasas, etc.)

Bloques 5 y
6: Contador
centello

29

domingo, 31 octubre 2010


Apertura de Muesras
Bloque 6: Producción + Enzimas
Bloque 3:Spectro pH+O2+Alk

30

domingo, 31 octubre 2010


Apertura de Muestras
Bloques 3, 4, 5 y 6: DOC + Volátiles (sellado de
ampoyas)
siembras en placa + radiacción UV

31

domingo, 31 octubre 2010


Apertura de Común: MiliQ +
Muesras limpieza
Común: Tóxico

32

domingo, 31 octubre 2010


Apertura de Muestras
Bloque 3 (todo el lab):
Autoanalizador
GCM
etc.

33

domingo, 31 octubre 2010


La Salinidad
Bloque 2: Autosal Bloque 6: Genómica y otros

34

domingo, 31 octubre 2010


Lab Microscopía
Microscopía: Bloques 5, 6 y 7

35

domingo, 31 octubre 2010


“Mapas”
Espectrofotómetro nuevo Fluoromax
Común Bloque 6: Citómetro

36

domingo, 31 octubre 2010


Sísmica
Radiómetro Bloque 7: Cámara fotos Medios/Crónica
Almacén seco

37

domingo, 31 octubre 2010


Otros
Productora TV: Local de Satélite/Metereología

Sobrepuente: Captadores aerosoles

38

domingo, 31 octubre 2010


NORMAS DE CONVIVENCIA  A BORDO DEL 
B.I.O. HESPÉRIDES 
EXPEDICIÓN MALASPINA (2010‐2011) 

La  Expedición  Malaspina  2010  tiene,  por  su  carácter  de  campaña  continua  de 
circunnavegación, en la cual durante la estancia en puerto se efectuaran visitas y ruedas de 
prensa,  y  produciéndose  un  cambio  de  científicos  participantes  de  forma  regular,  un 
carácter especial que requiere que se regule la presencia de personal científico y técnico a 
bordo  en  la  mar  y  en  puerto,  a  fin  de  asegurar  las  mejores  condiciones  de  habitabilidad 
posibles y su coordinación con las actividades del proyecto. A este fin, el Comandante del 
BIO Hespérides. CF. Juan Antonio Aguilar Cavanillas, el director de la UTM, J. J. Dañobeitia y 
el coordinador del proyecto Expedición Malaspina 2010, Prof. Carlos M. Duarte Quesada, 
han  acordado  unas  normas  de  habitabilidad  y  convivencia  ,  que  serán  de  obligado 
cumplimiento  para  todo  el  personal  científico‐técnico  que  participe  en  el  Proyecto  de 
Circunnavegación Malaspina 2010. 

I. NORMAS EN PUERTO: 
 
1) Todos  el  personal  científico  y  técnico  cuya  participación  en  el  proyecto 
Malaspina  concluya en un puerto intermedio, abandonará el buque la mañana 
de  llegada  a  puerto,  antes  de  las  1200  del  mediodía,  hora  local.  (cuando  la 
llegada se produzca a las 0800 habituales), o en un plazo de  cuatro horas si la 
llegada a puerto tuviese lugar más tarde de las 0800, siempre en horario diurno. 
 
2) Todo el personal científico‐técnico cuyo trabajo a bordo se inicie en un puerto  
intermedio,  ocupará  su  camarote  a  partir  de  la  noche  anterior  a  la    salida  del 
buque a la mar, nunca antes. 
 
3) El Jefe Científico y el Jefe de la UTM embarcados, máximos responsables de que 
se  cumplan  las  normas  de  convivencia  indicadas  por  parte  del  personal 
científico‐técnico,  nombrarán  una  “Persona  de  Contacto”  a  la  cual  dirigirse, 
para  todo  lo  referente  al  cumplimiento  de  estas  normas,  así  mismo,  será  el 
responsable de transmitir las necesidades del personal científico‐técnico, que no 
se  hayan  podido  atender  antes  de  la  entrada  en  puerto  al  personal  de  la 
dotación  designado  al  efecto  (Jefe  de  Aprovisionamiento  y  Suboficial  de 
Alojamientos y Servicios). Dicha persona de contacto, estará localizable en todo 
momento durante el horario de trabajo/visitas. 
 
4) El  personal  científico‐técnico  cuyo  trabajo  a  bordo  continúe  en  la  siguiente 
etapa  del  Proyecto,  seguirá  manteniendo  la  condición  de  personal  embarcado 

39
durante  la  estancia  del  buque  en  un  puerto  intermedio  y  podrá  mantener 
ocupado  su  camarote  si  así  lo  desea,  con  las  restricciones  que  se  señalan  a  
continuación: 
 
• Durante  la  estancia  en  puerto  únicamente  se  servirán  comidas  al 
personal  científico‐técnico  que  esté  a  bordo  para  atender  las  visitas  al 
buque relacionadas con el Proyecto (ya sean de medios de comunicación 
o  de  autoridades),  o  para  realizar  tareas  de  reparación  de  equipos  y 
recepción de material científico‐técnico. El Jefe Científico y el Jefe de la 
UTM o a través de su Persona de Contacto, entregarán una lista con el 
personal,  que  cumpliendo  las  condiciones  anteriormente  expuestas, 
comerá a bordo. Dicha lista será entregada al Oficial de Servicio, o en su 
defecto al Suboficial de Guardia siempre antes de las 0900 horas del día 
en cuestión, siendo aconsejable entregarla con 24 horas de antelación. 
 
• El  Servicio  de  Lavandería,  permanecerá  cerrado  durante  la  estancia en 
puerto para todo el personal científico‐técnico al igual que para el resto 
de la dotación, salvo casos excepcionales. 
 
• Durante  las  escalas  en  puerto,  todo  el  personal  científico‐técnico  que 
pernocte  a  bordo  del  buque,  sin  excepción,  deberá  ausentarse  del 
buque durante las horas fijadas para la limpieza, normalmente el día de 
llegada,  dejando  los  camarotes  listos  a  tal  fin.  El  personal  científico‐
técnico, dejará los espacios comunes arreglados, despejados de objetos 
y  listos  para  la  limpieza  a  las  0900  horas  del  día  en  que  se  haya 
contratado  el  servicio  de  limpieza.  En  el  caso  de  que  alguien  desee 
limpiar personalmente su camarote, deberá indicarlo y comunicarlo con 
antelación  suficiente  al  responsable  de  las  limpiezas  en  ese  puerto,  al 
objeto de que  los camarotes queden señalizados durante las  limpiezas. 
La  responsabilidad  de  la  verificación  del  servicio  de  limpieza  realizado 
recaerá exclusivamente sobre la persona  designada como  responsable 
de las limpiezas de zonas de personal científico‐técnico. 
 
• Durante  el  horario  de  actividades  relacionadas  con  el  Proyecto  y  que 
tengan lugar en puerto a bordo del buque (visitas o ruedas de prensa), 
solamente permanecerán  en  los  espacios  comunes  del  buque,  aquellos 
científicos‐técnicos  que  vayan  a  participar  en  estas  actividades,  o 
quienes  estén  involucrados  en  la  reparación  y  recepción  a  bordo  de 
equipos y material científico.  El resto del personal científico‐técnico solo 
podrá permanecer en su camarote; de circular por el buque, sólo lo hará 
para entrar o salir. Las puertas de los camarotes se mantendrán cerradas 
en todo momento durante el desarrollo de las actividades relacionadas 
con el Proyecto. 
 
 
• Cuando se celebre a bordo una rueda de prensa, el personal científico‐
técnico  que  no  intervenga  deberá,  en  la  medida  de  lo  posible, 

40
ausentarse  del  buque  durante  la  misma.  Si  decide  permanecer  en  su 
camarote, lo hará con la puerta cerrada hasta el fin de la misma, para no 
perturbar  el  acto,  que  tendrá  lugar  en  la  Cámara  de  Oficiales  y 
Científicos Nº1. 
 
5)    La  limpieza  de  la  cámara,  pasillos  y  office  de  la  zona  de  científicos  será 
responsabilidad  del  personal  científico‐técnico.  Estas  áreas  tendrán  que  estar 
recogidas  y  limpias  a  las  0900  horas  de  cada  día.  La/s  persona/s  de  contacto 
designadas  por  el  Jefe  Científico  y  el  Jefe  de  la  UTM,  se  preocuparán  del 
cumplimiento  de  las  normas,  así  como  de  comprobar  que  en  todo  momento 
disponen del material necesario, comunicando con antelación suficiente, antes 
de la entrada en puerto, cualquier necesidad de material de limpieza.  
 
6) El Jefe Científico y el Jefe de la UTM presentarán al Segundo Comandante antes 
de  la  entrada  a  cada  puerto,  un  listado  de  movimientos  de  personal  (se 
adjuntará modelo), identificando a las personas que desembarcan, embarcan o 
continúan a bordo, así como a aquellos que participarán en las visitas al buque 
relacionadas  con  el  Proyecto.  En  dicho  listado  se  facilitará  la  siguiente 
información: 
 
• Nombre y Apellidos 
• Nacionalidad 
• DNI ó Pasaporte 
• Número de Camarote 
 
El  Segundo  Comandante  proporcionará  las  llaves  de  los  camarotes  al  Jefe 
Científico y al Jefe de la UTM para el personal que continuando a bordo, así lo 
desee. El día de la salida a la mar serán devueltas al Segundo Comandante. 
 
7) El  barco  preparará  antes  de  la  llegada  a  cada  puerto  un  Calendario  de 
actividades a realizar durante la estancia en puerto y entregará una copia al Jefe 
Científico y al Jefe de la UTM. Al mismo tiempo el Jefe Científico y el Jefe de la 
UTM  facilitarán  al  Segundo  Comandante,  un  Calendario  de 
Trabajos/actividades  de  su  Personal  en  puerto,  poniendo  especial  énfasis  en 
aquellos  que  puedan  requerir  la  participación  de  miembros  de  la  dotación  del 
buque (movimiento de carga, recepción de material, etc.…). 

II. NORMAS EN LA MAR:  
 
1) Separación de basuras. A bordo se realizará en todo momento la separación de 
las  basuras.  Es  muy  importante  efectuar  esta  separación  también  en  los 
laboratorios, utilizando para ello los contenedores disponibles y rotulados para 
cada  tipo  de  basura.  Tanto  en  los  laboratorios  como  en  el  comedor  y  en  las 
distintas cámaras, hay contenedores para basura de los siguientes tipos: 
 
• orgánica (se tritura antes de arrojarse al mar)  
• papel (se quema) 

41
• envases (se compactan) 
 
Existen además contenedores para el almacenamiento de: 
 
• aerosoles  (cubierta de vuelo) 
•  pilas (Central de Máquinas) 
 
2) Comportamiento de respeto en zonas comunes 
 
• Respeto  y  cumplimiento  de  las  zonas  de  seguridad.  Es  importante 
respetar estas zonas durante el trabajo en cubierta, sobre todo el área 
de seguridad de los chigres y  grúas. Se cumplirán en todo momento las 
indicaciones  dadas  por  el  personal  de  la  dotación  en  cubierta.  Se 
respetaran  igualmente  las  zonas  de  trabajo  designadas  y  el  material 
asignado a cada zona de muestreo. 
 
• Todo  el  personal  que  se  encuentre  en  cubierta  participando  en  los 
trabajos  de  toma  de  muestras  deberá  llevar  el  vestuario  apropiad  que 
incluirá  los  equipos  de  protección  individual  (EPI´s),  compuesto  por  el 
chaleco salvavidas, casco, calzado de seguridad, guantes y todo artículo 
que fuese considerado necesario por el personal del buque responsable 
de la seguridad, de acuerdo con las circunstacncias. 
 
• Zona  de  fumadores.  Solamente  se  podrá  fumar  en  las  zonas 
específicamente  indicadas  para  ello  tanto  de  interiores  (solamente 
habilitadas  en  caso  de  mal  tiempo)  como  en  exteriores,  para  evitar  en 
todo momento la contaminación de las muestras. 
 
• Las  personas  responsables  de  las  visitas  guiadas  al  buque  durante  su 
estancia  en  puerto,  deberán  respetar  los  horarios  de  visitas, 
presentándose  con  la  antelación  requerida  al  objeto  de  ultimar  los.  El 
jefe  de  campaña  les  informará  de  los  horarios  y  de  las  instrucciones 
específicas de cada puerto. 
 
• Puntualidad  a  la  hora  del  muestreo.  Se  extremará  la  puntualidad  a  la 
hora  de  efectuar  los  muestreos.  En  caso  de  que  el  personal  designado 
para dicho muestreo no se encuentre en supuesto de trabajo a la hora 
correspondiente, ese muestreo será cancelado. 
 
• Se  recuerda  la  prohibición  de  consumir  bebidas  alcohólicas  de  alta 
graduación a bordo. 
 
• Celebraciones  durante  las  navegaciones:  En  cada  navegación  se  prevé 
organizar  dos  celebraciones  colectivas  (siempre  en  horario  diurno),  las 
cuales  serán  aprovechadas  para  conmemorar  cualquier  tipo  de 
onomástica, cumpleaños o celebración de cualquier otra índole y de tipo 
particular,  absteniéndose  por  tanto  los  participantes  en  cada  campaña 

42
de  solicitar  permisos  extraordinarios  para  celebrar  fiestas  de  cualquier 
otro tipo fuera de las mencionadas. 
 
• Buenas  prácticas  de  imagen:  Para  realizar  fotos  al  personal  de  la 
dotación del buque que vayan a ser publicadas en los medios, se avisará 
con una antelación de 24 horas al Segundo Comandante, acordándose el 
lugar, la hora y el personal implicado en el reportaje fotográfico que se 
desea realizar. Para fotografiar a cualquier persona a bordo del buque en 
momentos  de  ocio,  se  le  solicitará  previamente  su  autorización  para 
poder efectuar la toma de imágenes. 
 
3) Aspectos científicos 
 
• Los  participantes  que  vayan  a  necesitar  recarga  de  nitrógeno  líquido, 
deberán ponerse en contacto con el responsable a bordo (miembro de la 
UTM) con la antelación suficiente, para que se pueda confirmar con una 
semana  de  antelación  a  la  entrada  en  puerto,  el  pedido  a  la  empresa 
suministradora.  Los  bidones  a  recargar  se  sacarán  el  día  de  llegada  a 
puerto. 
 
• No se introducirán reactivos tóxicos en la cámara congeladora (‐18º C), 
ya  que  será  necesario  compartir  esta  cámara  con  almacenamiento  de 
víveres. 
 
• Todos los participantes en cada etapa de la campaña deberán conocer a 
los  responsables  a  bordo  de  los  asuntos  que  afecten  a  su  actividad 
científica (responsable de frío, residuos, etc.) 
 
4) Normativa de visados: 
 
Procedimiento a seguir a la hora de tramitar la entrada o salida del país en cada uno 
de los puertos: 
 
• En  primer  lugar,  los  jefes  científicos  de  cada  tramo  de    campaña 
remitirán con antelación suficiente los datos personales de los miembros 
de cada una de las campañas (según modelo adjunto). 
 
• Todo  el  personal  que  embarque  en  el  Hespérides  habrá  efectuado  su 
entrada  en  el  país  correspondiente  por  vía  aérea.  En  el  control  de 
seguridad del aeropuerto les sellarán en su pasaporte la entrada al país 
como a cualquier turista (puede que en algunos casos os entreguen una 
especie  de  certificado,  que  sería  aconsejable  no  perder).  Atentos  a  las 
peculiaridades de la entrada en USA. Habrá que obtener el permiso on‐ 
line y comprobar que el tipo de pasaporte es válido. 
 
• Muchos aprovecharán la oportunidad para presentarse unos días antes y 
recorrer  el  país.  Es  muy  importante  que  antes  de  que  el  barco  salga  a 

43
navegar  se  presentasen  con  antelación  suficiente  para  entregarnos  su 
pasaporte y tramitar su salida sellando su pasaporte, lo cual haremos a 
través  del  agente  logístico  que  nos  haya  asignado  la  Armada.  También 
pueden  hacerlo  a  nivel  particular,  presentándose  en  la  oficina 
correspondiente, pero siempre puede surgir algún inconveniente (sobre 
todo  en  determinados  países)  y  siempre  es  mejor  hacerlo  de  forma 
oficial, contando con el respaldo del agente logístico y de las autoridades 
locales. 
 
• El procedimiento con el personal que desembarca en cada puerto, será 
similar. Una vez que lleguemos a puerto, el agente logístico contratado 
por la Armada, subirá a bordo. El Habilitado le entregará los listados de 
personal  embarcado  (tanto  militar  como  civil  para  certificar  su  entrada 
en  el  país).  A  parte  se  le  entregará  una  lista  con  el  personal  que 
desembarca.  En  ese  instante  se  entregarán  los  pasaportes  que 
previamente habrán recabado del personal científico‐ técnico, para que 
sellen  la  entrada  (en  función  del  nivel  de  exigencia    de  cada  autoridad 
portuaria, es posible que soliciten información de los vuelos en los que el 
personal  abandonará  el  país).  La  salida  del  país  la  sellarán  en  el 
aeropuerto correspondiente, como es habitual. 
 
• Puede suceder que la autoridad migratoria solicite que todo el mundo se 
presente personalmente en las oficinas para sellar su pasaporte, aunque 
no  es  el  procedimiento  habitual,  ya  que  se  suelen  sellar  a  bordo  a  la 
llegada  del  buque  a  puerto,  ya  sea  porque  embarque  la  autoridad 
pertinente, o bien se encargue de ello el agente logístico. 
 
 
 

44
BLOQUE 2

CAMBIO EN LAS PROPIEDADES FÍSICAS DEL OCÉANO

MÉTODOS, TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS

45
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Procesado de muestras

2. Titulo de la técnica
Adquisición y procesado de datos CTD SBE911+

3. Autores del documento y filiación


Marta Nuez – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Pedro Vélez – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Eugenio Fraile – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Federico López Laatzen – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía

4. Finalidad. Campo de aplicación


El equipo CTD (siglas de “Conductivity”, “Temperature” y “Depth”) es un instrumento
electrónico que registra la conductividad, temperatura y profundidad del agua en el punto
en que el equipo se encuentra sumergido. Asimismo, se puede añadir otros sensores para
medir otros parámetros como oxígeno, fluorecescencia, etc.

5. Equipamiento necesario
El sistema CTD de medición en tiempo real debe ir instalado en una roseta oceanográfica
y conectarse a través de un chigre a la unidad de cubierta y al PC. El sistema CTD incluye
sensores de temperatura y conductividad modulables, estables y precisos, así como un
sensor digital de presión.
La adquisición de datos CTD se controla desde el PC a través de la aplicación informática
SEASOFT-WIN 32, con la que se realiza la instalación, la configuración y la obtención y
procesado de datos. Los programas que componen este paquete son tres: SeaTerm,
Seasave-V7 y SBEDataProcessing-Win 32.
SeaTerm se utiliza para configurar los equipos cuando son utilizados por primera vez o
para su posterior modificación.
SeaSave-V7 se utiliza para la adquisición de los datos en tiempo real.
SBEDataProcessing-Win32 se utiliza para realizar la preparación inicial y el procesado
preliminar de los datos, siendo la herramienta necesaria para que éstos puedan ser
analizados con mayor profundidad con programas tipo Matlab.

46
Sistema CTD.

6. Reactivos u otro material fungible


Para el buen funcionamiento del equipo CTD es necesario realizar el mantenimiento en:
La célula de conductividad: Debe mantenerse con agua destilada residente. Con este fin,
se introduce el agua destilada, con la ayuda de unas jeringuillas, desde las mangueras a
la entrada de la célula de temperatura.
Los conectores: Deben ser revisados y agregar periódicamente grasa de silicona para
aislarlos de posibles gotas de agua salada.

7. Calibración
Los sensores del equipo CTD han de ser calibrados en la propia casa de
manufacturación.

47
8. Descripción de la Técnica
8.1. Adquisición de datos con el CTD

8.1.1. CONEXIONES FÍSICAS: CARRUSEL/ROSETA Y CTD SBE 911PLUS - (SBE 32+SBE 9+SBE
11PLUS)

Paso Preliminar: Comprobación del cable RS-232:


Conectar mediante un cable serie el ordenador – puerto COM 1 (9 pines) – y la unidad de
superficie – puerto RS-232 (25 pines).

- 9 Pines Hembra (al PC)


- 25 Pines Macho (al SBE 11)

Ejecutar el programa SeaTerm para Windows, aparece la siguiente pantalla

Ir al menú CONFIGURE y seleccionar el dispositivo que queremos configurar.


Aparece un cuadro dialogo en donde definiremos las características de comunicación y
los puertos. Emplear las que aparecen en la figura para el SBE 11plus

Encender el SBE 11plus y presionar RESET, aparecerá la ventana del programa con la
siguiente información.

48
Esto indica que la comunicación con el PC es correcta. Por último, cerramos el programa
SeaTerm.

8.1.2. SISTEMA DE ADQUISICIÓN


1. QUITAR las jeringuillas de los 2 sensores
2. Adquisición de un perfil CTD:
Abrimos el programa SeaSave-V7. En la figura vemos la ventana principal de este
software:

Clicar en REAL-TIME DATA → START. Aquí tendremos que marcar “Begin archiving data
immediately” y en el botón de SELECT OUTPUT DATA FILE NAME, seleccionar el
archivo .hex. Después clicaremos START.

8.1.3. DISPLAY
El siguiente paso consiste en crear o modificar el escritorio colocando aquellos displays
que queremos que nos representen los datos. SeaSave-V7 puede mostrar tantas
ventanas de datos como queramos. Las ventanas pueden ser montadas para mostrar
datos en tiempo real (conductividad, Tª, presión, etc.) o calcular parámetros (salinidad,
etc.). Los 3 tipos de ventanas que existen son: Fixed, Scrolled y Plot.

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Fixed Display: Tiene una lista de los parámetros seleccionados en la izquierda y
muestra los valores actuales en la derecha.

Scrolled Display: Tiene una lista de los parámetros seleccionados en la parte


superior y muestra los valores en desplazamiento en las columnas verticales.

Plot Display: Traza un parámetro en el eje de las Y, y hasta 4 parámetros en el eje


de las X ó viceversa.

Los archivos .psa contienen toda la información con la que se ha trabajado, guardándose
las modificaciones en archivos temporales. La única manera de guardar todos los
cambios en el programa de configuración (.psa) es seleccionando FILE → SAVE SETUP
FILE AS o SAVE SETUP FILE, dependiendo de si queremos generar un nuevo .psa o
sobrescribir el actual. Tendremos que dar un nombre a la configuración.
Los DISPLAY pueden mostrarse en diversos tamaños y cantidades. Se pueden configurar
de tal modo que representen determinados valores de variables en intervalos, de tiempo o
presión, que nosotros le indiquemos. Todo esto lo encontramos en la BARRA DE
HERRAMIENTAS.

50
8.1.4. FICHERO DE CONFIGURACIÓN
Una vez definido lo que queremos representar en tiempo real, el siguiente paso es
configurar el archivo de configuración del instrumento (.con). Se define qué sensores
están integrados con el instrumento, qué canales van a ser usados por los sensores y los
coeficientes de calibración de los sensores.
Se abre en la barra del menú, CONFIGURE INPUTS

Si queremos crear un nuevo .con: INSTRUMENT CONFIGURATION → CREATE.


En el cuadro de dialogo SELECT AN INSTRUMENT, seleccionar el deseado →
OK.
Ir al punto 3.
Para seleccionar y ver o modificar un archivo .con existente: INSTRUMENT
CONFIGURATION → OPEN → SELECT INSTRUMENT CONFIGURATION FILE
y buscar el archivo deseado → OPEN.
El cuadro de dialogo CONFIGURATION aparece. Dependiendo del CTD, cambian
las selections. Para el SBE 9plus será:

51
Esta pantalla describe nuestro sistema CTD y debemos definir introduciendo los nombres
y las ubicaciones en función de los canales a los que estén conectados. Nos permite
sacar un informe de la configuración (REPORT).

8.1.5. OTRAS CONFIGURACIONES

Configuraciones de entrada
NOTA: La configuración de todos los parámetros de CONFIGURE INPUTS está incluida
en el archivo .psa. Para guardar esta configuración FILE → SAVE SETUP FILE, antes de
salir del SeaSave
En el menú CONFIGURE INPUTS podemos definir las características de otras
configuraciones cambiando de pestaña: SERIAL PORTS, WATER SAMPLER, TCP/IP
PORTS, MISCELLANEOUS, AND PUMP CONTROL.
WATER SAMPLER: Para definir las características de la Roseta podemos lanzar las
botellas de muestras de agua por una orden desde SeaSave, de forma autónoma
(basándonos en una imposición predefiniendo las presiones o profundidades), una mezcla
de órdenes y autónoma o desde un PC remoto vía un puerto TCP/IP.

52
Configuraciones de salida
NOTA: La configuración de todos los parámetros de CONFIGURE OUTPUTS (excepto
Diagnostics) está incluida en el archivo .psa. Para guardar esta configuración FILE →
SAVE SETUP FILE, antes de salir del SeaSave
En el menú CONFIGURE OUTPUTS podemos definir las características de configuración
de salida: SERIAL PORTS, SHARED FILE OUTPUT, MARK VARIABLES, TCP/IP
OUTPUT, TCP/IP PORTS, SBE 11PLUS ALARMS (solamente para configuraciones
911plus/917plus CTD), PC ALARMS, HEADER FORM Y DIAGNOSTICS.
HEADER FORM: Podemos establecer aquí las líneas de cabecera de los ficheros finales.
Tenemos hasta 12 líneas para introducir parámetros que queramos incluir en los ficheros
finales.

Si seleccionamos PROMPT FOR HEADER INFORMATION en HEADER CHOICE,


cuando comencemos la adquisición de datos, esta pantalla aparecerá para ser rellenada.

8.1.6. ADQUISICIÓN DE DATOS EN TIEMPO REAL


Una vez completado el proceso de configuración de nuestro sistema y conectado todo el
hardware: sensores al CTD, CTD al chigre, Slip-Ring a la Deck Unit y ésta al PC el último
paso y más importante es poner el sistema a capturar datos.
En el menú REAL-TIME DATA → START. Aparece el cuadro de dialogo START REAL-
TIME DATA ACQUISITION

53
En este punto, seleccionamos el archive .con adecuado a nuestra configuración, el
nombre del fichero de datos en el que almacenamos los datos (.dat o .hex) y su ubicación
(C:\Ctd\Raw\Sbe911_sn0702).
En esta pantalla podemos elegir la forma de almacenamiento de los datos (DATA
ARCHIVING OPTIONS) y la comprobación de datos. En este último, TIME IN SECONDS
AT STARUP hace referencia al tiempo permitido antes de que se reciba la primera
comprobación de datos desde el instrumento (No iniciar la adquisición hasta que el CTD
halla atemperado, 5 minutos) y TIMEOUT IN SECONDS BETWEEN SCANS al intervalo
máximo permitido entre comprobaciones tras recibir la primera desde el instrumento.
Para empezar la adquisición y visualizar los datos → START. A partir de aquí puede
ocurrir que:
Si configuramos en HEADER FORM → PROMPT FOR HEADER INFORMATION,
aparecerá el cuadro de dialogo para que lo rellenemos (Ver instrucciones adjuntas
encima del PC) → OK.
Si configuramos WATER SAMPLER, SeaSave enviará un Reset al muestreador y
esperará hasta 60s por confirmación (Disparar las botellas desde el ordenador
según las profundidades en folio sobre la Deck Unit).
Si seleccionamos NMEA POSITION DATA ADDED en el archivo .con, comenzará
aquí la comunicación.
Si seleccionamos CHECK SCAN LENGTH en el menú OPTIONS, se comprobará
el archivo .con. Si aparece mensaje de error, comprobar que se usa el archivo .con
correcto o que se han guardado las modificaciones posteriores
Aparecerá este mensaje:

54
Si, antes de que termine la cuenta atrás, esta ventana se cierra automáticamente quiere
decir que tenemos conexión con la Unidad de Cubierta y con la Roseta-el CTD y se puede
comenzar el perfil de muestreo.
Si no se reciben datos dentro del periodo de TIMEOUT IN SECONS STARUP, el software
se podrá en time out, y se deberá ir al apartado de Troubleshooting del manual del
SeaSave para ver qué está pasando.
Ahora podremos ver en los DISPLAY cómo van apareciendo y son representados los
datos recogidos por los sensores.
Disparo de las botellas:
Existen diferentes maneras, si hemos escogido hacerlo por órdenes a través del
SeaSave:
En el menú REAL-TIME CONTROL → FIRE BOTTLE CONTROL. Aparecerá el cuadro de
dialogo BOTTLE FIRE. Si hemos elegido la forma SEQUENTIAL o TABLE DRIVEN, se
mostrará el siguiente cuadro:

Comenzar la Adquisición en tiempo real.


El cuadro de dialogo BOTTLE FIRE nos dirá el número de la siguiente botella que se va a
disparar. Si hemos elegido USER INPUT en la configuración WATER SAMPLER,
seleccionaremos la botella que queremos disparar.
Cuando queramos disparar una botella, clicar FIRE BOTTLE (Ver las profundidades en el
folio sobre la Deck Unit)
Cuando se vuelva a la superficie: En el menú REAL-TIME DATA → STOP.
Cada vez que se termina un perfil:
Se cambia el fichero para que sea solo de lectura
Se hace una copia de seguridad en el disco Zip. E:\
Se hace otra copia del fichero en
X:\NOMBRECAMPAÑA\Ctd\Datos\Raw\Sbe911_sn0702
Se ponen las jeringuillas de los 2 sensores
Al terminar de coger agua, abrir botellas para la siguiente estación.

8.1.7. DATOS ALMACENADOS


Este software nos permite visualizar y trazar datos anteriormente guardados: En el menú
ARCHIVED DATA → START. Aparecerá el cuadro de dialogo PLAYBACK ARCHIVED
DATA:

55
Clicar START para comenzar el procesado y la visualización de datos.

56
9. Cuadro sinóptico de la técnica

57
10. Calculo de los resultados.
10.1. Procesado de los datos del CTD: SBEDataProcessing-Win32

PASO 1
Creamos una carpeta con el nombre de la campaña
PASO 2
Dentro de la carpeta con el nombre de la campaña, creamos 2 subcarpetas que serán
(Guardar siempre en C:/):
RAW: Aquí es donde vamos a tener todos los datos brutos: metemos los .hex, .dat, .psa,
el archivo de configuración .con y los BATCH. Creamos aquí dentro otra carpeta que se
llama PROCESANDO que es donde vamos a tener sólo los datos que estemos
procesando en ese momento.
CNV: Aquí metemos los .cnv finales después de pasarlos por BATCH 1 y BATCH 2.
Evitar que los nombres de carpetas y archivos lleven “ñ”, espacios o guiones medios, ya
que Matlab no los lee. Si se usan guiones, que sean bajos.
PASO 3
Corregimos los BATCH 1 y 2 poniendo las rutas adecuadas en la ubicación de nuestros
datos:
La línea de comandos para procesar SBE25 ampliable a 911+ es:
La secuencia es:
1º El ejecutable (sbebatch.exe) con su ruta entre comillas espacio
2º El fichero de comandos con su ruta (sin comillas).
3º La ruta de lectura y escritura (sin comillas).
Batch 1:

"C:\Archivos de programa\Sea-Bird\SBEDataProcessing-Win32\SBEbatch.exe"
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando\sbe911batch1_ctd.txt
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando
Los filtros que se pasan son: datcnv, wildedit, wfilter
Batch 2:

"C:\Archivos de programa\Sea-Bird\SBEDataProcessing-Win32\SBEbatch.exe"
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando\sbe911batch2_ctd.txt
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando
Los filtros que se pasan son: filter, alignctd, celltm, loopedit, derive, binavg, rossum
PASO 4
Creamos los .psa de cada uno de los filtros que vamos a correr posteriormente en los
BATCH:
Para ello abrimos el software SBE Data Processing Win 32 y al dar al botón RUN, nos van
a ir saliendo cada uno de los filtros que vamos a aplicar.
PASO 5
Corremos el BATCH 1:
Copiamos la siguiente rutina adaptada a nuestros datos en INICIO → EJECUTAR →
ACEPTAR

58
"C:\Archivos de programa\Sea-Bird\SBEDataProcessing-Win32\SBEbatch.exe"
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando\sbe911batch1_ctd.txt
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando

BATCH 1:
datcnv /i%1\*.hex /c%1\RAPROCAN0209_sn0702.con /p%1\DatCnv.psa /o%1
wildedit /i%1\*.cnv /p%1\WildEdit.psa /o%1
wfilter /i%1\*.cnv /p%1\W_Filter.psa /o%1
PASO 6
Borramos el periodo de atemperamiento del CTD en los .cnv, una vez que hemos pasado
el BATCH 1. Establecemos como inicio aquel en el que la presión sube de forma
progresiva.
NOTA: no eliminar datos en los .hex (SBE25) o .dat (911+), ya que el fichero puede
quedar corrupto.
PASO 7
Corremos el BATCH 2:
Copiamos la siguiente rutina adaptada a nuestros datos en INICIO → EJECUTAR →
ACEPTAR

"C:\Archivos de programa\Sea-Bird\SBEDataProcessing-Win32\SBEbatch.exe"
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando\sbe911batch2_ctd.txt
C:\RAPROCAN0209\Hidrografia\Datos\Raw\Procesando

BATCH 2:
filter /i%1\*.cnv /p%1\Filter.psa /o%1
alignctd /i%1\*.cnv /p%1\AlignCTD.psa /o%1
celltm /i%1\*.cnv /p%1\CellTM.psa /o%1
loopedit /i%1\*.cnv /p%1\LoopEdit.psa /o%1
derive /i%1\*.cnv /c%1\Raprocan0209_sn0702.con /p%1\Derive.psa /o%1
binavg /i%1\*.cnv /p%1\BinAvg.psa /o%1
rossum /i%1\*.ros /c%1\Raprocan0209_sn0702.con /p%1\BottleSum.psa /o%1

11. Control de calidad


Ver ficha sobre “Calibración de datos de CTD”

59
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Procesado de muestras
2. Titulo de la técnica
Adquisición y procesado de datos LADCP
3. Autores del documento y filiación
Marta Nuez – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Eugenio Fraile – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Pedro Vélez – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Federico López Laatzen – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
4. Finalidad. Campo de aplicación
El sistema LADCP (Lowered Acoustic Doppler Current Profiler) es un perfilador de
corrientes, basado en el Efecto Doppler. El perfilador forma parte del bloque CTD/Roseta
y conlleva un esfuerzo operacional relativamente pequeño en relación a la información
obtenida.
5. Equipamiento necesario
El sistema LADCP se compone de 2 cabezales Workhorse ADCP, dispuestos sobre la
misma vertical, pero orientados en sentido contrario y funcionando de forma síncrona.
Montados en la roseta, uno de los cabezales ADCP actúa como MASTER (mirando hacia
abajo, downlooking) y el otro como SLAVE (mirando hacia arriba, uplooking). Esta
denominación hace referencia a cual de ellos se encarga de sincronizar la emisión de los
pings con el fin de evitar interferencias en las señales de los instrumentos.
A través del chigre se conecta el sistema LADCP a un ordenador de a bordo, con el cual
iniciaremos y detendremos la adquisición de datos.

LADCP, disposición de los cabezales ADCP y la batería en la roseta.

60
5.1. Puesta en el agua del sistema LADCP

El sistema LADCP es un sistema autónomo, lo que quiere decir que una vez iniciada la
estación hidrográfica (el cast), este adquirirá datos gracias a unas baterías que también
deberán de ser montadas en la roseta.
Nótese que esto es lo contrario al sistema CTD + botellas, las cuales son controladas y
alimentadas con corriente desde el barco mediante el ordenador y/o unidad de superficie
SBE 11 plus CTD Deck Unit.
5.1.1. MONTAJE
El procedimiento detallado para el montaje está ilustrado en las siguientes fotos. El
SLAVE mirando para arriba y el MASTER mirando para abajo:

SLAVE

Las piezas de anclaje a la roseta normalmente estarán ya colocadas. Si se hubiesen


desmontado las sujeciones de la roseta hay que recordar que MASTER y SLAVE deben
coincidir en la vertical, tal y como se muestra en la foto:

La distribución de estas piezas es simple. En todos los casos cuentan con tres puntos de
unión a la estructura de la roseta, consistentes en pares de espigas que con una horquilla

61
y tuercas amordazan los tubos de la roseta. El MASTER y las cajas estancas de baterías
van sujetos a estas estructuras con unas abrazaderas. El SLAVE descansa en una jaula,
no tiene abrazaderas para fijarlo. Una placa constituye el anclaje, y cuenta con cuatro
agujeros que coinciden con los de la caja estanca del instrumento. Entre el ADCP y el
anclaje se colocara la protección y una lámina de neopreno. Todo se asegura bien con
tornillos pasantes. En este momento, es bueno intentar que MASTER y SLAVE queden
alineados tomando como referencia el beam 3 que tiene un puntito al lado del haz y
teniendo en cuenta que el SLAVE queda fijo y el MASTER el que se gira. Como se indica
después, una vez hecho el cableado se puede realizar una comprobación con un perfil en
seco.
ES IMPORTANTE QUE ENTRE TODAS LAS SUPERFICIES DE CONTACTO ENTRE
LAS CAJAS ESTANCAS Y LAS ESTRUCTURAS DE ANCLAJE SE COLOQUE UNA
LÁMINA DE NEOPRENO DE 5mm DE ESPESOR. Esto afianza la sujeción y asegura el
correcto funcionamiento de los instrumentos acústicos. Para facilitar el montaje es
recomendable sujetar cada una de las láminas a las abrazaderas de acero con una cinta
adhesiva (americana o aislante).
Las sujeciones o ‘cunas’ de las baterías se colocan en la base, sobre el aro inferior y la
barra que lo atraviesa diametralmente. Cada una de las dos sólo encaja en uno de los
lados, como se muestra en la siguiente foto:

Una vez terminada la fijación de los equipos se debe proceder al cableado.


5.1.2. CONEXIONADO DEL SISTEMA LADCP
Para el conexionado del sistema nos harán falta 4 cables:
1 cable estrella / star cable:

1 cable C2 del tipo y cantidad de conectores que se muestran a continuación:

62
2 cables I/O, que serán “alargadores” desde los pines P4 y P5, hasta los puertos COM1 y
COM2 del ordenador que adquiere los datos:

En la roseta se colocan 2 packs de baterías montados (EXTERNAL BATTERY),


utilizándose únicamente una de ellas, mientras que la otra permanece en reserva. En esta
batería que permanece “descansando” se conecta un dummy.
El conexionado del sistema LADCP se tiene que hacer SIEMPRE siguiendo el guión que
se muestra en la siguiente figura:

63
Se observa que en la parte del cable estrella en donde hay 3 cables, el del centro es
hembra y no se usará (conectado con un DUMMY PLUG). Este cable se reserva para
cuando se usen baterías propias (fabricadas por el centro / organización que utilice el
sistema LADCP).
En la adquisición usaremos un ordenador con 2 puertos COM. El terminal P1 irá al SLAVE
ADCP y el P2 al MASTER ADCP. El conector P4 (que es continuación del P1 –SLAVE-)
del cable estrella se conectará al terminal hembra del External Battery Pack “Y” Cable y el
extremo directamente opuesto a esta hembra, que será macho, irá conectado al terminal
hembra del cable “alargador” denominado formalmente como I/O Cable. Por último, el
extremo opuesto del conector hembra del I/O Cable será un conector tipo serie RS232, el
cual se conectará al puerto COMx del ordenador (siendo la x el número del puerto).
El conector P5 (que es continuación del P2 –MASTER-) del cable estrella deberá estar
conectado directamente al terminal hembra del cable “alargador” restante I/O Cable. El
extremo opuesto de este I/O Cable lo conectaremos a otro puerto COMx del (siendo la x
el número del puerto).

64
En los extremos que conectamos al ordenador de los cables “alargador” I/O Cable, habrá
un cable colgando que tendrá en su extremo un conector redondo tipo rosca. Este
conector es una toma de corriente que “enroscaremos” en su conector opuesto del
adaptador de corriente que viene en el pack del LADCP. Esto se hace con ambos cables
que van a los pines P4 y P5. Las fuentes de alimentación estarán conectadas siempre
para el caso que nos concierne.

6. Reactivos u otro material fungible


El sistema LADCP es un sistema autónomo que adquiere datos gracias a llevar
incorporado en la roseta unas baterías. Habrá que cerciorarse de que las baterías están
cargadas.

7. Descripción de la Técnica
7.1. MASTER / SLAVE: comunicación y puesta en funcionamiento

DESPERTAR EL LADCP

1. Comenzar la conexión despertando el ADCP SLAVE


- Abrimos BBTalk
- FILE → NEW CONNECTION
Marcamos: ADCP Type = WorkHorse y COM Port = COMx (SLAVE)
- → SIGUIENTE. Cambiamos Baud Rate a 115200

- → SIGUIENTE. Marcamos SEND BREAK ON NEW CONNECTION → FINISH.

Ya hemos establecido la conexión con el ADCP. Ahora, enviamos el fichero script

- FILE → SEND SCRIPT FILE. Seleccionamos el archivo de configuración (por ejemplo,


SlaveWM15mod00) → FINISH

Esperamos a que el BBTalk nos diga que podemos desconectar el SLAVE del PC.

2. Despertamos el ADCP MASTER


- Abrimos BBTalk
- FILE → NEW CONNECTION
Marcamos: ADCP Type = WorkHorse y COM Port = COMx (MASTER)

65
- → SIGUIENTE. Cambiamos Baud Rate a 115200
- → SIGUIENTE. Marcamos SEND BREAK ON NEW CONNECTION → FINISH.

Ya hemos establecido la conexión con el ADCP. Ahora, enviamos el fichero script

- FILE → SEND SCRIPT FILE. Seleccionamos el archivo de configuración (por ejemplo,


MASTER1WM15mod00) → FINISH

Esperamos a que el BBTalk nos diga que podemos desconectar el SLAVE del PC.

3. Se desconectan los cables “alargadores” del cable estrella y se colocan los dummies.
Se generará un fichero que contendrá todas las respuestas que dan ambos ADCP al
envío de los ficheros de configuración (.log). Estos se guardarán en
“C:\adcp\Xladcp.log” donde “X” será “M” para MASTER y “S” para SLAVE.

NOTA → Es sumamente importante el orden en que se configura el sistema LADCP;


primero el SLAVE y por último el MASTER. De no hacerlo así, habrá un desfase en el
inicio de recogida de datos entre los 2 ADCP.

4. Antes de iniciar la inmersión de los aparatos, se comprobará que los ADCP están
funcionando, acercándonos a las “lentejas” (los 4 círculos de color naranja) y escuchando
el pingeo, o bien con la ayuda de un walkie. Tras comprobar que ambos emiten, ya
podemos iniciar el CAST.

¿Qué hacer si el ADCP no despierta?

Si el ADCP no responde, comprobar que está conectado al puerto COM correcto,


comprobar cables, alimentación del adaptador de corriente AC y/o conexión a las
baterías. Si sigue sin despertar o aparecen símbolos extraños, existen 2 opciones: pulsar
el icono B de la barra de herramientas (mandar un break) o hacer FILE → PROPERTIES
→ AUTO DETECT ADCP → OK.

NOTA → Si alguno de los instrumentos no ha recibido órdenes en más de 5 minutos se


desconecta automáticamente; en este caso tenemos que volver a empezar todo el
proceso

66
Sincronización de Relojes → Muy importante en el inicio de la campaña
A. Primer uso de los ADCP en la campaña → Tras establecer la comunicación y si es la
primera vez que usamos el ADCP en la campaña, se tiene que sincronizar el RELOJ
INTERNO del ADCP con el del ordenador. Para ello debemos comprobar que el
ordenador tiene la hora correcta y dentro del BBTalk con la ventana del ADCP
correspondiente ACTIVA (SLAVE primero), hacemos un
CTRL + T
B. En las siguientes estaciones tras la sincronización inicial → Es recomendable ir
comprobando que la hora del ADCP corresponde con la del ordenador. Escribiendo
en el intérprete de comandos el comando “TS?”, nos devuelve la hora de los ADCP.
Si esta hora no coincide con la del ordenador, hay que repetir el paso A.

8. Cuadro sinóptico de la técnica

67
8.1 Puesta en el agua del LADCP

68
8.2. Descarga de datos del LADCP

69
9. Calculo de los resultados.
9.1. Descargar de datos del sistema LADCP

NOTA → Una vez que la roseta vuelve a la cubierta, se seca minuciosamente con un
papel los conectores P4 del External Battery Pack “Y” Cable y el P5 del cable estrella y
nos aseguraremos que no entra agua al quitarle los dummies.
Se vuelven a conectar los cables “alargadores” I/O Cables que interconectan el sistema
LADCP con el ordenador. Para evitar equivocaciones, se marcarán los cables con algún
distintivo para que siempre se conecten de la misma forma:

1. PRIMERO despertaremos el ADCP MASTER:


- Abrimos BBTalk
- FILE → NEW CONNECTION
Marcamos: ADCP Type = WorkHorse y COM Port = COMx (MASTER)
- → SIGUIENTE. Cambiamos Baud Rate a 115200
- → SIGUIENTE. Marcamos SEND BREAK ON NEW CONNECTION → FINISH.

Cuando se establezca la comunicación

- FILE → RECOVER RECORDER. Seleccionar la carpeta en la que almacenar y el


nombre del archivo (revisar los archivos anteriores para no sobrescribirlos)

Nos aparecerá la pantalla de la siguiente figura, indicándonos que la descarga del fichero
se está realizando. No hay que darle importancia a los caracteres ilegibles que aparecen
en el intérprete de comandos.

La duración de la descarga de datos varía dependiendo del tiempo en el que han estado
recogiendo datos, teniendo relación directa con la profundidad de la estación realizada.
Un perfil de 4000 metros puede tardar en descargarse unos 20 minutos.

70
2. CONTINUAMOS con el ADCP SLAVE:

- Abrimos BBTalk
- FILE → NEW CONNECTION
- Marcamos: ADCP Type = WorkHorse y COM Port = COMx (SLAVE)
- → SIGUIENTE. Cambiamos Baud Rate a 115200
- → SIGUIENTE. Marcamos SEND BREAK ON NEW CONNECTION → FINISH.

- Cuando se establezca la comunicación

- FILE → RECOVER RECORDER. Seleccionar la carpeta en la que almacenar y el


nombre del archivo (revisar los archivos anteriores para no sobrescribirlos)

Anotar el estadillo, hora y nombre del archivo. Al finalizar la descarga, quitar los cables del
cabezal y poner los dummies.
Cuando se hayan descargado los dos ADCP, se creará una carpeta con la nomenclatura
XXX, donde X será el número de la estación en la que se recogieron esos datos. Dentro
colocaremos los ficheros del MASTER y del SLAVE (Se recomienda hacer copia de
seguridad de los datos en otra carpeta del propio ordenador así como en otro medio
extraíble).
NOTA → Se recomienda descargar primero los datos del MASTER, ya que como el
SLAVE es guiado por el MASTER, éste parará de tomar datos al iniciar la conexión con el
MASTER

9.2. Procesado de datos LADCP

No se contempla en este manual

10. Control de calidad

El tratamiento de datos LADCP emplea el método de M.Visbeck escrito en Matlab. Se


calculan las velocidades usando un problema inverso. De este modo, se elimina el
desplazamiento LADCP/barco y se resuelve al aplicar las velocidades cerca del fondo, los
datos CTD y los datos ADCP de casco.

71
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Técnicas analíticas

2. Titulo de la técnica
Análisis de muestras de salinidad. Salinómetro de laboratorio Autosal 8400B

3. Autores del documento y filiación


Marta Nuez – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Eugenio Fraile – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Pedro Vélez – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Federico López Laatzen – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía

4. Finalidad. Campo de aplicación


El salinómetro Autosal 8400B es un aparato de gran utilidad para la determinación de la
salinidad (conductividad) del agua de mar, haciéndolo con un elevado grado de exactitud.
Las medidas siempre se hacen en comparación con un patrón de salinidad conocido. Este
equipo se utiliza para verificar la salinidad medida tanto por el termosalinógrafo instalado
a bordo como por los CTD

5. Equipamiento necesario
Salinómetro de Laboratorio Guildline Modelo 8400B “Autosal”

6. Reactivos u otro material fungible


Para el uso del equipo Autosal se necesita:
• agua destilada para ir limpiando entre muestras
• agua ultrapura para el llenado del baño térmico
• agua estándar, es decir muestras de salinidad de referencia certificada.

7. Calibración
Este procedimiento hay que realizarlo cada vez que se comienza una tanda de medidas o se
interrumpe el análisis.

7.1. Estandarización

1. Se agita una botella de salinidad estándar.

72
2. Se limpia el circuito con agua destilada. Para ello introducimos el capilar en la
botella. Con el selector FUNCTION en ZERO, accionamos PUMPS ON y giramos
la palanca de la bomba peristáltica una posición a la derecha. Con el botón FLUSH
presionamos y soltamos varias veces para limpiar bien el circuito. No girar la
palanca de la bomba peristáltica a su posición dos, que si es verdad que succiona
más rápido, se pueden colar burbujas en el circuito. Llenamos y vaciamos varias
veces.
3. Controlar que no quedan burbujas en el circuito. En su caso, jugar con la bomba
(succionamos agua y aire) y el botón FLUSH hasta que la burbuja desaparezca.
4. Se coloca la botella de agua estándar en el soporte, introduciendo el tubo de
succión dentro de la botella y cuidando que la botella quede bien sujeta.
5. PUMPS ON.
6. Se enciende la bomba peristáltica girando la palanca un punto hacia la derecha.
7. Cuando esté llena la célula, se vacía tapando la válvula FLUSH con el dedo. Se
repite otras dos veces.
8. Se gira la palanca de la bomba peristáltica a la izquierda para desconectarla y
seleccionamos PUMPS OFF.
9. Se coloca el selector FUNCTION en la posición READ.
10. Con el selector SUPPRESSION se ajusta la lectura hasta que dejen de parpadear
los números del display.
11. Con el botón STANDARDIZE, se quita la pestaña de seguridad y se mueve poco a
poco hasta que el valor del display sea dos veces la K15 de la botella de agua
estándar. Se vuelve a colocar la pestaña de seguridad.
12. Se anota el STD (Rs) en el estadillo, que es el valor que hemos puesto en el paso
anterior.
13. Se coloca el selector FUNCTION en ZERO.
14. PUMPS ON  FLUSH  BOMBA PERISTÁLTICA ON  llenado de la célula
cuidando de que no queden burbujas en el circuito.
15. BOMBA PERISTÁLTICA OFF  PUMPS OFF.
16. Colocamos el selector FUNCTION en READ. Anotamos en el estadillo.
17. Repetimos los pasos 13 a 16 hasta que nos den tres valores idénticos en el display.
Nos tenemos que fijar que en el display siempre se muestre [valor+ valor], en el
caso de que parpadee o de un signo menos, jugaremos con el selector
SUPPRESSION.

7.2. Cero Inicial

1. Situar el selector FUNCTION en la posición ZERO.


2. El display debe mostrar en los últimos 4 dígitos el valor 0000 o aproximado. Si no
es así, mirar manual. Se notará en el estadillo de análisis. También se anotará el
Sby inicial, girando el selector FUNCTION a la posición de STANDBY.

73
8. Descripción de la Técnica
8.1. Esquema Autosal

8.2. Procedimiento Inicial

1. Llenar el salinómetro con agua destilada (NUNCA CON AGUA DE MAR). Para ello
colocamos un tubo de silicona donde pone DRAIN/ FILL y otro donde pone
OVERFLOW y abrimos donde pone TANK DRAIN al máximo. Echamos agua hasta
que rebose por OVERFLOW y entonces cerramos la llave del TANK DRAIN.

74
2. Enchufar el baño termostático y el transformador a la corriente. El transformador irá
conectado a la bomba peristáltica.
3. Encender el Autosal 24 horas antes del análisis de las muestras, para que el baño
se caliente hasta la temperatura ambiental, mediante el botón de encendido de su
parte trasera.
4. Se debe ajustar el selector SET ºC al valor mas cercano de la temperatura del
laboratorio. La temperatura del salinómetro siempre debe ser inferior a la
temperatura ambiente. El baño estará caliente cuando las lámparas del baño se
enciendan y se apaguen en intervalos constantes
5. Quitamos los dos tubos y situamos uno de ellos en CELL DRAIN. El drenaje debe
ir, mediante un tubo de silicona, a parar a un recipiente en el que el tubo de drenaje
no llegue a tocar con la superficie de agua drenada.
6. En el momento de comenzar a utilizar el aparato, es necesario apuntar en el
estadillo correspondiente: Campaña, barco, remesa agua STD, Tª inicial del
laboratorio, Guideline (modelo y nº referencia del salinómetro), cero inicial, SBY
inicial (el selector FUNCTION lo giramos a la posición de STANDBY y su valor será
la temperatura más un número), nombre del observador, fecha, 2xK15 (K15 viene
anotado en la botella de agua de mar estándar OSI), STD(Rs) (es el valor que
ponemos en el botón STANDARIZE para que la lectura sea dos veces el K15 de la
botella de agua estándar).

8.3. Análisis de muestras

NOTA → Es mejor medir muestras de salinidad parecida, para así evitar los cambios
bruscos de salinidad de una muestra a otra. Es más es deseable seguir un orden
alternativo en la profundidad de las muestras, de modo que la salinidad de cada muestra
sea similar, en lo posible, a la muestra anterior y posterior.
1. Se agita bien la botella de muestra.
2. Anotamos: orden, muestra, profundidad, razón de conductividad y cualquier otra
observación.
3. Se destapa con mucho cuidado de que no entren restos de sal del tapón dentro de
la botella y se coloca en el soporte, fijándolo bien
4. El selector FUNCTION debe estar en la posición ZERO.
5. Se enjuaga la célula de conductividad 3 veces con la muestra, vaciándola tapando
la válvula FLUSH con el dedo cuando esté completamente llena.
6. Se deja la muestra entre 1- 2 minutos para que se estabilice.
7. Se lava de nuevo el circuito 3 veces.
8. Se coloca el selector FUNCTION en la posición READ.
9. Con el selector SUPPRESSION se ajusta la lectura hasta que dejen de parpadear
los números del display o para cambiar el signo a positivo (ojo con esto).
10. Se anota la lectura en el estadillo correspondiente
11. Se repiten los pasos 5 a 9 una o dos veces, según los resultados obtenidos, hasta
que nos de una medida muy similar.

75
8.4. Procedimiento final

1. Al finalizar el análisis de las muestras se debe anotar en el mismo estadillo: Cero


final, Tª final laboratorio y valor del STANDBY final.
2. Se seca bien el tubo de succión, dejando una burbuja de aire en él antes de
continuar con el siguiente paso.
3. Se coloca una botella de agua destilada y se enjuaga 3 veces con ella.
4. Se deja la célula de conductividad llena de agua destilada, junto con la botella
acoplada al tubo.
5. Se apaga la bomba de succión mediante el botón “PUMP”
6. Se apaga el salinómetro con el botón en la parte trasera del mismo

9. Cuadro sinóptico de la técnica


9.1. Puesta en marcha del AUTOSAL (24 h. antes)

76
9.2. Estandarización del Autosal

77
9.3. Análisis de salinidad en muestras de agua

78
9.4. Apagado del Autosal

10. Calculo de los resultados.


A partir del resultado de conductividad en la muestra, se calcula el valor de la salinidad
usando una hoja de cálculos modelo.

11. Control de calidad


El análisis se realiza por triplicado en cada muestra. Si la desviación estándar es mayor
de 0.00005, se repiten los análisis.

79
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Procesado de muestras

2. Titulo de la técnica
Calibración de datos de CTD

3. Autores del documento y filiación


Marta Nuez – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Eugenio Fraile – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Pedro Vélez – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía
Federico López Laatzen – C.O. Canarias, Instituto Español de Oceanografía

4. Finalidad. Campo de aplicación


Este apartado se centra en la calibración del sensor de conductividad instalado en el
equipo CTD, en las correcciones en la deriva de la conductividad basándonos en
muestras de salinidad y en general, en el mantenimiento del sensor de conductividad.

5. Equipamiento necesario
5.1. Instrucciones para el cuidado y limpieza de las celdas de conductividad

Esta parte es muy importante, ya que repercute directamente en la lectura del sensor de
conductividad. Los electrodos de la celda que puedan estar contaminados por
aceites/petróleos, bio-organismos o cualquier otro material extraño, van a causar lecturas
de conductividad más bajas. Por este motivo, es de especial importancia las
recomendaciones de enjuague y limpieza que especificamos a continuación:

• Control del crecimiento de micro-organismos → La manera más efectiva es limpiar


la celda de conductividad es con una solución de lejía diluida (50 partes de agua
por 1 de lejía).
• Extracción del aceite/petróleo de los conductos del CTD → Se recomienda el
enjuague y limpieza del sensor de conductividad con la solución Triton-X-100. Esta
solución es un detergente suave, muy valioso cuando se saca el CTD del agua y se
lleva a la mesa (la solución Triton-X-100 se incluye en el envío del CTD y puede
ser también encargado a Sea-Bird).
• Depósitos minerales → Si bien antes se recomendaba su limpieza ácida, se ha
observado que tiene una ocurrencia inusual, por lo que se descarta el uso de
ácidos y se recomienda enviar el equipo a fábrica para este tipo de limpieza si en
algún momento fuera necesario.

80
Respecto al almacén de la celda de conductividad, se recomienda guardarla en seco
(antes se recomendaba guardar en húmedo, pero ya se ha desechado), si bien antes
debe ser aclarada con agua dulce y después limpiarse cuidadosamente los restos de
agua para eliminar posibles cristales de sal.

5.1.1. Uso activo (después de cada lance)

1. Enjuague → Quitar el tubo Tygon del extremo de extracción de la celda de


conductividad. Empapar la celda con un solución al 0.1% de Triton X-100. Aclarar
minuciosamente con agua dulce LIMPIA y escurrir.

NOTA → Si no se enjuaga entre usos, pueden formarse cristales de sal en la superficie


platinizada de los electrodos de la celda de conductividad. En el siguiente uso del
instrumento, la precisión del sensor puede estar temporalmente afectada hasta que los
cristales de sal vuelven a ser disueltos.

2. Almacén → el principal objetivo de estas recomendaciones de almacén es prevenir la


contaminación por aerosoles o salpicaduras en la mesa del barco que perjudiquen la
calibración del sensor.

A. Cuando NO exista riesgo de congelación → Rellenar la celda con 500 –


1000 ppm de solución de lejía, usando un trozo de tubo Tygon adjuntado en
cada uno de los extremos del sensor de conductividad para cerrar los
extremos de la celda.

B. Cuando exista riesgo de congelación → Eliminar las gotas de agua


grandes soplando por la celda. NO USAR AIRE COMPRIMIDO, que
típicamente contiene vapor. Adjuntar un trozo de tubo Tygon en cada
extremo de la celda de conductividad para cerrar los extremos de la celda.

5.1.2. Almacén durante largo periodos de tiempo (después de usar en campaña)

1. Enjuague → Quitar el tubo Tygon del extremo de extracción de la celda de


conductividad. Empapar la celda con un solución al 0.1% de Triton X-100. Aclarar
minuciosamente con agua dulce LIMPIA y escurrir. Eliminar las gotas de agua
grandes soplando por la celda. NO USAR AIRE COMPRIMIDO, que típicamente
contiene vapor.

2. Almacén → Adjuntar un trozo de tubo Tygon en cada extremo de la celda de


conductividad para cerrar los extremos de la celda. Este circuito previene que
cualquier contaminante se introduzca en la celda.

A. Almacenar la celda en seco va a prevenir la proliferación de bio-organismos,


preservando así la calibración.

3. Cuando se vuelva a utilizar, rellenar la celda con una solución al 0.1% de Triton X-100
durante 1 hora antes de la utilización. Escurrir la solución Triton X-100, sin necesidad
de enjuagar la celda.

81
NOTA → Rodear la celda o sus extremos con un tubo Tygon, añade el beneficio de evitar
que se introduzcan contaminantes volátiles dentro de la celda (abundantes en la mayoría
de los barcos).

5.1.3. Precauciones

- La celda de conductividad es principalmente cristal, por lo que puede romperse: debe


usarse el tamaño de tubo Tygon correcto. El tamaño correcto es: 7/16" ID, 9/16" OD.
- No utilizar un cepillo u objeto dentro de la celda de conductividad para limpiar o secar.
Al tocar o doblar los electrodos podemos modificar la calibración e incluso estropear la
celda.
- Si en el CTD tenemos también un sensor SBE 43 de oxígeno disuelto (DO), antes de
empapar la celda de conductividad con solución Triton X-100, desconectar el tubo
entre la celda de conductividad y el sensor de DO. Debemos evitar un contacto
extenso (más de 1 min.) del Triton con la membrana del sensor DO.

6. Reactivos u otro material fungible


Se emplea una solución al 0.1% de Triton X-100 (proporcionada por el fabricante), tubos
Tygon y agua destilada.

7. Descripción de la Técnica

7.1. Calibración del sensor de Conductividad

Al introducir en el archivo de configuración .con, el slope y offset del sensor de


conductividad, el usuario puede hacer correcciones para la deriva del sensor entre
calibraciones. La fórmula de corrección es:

(Conductividad Corregida) = slope * (Conductividad Calculada) + offset

Donde:
slope = intervalo de conductividad real / intervalo de lectura de conductividad del
instrumento

offset (medido 0 S/m) = (conductividad real – lectura de conductividad del instrumento) *


slope

Para calibrar sensores nuevamente, utilizar slope = 1.0, offset = 0.0

Los sensores de conductividad Sea-Bird generalmente derivan al cambiar el lapso de


tiempo (el slope de la curva de calibración), mostrando lecturas de conductividad más
bajas a lo largo del tiempo. Cualquier error del offset en conductividad (error a 0 S/m) se
debe generalmente a deriva electrónica, típicamente menor de ±0.0001 S/m por año.

82
Cuando el offset es mayor que ±0.0002 S/m por año, es síntoma de un mal
funcionamiento del sensor.
Por este motivo, se recomienda corregir la deriva en la conductividad asumiendo que no
hay error de offset, a menos que exista una clara evidencia de lo contrario o sea una
necesidad especial.

Ejemplo:
Conductividad real = 3.5 S/m
Lectura de conductividad del instrumento = 3.49965 S/m
slope = 3.5 / 3.49965 = 1.000100

10. Cuadro sinóptico de la técnica

83
11. Calculo de los resultados.
11.1. Correcciones en la deriva de la conductividad basándonos en Botellas de
Salinidad recogidas en el mar

En este caso, los coeficientes de calibración (sensor calibrado y antes de ser usado en
campaña) son usados para calcular la conductividad y la salinidad de los CTD. Las
muestras de salinidad se obtienen usando botellas de muestreo durante los perfiles CTD,
y las diferencias entre la salinidad del CTD y la salinidad de las botellas se utilizan en la
determinación de la deriva en la conductividad.
NOTA → Al usar este método para corregir la salinidad, es importante tener en cuenta
que las diferencias entre la salinidad de los CTD y de las botellas hidrográficas se deben a
errores en las medidas de conductividad, temperatura y presión (tanto como a errores al
obtener y analizar los valores de salinidad de las botellas). Típicamente, para los sensores
que son calibrados regularmente, entre el 70 - 90% del error de salinidad de los CTD se
debe a la deriva en la calibración de la conductividad, entre el 10 - 30% a la deriva en la
calibración de la temperatura, y entre el 0 - 10% a la deriva en la calibración de la presión.
Todos los errores de temperatura y presión en los CTD y los errores en las botellas deben
ser corregidos primero, antes de atribuir las diferencias de la salinidad restante a errores
en la conductividad del CTD o a procedimientos con las correcciones de conductividad.

Ejemplo:

3 botellas de salinidad que son recogidas durante un perfil CTD; asumiendo que el
análisis en el barco de las botellas de salinidad es perfecto. La incorrección de los datos
CTD (desde SEASAVE) y las botellas de salinidad es:

Presión
Profundidad Temperatura Conductividad Salinidad Salinidad
CTD en
aproximada CTD en bruto CTD en bruto CTD en en la
bruto
(m) (°C) * (S/m) bruto Botella
(dbar)

200 202.7 18.3880 4.63421 34.9705 34.9770

1000 1008.8 3.9831 3.25349 34.4634 34.4710

4000 4064.1 1.4524 3.16777 34.6778 34.6850

*La temperatura mostrada es en ITS-90. Sin embargo, la ecuación de salinidad es en


términos de IPTS-68; debe convertirse ITS-90 a IPTS-68 (IPTS-68 = 1.00024 * ITS-90)
antes de calcular la salinidad. SEASOFT realiza esto automáticamente.

Las diferencias de salinidad incorrecta (salinidad CTD en bruto – salinidad en las botellas)
es de aproximadamente -0.007 PSU. Para determinar la deriva de conductividad, primero
hay que corregir los datos de temperatura y presión CTD. Imaginar que el error en la
temperatura es de +0.0015 °C uniformemente en todas las temperaturas, y el error en la
presión es de +0.5 dbar uniformemente en todas las presiones (las derivas de offset se

84
obtiene al proyectar el histórico de derivas de ambos sensores desde las calibraciones
pre-campaña). Introducir estos offset en el archivo .con para calcular la presión y
temperatura CTD corregidas, y calcular la salinidad del CTD usando esta presión y
temperatura CTD corregida. Este método de corrección asume que el coeficiente de
presión para la célula de conductividad es correcto. Los datos CTD con la temperatura y
presión corregidas serán:

Salinidad
Presión CTD Temperatura Conductividad
CTD Salinidad en
corregida CTD corregida CTD en bruto
[T,P las botellas
(dbar) (°C) (S/m)
corregidas]

202.2 18.3865 4.63421 34.9719 34.9770

1008.3 3.9816 3.25349 34.4653 34.4710

4063.6 1.4509 3.16777 34.6795 34.6850

A partir de aquí, las diferencias en la salinidad (CTD-botellas) de -0.005 PSU pueden


atribuirse a errores en la conductividad, siendo equivalentes a alrededor de -0.0005 S/m a
4.0 S/m.

Calcular la conductividad en la botella (conductividad calculada desde la salinidad en la


botella y la presión y temperatura CTD) abriendo SBEDataProcessing → RUN →
SeacalcW. Introducir en SALINITY la salinidad de la botella, en TEMP (ITS-90) la
temperatura CTD corregida, y en PRESSURE la presión CTD corregida:

Conductividad CTD en Conductividad en la Conductividad [CTD -


bruto (S/m) botella (S/m) Botella] (S/m)

4.63421 4.63481 -0.00060

3.25349 3.25398 -0.00049

3.16777 3.16822 -0.00044

Al representar el error de conductividad frente a la conductividad, se hace evidente que la


deriva es fundamentalmente un cambio en el slope. Si α es la conductividad CTD
calculada con los coeficientes de calibración del sensor y es β la conductividad en la
botella verdadera, entonces:

85
Al usar los datos de arriba, el coeficiente de corrección del slope para conductividad en
esta estación es:

Slope = [(4.63421 * 4.63481) + (3.25349 * 3.25398) + (3.16777 * 3.16822)] /


[(4.63421 * 4.63421) + (3.25349 * 3.25349) + (3.16777 * 3.16777)] = +1.000138

Siguiendo las recomendaciones del equipo, se asume un error del offset de conductividad
de 0.0.

86
BLOQUE 3

BIOGEOQUÍMICA DEL OCÉANO: CARBONO, NUTRIENTES Y


GASES TRAZA

MÉTODOS, TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS

87
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo, procesado de muestras y técnica analítica.

2. Titulo de la técnica

Muestreo y análisis de O2 disuelto en agua de mar.

3. Autores del documento y filiación

Marta Álvarez
IMEDEA (CSIC-UBI), Esporles, Mallorca.

4. Conceptos generales

El oxígeno disuelto en agua de mar se define como la cantidad de


moles de oxígeno gas por kilogramo de agua de mar.

Método potenciométrico automático para la determinación de oxígeno


disuelto en agua de mar basado en el método clásico Winkler. El
método descrito es adecuado para niveles de oxígeno entre 0 y 400
μmol kg-1 en agua de mar no contaminada, donde no halla sulfuro de
hidrógeno.

El método aquí descrito es una adaptación del protocolo WOCE de


Dickson (1995) donde se utilizan matraces especiales para oxígeno y
con volumen calibrado, y en ellos se realiza el análisis. Se hará
referencia a él porque se comparte el principio básico y gran parte del
protocolo.

El principio químico de la metodología está en Dickson (1995).

5. Finalidad. Campo de aplicación

Metodología para obtener y analizar muestras de oxígeno disuelto en


agua de mar para concentraciones de 0-400 mol kg-1 pero donde no
existe sulfuro de hidrogeno.

6. Equipamiento necesario

6.1. Muestreo

- matraces de muestreo: matraces winkler de cristal con sus


correspondientes tapones de un volumen de 100 ml.
- dispensadores de los reactivos de fijación: dos dispensadores que
dispenses alícuotas de 1 ml

88
- tubo de tygon o de silicona para el muestreo: asegurarse que se
puede fijar al pistón de la botella niskin y que sea lo suficientemente
largo para que entre hasta el fondo del matraz del muestreo y asegure
la comodidad en el mismo.

6.2. Análisis

- aparato de valoración potenciométrica (titrino, titrando u otro similar)


con bureta de 5 ml y electrodo de platino para oxígeno, si se dispone
de ellos vasos cerrados de valoración karl-fisher
- dispensador de alícuotas de 1ml para el ácido sulfúrico
- pipetas de cristal de 1 y 10 ml para pipetear yoduro potásico
- bureta knudsen de 50 ml
- sistema de vacío (una bomba o una tropa de vacío) para aspirar la
muestra fijada hacia la bureta knudsen
- mangueras con grifo para el sistema de aspiración
- termómetro para controlar la temperatura del laboratorio
- soporte con pinza para sostener la bureta knudsen
- agitadores magnéticos

7. Descripción de la Técnica

7.1. Muestreo

7.1.1 Introducción

Se debe muestrear la botella Niskin cerrada, es decir, el primero en abrir


la botella debe ser el que muestree O2, a menos que se muestreen
también CFCs que tienen prioridad. Esto es necesario para minimizar el
intercambio aire-agua de O2 con el head-space en la botella.

7.1.2. Procedimiento de muestreo

- confirmar que la Niskin está cerrada (apretar el pitorro y no sale agua,


ni gotea, si sale agua o gotea, anotar en el cuaderno de análisis)
- etiquetar adecuadamente los matraces de muestreo con la estación o
cast y el número de la Niskin, utilizar cinta blanca de electricista que no
se despega y se escribe bien, los rotuladores indelebles se borran.
- colocar los matraces de muestreo y los reactivos de fijación en un
lugar no peligroso donde no se rompan ni tropiece la gente con ellos.
- colocar la manguera de muestreo en el pitorro de la Niskin
- colocar el otro extremo del tubo en el fondo del matraz de muestreo,
abrir la niskin y cebar el tubo, lavar el matraz con esa agua
- llenar el matraz hasta rebosar dos veces su volumen, asegurarse de
que no hay burbujas ni en el tubo ni en el matraz, colocar el tubo en el
fondo del matraz y llenar

89
- cerrar la niskin
- inmediatamente añadir el cloruro manganoso (1 ml) y la disolución de
sosa (1 ml), la punta de los dispensadores se introduce como 1 cm
dentro de los matraces de muestreo.
- cerrar el matraz con su tapón y agitar fuerte
- comprobar que no hay burbujas dentro de la muestra fijada.
- seguir muestreando el resto de niskin
- reagitar todas la muestras una segunda vez, después de que se haya
formado el precipitado
- almacenar en zona fresca y oscura hasta que se valoren, cubrir con
una bolsa de basura oscura, las muestras deben estabilizarse durante
unas 24 horas

7. 2. Valoración potenciométrica

7.2.1. Montaje del sistema de valoración

Hacer un esquema previo de todas las cosas a colocar en la encimera:


titrino, soporte de bureta, sistema de vacío, …. Colocarlas de manera
operativamente cómoda para el analista y los compañeros de lab, en
el lab debería haber un fregadero cerca.
Cebar bien la bureta y los tubos del titrador con la solución de tiosulfato
a usar, hacer varios lavados y ensayos con muestras de mentira antes
de analizar las reales.
Colocar bien el electrodo y la bureta dosificadora en el vaso Kart-fisher,
cuando se dosifique el tiosulfato debe ir hacia el electrodo.
Controlar la fuerza del sistema de vacío, la aspiración de la muestra
debe ser suave, sin provocar burbujas, para eso se llevan grifos a
colocar en la manguera que conecta la knudsen con la trompa de
vacío.

7.2.2. Secuencia de análisis

Cualquier lote de muestras a analizar debe seguir este orden de análisis


- arranque del sistema con muestras de mentira para eliminar burbujas
de la línea de dosificación del tiosulfato
- determinación del blanco
- estandarización de la concentración del tiosulfato
- valoración de las muestras

7.2.2.1. Arranque del sistema

Tomar un litro de agua de mar del continuo y dejar que se estabilice a la


temperatura del laboratorio durante un día.
En el momento de empezar un lote de análisis, tomar 3 muestras de esta
agua en los matraces de muestreo y fijarlas.

90
Valorarlas (ver sección 7.2.4), si se ven burbujas en la línea del tiosulfato,
dar golpecitos a la misma para que se muevan.

7.2.2.2. Determinación del blanco


Se denomina blanco a la cantidad de O2 contenido en los reactivos y a
la presencia de otros oxidantes o reductores en la muestra a parte del
O2. El blanco de los reactivos se puede determinar experimentalmente
pero aquí hemos usado los valores dados por Murray et al. (1968) (ver
DOreg en apartado siguiente).
El blanco debido a la presencia de otros oxidantes o reductores en la
muestra se determinó de la siguiente manera: se estabiliza a
temperatura de laboratorio agua de mar de superficie, se llenan varias
botellas de muestreo de O2 con ella, a cada una se le añaden los
reactivos al revés, 1 ml de ácido sulfúrico, 1 ml de sosa/ioduro y 1 ml de
cloruro manganoso. Se agita fuertemente y se pipetean 50 ml exactos.
Una vez depositada en el vaso reactor se añade 1 ml de la disolución
estándar de iodato potásico 0.01N (Seawater solutions, OSIL, Inglaterra).
Se valora y se anota el volumen de tiosulfato gastado (V1, ml). Al
acabar la reacción se añade otro ml de iodato potásico y se valora. Se
anota el volumen de tiosulfato gastado (V2, ml).
El valor del blanco para una muestra de 100 ml sería V1-V2, al ser la
muestra de 50 ml será la mitad, valor que se introduce en la ecuación
(2).
Se realizan unos 5 blancos y se calcula la media.

7.2.2.3 Estandarización de la concentración del tiosulfato

La normalidad del tiosulfato se determina contra la disolución estándar


de iodato potásico 0.01N (Seawater solutions, OSIL, Inglaterra).
Se prepara agua de mar de la misma manera que para determinar el
blanco. Una vez los 50 ml en el vaso reactor se añaden 10 ml del iodato
0.01N con una pipeta.
Se realizan unas 4 valoraciones del tiosulfato por cada lote.
La molaridad de la disolución de tiosulfato a 20ºC se calcula:
10 * 0.01 ρ (20º C )
M S 2O 3 = * (1)
Vol S 2O 3 − Volbla ρ (TLab)

Donde:
VolS2O3 = volumen de tiosulfato gastado (ml)
Volbla = volumen del blanco (ml) La normalidad y la molaridad del
tiosulfato son equivalentes, al realizar los análisis a temperatura de
laboratorio estable todos los volúmenes de la fórmula (1) están referidos
a la misma y la molaridad a la temperatura de laboratorio es igual a la
de 20ºC que se introduce en la fórmula (2).

7.2.2.4 Valoración de las muestras

91
Una vez las muestras están estabilizadas a la temperatura del laboratorio
se procede a su análisis. Después de acidificar la muestra con 1 ml de
ácido sulfúrico (5M) y agitar, se toma una alícuota de la muestra con la
pipeta knudsen de volumen exacto 50ml a 20ºC.
La alícuota se analiza mediante una valoración en vaso cerrado con
una disolución de tiosulfato de sodio con una concentración nominal
de 0.025 M. El punto final se detecta potenciométricamente con un
electrodo de Pt/O2 y un valorador tipo "Titrino Metrohm". Los mililitros
gastados de tiosulfato se convierten a O2 en μmol kg-1 con la siguiente
fórmula:

V x * Vbot
( − Vblc ) * N S 2O3 * 5598 − 1000 * DOreg (2)
V Alic
O2 ,( mL / L ) =
(Vbot − Vreac )
(3)
O2 ( mL / L ) * 44.66
O2 ,( μmol / kg ) =
ρ ( Sal , Tlab) / 1000

Donde:
Vx = volumen gastado de tiosulfato, normalizado a 20ºC (ml)
Vbot = volumen aproximado de la botella (100 ml)
Vblc = volumen de tiosulfato gastado en el blanco, normalizado a 20ºC
(ml)
NS2O3 = normalidad a 20ºC del tiosulfato
DOreg = contenido en O2 de los reactivos de fijación añadidos (0.0017
ml según Murray et al. 1968)
Vreac = volumen añadido de los reactivos (2 ml)
ρ(Sal, Tlab) = densidad en kg/m3 del agua de mar a 1 atm de presión
con la salinidad (Sal, psu) de la muestra y la temperatura del laboratorio
(Tlab, ºC).
Todos los volúmenes se refieren a 20ºC usando la siguiente ecuación:

V 20 = VTlab * (1 + α * (TLab − 20)) (4)


α =(1 + 0.00000325) − 1 3

8. Reactivos u otro material fungible

Ver el apartado correspondiente de Dickson (1995) para las siguientes


disoluciones:
- cloruro manganoso (3 M)
- sosa (8 M) / yoduro de sodio (4 M)
- ácido sulfúrico (5 M)
- no se necesita la disolución indicadora de almidón

92
- tiosulfato de sodio: preparar como en Dickson (1995) pero a una
concentración de 0.025 M
- yoduro potásico: se puede preparar como en Dickson (1995) pero con
una concentración de 0.01 N o si no comprarla en OSIL SeaWater
Solutions
http://www.seawatersolutions.com/iodate-standards-73-c.asp

9. Calibración

Ver el apartado 7.

10. Calculo de los resultados.

Ver el apartado 7.

11. Control de calidad

11.1. Precisión de las medidas

La exactitud de las medidas de oxígeno debe satisfacer los


requerimientos WOCE, es decir, 0.5 μmol kg-1 durante una campaña
(una desviación estándar) y menos de 2 μmol kg-1 entre campañas y
entre laboratorios.
Se debe mantener un control de los blancos y del tiosulfato a lo largo de
la campaña así como de la reproducibilidad.
La exactitud de los análisis de O2 viene principalmente determinada
por el procedimiento de estandarización del tiosulfato. En cada lote de
análisis se debe realizar ya que la concentración del tiosulfato varía con
el tiempo, esta variación se debe mostrar en un gráfico en el informe
correspondiente.

11.2. Reproducibilidad de las medidas

Durante la campaña se deberían realizar análisis de replicados, varias


muestras tomadas de la misma niskin o muestras de distintas niskin
cerradas a la misma profundidad.
Más detalles se pueden encontrar en Dickson (1995).

12. Otras técnicas similares

Existen variantes a esta técnica según el método de detección del


punto final de la valoración, pudiendo ser potenciométrico como el
descrito o espectrofotométrico.

13. Referencias

93
Murray, C.N., J. P. Riley, T. R. S. Wilson (1968). The solubility of oxygen in
Winkler reagents used for the determination of dissolved oxygen. Deep-
Sea Research 15, 237-238.
Dickson, A.G. (1995). Determination of dissolved oxygen in sea water by
Winkler titration. WOCE Operations Manual. Part 3.1.3 Operations &
Methods, WHP Office Report WHPO 91-1.

94
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo, procesado de muestras y técnica analítica.

2. Titulo de la técnica

Determinación espectrofotométrica del pH mediante el uso de púrpura


de m-cresol

3. Autores del documento y filiación

Pelejero, C.
ICREA y Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.

Calvo, E.
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.

Fernández-Vallejo, P.
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.

Movilla, J.
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.

Álvarez, M.
Instituto Mediterráneo de Estudios Avanzados, CSIC-UIB, Esporles,
Mallorca

4. Conceptos generales

El pH del agua de mar, definido como el logaritmo, en signo negativo,


de la concentración de protones (pH = -log[H+]), es una variable crítica
en los sistemas marinos. Pequeñas variaciones en el pH del agua de mar
implican grandes cambios en la química marina, afectando, por
ejemplo, la especiación de nutrientes, la complejación de metales y la
estabilidad de las formas biogénicas de carbonato cálcico.

5. Finalidad. Campo de aplicación

Esta técnica permite la determinación del pH del agua de mar en la


escala total. La metodología descrita es una adaptación del método
‘SOP 6b’ del manual de Dickson et al. (2007), basado en el trabajo de
Clayton and Byrne (1993). En estas referencias, el lector encontrará más
información sobre el fundamento teórico y campo de aplicación. Muy
brevemente, esta técnica se basa en el cambio de color que
experimenta una muestra de agua mezclada con el colorante púrpura
de m-cresol en función del pH. Fundamentalmente, se trata de medir la
mezcla de agua de mar con colorante a tres longitudes de onda

95
específicas, que permiten conocer el pH del agua de mar. Este método
es superior en precisión y exactitud a las técnicas potenciométricas,
pudiéndose conseguir precisiones de hasta 0.0004 unidades de pH y
exactitudes de hasta 0.002 unidades de pH (Millero, 2007).

6. Equipamiento necesario

6.1. Muestreo

- Cubetas cilíndricas de vidrio óptico especial de 10cm de largo con dos


tapones.
- Bandeja con espuma cortada a medida para almacenar las cubetas.
- tubo de tygon o de silicona para el muestreo. En principio, se usará el
mismo que para el muestreo para el análisis de oxígeno (véase el
capítulo sobre el muestreo y análisis de O2 disuelto en agua de mar).

6.2. Análisis

- Espectrofotómetro dotado de soporte termostatizado para cubetas


cilíndricas (Shimadzu UV-2401 PC en el caso del Hespérides, o Perkin
Elmer Lambda 850 en el caso del Sarmiento de Gamboa) .
- Termómetro de varilla, para comprobar la temperatura de la muestra
después del análisis.
- Incubador para cubetas cilíndricas.
- Baño termostático con tubos de goma y fundas aislantes para
alimentar el soporte termostatizado del espectrofotómetro (primero) y el
incubador (después).
- Solución de indicador.
- CRMs.
- Multipipeta dosificadora con puntas, para administrar las alícuotas de
solución de indicador.

7. Reactivos u otro material fungible

7.1. Preparación de la solución de indicador

- Disolver 0.4 gramos de púrpura de m-cresol en 500 ml de agua de


CRM, que pueden ser restos (no es necesario abrir un frasco de CRM
nuevo). De este modo conseguimos una solución de concentración
2mM de indicador. En las muestras añadiremos 50 µl de esta solución, de
manera que las absorbancias no superen las 0.5 unidades.
- Para la campaña Malaspina, se preparará la solución de indicador
previamente, con la que se llenarán botellas pyrex de 100ml, que se
cubrirán de papel de aluminio, para evitar la fotodegradación del
indicador. A poder ser, se almacenarán las botellas en el frigorífico, pero
no es imprescindible. Si es este el caso, aproximadamente una hora

96
antes del análisis se sacará la botella para que adquiera la temperatura
ambiental del laboratorio.

8. Descripción de la Técnica

8.1. Muestreo

- Etiquetar adecuadamente las cubetas cilíndricas con la estación o


cast y el número de la Niskin (utilizar celo o cinta blanca de electricista
que no se despega y se escribe bien, los rotuladores indelebles se
borran).
- Colocar las cubetas en la bandeja con espuma recortada en un lugar
no peligroso donde no se rompan ni tropiece la gente con ellos.
- Las muestras de agua de mar se toman justo después del muestreo
para oxígeno disuelto, mediante las cubetas cilíndricas de 10 cm de
largo.
- Teniendo la manguera de muestreo del oxígeno disuelto en el pitorro
de la botella niskin, colocar el otro extremo del tubo en una de las
entradas de la cubeta cilíndrica.
- Abrir la botella niskin, y enjuagar primero la cubeta un par de veces.
- Llenarla posteriormente hasta que rebose el agua dos o tres veces el
volumen de la misma.
- Se debe evitar al máximo la formación de burbujas de aire, por lo que
es conveniente, durante el muestreo, situar la salida del agua de la
cubeta por encima de la entrada, procediéndose a tapar primero la
salida y retirando luego el tubo de la toma de muestra, colocándose a
continuación el segundo tapón, evitando que quede ninguna burbuja.
- Cerrar la niskin
- Una vez se han llenado todas las cubetas (una de cada botella niskin),
llevarlas al laboratorio y almacenarlas en el incubador durante 45 min
como mínimo.
- Antes de ponerlas al incubador es importante comprobar que no hay
burbujas de aire dentro del circuito interno de agua. Para eliminarlas,
basta con decantar un poco toda la caja del incubador con la salida
del agua hacia arriba y el circuito de agua en funcionamiento para que
vayan saliendo.
- También es muy importante comprobar que hay suficiente agua en el
baño termostático. Con los movimientos del barco es fácil que el baño
se vacíe un poco y no atempere correctamente.
- Sobretodo para las cubetas que contienen aguas profundas y frías, es
conveniente girar un poco los tapones por si se dilata el líquido interior (si
los tapones quedan demasiado apretados y resecos, hay riesgo de que
se rompan las cubetas por los extremos debido a la dilatación).

97
8.2. Análisis por espectrofotometría

- Encender el espectrofotómetro con antelación a la realización de las


medidas, a poder ser 2 horas antes. Encender las dos lámparas, la de
deuterio y la normal.
- Empezar a medir las muestras cuando ya lleven, como mínimo, 45 min
en el incubador.
- Si el espectrofotómetro es de doble haz, podemos dejar el haz de
referencia vacío o añadir una cubeta de referencia con agua milliQ o
con agua de mar. Si hay una cubeta dentro del equipo, es importante
sacarla cuando se reinicia el espectrofotómetro.
- Limpiar bien la cubeta, introducirla en el soporte del espectrofotómetro
y hacer línea de base en todo el rango, de 740 a 400 nm (o, opcional,
cero a las tres longitudes de onda)
- Es importante poner las cubetas en el soporte siempre con la misma
orientación, por ejemplo, con la marca de la cubeta en la parte
anterior.
- Sacar la cubeta, abrir un tapón, añadir solución de indicador (50 µl)
por el orificio, sumergiendo la punta de la pipeta hasta mitad de la
cubeta, abrir el otro tapón y cerrar con éste el orificio por el cual
introdujimos el indicador. Tapar el otro orificio con el tapón sobrante,
secar el líquido de muestra que se pueda derramar, agitar bien la
cubeta con la mezcla, limpiar de nuevo los extremos de la cubeta con
papel si es necesario, volverla a introducir en el soporte y leer a las tres
longitudes de onda de 434, 578 y 730 nm, tres veces.
- Si la absorbancia a la banda de referencia de 730 nm sale alta (>0.01),
es probable que no esté bien puesta la cubeta, que esté sucio uno de
los cristales o que haya una burbuja en la pared. Limpiar otra vez los
extremos de la cubeta, colocar bien en el soporte y volver a leer.
- Con el termómetro de varilla, medir la temperatura de las cubetas
después de leer con el espectrofotómetro. Apuntar este valor para el
cálculo del pH. El valor debería ser muy cercano a 25ºC. Si se observan
valores de temperatura ~0.2ºC por encima o por debajo de 25ºC, se
deberá modificar la temperatura del baño para corregir la diferencia
observada. Se debe tener en cuenta que durante la manipulación de
limpiado, secado y agitación de la cubeta con la muestra, e incluso
dentro del espectrofotómetro, se produce un calentamiento de la
muestra. Por ello, podría ser necesario fijar inicialmente la temperatura
del baño un poco por debajo de 25ºC (24.5 – 24.8ºC)
- Guardar los datos en un archivo nombrado por la estación, cada
muestra debe ir identificada con el número de botella.
- Para el cálculo de la perturbación del pH que ocurre al añadir el
indicador, deberemos calcular una ΔR añadiendo dos veces el
indicador en cuatro o cinco muestras de la roseta de profundidad,
repartidas entre fondo y superficie, para tener un buen rango de
variación del pH. Es importante hacer estas adiciones en cada estación,
para obtener la variación del ΔR con el pH para cada lote de indicador.

98
9. Calculo de los resultados.

- Durante la campaña Malaspina, el analista únicamente añadirá los


resultados obtenidos en las hojas Excel con macros que se habilitarán
para ello. Con posterioridad, M. Álvarez, E. Calvo o C. Pelejero realizarán
los cálculos oportunos.

10. Control de calidad

10.1. Determinación de la exactitud de las medidas.

- Una vez a la semana abriremos un frasco de CRM y llenaremos todas


las cubetas que podamos, directamente de la botella (aunque se
derrame un poco de líquido), sin sifonar. Para aprovechar al máximo el
CRM, el lavado de las cubetas lo haremos pasando el CRM enjuagado
de una cubeta a la siguiente. Deberíamos poder llenar unas 13 cubetas
con una botella de CRM.
- De esta forma, a partir de los datos de alcalinidad, DIC, salinidad y
nutrientes certificados del CRM, podremos calcular el pH real del CRM, y
comprobar la exactitud de nuestras medidas.

10.2. Determinación de la reproducibilidad de las medidas.

- Lo ideal es analizar repetidamente aguas profundas, que son las más


estables, por ejemplo una botella de 2.000m de profundidad, o la más
profunda de la roseta.
- Lo ideal es analizar la reproducibilidad una vez por semana, llenando
unas 10 cubetas.
- A las malas, si hay escasez de agua profunda, se puede hacer con
agua substandard del bidón, o de un bidón especial, por ejemplo de 5l,
que se debería llenar días antes con agua del continuo y sin ‘head
space’, para que se haya ido homogenizando y equilibrando.
- Un ejemplo del cálculo de reproducibilidad hecho de esta manera en
una campaña lo podemos encontrar en Álvarez et al. (2009), donde
obtuvieron reproducibilidades de 0.0009 unidades de pH (promedio de
las desviaciones estándar de la campaña).

10.3. Desfase constante de las medidas de pH espectrofotométrico.

- Según demostraron Del Valls y Dickson (1993), debido a inconsistencias


en las determinaciones de las constantes de disociación de las
soluciones de púrpura de m-cresol, las medidas de pH
espectrofotométrico deben corregirse con la adición constante de
0.0047 unidades de pH (Millero, 2007). Debe indicarse perfectamente en
el informe qué tipo de correcciones se han realizado sobre los valores
de pH, la escala y la temperatura en la que se calculan.

99
11. Referencias

Álvarez, M. et al., 2009. Estimating the storage of anthropogenic carbon


in the subtropical Indian Ocean: a comparison of five different
approaches. Biogeosciences 6, 681-703.

Clayton, T.D., Byrne, R.H., 1993. Spectrophotometric seawater pH


measurements: total hydrogen ion concentration scale calibration of m-
cresol purple and at-sea results. Deep-Sea Res. I 40, 2115-2129.

Del Valls, T.A., Dickson, A.G., 1998. The pH of buffers based on 2-amino-2-
hydroxymethyl-1,3-propanediol ("tris") in synthetic sea water. Deep Sea
Research Part I: Oceanographic Research Papers 45, 1541-1554.

Dickson, A.G., Sabine, C.L.; Christian, J.R. (Eds.) 2007. Guide to best
practices for ocean CO2 measurements. PICES Special Publication 3, 191
pp.

Millero, F.J., 2007. The marine inorganic carbon cycle. Chemical Reviews
107, 308-341.

100
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo, procesado de muestras y técnica analítica.

2. Titulo de la técnica

Determinación de la alcalinidad mediante valoración rápida a doble


punto final

3. Autores del documento y filiación

Pelejero, C.
ICREA y Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.

Calvo, E.
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.

Fernández-Vallejo, P.
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.

Movilla, J.
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.

Álvarez, M.
Instituto Mediterráneo de Estudios Avanzados, CSIC-UIB, Esporles,
Mallorca

4. Conceptos generales

Existen diversas definiciones de la alcalinidad del agua de mar, un


concepto cuyo desarrollo científico histórico se encuentra bien
detallado en Dickson (1992).

La alcalinidad hace referencia a la capacidad del agua para


neutralizar ácidos, y puede definirse rigurosamente, según Dickson
(1981), como el nombre de moles de protones equivalentes al exceso
de aceptores de protones (bases formadas de ácidos débiles con una
constante de disociación K ≤ 10-4.5 a 25°C y fuerza iónica cero) sobre
donantes de protones (ácidos con K > 10–4.5) en 1 kilogramo de muestra.
Así entonces, la alcalinidad (A) de la muestra vendría determinada por:

A = [HCO- ,3] + 2[CO2-,3] + [B(OH)- ,4] + [OH-] + [HPO2-,4]+ 2[PO3-,4] + [H3SiO- ,4]
+ [NH3] + [HS-] + … - [H+] - [HSO ,4] - [HF] - [H3PO4] …
-

donde los puntos suspensivos hacen referencia a especies adicionales


minoritarias básicas o ácidas que, o no se han identificado todavía, o

101
existen en tan pequeñas cantidades que pueden considerarse
despreciables.

5. Finalidad. Campo de aplicación

La alcalinidad es un parámetro muy importante y útil en el contexto del


sistema del carbonato en agua de mar. Es uno de los parámetros de
este sistema que se pueden medir y que, en combinación con otro
parámetro adicional (e.g. pH, pCO2 o carbono inorgánico disuelto),
permite determinar el resto de los parámetros. Análisis precisos de
variaciones en la alcalinidad permiten, asimismo, realizar estimaciones
sobre calcificación de los organismos marinos calcificadores.

Tradicionalmente, el análisis de alcalinidad en agua de mar implica la


realización de una valoración completa de la muestra mediante una
solución de ácido clorhídrico y la posterior evaluación computerizada
de la curva de valoración, para la determinación del punto final. Esta
valoración puede realizarse en un matraz cerrado (método ‘SOP 3a’ del
manual de Dickson et al. (2007)) o abierto (método ‘SOP 3b’ del manual
de Dickson et al. (2007)). Estos métodos, no obstante, son relativamente
lentos (~30 min por muestra), limitando críticamente su aplicabilidad en
campañas oceanográficas con gran número de muestras.

En el contexto de la campaña Malaspina, realizaremos los análisis de


alcalinidad mediante una valoración mucho más rápida (~ 2 a 3 min
por muestra), siguiendo el método desarrollado por Pérez y Fraga (1987),
modificado posteriormente por Pérez et al (2000). En estas referencias, el
lector encontrará más información sobre el fundamento teórico y el
campo de aplicación. Muy brevemente, esta técnica consiste en la
realización de una valoración rápida a punto final en un matraz abierto,
después de calibrar el electrodo a pH 4.4 (escala NBS), mediante la
utilización de un tampón de ftalato potásico-bórax. Mediante la
intercalación de medidas de material certificado (CRMs) entre los
análisis de muestras, este método permite alcanzar precisiones y
exactitudes del orden de 1 – 2 µmol/kg.

6. Equipamiento y fungible necesario

6.1. Muestreo

- Tubo de tygon o de silicona para el muestreo. En principio, se usará el


mismo que para el muestreo para el análisis de oxígeno y de pH (véase
los capítulos sobre muestreo y análisis de O2 disuelto y pH en agua de
mar).
- Frascos de 500 ml de borosilicato con tapón esmerilado.
- Cajas de plástico (estilo para cervezas) para almacenar los frascos de
500 ml (con espacio para unas 12 botellas por caja).

102
6.2. Análisis

- Titrando 808 de Metrohm con bureta de 5 ml.


- Electrodos 6.0257.000 Aquatrode plus con sonda de temperatura
Pt1000.
- Pipetas Knudsen de 195 ml.
- Bomba de vacío con trampa.
- Matraces (erlenmeyers) de valoración.
- Imanes.
- Matraz aforado de 5L, con divisiones de ml antes y después de la
marca de 5L, por si nos pasamos o no llegamos a este volumen.
- Termómetro de varilla.
- Ordenador portátil para operar el Titrando desde él. El titrando también
se puede controlar desde teclados táctiles específicos, pero es más
cómodo trabajar desde el portátil, tal i como haremos en la campaña
Malaspina.
- 2 bidones de agua substandard de 25 l.
- Soporte y pinza para la pipeta Knudsen.
- Cinta aislante para unir el electrodo y la bureta del Titrando una vez
corten bien.
- Cinta americana y cordinos para trincar bien el bidón, equipos, etc.
- Bolsas de basura negras para tapar el bidón de 25 L.

7. Reactivos y preparación de soluciones

7.1. Productos químicos necesarios:

- Solución comercial de electrolito (KCl) para llenar los electrodos, en


concreto KCl 3 mol/L Metrohm, botella de 250 ml Ref: 6.2308.020.
- Jeringas de Fixanal con 0.5 moles de HCl certificados (Riedel-deHaën).
- Tetraborato de sodio decahidratado (Na2B4O7•10H2O).
- Ftalato potásico (C8H5KO4).

7.2. Preparación de la solución de ácido clorhídrico para las


valoraciones

- La solución de HCl la prepararemos con agua destilada, no MilliQ!!, ya


que esta última normalmente contiene microburbujas generadas
durante el proceso de purificación.
- Enjuagaremos antes el matraz diversas veces con agua destilada para
eliminar restos de HCl que hayan podido quedar de la solución anterior.
- Siguiendo las instrucciones del producto comercial Fixanal, abriremos
una jeringa de 0.5 moles de HCl certificado y lo introduciremos en el
matraz aforado de 5 litros para obtener una disolución de HCl 0.1 molar.
- Añadiremos el HCl (jeringa) sobre cierto volumen de agua destilada en
el matraz, continuaremos pasando agua a través de la jeringa hasta

103
casi llenar el matraz, y enrasaremos a 5l o muy cerca (zona de divisiones
de ml marcadas), apuntando el volumen exacto.
- Mediremos la temperatura con el termómetro de varilla, y la
apuntaremos. Con este dato y el del volumen se podrá calcular,
durante el análisis de datos (hoja excel y macros ya preparados), la
concentración exacta de HCl teniendo en cuenta los cambios de
dilatación debidos a la temperatura.
- Agitaremos bien la solución y la dejaremos reposar, preferiblemente un
día como mínimo.
- En el caso concreto de la campaña Malaspina, suponiendo que
analizamos 14 profundidades de la columna de agua, por duplicado,
añadiendo 3 CRMs y 10 aguas substandard, y consumiendo unos 5 ml
de solución de HCl por valoración, implica que los 5 l de solución
alcanzarán para unos 25 días (200 ml de solución por día). En cada leg,
por lo tanto, se deberán preparar aproximadamente dos veces las
soluciones de HCl.
- Podemos apurar el HCl hasta el final, pero es importante no terminarlo
durante el análisis de una tanda. Por lo tanto, si ya queda poco, mejor
hacer de nuevo antes de empezar la tanda. De hecho, ya que hay que
dejarlo reposar durante al menos un día, preveer con antelación la
cantidad de ácido que se va a necesitar para procesar la siguiente
tanda de muestras.

7.3. Preparación de la solución tampón de ftalato potásico-bórax para


la calibración del electrodo a pH 4.4

- En el contexto de la campaña Malaspina, prepararemos cantidad


suficiente de este tampón para toda la campaña antes de su inicio, y la
almacenaremos en botellas pyrex de 100 o 200 ml, que guardaremos en
el frigorífico.
- Este tampón lo prepararemos con agua sin CO2, utilizando agua de
mar ya valorada después del análisis de alcalinidad, que dejaremos una
noche burbujeando con nitrógeno para eliminar cualquier traza de
CO2.
- Disolveremos 1,5257g de bórax (tetraborato de sodio decahidratado,
Na2B4O7·10H2O) y 4,085g de ftalato potásico (C8H5KO4) en 1 L de agua
sin CO2, y agitaremos.

7.4. Agua substandard para el bidón de 25 L

- El primer bidón se llenará una vez el barco ya esté situado a mar


abierto, para conseguir aguas con menos influencia costera y menor
carga en nutrientes inorgánicos. Llenaremos el bidón con agua del
sistema en continuo, y lo cubriremos con una bolsa de basura negra,
para evitar procesos de fotosíntesis. En principio debería dejarse
equilibrar 2 días antes de su uso. Por ello, utilizaremos dos bidones de 25

104
L, para poder llenar un segundo con tiempo para que se equilibre
cuando hagamos cambio de bidón.

8. Descripción de la Técnica

8.1. Muestreo

- Etiquetaremos adecuadamente los frascos con un número fijo, que


luego relacionaremos en cada caso con cada estación o cast y el
número de la Niskin, a través de un estadillo (utilizaremos celo o cinta
blanca de electricista que no se
despega y se escribe bien, los rotuladores indelebles se borran).
- Si se rompiera alguna botella la podríamos sustituir por los CRM vacíos,
tras haber retirado la grasa del cuello y del tapón.
- Colocaremos la caja de plástico con todos los frascos en un lugar no
peligroso donde no se rompan ni tropiece la gente con ellos.
- Las muestras de agua de mar para alcalinidad las tomaremos justo
después del muestreo de pH, que se toma justo después del muestreo
para oxígeno disuelto.
- Teniendo la manguera de muestreo del oxígeno disuelto en el pitorro
de la botella niskin, colocaremos el otro extremo del tubo en el fondo
del frasco de 500 ml.
- Abriremos la botella niskin y enjuagaremos los frascos y el tapón dos
veces con el agua de la niskin.
- Tomaremos la muestra llenando el frasco hasta arriba, dejando rebosar
al menos 1/3 de la botella, e intentando evitar la formación de burbujas.
- Cerraremos la niskin.
- Cerraremos bien el frasco y guardaremos, si es posible, en la oscuridad.
- Antes de guardar las botellas y tras asegurarnos que están bien
cerradas, es conveniente pasarles un poco de agua dulce por fuera
para evitar la acumulación de sal en el tapón y cuello de la botella
(podrían contaminar la muestra en el momento de abrirlas para su
valoración).
- Dejaremos estabilizar las muestras un mínimo de 4 o 5 horas antes de
analizar, para que se atemperen con el laboratorio. No fijaremos las
muestras con HgCl2, ya que éstas se procesarán 1 ó 2 días después del
muestreo, como máximo. Con el fin de ahorrar CRM, conviene acumular
un número importante de botellas y valorarlas todas el mismo día.

NOTA: No lavaremos nunca con agua dulce el interior de los frascos a


menos que tengan mucho fouling en el fondo, o no se hayan utilizado
en mucho tiempo.

8.2. Valoración con el Titrando

8.2.1. Calibración del electrodo con el tampón de pH 4.4

105
- Antes de empezar los análisis deberemos sacar el tampón de pH 4.4 de
la nevera para que se estabilice a temperatura ambiente (unos 20
minutos).
- Dejaremos inicialmente el electrodo del titrando sumergido en el
tampón viejo del día anterior unos 15 minutos. Abriremos antes el
taponcillo del electrodo (al final del análisis deberemos acordarnos de
cerrarlo de nuevo).
- Una vez el tampón nuevo esté estabilizado a temperatura ambiente,
dejaremos el electrodo del titrando sumergido en el tampón de pH 4.4
unos 20 minutos para que se estabilice.
- Apuntaremos la temperatura del laboratorio.
- Encenderemos el ordenador portátil, conectaremos el Titrando al
portátil por USB, y abriremos el programa TIAMO.
- Iremos a la opción [Method]. En “File”, “open”, buscaremos el método
“CAL”.
- Iremos a la opción [Workplace]. Introduciremos la identificación y el
método “CAL”.
- Con el electrodo sumergido en el tampón de pH 4.4, le daremos al
“Start” en el programa de calibración.
- Obtendremos el valor de la temperatura, el pH y el potencial. El
programa ya tiene memorizada la tabla de la relación pH vs T, obtenida
a partir de la ecuación publicada por Pérez et al (2000), pHNBS = 4.413 –
0.00059· ( T-25 ).

8.2.2. Valoración

- Agitaremos el matraz de ácido clorhídrico.


- Desde el portátil, cerraremos el método de calibración (opción
[Method], “Close” el método “CAL”.
- Abriremos el método alcalinidad (opción [Method], “File”, “open” y
buscaremos el método “alcalinidad”.
- Iremos a la opción [Workplace]. Entraremos los siguientes datos:
Identificación 1: fecha.
Identificación 2: Estación y número de botella.
Método: alcalinidad.
- Colocaremos bien la bureta y el electrodo para que corte bien, y la
valoración tarde entre 2 y 3 minutos. La punta de la bureta debe
quedar próxima al electrodo, de manera que éste sea muy sensible a la
adición de HCl. Una vez el sistema corta bien, fijaremos la posición del
electrodo y la bureta con cinta aislante, para que no se nos mueva la
configuración entre muestra y muestra.
- El volumen de agua a valorar será siempre constante, y lo
obtendremos mediante succión con una pipeta Knudsen (de volumen
calibrado) conectada a una bomba de vacío. Antes de empezar a
realizar valoraciones deberemos familiarizarnos con el grado de succión

106
de la bomba, para evitar turbulencias y burbujeos durante la extracción
de muestra (es importante abrir la llave poco a poco).
- Cuando introduzcamos la muestra succionada en la pipeta dentro del
matraz de valoración, tocaremos la pared superior del matraz (no la
muestra), y esperaremos siempre el mismo tiempo al final (e.g. 1
segundo). Es conveniente que el llenado se realice siempre de la misma
manera, para tener volúmenes lo más reproducibles posible.
- Una vez depositada la muestra, limpiaremos la punta de la pipeta con
papel de laboratorio.
- Entre muestra y muestra, nunca lavaremos el electrodo.
- Para empezar a valorar la solución en el matraz, provisto de un imán, le
daremos al botón ‘start’.
- Las primeras valoraciones las haremos con agua del continuo
(podemos llenar una botella de agua mineral de 1.5 l, despacio
evitando el burbujeo), hasta que corte bien, y obtengamos una buena
reproducibilidad en los volúmenes de HCl utilizados para llegar a los dos
puntos finales. Durante estas primeras valoraciones, aprovecharemos
para eliminar cualquier burbuja de aire que haya podido quedar
atrapada en el sistema de succión de HCl, tocando un poco los tubos
para que vayan saliendo. Opcionalmente, también existe una función
para realizar un lavado de la bureta mediante la expulsión de una
cantidad de HCl (en “workplace”, abrir la pestaña “Tools”, ir a “Manual
control”, “Dosing device 1”, “prepare” y presionar “START”. Poner la
bureta en una jarrita, dejar que complete 2 ó 3 ciclos y presionar
“STOP”).
- Para que corte bien y haga la valoración entre 2 y 3 minutos, puede
ser importante cambiar el volumen inicial de HCl que añade el titrando,
que se puede modificar mediante el software del equipo (‘Main
conditions’, ‘Start conditions’, cambiar el valor y, muy importante,
‘grabar’!). Dependiendo de la alcalinidad de cada zona oceánica,
puede que debamos cambiar este volumen inicial a lo largo de la
campaña o de cada transecto. De hecho, a veces es incluso necesario
ajustarlo en la misma estación, cuando hay mucha diferencia entre
aguas profundas y superficiales). Como indicación, el pH resultante
después de añadir el volumen inicial debe ser próximo a 5.
- Es importante observar el valor de pH que nos da el electrodo cuando
empieza la valoración. Si, por equivocación, estamos valorando una
muestra ya valorada, lo veremos así rápidamente. En este caso, parar
‘Stop’ inmediatamente, ya que el sistema continuaría añadiendo HCl sin
parar, al no alcanzar el punto final (según como se haya programado
en sistema, puede saltar una pantalla avisándote si pones una muestra
ya valorada).
- Una vez corte bien, valoraremos cuatro muestras de agua substandard
del bidón de 25L y, si obtenemos buena reproducibilidad, pasaremos ya
a los CRMs. Si no, podemos pasar alguna muestra más de agua
substandard hasta obtener buenos resultados.

107
- Valoraremos tres CRMs, para lo cual, seguramente, no bastará solo
con una botella.
- Valoraremos las muestras de la estación.
- Al final de la secuencia, valoraremos de nuevo 3 muestras de agua
substandard del bidón, para poder corregir posibles derivas.
- Si, por alguna razón, tenemos que parar a media tanda, es
conveniente pasar siempre 4 o 5 muestras de agua substandard del
bidón, para hacer los cálculos de deriva al final. Y antes de continuar los
análisis después de la pausa, también pasaremos 4 o 5 muestras del
agua substandard (es conveniente hacer turnos y evitar así paradas
largas, siempre que las condiciones lo permitan).
- Si analizamos dos estaciones seguidas, también pasaremos 2 ó 3
muestras de agua del bidón entre estación y estación.
- Después de valorar cada muestra, vaciaremos el contenido del matraz
vigilando no perder el imán, para lo cual nos ayudaremos con otro
imán.
- Al terminar la tanda de análisis, si no hay peligro de derrame por el
movimiento del barco, podemos dejar el electrodo sumergido en la
solución tampón hasta la próxima tanda de análisis, con el tapón
cerrado para que no se evapore el electrolito.

8.2.3. Cambio del agua del bidón

- Cambiaremos el agua del bidón de 25 L cuando el nivel esté


aproximadamente por debajo de 1/3 de su capacidad.
- Cuando lo hagamos, analizaremos 5 ó 6 substandards viejos seguidos
de 2 ó 3 CRMs, y de 5 ó 6 substandards nuevos.

8.2.3. Cambio de la solución de HCl

- Conviene hacerlo en un día diferente que el cambio del subestándar,


al menos con dos días de diferencia. Lo haremos analizando primero 5
muestras de agua substandard con el HCl viejo, después de las cuales
cambiaremos la solución de HCl, lavaremos la bureta desde la opción
‘Configuration’ del software Tiamo, y analizaremos 3 ó 4 muestras de
cualquier agua de mar, seguidas de 5 muestras de substandard y 2 ó 3
muestras de CRMs.

9. Calculo de los resultados.

- Durante la campaña Malaspina, el analista únicamente añadirá los


resultados obtenidos en las hojas Excel con macros que se habilitarán
para ello. Con posterioridad, M. Álvarez, E. Calvo o C. Pelejero realizarán
los cálculos oportunos.

10. Control de calidad

108
10.1. Determinación de la exactitud de las medidas.

La exactitud de las medidas se evalúa siguiendo la evolución temporal


de los análisis de CRMs de cada lote de análisis de muestras. Se
compara el valor medido con el valor certificado, la diferencia no debe
ser mayor de 2 μmol kg-1 . La exactitud puede calcularse como la media
de las diferencias entre los valores de alcalinidad medidos y certificados
de las CRMs de todos los lotes de cada leg de Malaspina. Ver el
material del apéndice en Álvarez et al. (2009).

10.2. Determinación de la reproducibilidad de las medidas.

La reproducibilidad se evalúa de dos modos distintos:


1) Análisis de alcalinidad de muestras (unas 5) tomadas de la misma
botella preferiblemente de aguas profundas, que son las más estables,
por ejemplo una botella de 2.000m de profundidad, o la más profunda
de la roseta. Esto se podría hacer dos veces en cada leg.
2) Análisis de alcalinidad de muestras tomadas de distintas botellas (de 2
a 5) pero cerradas a la misma profundidad en aguas profundas. Este
ejercicio es poco probable que se pueda realizar en Malaspina donde
la disponibilidad de agua y tiempo están muy ajustados.
3) Cada muestra se analiza dos veces por lo tanto tendremos una
media y una desviación estándar para cada muestra dentro de cada
lote de análisis. Estas desviaciones estándar dan una idea de la
reproducibilidad para cada lote y estudiándolas en conjunto para cada
leg.

11. Referencias

Dickson, A.G., 1981. An exact definition of total alkalinity and a


procedure for the estimation of alkalinity and total inorganic carbon
from titration data. Deep Sea Research Part A. Oceanographic
Research Papers 28, 609-623.

Dickson, A.G., 1992. The development of the alkalinity concept in marine


chemistry. Marine Chemistry 40, 49-63.

Dickson, A.G., Sabine, C.L.; Christian, J.R. (Eds.) 2007. Guide to best
practices for ocean CO2 measurements. PICES Special Publication 3, 191
pp.

Pérez, F.F., Fraga, F., 1987. A precise and rapid analytical procedure for
alkalinity determination. Marine Chemistry 21, 169-182.

Pérez, F.F., Ríos, A.F., Rellán, T., Álvarez, M., 2000. Improvements in a fast
potentiometric seawater alkalinity determination. Ciencias Marinas 26,
463-478.

109
Álvarez, M. et al., 2009. Estimating the storage of anthropogenic carbon
in the subtropical Indian Ocean: a comparison of five different
approaches. Biogeosciences 6, 681-703.

110
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo

2. Título de la técnica
Muestreo de carbono orgánico volátil (VOC)

3. Autores y filiación
Sergio Ruiz Halpern. Insitut Mediterani d´Estudis Avançats (IMEDEA).
Consejo superior de investigaciones científicas - Universitat Illes
Balears (CSIC-UIB)

4. Finalidad. Campo de aplicación

Técnica destinada a la cuantificación de carbono orgánico volátil tanto


en la atmósfera como disuelto en el agua, para la evaluación del pool
oceánico así como de los flujos difusivos brutos aire-agua/agua-aire y
los flujos difusivos netos de intercambio entre la atmósfera y el océano

5. Conceptos generales:

El flujo difusivo neto (Fwa) aire-agua, de cualquier compuesto se puede


estimar mediante:

Fwa= k (Cw-Cg/H’)

Donde Cw y Cg son las concentraciones disueltas y en fase gaseosa,


respectivamente, k el coeficiente de transferencia de masa aire-agua y
H’ es la constante adimensional de la ley de Henry (corregida para
temperatura) H’ se define como la razón entre la fase gaseosa y la
disuelta cuando el compuesto está en equlibrio

H’=Cgeq/Cweq

Si el objetivo es estimar el intercambio aire-agua de carbono orgánico,


hay que definir conceptos operacionales para el carbono orgánico en
fase gaseosa (GOC, en sus siglas en inglés: Gaseous organic carbon) y
el carbono orgánico disuelto intercambiable (EDOC, en sus siglas en
inglés: exchangeable disolved organic carbon). De esta manera el flujo
difusivo neto de carbono orgánico es:

Fwa,oc= k (EDOC-GOC/H’)

Por tanto, EDOC es una estimación de todo el carbono orgánico


disuelto en el agua que puede ser volatilizado y GOC/H’ es una
estimación de todo el carbono orgánico gaseoso que se puede
absorber en el agua.

111
Asimismo, ciertos compuestos orgánicos gaseosos, contienen nutrientes
(nitrógeno y fósforo) y se pueden estimar los flujos netos de nutrientes de
la misma manera.

6. Equipamiento necesario

-Nitrógeno de alta pureza (C-50 o superior, Ver figura 3)


-Regulador de gas con espiga para Nitrógeno (Ver figura 3)
-Botellas de vidrio de 1 L, con difusor de placa de vidrio porosa (Ver
figura 3)
-Trampas de vidrio de 100 mL con difusores de placa de vidrio porosa
(Ver figura 1)
-Llaves de tres vías (Ver figura 3)
-Tubo de Teflon fino (Ver figura 1)
-Tubo de silicona fino (Ver figura 1)

7. Reactivos u otro material fungible

-Agua ultrapura libre de carbono (MiliQ, Simplicity o para


cromatografía)
-H3PO4 “Reagent grade” concentrado (85%)
-Ampollas de vidrio mufladas (450º, 4,5 horas) (Ver esquema)
-Tubos para nutrientes HDPE (Ver esquema)
-Tubos para amonio HDPE (Ver esquema)

8. Calibración

No es necesaria

9. Descripción de la técnica

MUESTREO DE GOC:

GOC se determina indirectamente por el procedimiento descrito abajo,


pues este método da una estimación de GOC/H’, que no corresponde
realmente a la concentración en fase gaseosa, si no a la fase disuelta
equilibrada con aire. En cualquier caso esto tiene ventajas a la hora de
calcular el flujo difusivo neto.

Para muestrear GOC y nutrientes asociados a GOC, se equilibra aire


atmosférico libre de fuentes de contaminación cercanas (si se muestrea
desde un braco asegurarse que el motor está apagado o estamos a
sotavento de las emisiones), durante 30 minutos en agua ultrapura
acidificada con H3PO4 libre de carbono orgánico (MiliQ, simplicity o
agua para cromatografía), y sin acidificar para el muestreo de los
nutrientes asociados

112
PROCEDIEMIENTO:
Colocar un filtro (GF/F 25mm, sin muflar) en un tubo de teflón largo
mediante un porta filtros, colocar el extremo del tubo de teflón por
donde entrará el aire en un lugar ventilado y protegido de fuentes de
contaminación.

Aire fresco:
Burbujear durante 30 mins
A un flujo de 500-600 ml min-1 (Equivalente burbujas de pequeño
tamaño, que no hagan subir el nivel del agua ultrapura)
50 ml de agua ultrapura acidificada CON 50 µl de H3PO4, para GOC
50 ml de agua ultrapura SIN acidificar, para Nutrientes asociados

Figura 1. Circuito para muetreo de GOC

1: Portafiltros con filtro Whatman GF/F 25mm (no necesita ser muflado)
2: Difusores (uno para GOC otro para nutrientes asociados*
*(Si el flujo es desigual entre los dos difusores, se puede colocar una llave
de tres vias en cada difusor y regular un poco el flujo. Si no se toman
nutrientes asociados solo hace falta conectar un difusor)

113
3: Interruptor de puesta en marcha y potenciometro para regular el nivel
de burbujeo. (el burbujeo ha de ser mínimo, 500-600ml min-1, pocas
burbujas que no hagan subir el nivel del agua ultrapura)
4: Bateria de acido plomo 12V (cargar regularmente)
5: Bomba de vacio
6: toma de aire. Colocar en lugar ventilado libre de fuentes de
contaminación.

***COSAS IMPORTANTES
La bomba de vacio ha de colocarse al final del circuito y que actúe
desde ahí. Así se evita que el aire no pase por la bomba antes de pasar
por los difusores (se minimiza el riesgo de contaminación)

El difusor ha de conectarse de la manera adecuada, esto es con la


entrada de aire conectada a la entrada del difusor con la vara de
vidrio y placa porosa y la salida de aire (hacia la bomba) conectada al
otro extremo Si no la presión hará subir el agua por la vara y enviarlo a la
bomba (la bomba no se estropea, pero hay que limpiar todo de nuevo
y volver a colocarlo)

Utilizar siempre los mismos difusores para nutrientes y no mezclarlos (la


acidificación contamina con fósforo y da datos malos de nutrientes)

CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS

El agua ultrapura se transfiere a 2 ampollas de vidrio previamente


mufladas a 450 °C durante 4,5 horas y se sellan bajo llama, enjuagar con
muestra las ampollas antes de rellenarlas (agua ultrapura acidificada).
Una vez en el laboratorio se analizan mediante un analizador de
carbono orgánico total (Shimadzu TOC series o similar). IMPORTANTE: No
burbujear la muestra en el analizador

114
Figura 2. Detalle de sellado de las ampollas
MUESTREO DE EDOC:

EDOC y los nutrientes asociados a EDOC se determinan purgando 1 L


de agua de muestra (esta no se acidifica. Agua de mar, río o lago) con
N2 de alta pureza (C-50 o superior) durante 5-8 minutos en 50 ml de
agua ultrapura acidificada, para el muestreo de EDOC y sin acidificar
para el muestreo de los nutrientes asociados. El flujo para la purga es de
500/600 ml de N2 min-1, equivalente a un flujo muy pequeño,
prácticamente al mínimo, las burbujas deben ser de aproximadamente
el mismo tamaño que para GOC y que no hagan subir el nivel de agua.

1 L de agua de muestra en cada botella (agua de mar, dulce, de


incubación, etc)
50 ml de agua ultrapura acidificada con 50 l de H3PO4, para EDOC
50 ml de agua ultrapura SIN acidificar, para nutrientes asociados

115
Figura 3. Circuito para muestreo de EDOC

1. Botella de nitrógeno ultrapuro C-50 o superior


2. Manómetro con espiga para nitrógeno
3. Llaves de 3 vías para regular flujo
4. Botellas con 1 L de agua de muestra
5. Difusores con agua ultrapura. Si no se toman nutrientes asociados
solo es necesario conectar una botella con muestra a un difusor.

***COSAS IMPORTANTES

tanto el difusor como las botellas de muestra han de conectarse en el


sentido adecuado. El flujo de nitrógeno siempre ha de entrar en la vara
de vidrio con placa porosa para provocar el burbujeo de la muestra. Si
se conecta el revés la botella con muestra, el agua recorrerá el tubo y
entrará en el recipiente con agua ultrapura (hay que limpiar y volver a
empezar). si se conecta el difusor al revés, la presión de nitrógeno
desplazará al agua por la vara de vidrio y saldrá por el extremo final.

Utilizar siempre los mismos difusores para nutrientes y no mezclarlos (la


acidificación contamina con fósforo y da datos malos de nutrientes)

CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS

El agua ultrapura se transfiere a sendas ampollas de vidrio mufladas y se


sigue el mismo esquema que para GOC.

116
Notas sobre el muestreo de nutrientes

Para el muestreo de los nutrientes asociados tanto a GOC como a


EDOC. Se puede hacer simultáneamente en ambos casos, para ello solo
hay que dividir las conducciones y en el caso de EDOC, usar 1 L de
agua para cada muestra (EDOC y nutrientes asociados). Diferencias
importantes con respecto al muestreo de carbono orgánico son:

‐ No acidificar el agua ultrapura


‐ Conservar congelados en tubos HDPE de 13mL (tapón blanco)
‐ Analizar en un FIA (flow injection análisis).
‐ El agua para NH4+ se transfiere a tubo HDPE de 14mL (tapón rojo)
‐ Enjuagar los tubos y tapones con un poco de muestra (agua
ultrarpura burbujeada) antes de rellenarlos

Figura 4. Detalle para el muetreo de nutrientes asociados tanoto a GOC


como a EDOC

Si hay muestras que recoger a distintas profundidades o de varios


experimentos, se puede hacer simultáneamente para ahorrar tiempo.

NOTA: TODO el material debe ser debidamente limpiado antes de ser


usado. Conviene muflar todo el material de vidrio antes de ser utilizado
por primera vez o antes de embarcarse en la campaña. Una vez en la
campaña, si no se dispone de mufla, enjuagar con ácido diluido (3,7%)
y después con agua de muestra las botellas 3-4 veces antes de ser

117
usadas. Para las trampas de agua ultrapura, se recomienda enjuagar
varias veces con el agua que se vaya a usar para equilibrar la muestra
(con ácido para GOC-EDOC o sin ácido para nutrientes ), antes de
burbujearla. Jamás mezclar difusores para EDOC con difusores para
nutrientes (el fósforo residual de acidificar el agua ultrapura contamina
las muestras de nutrientes). También es conveniente lavar todo el
material (vidiro, tubos, portafiltros, etc) con HCl al 3,7% y enjuagarlo en
agua ultrapura.

10. Cuadro sinóptico de la técnica

Figura 5. Cuadro sinóptico de muestreo de carbono orgánico

11. Cálculo de los resultados

Calculo del Flujo Aire-Agua de VOC

Kwco2= (0.24*Uedoc^2+0.061*Uedoc)*24/100 (Nightingale et al. 2000)


(m d-1)

Vis =1.002*10^((1.3272*(20-Tw)-0.001053*(Tw-20)^2)/(Tw+105))

D =0.000000074*(2.6*18)^0.5*(Tw+273)/(vis*120^0.6)

118
Sc= vis/D * 0.01 (adimensional)
KGOC = Kwco2*(Sc/600)^-0.5 (m d-1)
Fvol= KGOC * EDOC (mmol C m-2 d-1)
Fab= -KGOC * (GOC/H’) (mmol C m-2 d-1)
Faw= Fvol + Fab (mmol C m-2 d-1)

Si Faw<0; ABS (Fab) > ABS (Fvol); flujo neto aire-aguaÆ deposición neta
de OC
Si Faw>0; ABS (Fab) < ABS (Fvol); flujo neto agua aire Æ volatilización
neta de OC

Uedoc= velocidad del viento a la hora del muestreo (m s-1)


Tw= temperatura de agua (º C)
Vis= viscosidad del agua
D= coeficiente de difusión molecular
Sc= número de Schmidt
KGOC= coeficiente de transferencia de masa (m d-1)
H’= H’ constante adimensinal de HenryÆ muestrear directamente
GOC/´H=
tiene la ventaja de no tener que estimar el valor de H´que introduciría
errores considerables a la hora de calcular el flujo.
GOC/H’ es la concentración que medimos directamente
EDOC y GOC/H’ is in µmol L-1 = mmol m-3
Fvol=flujo bruto de volatilización (mmol C m-2 d-1)
Fab= flujo bruto de absorción (mmol C m-2 d-1)
Faw= flujo neto difusivo de carbono orgánico (mmol C m-2 d-1)

U SST EDOC GOC/H' Vis D Sc=Vis/D Kwco2 KGOC Fvol Fab Faw
mmol m- mmol m- mmol m-
m s-1 ºC µmolL-1=mmol m-3 Adimensional m d-1 m d-1 2 d-1 2 d-1 d-1

Vis : =1,002*10^((1,3272*(20-B3)-0,001053*(B3-20)^2)/(B3+105))
D: =0,000000074*(2,6*18)^(0,5)*(B3+273)/(E3*120^(0,6))
Sc=Vis/D: =(E3/F3)*0,01
KwCO2: =(0,24*(A3)^2+0,061*(A3))*24/100
KGOC: =H4*(G3/600)^(-0,5)
Fvol: =I3*C3
Fab: =-I3*D3
Faw: =J3+K3

Estas son las fórmulas que han de introducirse en las celdas


correspondientes, siendo la celda A1 la primera del cuadrante superior
izquierdo

119
U: velocidad del viento en m s-1
SST: temperatura del agua en grados centígrados
EDOC: concentración de EDOC
GOC/H’: concentración de GOC
Vis: viscosidad del agua
D: coeficiente de difusión molecular
Sc: número de Schmidt
Kwco2: velocidad de pistón
KGOC: coeficiente de transferencia de masa (m d-1)
Fvol:f lujo bruto de volatilización (mmol C m-2 d-1)
Fab: flujo bruto de absorción (mmol C m-2 d-1)
Faw: flujo neto difusivo de carbono orgánico (mmol C m-2 d-1)

12. Control de calidad

Una vez al día, o cuando se considere necesario (experimentos


concretos…) se realizará un blanco burbujeando las trampas de 100 mL
directamente con Nitrógeno de alta pureza. El agua se acidificará para
el blanco de carbono, y se dejará pura para el blanco de nutrientes
asociados. Las conservación de los blancos es exactamente igual que
la de las muestras.
Hay que extremar las precauciones para mantener el material siempre
en óptimas condiciones de limpieza.

13. Referencias

Dachs, J., M. L. Calleja, C. M. Duarte, S. Del Vento, B.Turpin, G. J. Herndl,


AND S. AGUSTÍ. 2005. High atmosphere-ocean exchange of organic
carbon in the NE subtropical Atlantic. Geophys. Res. Lett. 32: L21807, doi:
10.1029/2005GL023799

Ruiz-Halpern, S., M.K. Sejr, C.M. Duarte, D. Krause-Jensen, T. Dalsgaard, J.


Dachs, and S. Rysgaard. 2010. Air water exchange and vertical profiles of
organic carbon in a subarctic fjord. Limnol. Oceanogr. 55, 1733-1740
doi:10.4319/lo.2010.55.4.1733

120
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Titulo de la técnica
Muestreo de nutrientes disueltos

3. Autores del documento y filiación


Montserrat Vidal, Irene Teixidor. Departament d’Ecologia. Universitat de
Barcelona.

4. Finalidad. Campo de aplicación


Recogida de muestras de agua para la determinación de las
concentraciones de nutrientes inorgánicos disueltos (nitrato, nitrito,
fosfato, silicato, amonio), y nitrógeno y fósforo orgánicos disueltos.

5. Conceptos generales
Los elementos nutritivos están implicados en la producción de materia
orgánica mediante fotosíntesis en la capa superficial de los océanos. Su
disponibilidad y distribución en formas inorgánicas y orgánicas juega un
papel esencial en los flujos y exportación de carbono.

6. Equipamiento necesario
Sistema de filtración Millipore.
Bomba de filtración
Nevera portátil.

7. Reactivos u otro material fungible


Cápsulas de filtración AcroPak de Pall Corporation.
Tubo de silicona
Botellas Nalgene de policarbonato de 1L, oscurecidas con cinta opaca.
Botellas pyrex de tapón de rosca y teflón (color rojo) de 50 ml
Botellas de borosilicato de tapón blanco de 60 ml
Botellas de plástico Nalgene de 60 ml
Probetas de vidrio de 250 ml.
Probetas de plástico de 0.1 L, 0.25 L, 0.5 L, 1 L
Probetas de vidrio de 10 ml, 25 ml, 50 ml.
Matraz aforado de 1 L
Botellas de polietileno de 1 L, 0.2 L, 0.1 L,
Tubos de polipropileno de 12 ml estériles.

Reactivos
(1) Ácido clorhídrico.

Preparación de las cápsulas de filtración.


(1) Llenar las cápsulas con una solución de ácido clorhídrico al 10 %.
(2) Mantener un mínimo de 24 h.

121
(3) Aclarar con abundante agua milli-Q.
Mantener en solución ácida después de cada utilización y repetir el
paso 3 antes de cada muestreo.

Ácido clorhídrico  Abundante agua 
10% bides tilada

24h

8. Calibración

9. Descripción de la Técnica
(01) Todo el material debe lavarse en ácido diluido y aclararse 3 veces
con agua milli-Q al inicio del tramo.
(02) Para evitar al máximo la posibilidad de contaminación, las botellas
de muestreo estarán numeradas y se usarán siguiendo el mismo orden.
Entre muestreos consecutivos se aclararán 3 veces con agua milliq.
(1) Conectar la cápsula de filtración a la Niskins mediante un tubo de
silicona.
(2) Dejar pasar unos 200 ml de muestra.
(3) Aclarar la botella de muestreo (Nalgene de 1L) 3 veces con la propia
muestra.
(4) Recoger la muestra. Evitar el contacto de la botella de muestreo con
superficies sucias (no depositar directamente en el suelo).
(5) Mantener las muestras protegidas de la luz natural y refrigeradas (en
nevera portátil) durante el muestreo de la Rosette.
(6) En el laboratorio, recoger las submuestras para las distintas
determinaciones. Los recipientes deben aclararse dos veces con la
muestra antes de llenarse. Mantener siempre los tubos y botellas en
posición vertical. No tocar con los dedos el interior de las botellas y
tapones. Se recogerá una botella Nalgene de 60 ml y se congelará
inmediatamente hasta la comprobación de todos los resultados. El resto
de muestras se recogerán como se indica a continuación:

122
SRP (método manual). Llenar 2 botellas de vidrio de tapón de rosca
blanco con 50 ml. Las muestras se mantendrán refrigeradas hasta el
momento de su análisis que no se demorará más de 2 h.
DOP Se analiza a partir de la determinación del fósforo total (TP),
después de la oxidación de la muestra y posterior análisis del SRP por el
método manual. Llenar 2 botellas pyrex de 50 ml de tapón de rosca y
junta de teflón con 30 ml. Las muestras se mantendrán refrigeradas
hasta el momento de su análisis, al cabo de unas pocas horas.
DON Se analiza a partir de la determinación del nitrógeno total (TN),
después de la digestión de la muestra y posterior análisis del NO3, a
través de autoanalizados. Llenar 2 botellas pyrex de 50 ml de tapón de
rosca y junta de teflón con 10 ml. Las muestras se mantendrán
refrigeradas hasta el momento de su análisis, al cabo de unas pocas
horas.
DIN Llenar 3 tubos de polipropileno de 12 ml estériles. Analizar
inmediatamente uno de los tubos, mediante autoanalizador, y congelar
los otros dos a -20 ºC hasta que se hayan verificado todos los resultados.
Congelar Llenar una botella Nalgene de 60 ml y congelar
inmediatamente.
En caso de que no sea posible el análisis inmediato, las muestras se
recogerán en botellas de polietileno o policarbonato y se congelarán
inmediatamente.
Adaptación de la técnica para medios pobres en elementos nutritivos.
En estos casos es conveniente no filtrar las muestras, de manera que el
procedimiento se iniciará en el punto 3.

10. Cuadro sinóptico de la técnica

Muestreo:

Tubo de
silicona
Aclarar (x2) Llenar C/N

Niskin

Filtro
200micras Garrafa 20l P

Botellas
Nalgene 123
Recoger submuestras:
 

50 ml  1l
muestra 

Llenar

50ml  Nalgene 
30 ml  60ml 
SRP x  Muestra 
Llenar

Pyrex 
CONGELA
50ml  10 ml
muestra

DOP x 2 

Pyrex 
50ml DIN x 3

           DON x    

124
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo y procesado de muestras

2. Titulo de la técnica
Filtración en rampa con presión positiva.

3. Autores del documento y filiación


Montserrat Vidal & Irene Teixidor. Departament d’Ecologia. Universitat de
Barcelona.

4. Finalidad. Campo de aplicación


Recogida de material en suspensión sobre filtros para la determinación
del carbono, nitrógeno y fósforo particulado. Se recogerán dos filtros de
cada muestra para un análisis posterior, uno para la determinación de
fósforo y otro para la determinación conjunta de nitrógeno y carbono.

5. Conceptos generales
La actividad biológica lleva a la incorporación de carbono, nitrógeno y
fósforo en los organismos. La concentración de carbono, nitrógeno y
fósforo de la fracción particulada se relaciona con las características
tróficas del medio.

6. Equipamiento necesario
Rampa de filtración conectada a botella de nitrógeno con soportes de
filtros y botellas de filtración (ver foto).

125
DIAGRAMA DEL MATERIAL

Manòmetro

Tubos de silicona
N2

Llaves

Botella de N2 Botellas
C/N P Nalgene

Rampa de
filtración
Filtro Whatmann GF/F
Soporte de filtro

Tubos de silicona

7. Reactivos u otro material fungible


Rampa de filtración
Botella de N2
Tubos de silicona
Manómetro
Llaves y conectores.
Botellas Nalgene de filtración (de tapón de rosca y abertura inferior).
Soportes de filtros de policarbonato de 25 mm.
Pinzas Millipore
Filtros Whatman G/F F de 25 mm
Garrafas de 10-20 L
Crioviales
Gradillas para crioviales
Gradillas para muestras encapsuladas
Ácido clorhídrico

8. Calibración

9. Descripción de la Técnica
(01) Usar filtros Whatmann GF/F, previamente calcinados a 450 ºC
durante 4 h.

126
(02) Todo el material mantenido en ácido diluido y aclarado 4 veces con
agua milli-Q.
(1) Aclarar la garrafa de muestreo 3 veces con la propia muestra.
(2) Recoger todo el volumen de una Niskin a través de un tubo de
silicona acabado en un prefiltro de 200 micras y que se conecta
directamente a la Niskin.
(3) Montar los filtros en sus soportes.
(4) Mezclar suavemente el contenido de la garrafa (4 veces) antes de
llenar las botellas de filtración, para homogenizar su contenido.
(5) Llenar las botellas de filtración con un volumen determinado de
muestra.
(6) Colocar las botellas de filtración en la rampa, abrir las llaves de paso
y eliminar cuidadosamente las burbujas del circuito.
(7) Verificar que la presión es inferior a 5atm.
(8) Comprobar la estanqueidad del circuito.
(9) Proceder a la filtración (abriendo las llaves de salida del agua
filtrada, recogerla en alguna botella para hacer los blancos).
(10) Para filtrar volúmenes adicionales sobre el mismo filtro, desenroscar
el tapón con el soporte de filtro, llenar nuevamente la botella (no olvidar
tapar la espita de conexión al aire), repitiendo los pasos a partir de (4).
Debe evitarse la exposición del filtro al aire.
(11) Acabada la filtración, sacar los filtros de su soporte con las pinzas,
depositar en un vial (previamente lavado en ácido y calcinado) y
congelar rápidamente en N líquido. Posteriormente los filtros pueden
trasladarse a una cámara de congelación a -20 ºC.
(12) Preparación de blancos de filtración. Filtrar agua previamente
filtrada y recoger el filtro para su posterior análisis. Se debe de filtrar un
mínimo de 2 L.

10. Cuadro sinóptico de la técnica

Procesado de muestras – filtración:

0. Inicio: 1. Montar los filtros en los soportes:

N2 N2

127
2. Abrir las llaves de paso y eliminar las burbujas 3. Filtración:

P < 5atm Si es necesario filtrar


un volumen mayor de
N2 N2
muestra:
- Cerrar las llaves
- Rellenar la botella
- Filtrar mediante el
mismo filtro

4. Cerrar las llaves, retirar los filtros y depositarlos en un vial:

N2

Conservación:
N líquido
Vial

128
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Procesado de muestras

2. Titulo de la técnica
Determinación de nitrógeno orgánico disuelto por el método de la
oxidación con persulfato en medio alcalino.

3. Autores del documento y filiación


Montserrat Vidal, Irene Teixidor. Departament d’Ecologia. Universitat de
Barcelona.

4. Finalidad. Campo de aplicación


El protocolo está destinado a la cuantificación del nitrógeno orgánico
disuelto.

5. Conceptos generales
El nitrógeno orgánico disuelto es un producto de la actividad biológica.
Por consiguiente, tiende a acumularse en las capas superficiales de los
océanos. La proporción de nitrógeno en forma orgánica disuelta es
variable y se relaciona con las características tróficas. Las formas
orgánicas disueltas pueden canalizar una parte sustancial de la
exportación de nitrógeno a las aguas profundas del océano.

6. Equipamiento necesario
Autoclave.

7. Reactivos u otro material fungible


Botellas pyrex de tapón de rosca y teflón (color rojo) de 50 ml.
Botellas de borosilicato de tapón blanco de 60 ml.
Pipetas automáticas, 1, 5 ml.
Puntas de pipeta.
Probetas de vidrio de 10, 50 y 100 ml.
Probetas de plástico de 250 ml.
Matraces aforados de 0.1 L, 1 L, 5 L.
Botellas de policarbonato de 0.2 L, 0.5 L, 1L.
Botellas de policarbonato Nalgene de 60 ml.
Pipeta multi-step.
Jeringas para pipeta multi-step.
Dosificador 10 ml.

Reactivos
(1) Hidróxido de sodio (NaOH)
(2) Ácido bórico (H3BO3)
(3) Peroxodisulfato de potasio (K2S2O8).
(4) Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate; EDTA disódica
(372.24 g/mol)

129
(5) Nitrato de potasio (KNO3; 101.1 g/mol)

Preparación de los reactivos


(01) Todo el material debe lavarse en ácido diluido y aclararse 3 veces
con agua milli-Q previo a su uso.
(02) Para evitar al máximo la posibilidad de contaminación, las botellas
de análisis estarán numeradas y se usarán siguiendo el mismo orden.
(1) Solución de NaOH 0.375 M: disolver 30 g de NaOH en 2L de milli–Q.
Guardar en botella de polietileno. Preparación de 1L antes de salir de
puerto, para cada leg.
(2) Solución oxidante de persulfato de potasio en medio alcalino: Diluir
300 ml de la solución de NaOH (0.375 M) a 1.5 L de agua milli–Q dentro
de una botella de polietileno de 2 L. Disolver 15 g de persulfato de
potasio y 9 g de ácido bórico. Guardar refrigerada y protegida de la
luz. Será necesario preparar solución cada 2AABs (es decir, cada seis
días). La solución es estable durante algunas semanas, por lo que podrá
aprovecharse la solución de uno a otro leg (no será necesario hacer
solución extra en puerto).

Solución NaOH: Solución oxidante de persulfato de


potasio:

(3) Preparación de referencias de DON.


(3.1) Solución madre: disolver 186.2 mg de EDTA en agua milli-Q, en
matraz aforado y enrasar a 0.1 L. La solución tiene una concentración
de 10 mM. Guardar en la oscuridad, refrigerada en botella de vidrio. La
solución es estable durante meses.
(3.2) Solución de referencia. Añadir 2 ml de la solución anterior a un
matraz aforado que contiene 5 L de agua de mar de baja
concentración de nutrientes (reactivo 4, del método de determinación
de SRP). La solución tiene una concentración de 4 μM de N-EDTA.
Repartir la solución en botellas de policarbonato de 60 ml (Nalgene) y
congelar.
(4) Preparación de referencias de NO3

130
(4.1) Solución madre: disolver 202.2 mg de KNO3 en agua milli-Q, en
matraz aforado y enrasar a 0.1 L. La solución tiene una concentración
de 10 mM. Guardar en la oscuridad, refrigerada en botella de vidrio. La
solución es estable durante meses.
(4.2) Solución de referencia. Añadir 1 ml de la solución anterior a un
matraz aforado que contiene 5 L de agua de mar de baja
concentración de nutrientes (reactivo 4, del método de determinación
de SRP). La solución tiene una concentración de 4 μM de N-NO3.
Repartir la solución en botellas de policarbonato de 60 ml (Nalgene) y
congelar.

Esquema de preparación de referencias de DON

Referencia orgánica:
186.2mg EDTA

[10 mM]
Solución
MQ Refrigerar
madre
0.1l

Matraz aforado

2ml solución madre

[4 μM N-
EDTA]
Solución
referencia Agua de mar a Congelar
baja
[nutrientes]

5l

Botellas Nalgene
Matraz aforado 60ml

202.2mg KNO3
Referencia inorgánica:

[10 mM]
Solución
MQ Refrigerar
madre
0.1l

Matraz aforado

1ml solución madre

[4 μM N-
EDTA]
Solución
referencia Agua de mar a Congelar
baja
[nutrientes]

5l 131

Botellas Nalgene
Matraz aforado 60ml
8. Calibración
(1) Se utiliza la misma serie patrón, a partir de nitrato de potasio (KNO3),
que para el método de análisis de nitrato mediante autoanalizador, con
la salvedad de que, previamente, las soluciones se han sometido al
proceso de oxidación.
(2) En cada tanda de oxidación se incluirán 1 referencia de nitrógeno
orgánico (EDTA) de concentración 4 μM N-EDTA y 1 referencia de nitrato
4 μM N-NO3.
(3) Se procederá también a la oxidación y análisis de la solución
oxidante cada vez que se prepare una nueva solución.

9. Descripción de la Técnica

Oxidación.
A cada muestra 10 ml (en botella de pyrex de tapón rojo):
(1) Añadir 10 ml de solución oxidante.
(2) Cerrar herméticamente y autoclavar a 120 ºC durante 0.5 h.
(3) Enfriar el autoclave hasta temperatura ambiente antes de abrir.
(4) Comprobar que los tapones de las botellas siguen firmemente unidos
y que no ha habido variaciones de volumen. Dejar enfriar. Una vez
digeridas, el análisis de nitrato puede demorarse 1-2 días.
(5) Analizar las concentraciones de nitrato mediante autoanalizador.

10. Cuadro sinóptico de la técnica

10ml s oluc ión


ox idante
Dejar enfirar a
Verificar ajuste de
temperatura
tapón y volumen
DON Autoclave ambiente

10ml  120ºC Autoanaliz ador


mues tra
0,5h

11. Calculo de los resultados.

12. Control de calidad


La reproducibilidad se verificará con referencias preparadas en agua
de mar, que se analizarán al mismo tiempo que las muestras (ver en
calibración).

13. Referencias
Grasshoff, K., K. Kremling and M. Ehrhardt, 1999. Methods of seawater
analysis. Wiley-VCH.

132
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Técnicas analíticas

2. Titulo de la técnica
Análisis de la concentración de fósforo reactivo soluble por el método
de la formación del complejo azul de fosfomolibdato.

3. Autores del documento y filiación


Montserrat Vidal, Irene Teixidor. Departament d’Ecologia. Universitat de
Barcelona.

4. Finalidad. Campo de aplicación


Se trata de un método manual de análisis espectrofotométrico. Permite
aumentar el límite de detección. Para ello la lectura de la absorbancia
se hace en cubeta de 10 cm de paso de luz. De esta forma, con un
buen espectrofotómetro, se pueden determinar concentraciones de
0.01 μM.

5. Conceptos generales
El fósforo reactivo soluble alude al fósforo disuelto en el medio en forma
de ortofosfato, además de la fracción orgánica e inorgánica que
resulta liberada a la solución debido a las condiciones ácidas de la
reacción.

6. Equipamiento necesario
Placa de agitación magnética
Espectrofotómetro

7. Reactivos u otro material fungible


Botellas de borosilicato de tapón blanco de 60 ml
Pipetas automáticas
Puntas de pipeta
Pipeta multi-step
Jeringas de distintos volúmenes para pipeta multi-step.
Botellas de polietileno de 1 L, 0.1 L, 0.25 L
Botella de vidrio pyrex de 0.1 L, 0.25 L, 0.5 L, 1 L
Matraz aforado de vidrio de 1 L
Matraz aforado de 5 L.
Erlenmeyers/Vasos de precipitados de: 0.25 L, 0.10 L, 0.05 L
Imanes magnéticos
Filtros de policarbonato de 2 μm y 5 μm
Pipetas aforadas de 1, 2 y 5 ml
Pipetas graduadas de 1 y 5 ml
Bandejas
Papel de secar
Guantes

133
Reactivos
(1) Ácido sulfúrico(1.835 g cm-3, 96 %).
(2) Ácido ascórbico (C6H8O6).
(3) Heptamolibdato amónico tetrahidrato ((NH4)6Mo7 O24 4H2O).
(4) Tartrato de antimonio y potasio (K(SbO)C4H4O6, con o sin 1/2 H2O).
(5) Dihidrógeno fosfato de potasio (136.09 g/mol).

Preparación de los reactivos:


(01) Todo el material debe lavarse en ácido diluido y aclararse 3 veces
con agua milli-Q previo a su uso.
(02) Para evitar al máximo la posibilidad de contaminación, las botellas
de análisis estarán numeradas y se usarán siguiendo el mismo orden.
(1) Solución de ácido sulfúrico de concentración 4.5 mol dm-3. Añadir 0.5
L del ácido concentrado a 1.5 l de agua milli–Q. Dejar enfriar y diluir a 2
L en matraz aforado de vidrio. Guardar en botella de polietileno. Es la
misma solución que la usada para el DOP (sólo se preparan 2L a la vez,
no 4L!)
(2) Solución ácida de ascórbico. Disolver 40 g de ácido ascórbico
(C6H8O6) en 200 ml de agua milli–Q; a continuación añadir 200 ml de la
solución de ácido sulfúrico 4.5 M (reactivo 1). Guardar en botella de
vidrio pyrex de 0.5 L refrigerada. El reactivo se puede usar durante una
semana, siempre que permanezca sin color. Será necesario preparar
solución cada 2 AABs y también antes de salir de puerto.
(3) Reactivo mixto.
(3.1) Disolver 50g de heptamolibdato amónico tetrahidrato en
500 ml de agua milli–Q.
(3.2) Disolver 2 g de tartrato de antimonio y potasio 80 ml de agua
milli–Q.
(3.3) Llenar una botella de borosilicato pyrex con 1400 ml de
ácido sulfúrico (reactivo 1) y poner en un agitador magnético en
agitación continua.
(3.4) Añadir la solución de molibdato.
(3.5) Añadir la solución de tartrato.
(3.6) Guardar en botella de vidrio ámbar refrigerada. El reactivo es
estable durante varios meses. Al preparar botellas de 2L sólo es
necesario preparar reactivo 4 veces a lo largo de todo el viaje. Será
bueno prever en que leg va a acabarse una botella para poder
preparar la siguiente a puerto.
(4) Agua de mar de baja concentración de nutrientes. Se recogerá en
una zona de mar abierto, de baja concentración de nutrientes. Filtrar
agua directamente del continuo, a través de un filtro de policarbonato
de 2 o 5 μm, y verter en garrafas de 20 L. Guardar en la oscuridad
durante varios meses para su estabilización. Filtrar a través de
Whatmann GF/F antes de su utilización para la preparación de
patrones:

134
Ácido ascórbico: Reactivo mixto:

8. Calibración
(0) El material deberá lavarse en baño ácido y aclararse 3 veces con
agua milliq previo a su uso.
(1) Preparación de patrones de dihidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4)
(1.1) Solución madre de fosfato de concentración 10 mM. Disolver
136.09 mg en agua milli-q a la que se ha añadido 0.2 ml de ácido
sulfúrico (reactivo 1), enrasar en matraz aforado de 100 ml. Guardar en
botella de vidrio pyrex refrigerada. La solución es estable durante meses.
(1.2) Solución de patrón primario. Se prepararán dos soluciones, para las
series de concentraciones bajas y altas, respectivamente.
Serie A (para concentraciones bajas): Diluir 1 ml de la solución
madre con agua milli-Q en matraz de vidrio aforado y enrasar a 1
L. Guardar en botella de vidrio pyrex, o policarbonato,
refrigerada. La solución tiene una concentración de 10 μM P-PO4.
Serie B (para concentraciones altas): Diluir 1 ml de la solución
madre con agua milli-Q en matraz de vidrio aforado y enrasar a
0.1 L. Guardar en botella de vidrio pyrex o policarbonato,
refrigerada. La solución tiene una concentración de 100 μM P-
PO4.
(1.3) Series patrón. Se preparan a partir de la solución de patrón primario
correspondiente A o B, en matraces de vidrio aforado de 100 ml. Se
preparan en agua de mar de baja concentración de nutrientes
(reactivo 4). El detalle de la preparación de las distintas soluciones se
indica en la tabla a continuación.

135
Patrón MQ (ml) [PO4]
primario (ml) (enrasar)
0.1 100 0.01
Solución 0.2 100 0.02
A 0.5 100 0.05
[10μM] 1 100 0.1
2 100 0.2
0.5 100 0.5
Solución 1 100 1
B 2 100 2
[100μM] 4 100 4

136.09mg 
K H 2P O 4

[10 mM
P-PO4] S olución 
MQ  + 0.2ml  madre
s ol.1 (ácido 
s ulfúrico)
0.1l

Matraz  aforado

S erie A S erie B
(concentraciones  bajas ) (concentraciones  altas )

[10 μM [100 μM
P-PO4] P-PO4] S olución  
1ml  1ml 
s olución  patrón 
s olución 
madre madre primario
1l 0.1l

Matraz  aforado Matraz  aforado

… …
[0.02 μM] [0.05 μM] [0.5 μM]
0.2ml  0.5ml  [1 μM]
0.5ml  1ml patrón 
patrón  patrón  patrón  S erie  
primario primario primario
primario patrón 
0.1l 0.1l 0.1l primario
0.1l

Matraz  aforado  Matraz  aforado Matraz  aforado 


Matraz  aforado

(2) Referencia de baja concentración de PO4. Añadir 15 ml de la


solución B de patrón primario 100 μM a un matraz aforado de 5 L y llenar
con agua de mar de baja concentración de nutrientes (reactivo 4). La

136
solución tiene una concentración de 0.3 μM P-PO4. Repartir la solución
en botellas de policarbonato de 60 ml (Nalgene) y congelar. .

5ml solución B [100μM] 

Referencia [0.3μM] 
Congelar y usar 1 botella con 
Agua de mar con  cada serie de análisis.  
baja [nutrientes] 
5l 

Matraz aforado  Nalgene 60ml

(3) Referencia de alta concentración de PO4. Añadir 50 ml de la


solución B de patrón primario 100 μM a un matraz aforado de 5 L y
llenar con agua de mar de baja concentración de nutrientes (reactivo
4). La solución tiene una concentración de 1 μM P-PO4. Repartir la
solución en botellas de policarbonato de 60 ml (Nalgene) y congelar.

50ml solución B 
[100μM] 

Referencia  Congelar y usar 1 botella con 
 [1μM] cada serie de análisis.  
Agua de mar con 
baja [nutrientes] 
5l 

Matraz aforado  Nalgene 60ml

(4) Calibración.
(4.1) Se llevará a cabo una calibración del equipo al inicio y final de
cada tramo, mediante el análisis de las dos series A y B de patrones.
(4.2) En cada tanda de muestras se analizarán 1 referencia de cada
concentración (0.3 y 1 μM).

137
9. Descripción de la Técnica
A cada muestra de 50 ml:
(1) Añadir 1 ml de la solución de Ascórbico, agitar y esperar 1 minuto.
(2) Añadir 1 ml de reactivo mixto y agitar.
(3) Esperar 10 minutos.
(4) Verter en una cubeta de 10 cm de paso de luz y leer en
espectrofotómetro a 880 nm.

Para el análisis del fosfato de las muestras digeridas (TP) se aplicará el


mismo procedimiento con una adaptación de los volúmenes de
reactivo (0.65 ml de cada una de las soluciones de ascórbico y reactivo
mixto).

10. Cuadro sinóptico de la técnica

11. Calculo de los resultados.

12. Control de calidad


La reproducibilidad se verificará con referencias preparadas en agua
de mar, que se analizarán al mismo tiempo que las muestras (ver en
calibración).
Periódicamente se analizarán además muestras de laboratorios de
referencia.

138
13. Referencias
Grasshoff, K., K. Kremling and M. Ehrhardt, 1999. Methods of seawater
analysis. Wiley-VCH.

139
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Procesado de muestras

2. Titulo de la técnica
Determinación de fósforo orgánico disuelto y particulado por el método
de la oxidación en persulfato ácido.

3. Autores del documento y filiación


Montserrat Vidal, Irene Teixidor. Departament d’Ecologia. Universitat de
Barcelona.

4. Finalidad. Campo de aplicación


Protocolo de oxidación de fósforo orgánico y posterior análisis de
fosfato. Se usa la modificación de Ridal & Moore (1990) del método
estándar (Grasshoff et al. 1999), que prolonga el tiempo de digestión
hasta 1.5 h, para aumentar la eficacia de la oxidación.

5. Conceptos generales
El fósforo orgánico disuelto y particulado es un producto de la actividad
de los organismos. Por consiguiente, tiende a acumularse en las capas
superficiales de los océanos. El fósforo orgánico disuelto constituye un
recurso nutritivo de especial relevancia en el océano oligotrófico.

6. Equipamiento necesario
Autoclave.
Espectrofotómetro.
Centrífuga.

7. Reactivos u otro material fungible


Botellas pyrex de tapón de rosca y teflón (color rojo) de 50 ml.
Botellas de borosilicato de tapón blanco de 60 ml.
Pipetas automáticas, 1, 5 ml.
Puntas de pipeta.
Probetas de vidrio de 10, 50 y 100 ml.
Probetas de plástico de 250 ml.
Matraces aforados de 0.1 L, 1 L, 5 L.
Botellas de policarbonato de 0.2 L, 0.5 L, 1L.
Botellas de policarbonato Nalgene de 60 ml.
Pipeta multi-step.
Jeringas para pipeta multi-step.
Dosificador 1 – 5 ml.

Reactivos
(1) Ácido sulfúrico (1.835 g cm-3, 96 %).
(2) Peroxodisulfato de potasio (K2S2O8).
(3) Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate (551.14 g/mol).

140
Preparación de los reactivos:
(01) Todo el material debe lavarse en ácido diluido y aclararse 3 veces
con agua milli-Q previo a su uso.
(02) Para evitar al máximo la posibilidad de contaminación, las botellas
de análisis estarán numeradas y se usarán siguiendo el mismo orden.
(1) Solución de ácido sulfúrico de concentración 4.5 mol dm-3 (reactivo
1 del método de análisis de SRP). Añadir 500 ml del ácido concentrado
a unos 1.5 L de agua milli–Q. Dejar enfriar y diluir a 2 L en matraz
aforado. Guardar en botella de polietileno. Una botella de 2L se gasta
aproximadamente en un leg, por lo que sería bueno prepararla antes
de salir de puerto.
(2) Solución oxidante de persulfato de potasio. Diluir 25 ml de ácido
sulfúrico 4.5 M con agua milli–Q hasta 500 ml, (medidos en probeta).
Disolver 25 g g de peroxodisulfato de potasio (K2S2O8). Guardar esta
solución saturada a temperatura ambiente en una botella de polietileno
de 0.5 L y protegida de la luz directa, durante una semana. Será
necesario preparar solución cada 2 AABs y también antes de salir de
puerto, puesto que caduca a la semana.

Solución ácido sulfúrico: Solución oxidante de persulfato de


potasio:

25ml Ácido sulfúrico

25g de persulfato de potasio


475ml
MQ

500ml

(3) Preparación de referencias de DOP.


(3.1) Solución primaria: disolver 275.57 mg de ATP en agua milli-Q, en
matraz aforado y enrasar a 1L. La solución tiene una concentración de
1.5 mM. Repartir en botellas de policarbonato de 0.2 L y guardar
congeladas.
(3.2) Solución de referencia. Añadir 1 ml de la solución anterior a un
matraz aforado que contiene 5 L de agua de mar de baja

141
concentración de nutrientes (reactivo 4, del método de determinación
de SRP). La solución tiene una concentración de 0.3 μM de P-ATP.
Repartir la solución en botellas de policarbonato de 60 ml (Nalgene) y
congelar.
(4) Preparación de referencias de PO4
Diluir 3 ml de la solución A de patrón primario de fosfato (10 µM de P-
KH2PO4, tal y como se explica en la ficha de análisis del SRP) hasta 100
ml de agua de mar de baja concentración de nutrientes (reactivo 4 del
método de SRP). La solución tiene una concentración de 0.3 µM de P-
PO4. 
 
Esquema de preparación de referencias de DOP 
 
Referencia orgánica: 
  275.57mg ATP

 
 
[1.5 mM]
  Solución
MQ Refrigerar
madre
1l

Matraz aforado

1ml solución madre

[0.3μM P-ATP]
Solución Agua de mar a
referencia baja Congelar
[nutrientes]

5l

Botellas Nalgene
Matraz aforado 60ml

Referencia inorgánica:

3ml Solución A
Patrón primario
de fosfato

[0.3μM]
Agua de
mar a baja Refrigerar
[nutr]

100ml

Matraz aforado

142
8. Calibración
(1) Se utiliza la misma serie patrón, a partir de dihidrógeno fosfato de
potasio, que para el método de análisis de SRP, con la salvedad de que,
previamente, las soluciones se han sometido al proceso de oxidación.
(2) En cada tanda de oxidación se incluirán 1 referencia de fósforo
orgánico (ATP) de concentración 0.3 μM P-ATP y 1 referencia de fosfato
0.3 μM P-PO4 .
(3) Se procederá también a la oxidación y análisis de la solución
oxidante cada vez que se prepare una nueva solución.

9. Descripción de la Técnica
Oxidación del fósforo total (TP).
A cada muestra de 30 ml (en botella de pyrex de tapón rojo):
(1) Añadir 2.4 ml de solución oxidante.
(2) Cerrar herméticamente y autoclavar a 120 ºC durante 1.5 h.
(3) Enfriar el autoclave hasta temperatura ambiente antes de abrir.
(4) Comprobar que los tapones de las botellas siguen firmemente unidos
y que no ha habido variaciones de volumen. Dejar enfriar. Una vez
digeridas, el análisis de fosfato puede demorarse 1-2 días.
(5) Transferir todo el volumen (32.4 ml) a las botellas de borosilicato de 60
ml para el posterior análisis del fósforo reactivo soluble.

Oxidación del fósforo orgánico particulado (POP).


Se sigue el mismo protocolo anterior, con la salvedad de que la muestra
consiste en el filtro (con el material en suspensión) que es introducido en
30 ml de agua milli-Q, y previo al análisis, las muestras son introducidas
en tubos para su centrifugación.

Análisis de la concentración de fosfato


A 32.4 ml de muestra digerida:
(1) Añadir 0.65 ml de la solución de ascórbico agitar y esperar 1 minuto.
(2) Añadir 0.65 ml de reactivo mixto y agitar.
(3) Esperar 10 minutos.
(4) Verter en una cubeta de 10 cm de paso de luz y leer en
espectrofotómetro a 880 nm

10. Cuadro sinóptico de la técnica

2,4ml solución 
Determinación de fósforo total (TP).  
oxidante 
30ml 
muestra 
 
 

Dejar enfriar a 
temperatura 
Autoclave  ambiente Verificar
ajuste de
120ºC  tapón y Análisis de 
1,5h  volumen   fosfato 
Pyrex 
50ml  32.4ml
Oxidación  143
Determinación de fósforo orgánico particulado (POP).   
2,4ml solución 
Filtro POP 
oxidante 
30ml MQ 

 
  Dejar enfriar a 
temperatura 
Autoclave  ambiente  Verificar
ajuste de
120ºC  tapón y Centrifugación  Análisis de  
1,5h  volumen fosfato
Pyrex 
50ml 

Oxidación 

11. Calculo de los resultados.

12. Control de calidad


La reproducibilidad se verificará con referencias preparadas en agua
de mar, que se analizarán al mismo tiempo que las muestras (ver en
calibración).

13. Referencias
Grasshoff, K., K. Kremling and M. Ehrhardt, 1999. Methods of seawater
analysis. Wiley-VCH.

Ridal, J. J. and R. M. Moore, 1990. A re-examination of the measurement


of dissolved organic phosphorus in seawater. Mar. Chem. 29: 19-31.

144
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento: Técnicas analíticas

2. Titulo de la técnica: Muestreo de agua de mar para el análisis de


dimetilsulfuro (DMS) y dimetilsulfoniopropionato (DMSP) por
cromatografía de gases (GC).

3. Autores del documento y filiación: Martí Galí y Rafel Simó.


Departament de Biologia Marina i Oceanografia (Institut de Ciències del
Mar, Barcelona)

4. Finalidad. Campo de aplicación


Procedimiento de muestreo de agua de una botella Niskin para el
posterior análisis del gas de azufre DMS (y su precursor algal DMSP)
mediante cromatografía de gases.

5. Conceptos generales
El DMS (CH3SCH3) es un gas producido por la redes tróficas marinas a
partir de su precursor DMSP ((CH3)2S+CH2CH2COO−), un compuesto
intracelular multifuncional del fitoplancton. El DMS es emitido en gran
cantidad del océano a la atmósfera, donde participa en la formación
de aerosoles y de núcleos de condensación de nubes, potencialmente
afectando al balance radiativo del planeta.

6. Equipamiento necesario
Muestreo (material que nos llevamos a cubierta)
− 1 vial de vidrio de 120 mL
− 1 vial de vidrio de 40 mL
− 2 tapones-septum de goma gris con recubrimiento interior de Teflon
− 1 tubo de silicona
− 1 malla de Nylon de 50 µm de luz
− Guantes (opcionales: no se conocen posibles contaminaciones de la
muestra)
− 1 bandeja u otro recipiente (para transportar el resto de material)

Preservación de muestras de DMSP (en el laboratorio)


− 1 tapón de silicona blanca (septum) con recubrimiento interior de
Teflon, acoplado a una cápsula de aluminio (crimp cap)
− Pellets de NaOH
− Pinzas (usadas solamente para los pellets de NaOH, etiqueta verde)
− Crimpador (herramienta para sellar herméticamente las muestras de
DMSP, figura 1)
− Etiquetas
− Rotulador permanente

* Nota: en la figura x del manual para el Análisis de DMS se puede ver


parte del equipamiento usado en este protocolo.

145
7. Reactivos u otro material fungible
− Hidróxido de sodio (NaOH). Sigma Aldrich (reagent grade, pellets,
anhidrous).

8. Calibración

9. Descripción de la Técnica
Antes de empezar
− Lavar la malla de 50 µm con agua del continuo en el laboratorio
− Asegurarse de que otros gases más volátiles que el DMS (O2) han sido
muestreados, en caso de que nos corresponda la misma botella.
− El DMS es volátil: es importante evitar burbujeos y flujos de agua
turbulentos y con salpicaduras al llenar los viales de muestreo (dentro
de lo posible). Además, de esta forma vamos a evitar artefactos en
la medida de DMS y DMSP causados por la rotura de células.

Muestreo para DMS


− Conectamos un extremo del tubo a la boca del grifo de la botella
Niskin. Lo lavamos con un poco de agua de la botella (lo justo para
que el agua llene todo el tubo una vez).
− Introducimos el tubo en un vial de 120 mL de forma que el otro
extremo del tubo toque el fondo. Eso va a evitar burbujeo y
salpicaduras en el momento de llenar el vial.
− Para lavar el vial, lo llenamos un poco (un dedo de agua), lo
cerramos con el tapón gris, y enjuagamos completamente las
paredes con un suave movimiento rotatorio, antes de vaciarlo. NO
AGITAR, SIMPLEMENTE ROTAR.
− Cubrimos el extremo libre del tubo con la malla de 50 µm, y lo
introducimos en el vial. Empezamos a llenar el vial dejando que el
agua se deslice suavemente por las paredes.
− Cuando esté totalmente lleno, dejamos un poco de overflow y
tapamos rápidamente con el tapón de goma gris, dejando el
mínimo aire posible dentro del vial. Presionamos el tapón gris
fuertemente con la palma de la mano para asegurarnos de la
estanqueidad del cierre.
− Al tratarse de un volátil, hay que analizarlo en fresco dentro de 1 hora
(si es posible antes) después del muestreo.

Muestreo para DMSP total (DMSPt)


− El procedimiento es prácticamente idéntico que el del DMS, con la
única diferencia de que NO PREFILTRAMOS el agua con la malla de
50 µm. Además, el vial que llenamos es de 40 mL.

Conservación de la muestra de DMSP


− Abrimos el vial de 40 mL y le añadimos dos pellets de NaOH. Lo
tapamos rápidamente con el septum de silicona blanca y la cápsula
(que ya vienen acoplados) y crimpamos (Figura 1). Se formará un

146
precipitado blanco; es normal. La addición de NaOH va a provocar
la hidrólisis alcalina del DMSP, formando DMS + acrilato, y además va
a conservar la muestra. De esta forma, el DMSP va a ser analizado
como DMS. El sistema de cierre es estanco (gas tight) evitando la
pérdida del DMS.
− Guardamos la muestra en la oscuridad, a temperatura ambiente
(por ej., dentro de un armario), adecuadamente etiquetada con la
fecha, el número de estación y la profundidad.

Limpieza del material


− Después del muestreo y/o análisis, habrá que lavar los viales usados
con agua MQ, así como el tubo de silicona y la malla de 50 µm. El
septum gris también se tiene que reutilizar.

Figura 1. Sellando herméticamente un vial con el crimpador

147
Figura 2. De arriba a abajo y de izquierda a derecha: conjunto formado por el
sistema de purga y trampa criogénica, el cromatógrafo, y el integrador;
generador de hidrógeno; y horno de permeación, con el display mostrando la
temperatura, y los caudalímetros del patrón (no confundir con los de la purga!).
La ruedecilla a la derecha de los caudalímetros es el potenciómetro, por donde
se regula la temperatura del horno de permeación.

148
Figura 3. Izquierda: sistema de purga y trampa criogénica. Los caudalímetros
de la izquierda corresponden al aire y al He de la purga. Los termos contienen,
de izquierda a derecha, agua caliente (calentada con un hervidor tipo “kettle”),
agua fría (ambiente) y nitrógeno líquido. Derecha: detalle del vial donde se
realiza la purga. El gas de la purga (He) entra por la aguja IN (larga),
burbujeando a través del agua y arrastrando con él los volátiles de la muestra,
que salen por la aguja OUT (la corta; no tiene que llegar NUNCA al agua).

149
Figura 4. De arriba a abajo y de izquierda a derecha: submuestreando del vial
de 120 mL; eliminando burbujas; enrasando a 5 mL; filtrando hacia el vial de 20
mL usado para la purga (con su septum gris al lado, a punto para taparlo).

150
Figura 5. Enciendendo la llama del detector.

151
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Titulo de la técnica

Muestreo de carbono orgánico total (TOC) y nitrógeno total (TN)

3. Autores del documento y filiación

Álvarez-Salgado, X.A., CSIC Instituto de Investigacións Mariñas


Nieto-Cid, M., CSIC Instituto de Investigacións Mariñas
Romera-Castillo, C., CSIC Institut de Ciències del Mar
Marrasé, C., CSIC Institut de Ciències del Mar

4. Finalidad. Campo de aplicación

Protocolo de recogida y conservación de muestras de agua para el


análisis simultáneo de carbono orgánico total (TOC) y nitrógeno total
(TN) por el método de oxidación catalítica a alta temperatura, que se
realizarán en el laboratorio base.

5. Conceptos generales

La materia orgánica disuelta es aquella fracción de la materia orgánica


presente en los océanos que no es retenida por un filtro cuyo tamaño
de poro oscila entre 0.2 y 1 μm dependiendo del método utilizado. Por el
contrario, la materia orgánica particulada es aquella que queda
retenida en el filtro. En el océano abierto, las concentraciones de
materia orgánica particulada son tan bajas, 1-2 μmol C L-1, que se
acostumbra a no filtrar las muestras para minimizar el riesgo de
contaminarlas en el proceso de filtración. Este es el caso de MALASPINA.

Los océanos contienen aproximadamente 660 1015 g de C en forma de


materia orgánica disuelta, cantidad similar a la de carbono acumulado
en la atmósfera en forma de CO2 o la de carbono orgánico presente en
los ecosistemas terrestres. La materia orgánica disuelta juega un papel
clave en los ciclos biogeoquímicos en ecosistemas marinos: la fracción
lábil (<5% del total) contribuye a la producción regenerada, la fracción
semilabil (<20% del total) a la producción nueva y es un componente
fundamental de la bomba biológica de almacenamiento transitorio de
carbono antropogénico en los océanos y la fracción refractaria (>75%
del total) contribuye al almacenamiento permanente de carbono
antropogénico a través de la llamada bomba microbiana.

152
6. Equipamiento necesario

N/A

7. Reactivos u otro material fungible

● Guantes de polietileno (frutería) o nitrilo (sin polvo)


● Estadillo de recogida de muestras
● Libreta de incidencias
● Material de librería (rotuladores, bolígrafos, lápices, etc.…)
● Ampollas de vidrio de 10 ml selladas con papel de aluminio y
calcinadas a 450ºC durante 24 horas
● Etiquetas de 20 mm x 20 mm (para identificar las muestras recogidas
en las ampollas)
● Ácido fosfórico (H3PO4) al 25% (en frasco de vidrio con tapón de
teflón)
● Micro–dispensador de acido fosfórico (H3PO4) al 25%
● Gradilla de plástico para muestrear con ampollas
● Rollo de papel de aluminio
● Gradilla de metal para sellado de ampollas al calor
● Bombona butano (para sellado de ampollas al calor)
● Quemador para bombona butano (para sellado de ampollas al calor)
● Bandeja de papel de aluminio (para sellado de ampollas al calor)
● Pinza de acero inoxidable de 25 cm (para sellado de ampollas al
calor)
● Gafas de seguridad (para sellado de ampollas al calor)
● Mechero (para sellado de ampollas al calor)
● Planchas de espuma agujereada y cajas de cartón (para
almacenamiento de ampollas)

8. Calibración

N/A

153
9. Descripción de la técnica

Recogida, conservación y almacenado de las muestras


● Rellenar el estadillo registrando el nº de estación, nº de CTD, hora del
lance del CTD, botellas y profundidades de las que se toman las
muestras. Anotar cualquier incidencia en el espacio dedicado a
“observaciones”.
● Etiquetar las ampollas escribiendo MALASPINA-HES ó MALASPINA-SDG
en la 1ª línea (según se trate del BIO Hespérides o Sarmiento de
Gamboa), la fecha en la 2º línea, y la estación, profundidad y botella
en la 3º línea.
● Ponerse guantes de polietileno o nitrilo.
● Colocar las ampollas en una gradilla de plástico (1 por profundidad,
excepto en el máximo de salinidad del agua profunda, que se
tomarán por duplicado en el caso del BIO Hesperides; y 2 en todas las
profundidades en el caso del BIO Sarmiento de Gamboa), retirarle la
cubierta de papel aluminio y añadir 50 μL de H3PO4 al 25% (con micro-
dispensador) a cada una de ellas. Tapar las ampollas con una lámina
de papel de aluminio.
● Tomar las muestras directamente de la botella Niskin correspondiente
(sin usar tubos y sin enjuagar) en las ampollas de vidrio llenándolas 5
mm por debajo de la línea de corte de la ampolla). Al finalizar el
llenado de las ampollas, volver a taparlas con la lámina de papel
aluminio.
● Sellar las ampollas al calor, comprobando al cabo de 10 minutos si hay
pérdidas. El sellado debe realizarse inmediatamente después de la
recogida de las muestras, en un laboratorio con atmósfera limpia (libre
de disolventes orgánicos, especialmente acetona).
● Colocar las ampollas en los bloques de espuma agujereados, colocar
los bloques en cajas de cartón almohadilladas con plástico de
burbujas y conservarlas en nevera (4 ºC). La caja de cartón debe
rotularse como: “TOC/TN” (1º línea), “MALASPINA-HES” o “MALASPINA-
SDG” (2º línea) y BLOQUE 3 (3º línea).
● Volumen necesario: 20 mL

154
Mantenimiento del micro–dispensador1

Puesta en funcionamiento
● Ponerse guantes de polietileno o nitrilo.
● llenar ¾ del depósito del micro–dispensador con acido fosfórico
(H3PO4) al 25%.
● Ajustar el micro–dispensador para dispensar 500 μL y proceder al
llenado y vaciado del émbolo 5 veces, para enjuagarlo con la
disolución de ácido fosfórico (H3PO4) al 25%.
● Ajustar el micro–dispensador para dispensar 50 μL (ya esta listo para
acidificar las ampollas).
● Colocar el dispensador en un vaso de precipitados de plástico fijado a
la poyata del laboratorio con “Velcro” o sistema similar (protección
contra rotura).
● Antes de dispensar cada serie de ampollas, desechar 3 dosis de 50 μL,
comprobando que no quedan burbujas en la punta del micro–
dispensador.

Al terminar la campaña
● Ponerse guantes de polietileno o nitrilo.
● Vaciar el acido fosfórico (H3PO4) al 25% del depósito del micro–
dispensador.
● Lavar el depósito del micro–dispensador con agua Milli–Q abundante,
llenándolo y vaciándolo 5 veces.
● Con el depósito lleno de agua Milli–Q, ajustar el micro–dispensador
para dispensar 500 μL y proceder al llenado y vaciado del émbolo 5
veces, para enjuagarlo abundantemente.
● Separar el micro–dispensador del depósito y proceder al llenado y
vaciado del émbolo del micro–dispensador 5 veces, para evacuar
toda el agua milli–Q que quede en su interior. Poner el depósito a
secar.
● Empaquetar el micro–dispensador y el depósito en su caja
correspondiente.

1 En caso de que el depósito se rompiera o el micro–dispensador se estropeara, se


usará una micro–pipeta de 50 μL que se adjunta como material de respaldo.

155
10. Cuadro sinóptico de la técnica

Se presenta una secuencia de fotografías numerada mostrando los


pasos más relevantes del proceso de recogida y conservación de
muestras de agua para el análisis simultáneo de carbono orgánico total
(TOC) y nitrógeno total (TN). (1) ampollas tapadas en gradilla de
plástico; (2) etiquetado de ampolla; (3) adición de 50 μL de 25% H3PO4
con microdispensador; (4) recogida de la muestra directamente de la
botella Niskin; (5) sellado al calor de ampolla; (6) ampolla enfriando en
gradilla metálica antes de comprobar si está correctamente sellada; (7)
colocación de la ampolla en el bloque de espuma.

11. Cálculo de los resultados

N/A

12. Control de calidad

● Las ampollas de vidrio de 10 ml deben haberse tapado con papel de


aluminio y calcinado a 450ºC durante 24 horas para eliminar trazas de
materia orgánica.
● En el microdispensador, el 25% H3PO4 debe estar en contacto
únicamente con elementos de vidrio y teflón.

156
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo y procesado de muestras.

2. Título de la técnica

Recogida de muestras de materia orgánica particulada (POM) y


disuelta ultrafiltrada (UDOM) en el océano profundo.

3. Autores del documento y filiación

Nieto-Cid, M. y Álvarez-Salgado X.A.


Instituto de Investigaciones Marinas-CSIC.

4. Finalidad. Campo de aplicación

Metodología para obtener muestras de materia orgánica particulada


(POM) y disuelta ultrafiltrada (UDOM), o de alto peso molecular, en
aguas profundas, con la siguiente periodicidad de estaciones:
AABAACAAD…, donde se ultrafiltrarán 280L en las tipo B y 140 en las
tipo D.
La concentración de materia orgánica disuelta (DOM) en los
ecosistemas marinos es demasiado baja como para realizar una
caracterización directa y completa de la misma. Los mayores avances
en este sentido se han conseguido combinando métodos de
ultrafiltración y técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN).

5. Conceptos generales

La UDOM (>1 KDa) se concentrará por ultrafiltración, recuperándose


entre el 10% y el 40% de la DOM total, para caracterizarla tanto
ópticamente, a través de espectrometría de absorbancia y
fluorescencia, como químicamente, con técnicas de RMN,
espectrometría de masas, cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC), análisis elemental, e isótopos y radio-marcadores de carbono.
Además, la mitad de cada muestra se destinará a la colección
MALASPINA, para en un futuro realizar medidas de variables químicas
por técnicas no disponibles en la actualidad o que aún requieren
grandes cantidades de material.

157
6. Equipamiento necesario

- Sistema de ultrafiltración de flujo


tangencial construido en metacrilato
y teflón y provisto de membrana de
ultrafiltración de 1 kDa. El sistema se
conecta a una bomba peristáltica
que recircula el agua a través de la
membrana, entre un recipiente
donde se concentra el material de
alto peso molecular (HMW), en el cual
se va añadiendo la muestra
(CONTROL) con una segunda bomba
peristáltica, y otro donde se recoge el
material de bajo peso molecular
(LMW). El sistema lleva además un
manómetro en el extremo superior,
para comprobar que se está
ejerciendo siempre la misma presión
(~5 psi). Se llevará un sistema
completo de repuesto.
- Espectrofluorímetro (Fluoromax-4).
- Espectrofotómetro (Shimadzu UV-
2401).
- Espacio en nevera (20 dm3/leg),
congelador -20ºC (30 dm3/leg) y
congelador -80ºC (5 dm3/leg) para
conservar todas las muestras
(ampollas, UDOM+nuts y POM).

7. Reactivos y otro material fungible

- Estadillo de recogida de muestras.


- Libreta de incidencias.
- Material de librería (rotuladores, bolígrafos, lápices, etc…).
- Bolsas de basura negras grandes, opacas.
- Dinamómetro.
- Bolsas de plástico de distintos tamaños.
- Gomas elásticas.
- “Pulpos”, “sargentos” y cabo.
- Guantes de polietileno (frutería) o vinilo (sin polvo).
- 5m Tubo de tygon para conectar a las botellas al muestrear.
- 15 Bidones de 20 L para recoger el agua de las botellas
oceanográficas.

158
- 1 Bidón de 20L para mezclar la sosa y el ácido después del lavado, y
así neutralizarlos.
- 1 Jarra (5L) de plástico.
- 2 Embudos de plástico.
- 1 Cubo.
- 25 Filtros Pall Acropak 1500 0.8/0.2 µm.
- 1 Soporte Millipore (316 Stainless Sanitary 293 mm Filter Holder, YY30
293 16).
- 1 Llave para apretar/aflojar los cierres del soporte Millipore.
- 50 Filtros GF/F de 293 mm, calcinados durante 4 horas a 450ºC.
- 2 Cubas grandes de plástico (300 L) para la muestra de agua de mar
(“CONTROL”) y la porción de bajo peso molecular (“LMW”).
- 2+2 Conexiones de teflón para extraer el agua de las cubas de
plástico.
- 2+1 Bombas peristálticas.
- 2 Bidones de 20 L con grifo y dos orificios en la parte superior para
conectar al sistema de ultrafiltración.
- 30 Botellas de teflón de dos litros para contener la fracción de alto
peso molecular (“HMW”) de las muestras una vez ultrafiltradas. Las
botellas estarán etiquetadas, taradas e incluidas en el fichero de
inventario y seguimiento.
- 70 Botes Kartell® de plástico de 50 mL para muestras de nutrientes.
- 70 Botes de vidrio de 50 mL para muestras de DO13C.
- Disolución de HgCl para conservar las muestras de DO13C.
- 2 Pipetas de plástico para añadir la disolución de HgCl.
- Cajas para muestras de nutrientes y de DO13C.
- 1 Desecador de plástico.
- 3 Botes de silica gel.
- 50 Trozos de papel de aluminio (29x40cm) calcinados (12h, 450ºC)
para guardar los filtros.
- 3 Bidones de 10 L (con marcas de 5 y 10 L) para ácido, sosa y agua
destilada/milli-Q de lavado.
- 1 L HCl (ácido clorhídrico, para preparar ácido diluido para lavar el
sistema, 5 mL de HCl concentrado por cada 5 L de agua destilada).
- Probeta de 10 mL para medir el HCl.
- 50 Viales con 2 g de NaOH (para preparar sosa diluida para lavar el
sistema, añadiéndolos a 5 L de agua destilada).
- Papel de medida de pH.
Carbono orgánico disuelto2
- 300 Ampollas de vidrio de 10 mL tapadas con papel de aluminio y
calcinadas a 450 ºC durante 24 horas.
- 300 Etiquetas de 20 mm x 20 mm (para identificar las muestras
recogidas en las ampollas).
- Rotuladores finos para etiquetar ampollas.

2 Ver protocolo general de muestreo de carbono orgánico disuelto.

159
- 25% H3PO4 (ácido fosfórico) en dos frascos de vidrio de 250 mL con
tapón de teflón.
- Micro-dispensador de 25% H3PO4.
- Micropipeta para dispensar 50 µL con puntas apropiadas y limpias
(lejía y 10% HCl).
- Gradillas de plástico para muestreo con ampollas.
- Quemador bombona butano (para sellado de ampollas).
- Bombona butano (para sellado de ampollas).
- Bandejas de aluminio flexible (para sellado de ampollas).
- Pinzas de acero inoxidable de 25 cm (para sellado de ampollas).
- Gafas de seguridad (para sellado de ampollas).
- Mechero (para sellado de ampollas).
- Trozos de espuma agujereada y cajas de plástico (para
almacenamiento de ampollas).
CDOM3
- 5 Frascos de vidrio con tapón de vidrio de 250 mL.
- 2 Cubetas prismáticas con paredes de cuarzo de 10 cm para
absorbancia.
- 2 Cubetas de cuarzo de 1 cm para fluorescencia.
- 1 L HCl concentrado (37%) para preparar 1% HCl (que se usará para
lavar frascos de vidrio y cubetas).4
- Probeta de 100 mL (para medir el volumen de 37% HCl).
- NaHCO3 (que se usará para neutralizar el 1% HCl una vez usado).5
- Metanol (que ser usará para lavar la cubeta de fluorescencia en
caso de que el 1% HCl no sea suficiente).
- Caja plástico con tapa para sumergir frascos de vidrio en 10% HCl.
- 10 Cajas de KimWipes (para secar y limpiar las paredes de las
cubetas).

8. Calibración

Ver el apartado de calibración para la fluorescencia en el protocolo


de muestreo de materia orgánica disuelta coloreada (CDOM).
También se hará un balance de masas de la ultrafiltración, a posterirori
en el laboratorio, utilizando los volúmenes de las tres fracciones (el del
alto peso molecular se medirá en el laboratorio por pesada) y los
valores de carbono orgánico disuelto de cada una.

3 Ver protocolo general de muestreo de materia orgánica disuelta coloreada (CDOM).


4 Preparar añadiendo 10 mL de HCl al 37% por cada 1000 mL de agua destilada.
5 Añadir hasta que no se produzca burbujeo (aproximadamente 8g de NaHCO3 por

litro de HCl al 1%).

160
9. Descripción de la Técnica

1. Sistema:
El sistema de ultrafiltración mide un metro y medio de alto. Se
colocará encima de un soporte en el suelo del laboratorio, al lado
de un mesado donde se colocará un bidón de plástico de 20 L con
soporte, y cercano a un espacio abierto donde se puedan colocar
las dos cubas de plástico de 300L (ver Esquema 1). Asimismo se
necesitará un espacio para guardar los 15 bidones de 20 L, el sistema
de filtración de material particulado y material variado como un
cubo, jarras, bidones de disoluciones de lavado, etc. Un total de 2 m
de poyata debería ser suficiente. Es importante colocar la cuba de
plástico para el LMW cerca de un desagüe para agua de mar, ya
que, eventualmente, ese volumen de agua de mar se descartará.

sistema
de ultrafiltración

manómetro

bomba
peristáltica 1

bomba
peristáltica 2

150
cm

conc

116
cm LMW CONTROL

50 llave
cm de 3 vías HMW

65 cm

a) b)

161
Esquema 1. Ultrafiltración, y detalle de la tapa superior (a) y de la tapa
inferior (b).

2. Lavado y acondicionamiento del sistema de ultrafiltración (usar


guantes de vinilo):
Entre muestra y muestra, así como al principio y al final de cada ‘leg’,
se debe lavar el sistema. Los lavados consisten en hacer funcionar el
sistema en modo recirculación: se desconecta del bidón “conc” el
tubo que viene de la bomba peristáltica 1 (tubo naranja del
Esquema 1, cuyo extremo se cubrirá con una bolsa limpia, atándolo
con una goma), a continuación se conecta el extremo abierto del
tubo de salida del material de bajo peso molecular (conexión
central, tubo azul claro en el Esquema 1, y que durante la
ultrafiltración está colocado dentro de la cuba “LMW”) a la conexión
del bidón “conc” que acabamos de dejar libre (ver resultado final en
el Esquema 2).
El sistema se lava con el siguiente protocolo:
- sosa diluida (2 g de NaOH en 5 L de agua destilada) dejando
recircular durante la noche
- agua destilada (añadir al menos 2-3 volúmenes de 5 L), se deja
recircular durante 2-3 horas con cada nuevo volumen de cada vez
- ácido diluido (5 mL de HCl en 5 L de agua destilada) dejando
recircular durante la noche
- agua destilada (añadir al menos 3 volúmenes de 5 L), dejándolos
recircular durante 4-5 horas y hasta que tengamos que muestrear la
siguiente muestra
- agua milli-Q (5 L), dejándolos recircular mientras que realizamos la
filtración de la muestra (el sistema no debiera estar parado durante
más de 1 hora)

162
sistema
de ultrafiltración

manómetro

bomba
peristáltica 1

bomba
peristáltica 2

150
cm

conc

116
cm LMW CONTROL

50 llave
cm de 3 vías HMW

65 cm

Esquema 2. Recirculación.

Los líquidos de lavado se añaden directamente en el bidón “conc” y


se eliminan del sistema en dos etapas:
i) se cierra el grifo del bidón “conc”, se desconecta el tubo de este
grifo y se vacía este bidón por ese grifo, recogiendo el líquido en un
cubo o en el bidón de mezcla de NaOH y HCl
ii) a continuación se vacía la columna de ultrafiltración a través de la
llave de tres vías, recogiendo el líquido en la jarra de plástico. En esta
llave, un punto ROJO indica la vía que está cerrada. Durante la
ultrafiltración y la recirculación se cierra la salida del HMW para que
la muestra pase horizontalmente a través de la llave (Esquema 3.a),
para el vaciado de la columna se coloca el cierre en la vía muerta
para que el sistema se vacíe por ambos lados hacia la salida del
HMW (Esquema 3.b).

163
a) b)

Esquema 3. Llave de tres vías.

El agua destilada/milli Q se puede verter por los fregaderos y, una vez


mezclados entre sí, el ácido y la sosa también, ya que se neutralizan.

3. Procedimiento (usar guantes de vinilo):


• Muestreo: muestrear el CTD vaciando las botellas niskin en los
bidones de 20 L con ayuda de tubos de tygon. Cada uno de los
bidones llenos con agua se pesa utilizando un dinamómetro, y tras
restar 3 kg al peso obtenido (debido a la corrección de la salinidad y
al peso del bidón) se anota el número de bidón y el peso corregido
en la libreta de anotaciones, para el cálculo del volumen final, en
ella también se contabilizará todo el volumen perdido en lavados u
otras acciones, todo se debe registrar para el cálculo del volumen
final de “CONTROL”.
Para cada muestra se debe rellenar la información requerida en el
estadillo de UDOM de MALASPINA 2010 consistente en nombre de
muestra, etapa (“leg”), estación, tirada de CTD (“cast”), fecha y hora
del muestreo (local y GMT), latitud y longitud de la estación, salinidad
y temperatura del agua original. A lo largo del proceso se irán
apuntando: volúmenes de “CONTROL” (al finalizar la ultrafiltración),
de “HMW” y “LMW” (en el laboratorio base) y el número de botella
de teflón de 2L donde se guarda el “HMW” (al recogerlo). También al
finalizar se anotará la presión del sistema, el flujo medio y la duración
de la filtración para la muestra, así como cualquier otra incidencia.

164
Esquema 4. Llave de mano, para apretar y aflojar los cierres del sistema
de filtración de POM.

• Filtración: utilizar la bomba peristáltica 1 para filtrar


simultáneamente y en paralelo la muestra a través de i) un filtro de
recogida del material orgánico particulado en suspensión (sistema
de filtración Millipore para filtros de 293 mm de diámetro, utilizado
con filtros GF/F calcinados, 4h a 450ºC) y ii) una cápsula de filtración
Pall Acropak 1500 0.8/0.2 µm (ver Esquema 5). Se debe colocar un
filtro GF/F en el sistema Millipore para cada muestra (cara menos
rugosa hacia arriba) utilizando las manos (con guantes nuevos y
limpios), y se cierran las ocho tuercas con la llave apropiada
(Esquema 4), apretando lados opuestos para lograr un cierre
homogéneo. Igualmente, se utilizará una nueva cápsula para cada
muestra donde se recoja la roseta completa para nosotros (estación
tipo B) mientras que en las estaciones tipo D se utilizará una cápsula
para cada dos estaciones, por lo cual el filtro debe ser lavado
(haciendo pasar 5 L de agua milli-Q) después del primer uso y
guardado en nevera (4ºC) hasta su segundo y último uso.

165
sistema
de ultrafiltración

manómetro

bomba
cápsula de peristáltica 1
filtración PAL
POM: sistema
(0.8/0.2 µm) bomba de filtración
peristáltica 2
Millipore
(GF/F 293mm)

conc

LMW CONTROL

llave
de 3 vías

SW

bomba
cápsula de peristáltica 1
filtración PAL
POM: sistema
(0.8/0.2 µm)
de filtración
Millipore
(GF/F 293mm)

CONTROL

SW

Esquema 5. Filtración, la figura superior muestra el montaje completo tal


y como estará en el barco y en la inferior se han dejado solo los
elementos utilizados en la filtración.

Antes de comenzar se lavan los dos filtros pasando 5L de agua milli-Q


a través de ellos, y a continuación se pasa una pequeña alícuota de
la muestra, alrededor de 3L. Todos estos volúmenes se descartan. El
sistema Millipore dispone de una válvula en la parte superior que
debe estar abierta (posición vertical, Esquema 6.a) cuando se
comienza el llenado del sistema (para eliminar el volumen muerto de
aire en el interior) y que se debe cerrar (posición horizontal, Esquema

166
6.b) en el momento en el que el líquido comience a salir por ella. La
cápsula de filtración también tiene una pequeña llave en la parte
superior que se debe abrir hasta eliminar el aire del interior (Esquema
6.c).

a) b) c)

Esquema 6. Detalle de las válvulas.

Después de lavar los filtros se procede a filtrar el resto la muestra y a


recoger el filtrado en una de las cubas de plástico, etiquetada como
“CONTROL”. Una vez terminada la filtración se abre el sistema de
filtración Millipore y se retira el filtro con mucho cuidado para no
romperlo (los bordes exteriores del mismo, sin muestra, se quedan
pegados en la sujeción de teflón del sistema). El filtro se pliega dos
veces a la mitad y se deja secando 24 horas en un desecador. Al
cabo de este tiempo se envuelve en papel de aluminio calcinado y
se congela a -80ºC. Etiquetado con el nombre de la campaña, la
etapa (“leg”), la estación y “POM”, por ejemplo: MALASPINA-leg1
STN-1, POM. El sistema de filtración Millipore se lava SOLAMENTE con
agua milli-Q, desmontando las piezas principales. No esperar más de
2-3 horas para su lavado.
• Ultrafiltración: Con toda la muestra filtrada en la cuba “CONTROL”
se procede a la ultrafiltración, conectando de nuevo la bomba
peristáltica 1 como se muestra en el esquema 1. El sistema se ha
lavado con agua milli-Q durante la filtración, por lo que está limpio.
Ahora debemos acondicionar la membrana con la muestra, para
ello se añaden aproximadamente 4 L de la muestra desde la cuba
“CONTROL” al bidón “conc” utilizando la bomba peristáltica 1
(llenado hasta la marca “lavado” en el bidón). Se conecta el sistema
en recirculación (Esquema 2) y se deja recircular durante 40-60
minutos. Se elimina la muestra de acondicionamiento de igual
manera que los líquidos de lavado, no se conserva.
A continuación se conecta el sistema siguiendo el esquema 1 de
nuevo, y después de añadir 12-15 L de muestra de igual manera que
antes (llenado hasta la marca “comienzo” en el bidón) se toma una
alícuota de la muestra “CONTROL”. Para ello se utiliza el frasco de

167
vidrio de 250 mL etiquetado como “CONTROL” y se llena del agua de
bidón “conc” utilizando la bomba perstáltica 2 y la salida de la llave
de tres vías en la posición mostrada en el esquema 3.b. Se lava 2-3
veces y se llena completamente el frasco, el cual se conserva en
nevera y oscuridad hasta el final de la ultrafiltración, para su medida
conjunta con el bajo peso molecular (“LMW”). Una vez llenado se
vuelve a poner la llave de tres vías en la posición de paso horizontal
(Esquema 3.a) y con ambas bombas encendidas se comienza la
ultrafiltración. En la bomba 2 regulamos el flujo para que el
manómetro (situado en le parte superior del sistema) indique una
presión entorno a 5 psi (regulador de velocidad en posición quasi
horizontal, Esquema 7), lo que equivale a un flujo en la salida del bajo
peso molecular entre 70 y 100 mL por minuto. La bomba 1 se debe
poner siempre a menos velocidad que la 2 (Esquema 7) y es la que
se cambia a lo largo de la ultrafiltración, para regular el volumen del
bidón “conc” (para que no desborde ni se vacíe). En la libreta de
notas, se hace el seguimiento de la ultrafiltración, anotando la hora y
la presión del manómetro. También se mide (y anota) el flujo en la
salida del “LMW”, utilizando una probeta y un cronómetro (a la
misma altura que la salida, y devolviendo la muestra a la cuba, por lo
que hay que ser muy limpio al hacerlo). Esto se controlará y anotará
más frecuentemente al principio o cuando las condiciones del
sistema cambien. Además se controlará el flujo de entrada desde la
bomba 1 haciendo marcas en el bidón “conc” en una cinta
adhesiva que se colocará para cada muestra. Se intentará que el
sistema funcione lo más compensadamente posible.

bomba bomba
peristáltica 2 peristáltica 1

Esquema 7. Detalle de las bombas peristálticas.

168
A medida que la muestra se va concentrando, el material de bajo
peso molecular se va depositando en la cuba “LMW”. El bidón
“conc” donde se concentra la muestra se va rellenando con el agua
de mar procedente de la cuba “CONTROL” con la bomba
peristáltica 1. Lo que se intenta es que la velocidad de esta bomba
sea lo más parecida a la velocidad de salida del material de bajo
peso molecular, para que el sistema pueda ser quasi autónomo.
Al final, cuando el volumen de muestra es reducido a menos de dos
litros (marca “final” en el bidón “conc”), se para la ultrafiltración (hay
que prestar especial cuidado en vigilar la ultrafiltración al final para
que no se nos acabe el agua y bombeemos aire al sistema). Se vierte
la muestra en un bote de teflón (utilizando la llave de tres vías en la
posición del esquema 3.b, para recoger tanto la porción de muestra
del bidón “conc” como la porción que se encuentra dentro del
sistema de ultrafiltración, volumen mayoritario y que cae muy
lentamente, por lo que se debe dejar vaciando pdurante al menos
15-20 mins). Este bote (“HMW”) se sella con cinta de teflón, se
introduce en dos bolsas de plástico con zip, se etiqueta la bolsa con
el nombre de la campaña, la etapa (“leg”), la estación y “HMW-UF”,
por ejemplo: MALASPINA-leg1 STN-1, HMW-UF, y se congela a -20ºC.
Para muestrear el “LMW” se utiliza una bomba peristáltica para,
después de homogeneizar el contenido de la cuba “LMW” coger
una muestra en un frasco de vidrio de 250 mL etiquetado como
“LMW” (lavando dos veces). El gran volumen restante de agua de
mar en la cuba “LMW” se descarta hacia la cubierta del barco o
hacia un fregadero apto para agua de mar, a través del grifo inferior
y una manguera. El líquido remanente en la cuba deberá ser
extraído con la bomba peristáltica.
• Muestras/medidas a bordo: de los dos frascos de vidrio
(“CONTROL” y “LMW”) se toman muestras para: nutrientes, DO13C,
DOC y CDOM.
NUTRIENTES
- Utilizar botes kartell de plástico de 50 mL. Cada bote se
etiqueta previamente con el nombre de la campaña, la
etapa (“leg”), la estación y el tipo de muestra (NUT-
CONTROL o NUT-LMW), por ejemplo:
MALASPINA-leg1
STN-1, NUT-CONTROL
- Llenar hasta 40 mL, colocar en caja de cartón y congelar
a -20ºC.
DO13C
- Utilizar botes de vidrio de 50 mL. Cada bote se etiqueta
previamente con el nombre de la campaña, la etapa
(“leg”), la estación y el tipo de muestra (13C-CONTROL o
13C-LMW), por ejemplo:
MALASPINA-leg1
STN-1, 13C-CONTROL

169
- Llenar hasta 50 mL, añadir unas gotas de la disolución de
cloruro de mercurio y colocar en una caja para su
almacenamiento y transporte.
DOC6
- Acidificar ampollas para DOC (5 por muestra) con 50 μL
de 25% H3PO4 (ácido fosfórico). Las ampollas se etiquetan
previamente con el nombre de la campaña, la etapa
(“leg”), la estación y el tipo de muestra (DOC-CONTROL o
DOC-LMW) y número de réplica, por ejemplo:
MALASPINA-leg1
STN-1, DOC-CONTROL_01
- Llenar las ampollas 5 mm por debajo de la línea de corte
de la ampolla.
- Sellar las ampollas al fuego (comprobando al cabo de 15
minutos si hay pérdidas).
- Colocar las ampollas en la espuma con agujeros dentro
de cajas de plástico y conservarlas en nevera (4 ºC).
CDOM7
- Analizar las muestras siguiendo el protocolo general de
CDOM (absorción y fluorescencia), adjuntándolas al resto
de las muestras del día.
- La nomenclatura a seguir para nombrar el fichero de
cada muestra al usar el FLUOROMAX es:
M(leg)(stn)(tipo)
donde tipo = control o lmw (por ejemplo M1_001control o
M1_177lmw).

6 Ver protocolo general de muestreo de carbono orgánico disuelto.


7 Ver protocolo general de muestreo de materia orgánica disuelta coloreada (CDOM).

170
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo
Procesado de muestras
Técnicas analíticas

2. Título de la técnica

Recogida y análisis a bordo de muestras de materia orgánica total


cromófora: absorbancia (aDOM) y fluorescencia (FDOM)

3. Autores del documento y filiación

Álvarez–Salgado, X.A., CSIC Instituto de Investigacións Mariñas


Nieto–Cid, M., CSIC Instituto de Investigacións Mariñas
Romera–Castillo, C., CSIC Institut de Ciències del Mar
Reche, I., Universidad de Granada, Departamento de Ecología
Marrasé, C., CSIC Institut de Ciències del Mar

4. Finalidad. Campo de aplicación

Protocolo de recogida de muestras de agua para el análisis de la


absorbancia y fluorescencia de la materia orgánica cromófora y su
determinación a bordo por espectrofotometría y espectrofluorimetría.

5. Conceptos generales

La fracción de la materia orgánica disuelta en los océanos que absorbe


luz en el rango de longitudes de onda del ultravioleta y, en menor
medida, del visible, se conoce como materia orgánica disuelta
cromófora. Cuando la materia orgánica disuelta cromófora se irradia
con luz ultravioleta ésta emite luz fluorescente característica de
materiales tanto proteínicos como húmicos.

La materia orgánica disuelta cromófora se caracteriza mediante


espectros de absorción entre 250 y 800 nm y matrices de excitación–
emisión de fluorescencia, excitando entre 250 y 450 nm y leyendo la
intensidad de emisión entre 300 y 560 nm.

En el océano abierto, las concentraciones de materia orgánica


particulada son tan bajas que se acostumbra a no filtrar las muestras
para minimizar el riesgo de contaminarlas en el proceso de filtración. En
el caso de MALASPINA se filtrarán solo las muestras de la roseta
superficial a través de filtros GF/F de 47mm de diámetro (calcinados a
450ºC durante 4h) con un sistema de filtración de vidrio bajo presión
controlada de N2.

171
La materia orgánica disuelta cromófora modifica las propiedades
ópticas de los océanos, influyendo en su transparencia tanto a la
radiación UV como visible y, por tanto, afectando a la actividad
biológica (protección contra el efecto dañino de la radiación UV,
reducción de la producción primaria, etc…). Además, los procesos
tanto fotoquímicos como microbiológicos alteran las propiedades
ópticas de la materia orgánica disuelta cromófora de manera que la
absorbancia y fluorescencia pueden usarse para trazar la intensidad de
dichos procesos.

6. Equipamiento necesario

● Espectrofotómetro Shimadzu UV–2401 con porta cubetas para


cubetas prismáticas de 10 cm de camino óptico.

● Espectrofluorímetro FLUOROMAX–4 (Jobin Yvon Horiba) con porta


cubetas para cubetas cuadradas de 1 cm de camino óptico.

7. Reactivos u otro material fungible

● Guantes de vinilo (sin polvo)


● Estadillo de recogida de muestras
● Libreta de incidencias
● Material de librería (rotuladores, bolígrafos, lápices, etc.…)
● Bolsas de basura negras, para tapar las muestras
● Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de vidrio
● Sistema de filtración de vidrio (x2)
● Bombona de N2 ultrapuro de 20 L (x2)
● Manómetro para bombona de N2 ultrapuro (x1)
● Filtros GF/F de 47 mm de diámetro calcinados a 450ºC durante 4h
(x300 u.d.)
● Patrón de referencia de agua milli-Q en cubeta sellada (x2)
● Patrón de referencia de p-terfenilo en bloque de metacrilato (x2)
● Patrón de referencia de tetrafenilbutadieno en bloque de metacrilato
(x2)
● Cubeta prismática de 10 cm con 2 ventanas de cuarzo para
absorbancia (x4)
● Cubeta de 1 cm con 4 ventanas de cuarzo para fluorescencia (x4)
● HCl concentrado (37%) para preparar 1% HCl añadiendo 10 mL de
37% HCl por cada 1000 mL de agua destilada (se usará para lavar
frascos de vidrio y cubetas)

172
● Probeta de 100 mL (para medir el volumen de 37% HCl)
● Bicarbonato sódico comercial, que se usará para neutralizar el 1% HCl
una vez usado añadiendo bicarbonato hasta que se acabe el
burbujeo (aprox. 8 g /litro de 1% HCl).
● Papel indicador de pH
● Metanol, para lavar la cubeta de fluorescencia en caso de que el 1%
HCl no sea suficiente
● Caja de plástico pequeña con tapa, para sumergir cubetas en 1% HCl
● Caja de plástico con tapa, para sumergir frascos de vidrio en 1% HCl
● Tisúes, para secar y limpiar las paredes de las cubetas (KimWipes)

8. Calibración

Absorbancia

De cada muestra se obtendrá un espectro de absorción entre 250


nm y 800 nm a intervalos de 1 nm. Como blanco se usará agua milli–Q
recién producida. En espectrofotómetros de doble haz, en el porta
cubetas de referencia se colocará una cubeta de 10 cm con agua
milli–Q recién producida evitando el desarrollo de burbujas. El agua de
esta cubeta se renovará al menos al inicio de cada sesión de análisis, y
cada hora si el tiempo de medida es superior a dos horas.

Los espectros de absorción se obtienen en unidades de


absorbancia, por lo que no se calibran contra ninguna sustancia de
referencia.

Fluorescencia

Antes de comenzar la secuencia de análisis de cada estación se


hará un espectro de emisión de: (1) el patrón de referencia de agua
milli–Q entre 365 nm y 450 nm excitando a 350 nm; (2) el patrón de
referencia de p-terfenilo entre 310 nm y 600 nm excitando a 295 nm; y
(3) el patrón de referencia de tetrafenilbutadieno entre 365 nm y 600 nm
excitando a 348 nm, fijando el ancho de ranura de excitación y emisión
en 5 nm y el tiempo de integración en 0,25 segundos. El área bajo el
pico del patrón de referencia de agua milli–Q, conocido como pico
Raman, se dividirá entre la intensidad de fluorescencia, para expresar
los valores obtenidos en unidades Raman (Lawaetz & Stedmon, 2009).
Para ello:
1. Encendido del instrumento
o Encender el espectrofluorímetro en el botón situado en el lateral
derecho del aparato.

173
o Esperar 1 minuto.
o Encender el ordenador.
o Esperar 30 minutos a que la lámpara se caliente.
o Usar cubetas con las 4 caras de cuarzo. NUNCA tocar las cubetas
con los dedos, usar SIEMPRE guantes de vinilo o polietileno.
2. Iniciación del programa
o Abrir la hoja excel “DAILY fluoroLOG.xls” – en la que se registrará
diariamente información sobre el estado del instrumento,
inicialmente escribir fecha, usuario y horas de trabajo de la
lámpara al comienzo de la sesión (en el lateral derecho del
instrumento), el resto se irá completando a lo largo del apartado 3.
o Hacer doble clic en el icono FLUORESSENCE.
o Hacer clic en “M” para iniciar el programa (tarda unos segundos,
esperar sin tocar nada).
3. Comprobaciones diarias del estado del instrumento
● Comprobación de la Excitación
o El objetivo es comprobar la estabilidad de la intensidad de la
lámpara de xenón día a día.
o Hacer clic en “Spectra”.
o En “Experiment Type”, seleccionar “excitation”.
o Usar el “experiment file” por defecto, “DfltSpectralExcitation.xml”.
o Comprobar que la configuración es Ex 200–600 nm, Em 350 nm, Ex y
Em “slits” 1 nm.
o Hacer clic en “Detectors” y comprobar que el tiempo de
integración es 0,1 s y que la señal R1 está seleccionada y aparece
en el cuadro de “formulas”.
o Asegurarse de que la cámara del porta cubetas está vacía y bien
cerrada.
o Hacer clic en “Run” para realizar el espectro.
o Para poder visualizar los resultados, el programa preguntará por el
nombre que se quiere dar al proyecto. Introducir la fecha como
nombre del proyecto y un subíndice por si se hace más de una
sesión por día (eg. “081104_a” para la primera sesión del 4 Nov
2008). El proyecto se debe guardar en la carpeta “C:\Program
Files\Jobin Yvon\Data\MALASPINA”.
o Cuando se haya realizado el espectro, hacer clic en el 14º botón
contando desde la derecha (”Data Reader”, apariencia de visor).
Acto seguido, hacer clic en el pico más alto, que debiera
encontrarse a 467 nm con una intensidad de unos 0.1000
MicroAmps.
o Este espectro se grabará como “DfltEx1”.
o Registrar la posición (X) e intensidad (Y) del pico en el fichero
“DAILY fluoroLOG.xls” y en el cuaderno.

174
o Se pueden hacer espectros adicionales seleccionando el botón
justo a la derecha de “M”. En ese caso, los espectros adicionales se
grabarán con los nombres DfltEx 2, DfltEx 3, etc.

● Comprobación de la emisión
Espectro Raman de la cubeta sellada con agua milli–Q
o Esta prueba permite comprobar la deriva de la lámpara.
o Hacer clic en “M”.
o Hacer clic en “Spectra”.
o En “Experiment Type”, seleccionar “emission”.
o Cargar un nuevo “experiment file” llamado “Emission check
25.xml”.
o La configuración debiera ser Ex 350 nm, Em 365-450 nm, Ex y Em
“slits” 5 nm.
o Hacer clic en “Detectors” y comprobar que el “integration time” es
0,25 s y que los modos S1/R1 y S1c/R1c estén seleccionados y
aparezcan en el cuadro de “formulas”.
o Cambiar el nombre del fichero (en “Data Identifier”) a
M(leg)_(stn)sMQ_a (por ejemplo M1_001sMQ_a, para el primer leg,
primera estación y primer Raman del día)y así el espectro se
guardará como M(leg)_(stn)sMQ_a1.
o Usando guantes, limpiar las paredes de la cubeta sellada con
agua miili-Q con tisue y colocarla en el porta cubetas, con las letras
mirando hacia nosotros.
o Hacer clic en “Run” para registrar el espectro.
o Cuando el espectro termine, hacer clic en el pico más alto de
ambos modos. El máximo del pico Raman debiera aparecer a
397±1 nm y la intensidad debiera ser alrededor de 530000 CPS en
ambos modos.
o Si el pico Raman está dentro de este rango, calcular el área bajo el
pico. Para ello, ir a “Analysis” en el menú principal Æ “Calculus” Æ
“Integrate”. El área aparecerá en un pequeño recuadro blanco en
la esquina inferior derecha de la pantalla. Registrar la altura y área
del pico en ambos modos en el fichero “DAILY fluoroLOG.xls” y en
el cuaderno de campaña.
Espectro del bloque de p–terfenilo
o Esta prueba permite comprobar la deriva de la lámpara en la
región donde fluorescen los amino ácidos / proteínas aromáticos.
o Hacer clic en “M”.
o Hacer clic en “Spectra”.
o En “Experiment Type”, seleccionar “emission”.
o Cargar un nuevo “experiment file” llamado “Terphenyl check.xml”.
o La configuración debiera ser Ex 295 nm, Em 310-600 nm, Ex y Em
“slits” 5 nm.

175
o Hacer clic en “Detectors” y comprobar que el “integration time” es
0,25 s y que los modos S1/R1 y S1c/R1c estén seleccionados y
aparezcan en el cuadro de “formulas”.
o Cambiar el nombre del fichero (en “Data Identifier”) a
M(leg)_(stn)Tph_a (por ejemplo M1_001Tph_a, para el primer leg,
primera estación)y así el espectro se guardará como
M(leg)_(stn)Tph_a1.
o Usando guantes limpios/nuevos, limpiar las paredes del bloque de
p–terfenilo con tisúe y colocarlo en el porta cubetas, con el número
3 de la parte superior colocado hacia nosotros para que se lea al
derecho.
o Hacer clic en “Run” para registrar el espectro.
o Cuando el espectro termine, hacer clic en el pico más alto de
ambos modos. El máximo del pico de p–terfenilo debiera aparecer
a 338±1 nm y la intensidad debiera ser alrededor de 61600000 CPS
en ambos modos.
o Si el pico de p–terfenilo está dentro de este rango, calcular el área
bajo el pico. Para ello, ir a “Analysis” en el menú principal Æ
“Calculus” Æ “Integrate”. El área aparecerá en un pequeño
recuadro blanco en la esquina inferior derecha de la pantalla.
Registrar la altura y área del pico en ambos modos en el fichero
“DAILY fluoroLOG.xls” y en el cuaderno de campaña.
Espectro del bloque de p–tetrafenilbutadieno
o Esta prueba permite comprobar la deriva de la lámpara en la
región donde fluorescen las sustancias húmicas.
o Hacer clic en “M”.
o Hacer clic en “Spectra”.
o En “Experiment Type”, seleccionar “emission”.
o Cargar un nuevo “experiment file” llamado “TPButadiene
check.xml”.
o La configuración debiera ser Ex 348 nm, Em 365-600 nm, Ex y Em
“slits” 5 nm.
o Hacer clic en “Detectors” y comprobar que el “integration time” es
0,25 s y que los modos S1/R1 y S1c/R1c estén seleccionados y
aparezcan en el cuadro de “formulas”.
o Cambiar el nombre del fichero (en “Data Identifier”) a
M(leg)_(stn)But_a (por ejemplo M1_001But_a, para el primer leg,
primera estación)y así el espectro se guardará como
M(leg)_(stn)But_a1.
o Limpiar las paredes del p–terfenilo y colocarlo en el porta cubetas,
con el número 4 de la parte superior colocado hacia nosotros para
que se lea al derecho.
o Hacer clic en “Run” para registrar el espectro.
o Cuando el espectro termine, hacer clic en el pico más alto de
ambos modos. El máximo del pico de p– tetrafenilbutadieno
debiera aparecer a 422±1 nm y la intensidad debiera ser alrededor
de 19600000 CPS en ambos modos.

176
o Si el pico de p–tetrafenilbutadieno está dentro de de este rango,
calcular el área bajo el pico. Par ello, ir a “Analysis” en el menú
principal Æ “Calculus” Æ “Integrate”. El área aparecerá en un
pequeño recuadro blanco en la esquina inferior derecha de la
pantalla. Registrar la altura y área del pico en ambos modos en el
fichero “DAILY fluoroLOG.xls” y en el cuaderno de campaña.

● Comprobación de contaminación en la cubeta


o Con los guantes de vinilo o polipropileno puestos, enjuagar (3
veces) y llenar la cubeta de cuarzo con agua milli–Q recién
producida, evitando el desarrollo de burbujas.
o Secar las paredes exteriores de la cubeta con tisúes.
o Insertar la cubeta en el porta cubetas y cerrar bien la cámara de
muestra. Colocar la cubeta siempre en la misma posición, con las
letras hacia delante.
o Hacer clic en “M”.
o Hacer clic en “Spectra”.
o En “Experiment Type”, seleccionar “emission”.
o Cargar (load) un nuevo “experiment file” llamado “contam.xml”
o La configuración debiera ser Em 270–430 nm, Ex 240 nm, Ex y Em
“slits” 5 nm y “integration time” 0,1 s.
o Hacer clic en “Run” para realizar el espectro.
o Este espectro se grabará como “contam1”.
o Se pueden hacer espectros adicionales seleccionando el botón
justo a la derecha de “M”. En ese caso, los espectros adicionales se
grabarán con los nombres contam2, contam3, etc.
o El espectro resultante debiera ser una línea plana con ruido y tener
una intensidad muy baja (<2000 CPS). Si se ve algún pico, aunque
sea con mucho ruido, debe lavarse de nuevo la cubeta y llenarse
con milli–Q recién preparada.
o Registrar el máximo valor de intensidad entre 300nm y 350 nm en la
columna “contaminación?” del fichero “DAILY fluoroLOG.xls” y en
el cuaderno de campaña; en estas longitudes de onda es donde
los amino ácidos/proteínas fluorescen, por eso no debiera
observarse ningún pico en el agua milli–Q.
o Si después de repetidos lavados el pico sigue apareciendo, probar
a rotar la cubeta 90º y medir de nuevo. Cualquier cambio en la
intensidad o posición del pico nos indica que alguna de las
paredes de la cubeta sigue estando sucia. En ese caso, será
necesario limpiar la cubeta con metanol (ver el apartado de
“Notas” más abajo).
● Calibración RAMAN
Espectro Raman de la cubeta de medida con agua milli–Q
o Se realiza sin retirar la cubeta con milli-Q, después de conseguir un
espectro sin contaminación. El área bajo el pico Raman se usará
para normalizar las medidas realizadas.

177
o Hacer clic en “M”.
o Hacer clic en “Spectra”.
o En “Experiment Type”, seleccionar “emission”.
o Cargar un nuevo “experiment file” llamado “Emission check
25.xml”.
o La configuración debiera ser Ex 350 nm, Em 365-450 nm, Ex y Em
“slits” 5 nm.
o Hacer clic en “Detectors” y comprobar que el “integration time” es
0,25 s y que los modos S1/R1 y S1c/R1c estén seleccionados y
aparezcan en el cuadro de “formulas”.
o Cambiar el nombre del fichero (en “Data Identifier”) a
M(leg)_(stn)raman_a (por ejemplo M1_001raman_a, para el primer
leg, primera estación y primer Raman del día)y así el espectro se
guardará como M(leg)_(stn)raman_a1.
o Hacer clic en “Run” para registrar el espectro.
o Cuando el espectro termine, hacer clic en el pico más alto de
ambos modos. El máximo del pico Raman debiera aparecer a
397±1 nm y la intensidad debiera ser alrededor de 530000 CPS en
ambos modos.
o Si el pico Raman esta dentro de de este rango, calcular el área
bajo el pico. Para ello, ir a “Analysis” en el menú principal Æ
“Calculus” Æ “Integrate”. El área aparecerá en un pequeño
recuadro blanco en la esquina inferior derecha de la pantalla.
Registrar la altura y área del pico en ambos modos en el fichero
“DAILY fluoroLOG.xls” y en el cuaderno de campaña.

Al final de la tanda de análisis, repetir el espectro de emisión de la


cubeta sellada de agua milli–Q entre 365 nm y 450 nm excitando a 350
nm.

9. Descripción de la Técnica

Recogida de muestras para la determinación de la absorbancia y


fluorescencia

● Ponerse guantes de vinilo.


● Tomar las muestras directamente de la botella Niskin en frascos de
vidrio de 250 mL (haciendo coincidir el nº de frasco con el nº de la
botella Niskin). Enjuagar tres veces con la misma agua de muestreo y
recoger aprox. 200 mL de agua.

178
● Almacenar las muestras en la oscuridad, en un lugar fresco y alejado
de compuestos orgánicos volátiles hasta el momento de medir su
fluorescencia y absorbancia. Debe esperarse a que la temperatura de
las muestras se equilibre con la del laboratorio antes de comenzar a
medir. Las medidas deben hacerse en < 2 horas desde que se recojan
las muestras.
● Una vez que la absorbancia y fluorescencia de las muestras se ha
medido, lavar los frascos de vidrio de 250 mL con agua milli–Q (3
lavados sucesivos con 25 mL). Cada 3 días, sumergir los frascos en 1%
HCl durante 24 horas y lavarlos con agua milli–Q abundante (3 lavados
sucesivos con 25 mL de milli–Q). Renovar el ácido 1% HCl al cabo de 5
lavados, es decir, cada 15 días.

Filtración de muestras para la determinación de la absorbancia y


fluorescencia

Las muestras de la roseta superficial han de filtrarse previamente a


través de filtros GF/F de 47 mm en un sistema de filtración de vidrio bajo
presión controlada de N2 ultrapuro. Para ello:

● Ponerse guantes de vinilo.


● Colocar un filtro GF/F en el porta filtros (usar un filtro por estación) y
añadir 50 mL de agua milli–Q para lavar el filtro, fijando la presión de
manómetro en 0,5 bares y el flujo del flujómetro en 100 mL min-1.
● Añadir 50 mL de muestra para lavar el sistema de filtración y el filtro.
● Añadir otros 50 mL de muestra, recoger el filtrado directamente en las
cubetas de fluorescencia y absorbancia, y proceder a su
determinación.

Este proceso se repetirá para las muestras de la roseta superficial,


comenzando por la de mayor profundidad y terminado por la más
superficial.

Una vez finalizada la filtración, lavar el sistema de filtración de vidrio


con agua milli–Q (3 lavados sucesivos con 25 mL). Cada 3 días, sumergir
los frascos en 1% HCl durante 24 horas y lavarlos con agua milli–Q
abundante (3 lavados sucesivos con 25 mL de milli–Q). Renovar el ácido
1% HCl al cabo de 5 lavados, es decir, cada 15 días.

Determinación a bordo de la absorbancia


● Encender el espectrofotómetro aproximadamente ½ hora antes de
comenzar a hacer las medidas.
● Programar el espectrofotómetro para realizar espectros de absorción
entre 250 nm y 800 nm a intervalos de 1 nm.

179
● Ponerse guantes de vinilo.
● Llenar la cubeta de referencia con agua milli–Q recién producida
evitando el desarrollo de burbujas. Secar completamente las paredes
de la cubeta con tisue y colocarla en el porta cubetas de referencia.
● Llenar la cubeta de medida con agua milli–Q recién producida
evitando el desarrollo de burbujas y hacer un blanco de absorbancia.
Tener cuidado de colocar la cubeta en la misma posición siempre que
hagamos una medida. Secar completamente las paredes de la
cubeta con tisue y colocarla en el porta cubetas de medida.
● Enjuagar la cubeta de medida tres veces con agua de muestra y
llenarla evitando el desarrollo de burbujas (tomando el agua del
sistema de filtración en caso de que se trate de una muestra de la
roseta superficial o directamente del frasco de vidrio de 250 L en caso
de que se trate de una muestra profunda). Tener cuidado de colocar
la cubeta en el espectrofotómetro en la misma posición siempre que
hagamos una medida. Secar completamente las paredes de la
cubeta con tisue y colocarla en el porta cubetas de medida. Realizar
el espectro y grabarlo en formato compatible con Excel (ej. ascii). Abrir
un directorio por estación y anotar en la libreta y el estadillo la
equivalencia entre el número del fichero y la muestra correspondiente.
● Al principio, mitad y final de cada sesión de análisis hacer un espectro
del agua milli–Q para comprobar la deriva del espectrofotómetro.
● Al terminar la secuencia de análisis, sumergir las cubetas de 10 cm en
1% HCl durante al menos 2 horas y lavarlas con agua milli–Q
abundante (3 lavados sucesivos con 25 mL de milli–Q) antes de usarlas
de nuevo.

Determinación a bordo de la fluorescencia


1. Matrices
Las matrices de excitación–emisión consisten en 22 espectros de
emisión concatenados, empezando a una longitud de onda de
excitación de 240 nm y terminado a 450 nm (es decir separados en 10
nm) y leyendo la intensidad de emisión entre 300 y 560 nm a intervalos
de 2 nm.
● Espectros 3–Dimensionales (EEMs) – blancos
o Cada EEMs lleva unos 20 minutos.
o Nota: Cada día hay que hacer una EEM de agua milli–Q recién
preparada que luego se sustraerá a cada muestra. Tanto el blanco
como las muestras deben generarse usando el mismo “experiment
file”.
o Hacer clic en “M”.
o Hacer clic en “3D”.
o Cargar un nuevo “experiment file” llamado “EEMnew25.xlm”.

180
o Comprobar que la configuración es Ex 240–450 a intervalos de 10
nm, Em 300–560 nm a intervalos de 2 nm, Ex y Em “slits” a 5 nm, y no
“Rayleigh masking checked”.
o Hacer clic en “Detectors” y asegurarse de que el tiempo de
integración es 0,25 s y que amos modos S1/R1 y S1c/R1c están
seleccionados y aparecen en el cuadro de “formulas”.
o Cambiar el nombre del fichero (en “Data Identifier”) a uno del tipo
M(leg)_(stn)blank_a, por ejemplo el primero sería M1_001blank_a.
La letra final (a, b, c…) se utiliza para diferenciar los distintos
blancos hechos en una misma estación.
o Hacer clic en “Run” para iniciar la EEM.
o Para el ejemplo, las EEM se grabarán como
“M1_001blank_a1_S1R1” (sin corregir) y “M1_001blank_a2_S1cR1c”
(corregida) y los ficheros con los datos se grabarán con los
nombres “M1_001blank_ad1” y “M1_001blank_ad2” (pueden
encontrarse en la lista de ficheros si se hace doble clic en “data”).
● Espectros 3–Dimensionales (EEMs) – muestras
o Enjuagar la cubeta de 1 cm tres veces con agua de muestra y
llenarla evitando el desarrollo de burbujas (tomando el agua del
sistema de filtración en caso de que se trate de una muestra de la
roseta superficial o directamente del frasco de vidrio de 250 L en
caso de que se trate de una muestra profunda).
o Hacer clic en el botón justo a la derecha de “M” (es el dibujo de un
espectro) y se llama “Previous experiment setup”.
o Así se cargará el mismo “experiment file”, es decir,
“EEMnew25.xlm”.
o No cambiar la configuración, EXCEPTO en el cuadro “Data
Identifier” donde debe escribirse el nombre de la muestra:
M(leg)_(stn)(cast)(bottle), donde leg = 1 a 7, stn = 001 a 177, cast = s
(superficie) o d (“deep”, profundo), y bottle = 01 a 24. Por ejemplo,
la primera muestra sería M1_001s01 y la última: M7_177d24.
o Hacer clic en “Run” para empezar la EMM.
● Corrección del pico Rayleigh
o Una vez que todas las EMMs has sido registradas, los picos Rayleigh
de primer y segundo orden deben eliminarse.
o Antes de eliminarlos, grabar el proyecto haciendo clic en “Save
Project”.
o En la lista de ficheros al final de la página, hacer doble clic en
“data” para ver los datos crudos en lugar de las EEMs.
o Hacer doble clic en el primer fichero EEM de la lista,
probablemente los blancos. Al hacer esto, debieran verse los datos
en una hoja de cálculo.
o Hacer clic primero en “M1_001blank_ad1” (la matriz registrada en
modo S1/R1).
o Seleccionar “Analysis” en el menú principal.
o Seleccionar “Rayleigh Masking”.

181
o Seleccionar “1st AND 2nd order Rayleigh” y hacer clic en “OK”.
o Una nueva matriz llamada “M1_001blank_aM1” aparecerá en el
listado de ficheros.
o A continuación, proceder con “M1_001blank_ad2” (la matriz
registrada en modo S1c/R1c).
o después, corregir cada EEMs de cada muestra en el mismo orden –
las S1/R1 primero y las S1c/R1c después.
o Una vez que el proceso se ha completado, grabar el proyecto
seleccionando “File” en el menú principal y “Save Project as” de la
barra. Grabar el proyecto en un nuevo directorio “MALASPINA” con
la misma fecha que el proyecto (habrá que crear una nueva
carpeta). Por ejemplo, para las muestras corregidas el 4–Nov–2008,
grabar el proyecto en el directorio
C:\Program Files\Jobin Yvon\Data\MALASPINA\081104\.
● Exportar datos
o Para exportar los ficheros en ascii, ir al menú principal y seleccionar
“File”.
o Seleccionar “Batch Export” y “ASCII Data” de menú.
o Seleccionar todos los ficheros a exportar y hacer clic en “Export
Data”.
o Elegir la carpeta donde grabar los ficheros exportados.
o Para el proyecto MALASPINA, grabarlos en una nueva carpeta
dentro del directorio MALASPINA con la misma fecha que el
proyecto y en un subdirectorio llamado “ascii” (p.e. para las
muestras medidas el 4–Nov–2008, grabar en:
C:\Program Files\JobinYvon\Data\MALASPINA\081104\ascii\)
o Hacer copias de seguridad.
● Corrección de “inner–filter” de las EEMs: se hace posteriormente en
MATLAB.
● Normalización al pico Raman de las EEMs: se hace posteriormente en
MATLAB.
● Substracción del blanco de agua milli–Q de las EEMs: se hace
posteriormente en MATLAB.

Al terminar la secuencia de análisis, sumergir la cubeta de 1 cm en


1% HCl durante al menos 2 horas y lavarla con agua milli–Q abundante
(3 lavados sucesivos con 5 mL de milli–Q) antes de usarla de nuevo. Si la
cubeta sigue sucia, lavarla con metanol (3 lavados sucesivos con 5 mL)
y después con agua milli–Q abundante (3 lavados sucesivos con 5 mL
de milli–Q)

2. Apagado del instrumento (se apagará siempre que el instrumento


vaya a estar más de 2 horas inactivo)
o Hacer clic en “X” en la parte derecha superior de la pantalla para
salir del programa.

182
o Asegurarse de que se ha introducido toda la información necesaria
en el fichero “DAILY fluoroLOG.xls” y en la libreta de campaña.
o 1º – apagar el ordenador.
o 2o – apagar el fluorímetro y cubrirlo con plástico.
o NO REINICIAR NUNCA EL FLUORIMETRO JUSTO DESPUES DE
APAGARLO. DEBE DEJARSE QUE LA LAMAPRA SE ENFRIE DURANTE AL
MENOS 1 HORA ANTES DE ENCENDERLO DE NUEVO.
o Lavar la cubeta con agua milli–Q. Dejarla secar unos minutos.
Colocarla en su estuche.

3. Notas/Correcciones/actualizaciones
● Lavado de la cubeta
o Normalmente la cubeta se limpia únicamente con agua milli–Q o
con 1% HCl y luego milli–Q. Si este procedimiento no es suficiente,
entonces puede lavarse con metanol y luego con milli–Q. Si la
cubeta sigue sucia, puede probarse disolviendo 2 lentejas de
NaOH en 200 mL de metanol y sumergir la cubeta en esa
disolución durante 2 horas. Después, enjuagar abundantemente
con agua milli–Q (>10 veces).
● Enjuagado de la cubeta entre muestras
o Entre muestras, enjuagar la cubeta 2 veces con agua milli–Q y
luego otras 2 veces con la muestra.
● Nomenclatura de las muestras
o Nombre menores de 5 caracteres darán un error.

Archivo y custodia de datos


El nombre, posición y profundidad de cada muestra así como el
fichero/directorio en el que se graban los datos se registrará en un
estadillo, en el que además se anotará cualquier incidencia en la
columna de observaciones.

Al terminar la secuencia de análisis de absorbancia, fluorescencia


puntual y EEMs deben hacerse una copia en un pen drive y otra en el
servidor del BIO Hespérides de todos los datos (además de la que quede
en los ordenadores del espectrofotómetro y espectrofluorímetro y el del
responsable de las medidas). Enviar semanalmente los archivos de
datos a la cuenta de correo electrónico de los responsables de esta
actividad.

10. Cuadro sinóptico de la técnica

Se presenta una secuencia de fotografías numerada mostrando los


pasos más relevantes del proceso de recogida, filtrado y análisis a bordo
de la absorbancia (aDOM) y fluorescencia (FDOM) de muestras de

183
materia orgánica total cromófora. (1) y (2) recogida de la muestra en
frascos de vidrio de 250 mL directamente de la botella; (3) y (4)
enjuague y llenado de la cubeta de cuarzo de 1 cm para la mediad de
la fluorescencia; (5) secado de la cubeta de 1 cm; (6) colocación en el
porta cubetas del espectrofluorímetro; (7) y (8) enjuague y llenado de la
cubeta de 10 cm con paredes de cuarzo para la medida de la
absorbancia; (9) y (10) colocación en el porta cubetas del
espectrofotómetro.

En caso de tratarse de una muestra de agua superficial, después del


paso (2), hay que proceder al filtrado de la muestra, tal y como se
recoge en la siguiente secuencia de fotografías. (1) sistema de filtración
de material disuelto que se utilizará; (2) y (3) filtros GF/F de 47 mm
calcinados que se colocarán en el sistema con la cara menos rugosa
hacía arriba con una pinza millipore; (4) y (5) colocación del filtro en el
sistema y cierre del mismo con una pinza de sujeción Millipore; (6) y (7)
se añaden 50 mL de agua milli–Q para lavar el filtro y se coloca el tapón
superior con la pinza de sujeción que se muestra; (8) y (9) se abren las
llaves de la bombona de aire sintético y del manómetro, luego la llave
que conecta con flujómetro y en éste se fija la presión alrededor de 100
mL; (10) se vacía el sistema en la bandeja que hay debajo del sistema;
(11 y 12) se añade la muestra de igual manera que se hizo con el agua
Milli-Q, enjuagando previamente el sistema de cada vez con 50 mL de
muestra, y recogiendo luego el filtrado para medir la florescencia y la

184
absorbancia, lavando dos veces cada cubeta. A continuación se
miden las muestras como se mostró anteriormente.

11. Cálculo de los resultados.

Absorbancia

Se calculará el coeficiente de absorción a cada longitud de


onda, a(λ), aplicando la siguiente ecuación:

a(λ) = 23,03 · [ABS(λ) – ABS(600-800)]

Donde ABS(λ) y ABS(600-800) son las absorbancias a las longitudes de


onda λ y promedio entre 600 y 800 nm, respectivamente.

Se obtendrá la pendiente espectral, S, como la pendiente de la


regresión lineal entre ln[a(λ)] y λ para longitudes de onda entre 250 y 500
nm. El valor de S se acompañará del error estándar de la estimación
(E.E.)

Fluorescencia

Tanto los valores puntuales como las matrices de excitación–


emisión se expresarán en unidades Raman dividiendo la intensidad de
fluorescencia entre el área bajo el pico Raman (ver apartado de
calibrado).

185
12. Control de calidad

Absorbancia

● Al principio, mitad y final de cada sesión de análisis se hará un


espectro del agua milli–Q para comprobar la deriva del
espectrofotómetro.
● De la muestra correspondiente al máximo de salinidad del agua
profunda se registrarán dos espectros de absorción (cambiando el
agua de la cubeta) para comprobar la reproducibilidad del
espectrofotómetro.

Fluorescencia

● Diariamente se calibrará el espectrofluorímetro en unidades Raman,


registrando un espectro de emisión de: (1) el patrón de referencia de
agua milli–Q entre 365 nm y 450 nm excitando a 350 nm; (2) el patrón
de referencia de p-terfenilo entre 310 nm y 600 nm excitando a 295
nm; y (3) el patrón de referencia de tetrafenilbutadieno entre 365 nm y
600 nm excitando a 348 nm, fijando el ancho de ranura de excitación
y emisión en 5 nm y el tiempo de integración en 0,25 segundos para
comprobar, y en caso necesario, corregir la deriva del aparato.
● De la muestra correspondiente al máximo de salinidad del agua
profunda se harán dos tandas de medidas puntuales y matrices de
excitación–emisión (cambiando el agua de la cubeta) para
comprobar la reproducibilidad del espectrofluorímetro.

13. Referencias

Lawaetz, A.J. and Stedmon, C.A. 2009. Fluorescence intensity calibration


using the Raman scatter peak of water. Applied Spectroscopy 63(8):
936–940.

186
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Técnicas analíticas

2. Titulo de la técnica
Determinación manual de urea en agua de mar

3. Autores del documento y filiación


Teodoro Ramírez, Ana Virginia Filgueiras Y Jesús Gago(IEO)

4. Finalidad. Campo de aplicación

El método que se empleará para la determinación de urea se basará


en el método manual de Goeyens et al (1998). Las medidas de urea se
realizarán únicamente en las estaciones que en las que se vaya a medir
el consumo de 15N-urea. El método desarrollado por Goeyens et al
(1998) es un método muy adecuado para trabajar a bordo, sobre todo
teniendo en cuenta que el control de Tª y de los tiempos de incubación
es difícil en campaña, y además es más económico al no requerir el uso
de baños a alta temperatura.
Básicamente se siguen los pasos indicados en el método de alta Tª
(Mulvenna y Savidge, 1992) pero se omite la incubación de las muestras
a 85ºC. En vez de esto se mantienen las muestras en la oscuridad a Tª
ambiente (22 ºC ±1) durante 3 días. Este método es válido para rangos
de urea de 0 a 5 μM.

5. Conceptos generales

El método que se empleará para la determinación de urea se basará


en el método manual de Goeyens et al (1998). Las medidas de urea se
realizarán únicamente en las estaciones que en las que se vaya a medir
el consumo de 15N-urea, ya que para las estimaciones de dicho
consumo es necesario conocer la concentración inicial de urea en el
medio.

Toma de muestras

Las muestras para el análisis de la urea se recogen directamente desde


la botella Niskin. Para la toma de muestras de agua de mar de la botella
Niskin se emplearán botes de polipropileno con tapón de rosca de 50
mL de capacidad (tubos tipo Falcon) (los botes vienen cerrados por lo
que no es necesario ningún tratamiento previo de los mismos). Los botes
serán previamente lavados 2 veces con el agua que se va a
submuestrear. Llenar el bote por encima de 40 mL Es conveniente el uso
de guantes desechables en todo el proceso de muestreo y análisis de

187
nutrientes a fin de evitar la contaminación de las muestras. También es
conveniente que la persona se lave frecuentemente las manos
(particularmente tras ir al aseo). Los baños y aseos del barco no deben
emplearse durante el muestreo de nutrientes, incluida la urea.

Conservación de las muestras


Una vez tomadas las muestras de agua, los botes con las mismas deben
ser almacenados en la oscuridad y en frío (por lo tanto, mejor en una
nevera) hasta que los análisis sean realizados en el mismo día de
muestreo. La filtración de las muestras es desaconsejable, en el caso de
estas muestras es preferible evitar cualquier manipulación que pueda
contaminarlas.

6. Equipamiento necesario
Espectrofotómetro, agitador-vortex, agitador magnético, micropipetas,
nevera, congelador.

7. Reactivos u otro material fungible

Material fungible:
Guantes desechables, tubos desechables polipropileno de 50 y 20 mL,
gradillas de plástico, imanes, matraces, vasos de precipitado de
plástico, botellas de color ámbar, probetas, cubetas de vidrio óptico de
5 cm de paso de luz, frascos lavadores, puntas desechables para
micropipetas, gafas protectoras.

Reactivos:
Diacetil monoxima, tiosemicarbazida, ácido sulfúrico, cloruro férrico
hexahidratado, urea, cloruro sódico, agua Elix y MilliQ.

Preparación de Reactivos

Reactivo A.

- Disolver 3.35 g de diacetil monoxima (2,3-butanodiona monoxima),


CH3·COC·(NOH)·CH3 en 100 mL de agua destilada. Al barco se
llevarán 20 botes de plástico unos 125 mL de color ambar
conteniendo cada uno de ellos 3.35 g de diacetil monoxima para
preparar allí las disoluciones. Para preparar la disolución, medir con
una probeta 100 mL de agua MilliQ y verter el contenido al bote
conteniendo la diacetilmonoxima. Disolver la diacetil monoxima.
Finalmente almacenar la disolución en la misma botella ámbar en la
que se ha preparado (si no se dispone de botella de color ambar
emplear papel de aluminio para cubrir el frasco completamente).

188
- Preparar una disolución de 0.15 g de tiosemicarbacida,
NH2·NH·CS·NH2, en 15 mL de agua destilada. Preparar una
disolución para cada 3 estaciones en las que se hagan muestros
para urea. Este reactivo habrá que llevarlo prepesado desde el
laboratorio. Para ello se prepararán al menos 26 botes de unos 20
mL con tapón de rosca, cada uno de ellos conteniendo 0.15 g de
tiosemicarbacida (se pueden emplear los tubos de vidrio ambar y
tapón de rosca que se compraron). Con una pipeta de 10 mL
añadir 15 mL de agua MilliQ al bote que contiene la
tiosemicarbacida, cerrar el bote con el tapón de rosca y disolver
agitando. Conservar en nevera protegida de la luz. Emplear la
disolución durante una semana como máximo (análisis en 3
estaciones). Después volver a preparar reactivo utilizando los botes
que se llevan prepesados al barco.

- Añadir 3.85 ml de la disolución de tiosemicarbacida a la primera


disolución, empleando una micropipeta de 5 mL. Agitar bien la
mezcla. Según Koreleff (Grasshoff et al 1983) este reactivo es estable
al menos una semana. Preparar por tanto el reactivo en el barco
para ser empleado en los análisis de 3 estaciones, es decir cada 7
días. Una vez pasado 7 días preparar nuevo reactivo. Guardar el
resto de tiosemicarbacida en su bote y en nevera protegido de la
luz.

Reactivo B.

- Con una probeta de 500 mL tomar 235 mL de agua MilliQ y


depositarlos en una botella de vidrio pyrex de 1 L (preferible ambar
si hay disponible. En caso contrario utilizar papel de alumino para
cubrir). Con una probeta de vidrio tomar 300 mL de ácido sulfúrico
concentrado (d=1.84 g/cm3) y añadir muy lentamente y con
agitación esos 300 mL de ácido sobre los 235 mL de agua MilliQ.
Dejar que la disolución se enfríe hasta que alcance la temperatura
ambiente (Esta disolución habrá que prepararla al menos con un
día de antelación a los análisis). Sería conveniente preparar una
disolución de sulfúrico diluido en el laboratorio para llevar al barco y
evitar tener que preparar la primera disolución allí. El resto de ácido
sulfúrico diluido que se necesite a lo largo de la campaña se
deberá preparar en el barco de la forma indicada. Para ello habrá
que llevar suficiente ácido sulfúrico concentrado (d=1.84 g/cm3) al
barco, al menos 3 L para preparar el resto de soluciones de ácido
sulfúrico necesarias.

189
- Preparar una disolución de cloruro férrico hexahidratado
(FeCl3·6H2O) de 0.15 gr en 10 ml de agua MilliQ. El cloruro férrico se
transportará al barco en viales prepesados de 20 mL de capacidad.
Para lo cual se pueden emplear los viales de vidrio ambar de 19 mL
con tapón de rosca que se compraron. Preparar al menos 10 botes
cada uno de ellos con 0.15 g de FeCl3·6H2O para llevar al barco
donde se prepararán las disoluciones según vaya siendo necesario.
Es necesario proteger la disolución de la luz.

- Añadir 0.5 mL de la disolución de cloruro férrico a la primera


disolución conteniendo el ácido sulfúrico. Agitar bien. Almacenar en
una botella ámbar (si es posible), si no proteger con papel de
aluminio y guardar en sitio oscuro. Este reactivo es estable meses,
aunque se debe mantener protegido de la luz. Preparar cada vez
que sea necesario. Se estima que habrá que preparar este reactivo
al menos 9 veces a lo largo de la campaña.

- Stock de solución estándar 10 mM. Disolver 150.15 mg de urea y


diluir a 250 mL con agua MilliQ en un matraz aforado. Secar
previamente unos 200 mg de urea a 95ºC durante 2 horas utilizando
un recipiente de vidrio (p. ej. vaso de precipitado de vidrio).
Transcurrido este tiempo guardar en desecador y dejar atemperar
bien antes efectuar las pesadas.

- Para pesar la urea se utilizarán botes de vidrio previamente lavados


con ácido. Al barco se llevarán 10 botes en los que se habrá
pesado una cantidad de urea lo más próxima posible a la cantidad
indicada (150.15 mg). Anotar en cada bote la cantidad pesada
exactamente para cada uno de ellos. Para preparar la disolución
patrón, tomar uno de los botes con la urea prepesada y añadir
suficiente volumen de agua destilada para disolver la urea. Con
cuidado transferir la urea disuelta desde el bote a un vaso de
precipitado. Lavar con cuidado el bote que contenía la urea
prepesada varias veces con agua MilliQ y vaciar su contenido en el
mismo vaso de precipitado para así arrastrar cualquier resto de urea
que haya podido quedar en el bote. Con cuidado transferir la
disolución de urea desde el vaso de precipitado a un matraz
aforado de 250 mL. Arrastrar con unos mL de agua MilliQ los restos
de solución de urea que queden vaso de precipitado y añadirlos al
matraz, repetir la operación varias veces. Finalmente enrasar a 250
mL con agua MilliQ.

190
- Este estándar contiene 10 mM de urea. Una vez preparada la
disolución, tomar alícuotas de 10 mL y congelar las alícuotas a -20ºC
en tubos con tapón de rosca. Congelar al menos 33 tubos, con
vistas a utilizar 1 tubo (10 mL) cada dos días de muestreo, con vistas
a preparar los patrones correspondientes. La urea sobrante tras el
primer uso se guardaría en nevera para el análisis siguiente (3 días
más tarde).

- Las alícuotas se emplearan para preparar una disolución de 100 μM


(ver más adelante). Para ello será necesario descongelar el tubo y
dejar atemperar bien antes de usar. Aunque en principio sólo haría
falta preparar una única disolución y congelar las alícuotas es
conveniente llevar al barco 10 botes con urea prepesada para
poder preparar varios patrones 10 mM en caso de que surja
cualquier problema durante la campaña. Anotar en cada bote la
cantidad pesada exactamente para cada uno de ellos. La urea
sobrante se guardará en nevera y se utilizaría en el siguiente
muestreo.

- Cloruro sódico, NaCl, sólido. Disolver 21.3 g y llevar a 150 mL con


agua MilliQ. El NaCl se llevará prepesado desde el laboratorio en
botes de tapón de rosca de suficiente capacidad (250 mL) Tomar
con una probeta 140 mL de agua MilliQ y añadir al bote
conteniendo el NaCl. Agitar bien hasta la completa disolución del
NaCl. Guardar en nevera.

- Teniendo en cuenta que cada día se tomarían 5 mL por muestra,


esto supone que cada día de análisis se consumirán 40 mL (5
patrones +3 blancos). Una misma disolución podría emplearse para
3 análisis consecutivos (que distan entre ellos tres días, ya que las
determinaciones de urea se llevaran a cabo en 1 de cada 3
estaciones). Para evitar cualquier tipo de contaminación del NaCl,
de los 150 mL de NaCl preparados tomar 50 mL en un bote o vaso
de precipitado limpio y usarlos para los análisis de ese día. Guardar
el resto de la disolución de NaCl sobrante en nevera para su uso en
las siguientes estaciones. Habrá que prepesar NaCl en suficientes
botes para tener disolución para todas las estaciones.
Considerando el número de estaciones B y C en la campaña serían
56, y considerando que pudiera haber problemas con algunos de
las botes o disoluciones de NaCl, habrá que preparar al menos 26
botes cada uno de ellos conteniendo 21.3 g de NaCl, de forma que

191
se puedan preparar las disoluciones en el barco cada vez que haya
que efectuar el análisis de urea.

8. Calibración

- Descongelar una alícuota de patrón de urea 10 mM y dejarla


atemperar hasta que alcance la temperatura ambiente. Hacer esta
operación con tiempo suficiente (al menos 2 h antes de los análisis).
Los patrones se preparan a partir de la solución de urea 100 μM.
Para prepararla se toma 1.0 mL de una solución concentrada 10 mM
de urea y se diluyen con agua MilliQ a 100 mL en un matraz aforado.
Atemperar también los reactivos.
- Preparar una curva de calibración con 5 puntos (0.5 μM, 1.0 μM, 2.0
μM, 3 μM y 5 μM de urea) a partir de la disolución de urea 100 μM
(como se indica en la tabla más abajo). El patrón de 5 μM de urea
se preparará por duplicado para comprobar con él que el máximo
de absorción se encuentra a 520 nm.
- En primer lugar tomar el volumen de agua MilliQ necesario para
completar 15 mL en cada patrón y añadirlo a cada tubo (ver tabla).
Utilizar una pipeta de 10 mL para añadir en primer lugar 10 mL de
MilliQ a todos los tubos, seguidamente completar los volúmenes.
- Preparar paralelamente 3 blancos como se indica en la tabla,
añadiendo 15 mL de MilliQ a cada tubo y siguiendo a continuación
los pasos descritos para los patrones. Utilizar las mismas puntas para
añadir el agua MilliQ a los patrones y a los blancos.
- Con una micropipeta de 5 mL añadir 5 mL de la solución de NaCl
(21.3 g/150mL) a todos los patrones y blancos, utilizar la misma punta
para patrones y blancos.
- A continuación añadir a los tubos de los patrones el volumen
correspondiente de estándar 100 μM (como se indica en la tabla),
utilizando las micropipetas disponibles.
- Seguidamente añadir 1.4 mL del reactivo A a los patrones y blancos.
Comenzar por los blancos y finalizar por el patrón de mayor
concentración. Utilizar siempre la misma punta evitando el contacto
con el patrón y el tubo. Si hay sospecha de que la punta puede
haberse contaminado cambiar la punta por una nueva.
- Tras añadir el reactivo A, agitar la mezcla en un vortex durante 3
segundos, con cuidado de que no salpique.
- Inmediatamente añadir con cuidado 4.6 mL del reactivo B a todos
los patrones y a los blancos empleando un dosificador de 5 mL.
Seguir el orden indicado anteriormente comenzando por los blancos
y finalizando por los patrones más altos. Evitar salpicaduras en el

192
tubo de salida del dispensador. Asegurarse de sangrar el dosificador
antes de comenzar los análisis.
- Después agitar los tubos durante 5 seg y seguidamente tapar los
tubos con un tapón de rosca.

- Cubrir inmediatamente los tubos con papel de aluminio (tener


preparados con anterioridad) e incubar en la oscuridad y a
temperatura ambiente de 22ºC (±1) durante 72 h. Si es posible
guardar en sitio oscuro. Anotar el tiempo de comienzo de las
incubaciones.

Conc. de urea mL agua MilliQ mL NaCl μL Urea 100 μM mL reactivo A mL reactivo B


(en 20 mL)
0.00 μM# 15.00 mL 5.00 0 μL 1.40 mL 4.60 mL
0.50 μM 14.90 mL 5.00 100 μL 1.40 mL 4.60 mL
1.00 μM 14.80 mL 5.00 200 μL 1.40 mL 4.60 mL
2.00 μM 14.60 mL 5.00 400 μL 1.40 mL 4.60 mL
3.00 μM 14.40 mL 5.00 600 μL 1.40 mL 4.60 mL
5.00 μM 14.00 mL 5.00 1000 μL 1.40 mL 4.60 mL
5.00 μM* 14.00 mL 5.00 1000 μL 1.40 mL 4.60 mL
#Los blancos se preparan en triplicado para tomar el valor medio de la absorbacia.
*El patrón se prepara en duplicado para comprobar con ese estándar que el máximo
de absorción tiene lugar a 520 nm.

Antes de añadir los reactivos el volumen final de los patrones es de 20


mL. La concentación de urea está calculada para este volumen de 20
mL, con un contenido en NaCL de 35.5 g de NaCl/Litro (y un
equivalente de volumen de muestra de 20 mL). El volumen tras añadir
los reactivos es de 26 mL. Hacer las incubaciones en botes de 30 mL de
plástico.

Análisis de las muestras

- Las muestras de agua de mar se comenzarán a preparar antes de


iniciar la preparación de la curva de calibración. Preparar 8 tubos
de 30 mL (2 réplicas por profundidad). A cada tubo se transfiere
un volumen de 20 mL de muestra de agua de mar
correspondiente empleando la micropipeta de 10 mL (2 pipeteos
con una pipeta de 10 mL) a un tubo de polipropileno de 30 mL
con tapón de rosca. Utilizar siempre que sea posible la misma
punta para tomar la muestra de la segunda réplica, si se
sospecha que la punta puede estar contaminada descartar la
punta y usar una nueva.

193
- Tomar los volúmenes correspondientes del resto de las muestras
de agua de mar, de dos en dos. Asegurarse de cambiar la punta
entre muestras de diferentes profundidades.

- A continuación se le añaden a cada tubo 1.40 mL del reactivo A


utilizando una micropipeta de 5 mL (si es posible emplear la misma
punta para todas, evitando que ésta se contamine).

- Agitar con un vortex los tubos durante 3 seg., evitando


salpicaduras.

- A continuación añadir 4.60 mL del reactivo B mediante un


dosificador.

- Agitar la mezcla en un vortex durante 4 seg y cerrar el tubo con


un tapón. Cubrir el tubo con papel de aluminio e incubar en la
oscuridad durante 72 horas a 22ºC (±1). Hacer medidas por
duplicado para cada profundidad. Rotular los tubos una vez que
estos han sido envueltos en papel de aluminio.

9. Descripción de la Técnica

El método desarrollado por Goeyens et al (1998) es un método muy


adecuado para trabajar a bordo, sobre todo teniendo en cuenta que
el control de Tª y de los tiempos de incubación es difícil en campaña, y
además es más económico al no requerir el uso de baños a alta
temperatura.
Básicamente se siguen los pasos indicados en el método de alta Tª
(Mulvenna y Savidge, 1992) pero se omite la incubación de las muestras
a 85ºC. En vez de esto se mantienen las muestras en la oscuridad a Tª
ambiente (22 ºC ±1) durante 3 días. Este método es válido para rangos
de urea de 0 a 5 μM.

Medir las absorbancias de los blancos, patrones y muestras al cabo de 72


horas de incubación, para las medidas emplear cubetas de vidrio óptico de 5
cm de longitud a 520 nm. Comenzar las medidas por los blancos y patrones. El
volumen de las cubetas de 5 cm de paso óptico es de 17.5 mL por lo que hay
suficiente volumen de muestra (26 mL) para realizar las medidas, pudiéndose
incluso emplear algunos mililitros de volumen de muestra para lavar la cubeta
con un poco de la propia muestra.

- Antes de efectuar las medidas de los blancos, patrones y muestras


comprobar con uno de los patrones más concentrados (que se ha
preparado en duplicado) que el máximo de absorción está realmente a

194
520 nm. De esa forma se verifica que el monocromador del
espectrofotómetro no ha sufrido ningún desajuste por el movimiento del
barco. Esto se puede hacer registrando el espectro del patrón y
visualizando el máximo de absorción. En caso de que se detectara que
el máximo de absorbancia se ha desplazado durante la campaña a
otra longitud de onda (e.g. 500 nm o 530 nm), entonces emplear esa
otra longitud de onda donde está el máximo para realizar las medidas.

- Una vez comprobada que la longitud de onda es la correcta fijar la


misma en el equipo para hacer las medidas.

- Hacer el autocero con Agua MilliQ

- Medir las absorbancias de los blancos. Como valor del blanco se


utilizará el valor medio de la absorbacia de los 3 blancos preparados
simultáneamente Recuperar los botes empleados para los blancos,
lavándoles bien con agua destilada después de su uso.

- Medir las absorbacias de los patrones (comenzando por el más diluido)

- Medir las absorbancias de las muestras, de forma que las réplicas sean
medidas de dos en dos, de forma seguida.

Lavar las cubetas bien entre medida y medida con agua MilliQ (varias veces) y
dejar escurrir bien las cubetas antes de volver a medir (durante unos minutos);
después lavar con unos 4 ml-5ml de la propia muestra que se va a medir
(cuidado de no lavar con demasiada cantidad de muestra, y asegurarse que
el volumen que queda será suficiente para la medidas).

Puesto que el color desarrollado por los blancos, patrones y muestras se ve


afectado por la luz, retirar el papel de aluminio de cada tubo justo antes de
hacer la medida de cada muestra (los tubos tendrán que ser rotulados de
nuevo una vez cubiertos con el papel de aluminio para poder ser
identificados. Comprobar que la identificación sobre el papel de aluminio
coincide con el rotulo del propio tubo)

Antes de realizar las medidas de absorbacia de cada blanco/patrón/muestra


asegurarse de que las caras ópticas de las cubetas están bien limpias y secas.
Emplear para ello un trozo de papel ligeramente humedecido con agua MilliQ,
frotando las caras ópticas de las cubetas con el papel ligeramente
humedecido y comprobando que realmente están limpias y secas antes de
medir.

Una vez efectuadas las medidas volver a lavar bien las cubetas con agua
MilliQ y dejarlas escurrir durante unos minutos antes de guardarlas para los
análisis en las siguientes estaciones. Guardar las cubetas en lugar donde estén
bien protegidas de posibles golpes y evitando también que éstas se puedan
contaminar o llenar de polvo o pelusa en su interior.

195
Realizar una curva de calibración cada vez que se vayan a efectuar medidas
de urea (coincidiendo con las estaciones donde se determinen consumo de
15N-urea).

Antes de realizar las medidas de absorbancia de cada patrón asegurarse de


secar bien y dejar completamente limpias las caras ópticas de las cubetas,
emplear para ello un trozo de papel humedecido con agua MilliQ.

10. Cuadro sinóptico de la técnica

Muestra Medir
Incubación 72 h
+ Agitación Reactivo B Agitación absorbancia
22ºC, oscuridad
Reactivo A 520 nm

11. Calculo de los resultados.

Calcular la concentración de urea en cada estación a partir de la


curva de calibración realizada ese mismo día. Anotar la temperatura de
incubación de las muestras varias veces a lo largo del periodo de
incubación. Y hacer un registro con las diferentes curvas de calibración
obtenidas a las diferentes temperaturas de incubación.

Las concentraciones de urea en las muestras se calcularán a partir de


las curvas de calibración obtenidas cada día de análisis. Representar los
valores de absorbancia (eje y) frente a las concentraciones de los
estándar de urea (eje x) y ajustar a una ecuación lineal con ordenada
en el origen (Y=a*X), forzando el ajuste de la ecuación lineal a pasar por
cero, ya que teóricamente el ajuste debería pasar por cero. Si la
ordenada en el origen no es cero sería señal de contaminación de los
estándares o del blanco (en caso de que la ordenada sea positiva la
contaminación sería debida a los patrones, en caso de que fuese
negativa sería atribuible al blanco)
La pendiente “a” será empleada para obtener la concentración de
urea en las muestras:

[urea] = ( As − Ab)
a

donde As-Ab es la absorbancia de la muestra menos la absorbancia del


blanco.

12. Control de calidad


La mayor parte del material que se empleará será material desechable
de plástico (puntas, tubos, etc). Este material suele venir en condiciones
adecuadas de fábrica, por lo que no es necesario ningún tratamiento ni

196
lavado previo del mismo. Sólo los botes con los que se va a muestrar
desde las botellas Niskin se lavarán un par de veces con un poco de
volumen del propio agua que se quiere muestrear. El resto del material
de plástico o vidrio (probetas, vasos de pp, matraces, imanes
recubiertos de teflón, etc) habrá que limpiarlo de forma adecuada y
lavarlo con HCl diluido, con varios lavados posteriores con MilliQ.
Durante la limpieza del material emplear guantes desechables. Una vez
limpio el material, dejar secar en un sitio limpio y guardar en un sitio
donde no pueda ser contaminado (e.g en bolsas de plástico de
grandes dentro de una caja de plástico cerrada con tapa y alejada de
posibles fuentes de contaminación). Tomar todas las precauciones
posibles para evitar la contaminación de las puntas y del resto del
material empleado en el análisis y muestreo.

Después de varios usos y en el caso de que se observe que tiene


suciedad en su interior, sería necesario lavar las cubetas interiormente y
exteriormente con ácido. Para ello poner las cubetas en un recipiente
de plástico y llenarlas de ácido clorhídrico diluido durante algunas
horas. Sacar las cubetas y lavarlas con abundante agua destilada.
Ponerlas en un sitio seguro para que estas se sequen. Guardarlas
inmediatamente en la caja correspondiente protegidas de posibles
golpes y contaminación.

13. Referencias

Goeyens L., Kindermans N., Abu Yusuf M. y Elskens M. (1998). A room


temperature for the manual determination of urea in seawater.
Estuarine, coastal and shelf science, 47, 415-418.
Grasshoff K., Ehrhardt M. and Kremling K. (Eds.). (1983). Methods of
seawater analysis. Verlag Chemie, Weinheim, Alemania.
Mulvenna, P. F. & Savidge, G. 1992 A modified manual method for the
determination of urea in seawater using diacetylmonoxime reagent.
Estuarine, Coastal and Shelf Science 34, 429–438.

197
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Titulo de la técnica
Determinación del consumo de 15NO3-, 15NH4+ y 15urea y fijación de 15N2

3. Autores del documento y filiación


Teodoro Ramírez y Jesús Gago(IEO)

4. Finalidad. Campo de aplicación

Obtención de muestras de agua de mar para realización de


incubaciones a bordo del buque con el objeto de medir la producción
nueva, la producción regenerada y las tasas de fijación de N2 a
diferentes profundidades.

5. Conceptos generales
Generalmente se acepta que en el océano global el N es el elemento
nutriente que más frecuentemente limita la producción primaria.
Aunque el NO3- es la especie dominante de N inorgánico en muchas
regiones oceánicas, gran parte de la producción primaria en el océano
es debida al consumo por el fitoplancton de formas de N reciclado
(amonio, urea y amino ácidos). La producción primaria nueva depende
de la llegada de nutrientes nuevos a la capa fótica a través de
procesos de difusión turbulenta, afloramientos, aportes de los ríos,
deposición atmosférica o fijación de N2. Por el contrario, la producción
primaria regenerada se debe al consumo por el fitoplancton de
nutrientes que son reciclados en la capa fótica a través de las redes
tróficas heterotróficas.
La capacidad del océano para secuestrar CO2 atmosférico viene en
gran medida determinada por la producción nueva, definida como la
fracción de la producción primaria soportada por la entrada de
nutrientes nuevos (habitualmente nitrato) en la zona eufótica (Eppley y
Peterson, 1979; Dugdale y Goering, 1967). En el océano la producción
nueva y, consecuentemente la exportación de C por la bomba
biológica se incrementa en regiones donde tienen lugar mezcla
turbulenta y el afloramiento de aguas profundas, debido al aporte de
nutrientes nuevos a la zona fótica. Debido precisamente al papel
regular que el océano juega sobre el clima, en las últimas décadas se
ha realizado por parte de la comunidad científica un gran esfuerzo para
cuantificar de forma global la producción nueva y regenerada en el
océano. La determinación de la f-ratio, la proporción entre producción
nueva y la producción total, permiten hacer estimaciones de la
proporción de la producción biológica que es exportada hacia el fondo
del océano en forma de materia orgánica particulada.

198
La producción nueva y la producción regenerada en la zona fótica
pueden estimarse midiendo el consumo por el fitoplancton de diferentes
formas de N disuelto. En concreto la producción nueva se mide
añadiendo concentraciones traza de 15NO3- (<10% de la concentración
inicial de NO3 presente en la muestra de agua de mar) a una muestra
de agua de mar contenida en una botella transparentes de
policarbonato. Una vez adicionado el 15NO3- , las muestras son
incubadas en determinadas condiciones de luminosidad y temperatura
durante un periodo de tiempo determinado, tras el cual las
incubaciones son finalizadas y las muestras de agua de mar filtradas. La
concentración de 15N en el filtro permitirá estimar el consumo de 15NO3-
y determinar el valor de al producción nueva. La determinación de la
producción regenerada se basa en las medidas del consumo de 15NH4+
y 15urea (Dugdale y Goering, 1967) en las mismas condiciones que las
empleadas para medir el consumo de 15NO3- .

La fijación de N2 atmosférico en el océano es un proceso clave del ciclo


biogeoquímico del N y contribuye de forma importante a la producción
nueva y a la capacidad del océano para el secuestro de C. Hasta
hace no mucho se pensaba que este proceso sólo era de relevancia en
regiones oceánicas ultraoligotróficas, donde las formas disueltas de N
(inorgánicas y orgánicas) son muy escasas y donde abundan los
microorganismos diazótrofos. Sin embargo, se ha visto que la fijación de
N2 atmosférico parece ser más frecuente y estaría más extendida en el
océano de lo que se pensaba en principio. Para poder entender mejor
la importancia de la fijación de nitrógeno, su extensión y distribución en
el océano global, durante el transcurso de la Expedición Malaspina 2010
se llevaran a cabo ensayos para cuantificar la magnitud de este
proceso en los diferentes océanos y regiones oceánicas. La estimación
de la fijación de N2 se realizará basándose en el método de Montoya et
al (1996), realizando para ello incubaciones de agua de mar en botellas
cerradas a las que se le inyectará 15N2. Posteriormente se medirá la
cantidad de 15N que ha sido fijado por el fitoplancton durante el tiempo
de incubación, lo que permitirá estimar las tasas de fijación de N2 a
diferentes profundidades.

6. Equipamiento necesario
Congelador, nevera, nevera portátil, rampas de filtración y soportes
para las botellas, bombas de vacío, estufa de desecación, soportes de
madera para bidones de 30 L.

7. Reactivos u otro material fungible


Guantes desechables, botes desechables de plástico 20 mL y 10 mL,
gradillas de plástico, botellas de policarbonato transparente de 2 y 4 L
calibradas y con cierre hermético, botellas de policarbonato de 4 L con
tapones provistos de septa, micropipetas de volumen variable de 100-

199
200 μL, 100-1000 μL, 1000-5000 μL, puntas para micropipetas, jeringas
Hamilton gas-tight de 5-10 mL y agujas, 4 incubadores de 180 litros,
mangueras y conexiones para mangueras, 4 bidones de policarbonato
con grifo de 30 litros, filtros de densidad neutra atenuando al 60%, 20%,
10% y 1% de PAR, -,K15NO3, (15NH4)2SO4 y 15urea , 15N2, agua MilliQ,
embudos de plástico, tubos de silicona, termómetro digital, acido
clorhídrico diluido (10%), parafilm, vasos de precipitado de plástico de
varios volúmenes, probetas de plástico de varios volúmenes, filtros de
fibra de vidrio Whatman GF/F de 25 mm de diámetro precalcinados a
450ºC, pinzas, viales herméticos, gradillas para viales, gafas protectoras,
bandejas.

8. Calibración

Enriquecimiento inicial en 15N del NOP


La determinación del enriquecimiento inicial en 15N del NOP es
necesaria para poder después realizar los cálculos para las estimaciones
de la fijación de N2 y del consumo de N.
Fijación de 15N2
Las botellas empleadas para la fijación de 15N2 serán calibradas para
determinar en el laboratorio para determinar su volumen exacto, que
será necesario conocer para realizar los cálculos posteriores. Cada
botella se identificará para saber en todo momento el volumen exacto
de la misma. La temperatura del agua del que contiene cada uno de
los bidones será medida antes de tomar las muestras para los
experimentos de fijación de N2.
Consumo 15NO3-, 15NH4+ y 15Urea
Las adiciones de 15NO3-, 15NH4+ y 15Urea a las botellas de incubación se
realizarán a partir de patrones de 15NO3-,(K15NO3) 15NH4+ ((15NH4)2SO4) y
15urea de concentración 2 mM y/o 10 mM., dependiendo de las

concentraciones de estos nutrientes en el medio. Los patrones de


concentración 2 mM se prepararán diariamente a partir de patrones
más concentrados (10 mM). Se dispondrá de un stock de los patrones
concentrados en congeladores.
Las disoluciones 2 mM se prepararán a partir de las alícuotas de
concentración 10 mM, tomado 1 mL la disolución 10 mM y añadiendo 4
mL de agua MilliQ.

Contenido de 15N sobre los filtros calcinados.


Algunos filtros GF/F calcinados de los que se emplearán para las
filtraciones se guardarán para conocer el posible contenido de los
mismos en 15N.

200
9. Descripción de la Técnica

Enriquecimiento inicial en 15N del NOP


La determinación del enriquecimiento inicial en 15N del NOP es
necesario para poder después realizar los cálculos para las estimaciones
de la fijación de N2 y del consumo de N.
Muestreo
De cada uno de los bidones se tomarán dos muestras en botellas de
policarbonato 4 L de capacidad nominal, para la determinación del
enriquecimiento inicial en 15N del NOP. Las botellas, que habrán sido
calibradas previamente se llenarán hasta la marca señalada en el
cuello. El volumen exacto de cada una de las botellas deberá ser
anotado y las botellas identificadas. El enriquecimiento inicial en 15N del
NOP se utilizará para la estimación de la fijación de 15N2 y para el
cálculo del consumo de 15NO3- , 15NH4+ y 15urea.
Filtración
Para la determinación del enriquecimiento inicial en en 15N del PON el
contenido de las botellas se filtrará a baja presión 100-150 mm Hg a
través de filtros Whatman GF/F de 2.5 cm de diámetro precalcinados
(450 ºC durante 4 horas). Los filtros serán guardados en viales y secados
(en el interior de los viales) a 60ºC durante 24h. Transcurrido este tiempo
los viales serán cerrados herméticamente y se almacenarán hasta su
análisis mediante espectrometría de masas en los servicios de análisis de
la Universidad de la Coruña.
Tras finalizar la filtración se procederá a lavar el material empleado
(embudos, soportes de los filtros, etc) para su posterior uso para la
filtración de las muestras para fijación de N2.
Precauciones
Utilizar guantes desechables durante los muestreos y la manipulación de
las muestras, guardando siempre la máxima precaución para evitar
posible contaminación de las muestras de cualquier tipo de fuente.
También es necesario usar durante la filtración del agua para la
determinación del contenido inicial en 15N material distinto del
empleado para las filtraciones de las muestras marcadas con 15NO3- ,
15NH + y 15urea (diferentes soportes para los filtros, embudos, pinzas, etc).
4
Por lo que se dispondrá del material separado para tal fin. También será
necesario cambiar de guantes si se han manipulado con anterioridad
muestras o patrones marcados con 15NO3- , 15NH4+ y 15urea.
Será necesario cambiar de guantes si se han manipulado con
anterioridad muestras o patrones marcados con 15NO3- , 15NH4+ y 15urea.

201
Fijación de 15N2

Muestreo
Los experimentos de fijación de nitrógeno se realizarán siguiendo
básicamente la metodología descrita por Montoya et al (1996). Las
muestras de agua de mar se tomarán en botellas de policarbonato
transparentes (Zehr et al., 2001) 4.0 L de capacidad nominal provistas de
tapones con septa. Las botellas habrán sido previamente lavadas con
HCl 10%, seguido de varios lavados con agua Elix y después con MilliQ
(18.2 MΩ). Finalmente las botellas serán lavadas un par de veces con
unos 200 mL del agua de mar de la profundidad a ensayar.
La muestra de agua se tomará evitando la formación de burbujas, por
ello es conveniente que el flujo de agua desde el bidón sea más lento,
y las botellas se llenarán completamente. Al cerrarlas, las botellas deben
estar en posición vertical, y hay que evitar que penetre aire en las
mismas. Para ello colocar las botellas verticalmente y llenar la botella
hasta que esté a punto de desbordar (hasta que se forme un menisco
convexo en el borde del cuello de la botella), colocar con cuidado el
tapón y cerrar bien. Finalmente comprobar que no hay burbujas de aire
en la botella y que la botella está bien cerrada. En caso de que hayan
quedado burbujas hay que tratar de eliminarlas.. En ese caso abrir la
botella, eliminar las burbujas, y añadir el agua necesaria para volver a
llenar la botella hasta el borde del cuello (como se ha descrito antes),
colocándole de nuevo el tapón con la botella en posición vertical.
Adición de sustrato (15N2)
Una vez que no queden burbujas de aire en las botellas, a cada una de
ellas se inyectará un 8 mL de 15N2 (98% átomos) utilizando una jeringa
Hamilton Gas-Tight, de forma que el enriquecimiento resultante de 15N2
sea próximo al 10 % (Capone y Montoya, 2001). El 15N2 se tomará del
cilindro conectando al mismo utilizando una bolsa de muestreo de
gases. La bolsa se llenará con una cantidad superior al 15N2 necesario
para el muestreo de cada estación (24 mL de gas por cada estación). Si
queda algún 15N2 restante en la bolsa se podrá utilizar para los
experimentos de fijación un próximo muestreo. Después de llenar la
bolsa cerrar bien las válvulas del cilindro y de la llave de acero que va
conectada a éste. La bolsa irá provista de unos tubos de silicona y una
llave para poder hacer la conexión al cilindro.
Antes de ser llenada con 15N2 la bolsa y los tubos deberán primero
vaciarse de aire, para ello se conectará la bolsa a través de los tubos de
silicona y llave de plástico a una bomba de vacío, haciendo el vacío
durante unos segundos con la bomba. Cerrar la llave de plástico con la
que van provistas las bolsas mientras la bomba está aún en
funcionamiento. A continuación se colocará en el extremo libre de la
llave un pequeño trozo de tubo de silicona, en el extremo del cual se
habrá ajustado un septa de silicona. Con la de llave plástico cerrada y

202
con una jeringa Hamilton gas-tight provista de aguja penetrar el septa
de silicona que y sacar el aire que queda en el extremo de llave,
retirando 10 mL de aire. Retirar la aguja con la jeringa y vaciar su
contenido de aire. Insertar de nuevo la jeringa con la aguja en el septa
y repetir la operación 2 veces más.
Finalmente, tras sacar la jeringa, abrir la llave de plástico. A
continuación el 15N2 se extraerá de la bolsa que lo contiene pinchando
con la aguja Hamilton gas-tight a través del septa de silicona colocado
en el extremo de la llave de plástico. El 15N2 extraído de la bolsa se
inyectará inmediatamente en las botellas de 4 L a través de los tapones
de septa de las mismas. Cambiar de aguja cada vez que se vaya a
inyectar 15N2 en una nueva botella. Ajustar bien las agujas en la jeringa.
Una vez que se haya tomado todo el 15N2 necesario para las
incubaciones, cerrar la llave de plástico que va conectada a la bolsa
que contiene el 15N2. El resto del 15N2 que quede en la bolsa se podrá
utilizar en la siguiente estación en las que se vayan a realizar
incubaciones. Guardar la bolsa protegida de cualquier objeto cortante
o punzante, o que pueda dañarña. Lo más adecuado es guardarla en
una caja cerrada separada de cualquier otro tipo de material.
Si las operaciones se efectúan en la cubierta, tomar las precauciones
necesarias para evitar que durante la manipulación, la bolsa que
contiene el 15N2 pueda romperse, perforarse o salir volando por el viento.

Incubaciones (15N2)
Tras la inyección de 15N2, las botellas se agitarán suavemente y las
muestras se incubarán en incubadores instalados en la cubierta del
buque oceanográfico durante 24 h.
Las incubaciones se realizarán en 4 incubadores (de aproximadamente
80-100 L de capacidad), uno para cada profundidad de muestreo. Los
incubadores se llenarán con agua de mar de superficie y el agua en los
incubadores se mantendrá próxima a la temperatura superficial del mar
mediante bombeo continuo de agua desde la superficie.
Durante las incubaciones la intensidad de luz en el interior de los
incubadores será ajustada para simular las condiciones lumínicas in situ
empleando para ello filtros de densidad neutra (malla de nylon de 1.5
mm de luz). En estos incubadores también se llevarán a cabo de forma
simultánea las incubaciones para determinar las tasas de consumo de
15NO -, 15NH + y 15N-Urea, como se indica más adelante.
3 4

203
Filtración
Una vez finalizado el periodo de incubación se filtrará el contenido de
las botellas (a baja presión 100-150 mm Hg) a través de filtros Whatman
GF/F de 2.5 cm de diámetro (precalcinados a 450 ºC durante 4 horas).
Los filtros serán introducidos en viales y serán secados (en el interior de
los viales) a 60ºC durante 24 horas. Finalmente los viales serán cerrados
herméticamente y se almacenarán hasta su análisis mediante
espectrometría de masas en los servicios de análisis de la Universidad de
la Coruña.

Consumo de 15NO3-, 15NH4+ y 15Urea

Muestreo
De cada profundidad se tomarán muestras de agua de mar en botellas
de policarbonato transparente de 2 L de capacidad nominal
(previamente tratadas con acido clorhídrico diluido y lavadas varias
veces con agua Elix, seguido de lavados con agua MilliQ y finalmente
enjuagadas dos veces con unos 150 mL del agua de mar de la
profundidad de muestreo). Aunque la capacidad nominal de las
botellas es de 2L, las mismas tienen realmente más de 2 L de
capacidad. Las botellas se llenarán hasta la marca del cuello, habiendo
sido el contenido de cada botella previamente calibrado en el
laboratorio. Cada botella deberá ser identificada para tener en cuenta
el volumen de cada una de ellas en las incubaciones. Por lo que habrá
que tomar nota de las botellas empleadas y del volumen de las mismas.

Adiciones de sustratos
Las muestras serán inoculadas con cantidades traza de 15NO3-, 15NH4+ y
15Urea (99% átomos), de forma que la concentración final de estos

sustratos en la muestra no exceda, siempre que sea posible, el 10% de la


concentraciones presentes en el medio (Dugdale y Goering, 1967). Por
ello sería deseable poder disponer de medidas de NO3- , NH4+ y urea
antes de proceder a la adición de los sustratos. En caso de que, por
cuestiones técnicas, no fuera posible disponer de esas medidas en la
estación en cuestión, entonces se añadirían concentraciones traza de
cada uno de los sustratos en función de las concentraciones de
nutrientes obtenidas para cada profundidad correspondiente a la
estación más próxima a la estación de trabajo. Las botellas empleadas
para las incubaciones con cada uno de los sustratos se identificaran de
forma adecuada y visible. Las cantidades adicionadas de cada uno de
los sustratos a las diferentes muestras serán anotadas.

204
Las adiciones de los sustratos se realizarán a partir de patrones de 15NO3-
,(K15NO3) 15NH4+ ((15NH4)2SO4) y 15urea de concentración 2 mM o 10 mM.
Del patrón concentrado de 10 mM y para cada uno de los sustratos
(K15NO3, (15NH4)2SO4) y 15urea) se prepararán 30 alícuotas de 2 mL. Para
preparar las alícuotas se emplearán tubos de plástico con tapón de
rosca de 4-5 mL de capacidad, lavados previamente con ácido. Las
alícuotas se congelarán a -20ºC, de esa forma se dispondrá de un stock
del patrón de 10 mM. Teóricamente esas alícuotas deben ser suficientes
para realizar los ensayos durante toda la campaña. En función de las
concentraciones de NO3-, NH4+ y urea en el agua de mar a cada una
de las profundidades, se empleará la disolución 2 mM y/o la disolución
10 mM para añadir la concentración de sustrato deseada a las botellas
de incubación.
Las disoluciones 2 mM se prepararán a partir de las alícuotas de
concentración 10 mM, tomado 1 mL la disolución 10 mM y añadiendo 4
mL de agua MilliQ. Tanto el patrón concentrado como el diluido deben
estar bien atemperados antes de su uso. El volumen de patrón
empleado para realizar las adiciones de sustratos a las botellas de
incubación dependerá de las concentraciones de nutrientes presentes
en el medio, de forma que la concentración añadida sea ligeramente
inferior o igual al 10% de la concentración de nutriente presente en el
medio o sea ligeramente . En los casos en las concentraciones de NO3-,
NH4+ o urea se encuentren por debajo de los límites de detección, las
adiciones de los sustratos marcados isotópicamente se realizarán para
alcanzar concentraciones finales de 0.05 μM en las botellas de
incubación.

Incubaciones
Las incubaciones se realizarán en la cubierta del buque, en los 4
incubadores que se instalarán como se ha descrito anteriormente en el
protocolo para la fijación de 15N2. Cada incubador se utilizará para
realizar los ensayos correspondientes a una determinada profundidad
de muestreo y e irá dotado del filtro de densidad neutra adecuada
para simular las condiciones de luz a cada una de las profundidades.

Filtraciones
Tras finalizar el periodo de incubación el contenido de las botellas será
filtrado a través filtros Whatman GF/F de 2.5 cm, que habrán sido
precalcinados a 450ºC durante 4 horas. Tras las filtraciones, los filtros
serán lavados un par de veces con agua de mar filtrada (GF/F), para
eliminar posibles trazas de los sustratos marcados isotópicamente. Los
filtros serán tratados de forma similar a la descrita para al fijación de 15N2
y se almacenarán hasta su envío para análisis a los Servicios

205
Centralizados de Apoyo a la Investigación de la Universidad de La
Coruña.
10. Cuadro sinóptico de la técnica
Muestreo:

Botellas Niskin

Bidón
30 L

Bidón PET
30 L

15NO3 15NH4 15urea 15N2 NOP nutrientes

Para NOP se tomarán 2 réplicas para cada muestra

206
FILTRACIÓN:

Secar en estufa
60ºC, 24 h
Lavado de filtros
Filtración, GF/F 25 mm Ø con agua de mar filtrada (GF/F)

Cerrar herméticamente
y guardar

11. Calculo de los resultados.

Consumo de 15NO3-, 15NH4+ y 15Urea


Las tasas de incorporación de 15NO3-, 15NH4+ y 15urea serán calculadas
usando las ecuaciones de Dugdale y Wilkerson (1986). Las tasas de
consumo NH4+ serán corregidas para tener en cuenta el efecto de la
dilución isotópica debido a la regeneración de NH4. Para ello se
emplearan las ecuaciones de Kanda et al. (1987). La f-ratio (Eppley y
Peterson, 1979) será calculada a partir de esos valores.

Fijación de 15N2
El enriquecimiento inicial en 15N (% en átomos) del N2 contenido en la
muestra tras inyectar el 15N2 se calculará para cada botella (teniendo en
cuenta el volumen de 15N2 añadido y el volumen de la botella de
incubación). Para ello se utilizará la ecuación de Weiss (1970)
(considerando que el N2 presente en la muestra se encuentra en
equilibrio con la atmósfera). El enriquecimiento en 15N del nitrógeno
orgánico particulado en la muestra al final del experimento y las tasas
de de fijación de 15N2 por la comunidad se estimarán aplicando las
ecuaciones de Montoya et al. (1996).
Para obtener mejores resultados es necesario conocer el volumen
exacto de las botellas y la temperatura del agua. Las botellas
empleadas para las incubaciones se identificaran con el fin de tener en
cuenta el volumen de cada una de ellas en los diferentes experimentos
y se tomará nota de las mismas. Para tener en cuenta el volumen de
cada botella, durante el muestreo de agua para los ensayos de fijación
de 15N2, será además necesario medir la temperatura del agua de mar

207
en cada uno de los bidones tras tomar las muestras para las
incubaciones con 15N2.

12. Control de calidad

Utilizar guantes desechables en todo el proceso de muestreo,


incubaciones y filtrado y guardar la máxima precaución para evitar
posible contaminación de las muestras de cualquier tipo de fuente,
incluyendo contaminación por 15N entre muestras.

Para estimar el enriquecimiento inicial en 15N del NOP hay que emplear
otro sistema de filtración distinto del utilizado para las muestras tratadas
con marcadores isotópicos. Además conviene mantener este sistema lo
más alejado posible del sistema de filtración de incubaciones
(enriquecido en 15N) para evitar cualquier contaminación de las
muestras. Cambiar de guantes si se van a manipular muestras después
de haber manipulado patrones o muestras marcados con 15NO3-, 15NH4+
o 15urea.

Una vez finalizado el muestreo y las incubaciones es necesario llevar a


cabo la limpieza de todo el material empleado en las mismas. Todos los
bidones y botellas empleados, así como el material usado (embudos,
redes, tubos de silicona, etc) deberán ser tratados con HCl diluido y
posteriormente lavados varias veces con Elix y finalmente 2 veces con
agua MilliQ., de forma que puedan emplearse en siguientes estaciones
de muestreo. Utilizar guantes desechables durante la limpieza del
material. Durante el tiempo que
Con respecto a los bidones donde se homogeneizarán las muestras de
agua de mar procedentes de una misma profundidad, es necesario
que una vez se finalice el muestreo estos se limpien adecuadamente
con ácido diluido, seguido de numerosos lavados con agua destilada
(entre lavado y lavado intentar evacuar toda el agua posible de los
bidones). Finalmente se lavarán un par de veces con agua MilliQ. Una
vez limpios los bidones sean cerrados, protegiéndolos adecuadamente
de posible contaminación, particularmente la boca y los grifos de los
bidones (p. ej. Con parafilm y cubriéndolos con bolsas de plástico, etc).
En el caso de los grifos conviene retirarlos, limpiarlos bien y guardarlos en
una bolsa limpia de tipo Zip. En su lugar colocar los tapones que traen
los bidones originalmente (los cuales deberán haber sido tratados
también con HCl), de esa forma se evita que durante el tiempo que no
estén en uso los bidones, los grifos puedan contaminarse, sufrir golpes, e
incluso romperse. También es conveniente trincar los bidones a los
soportes cuando éstos no se estén utilizando, para evitar que puedan
salir rodando, sufrir daños y puedan contaminarse.

208
13. Referencias

Capone DG, Montoya JP (2001) Nitrogen fixation and denitrification. In:


Methods in Microbiology. Vol. 30 Marine Microbiology, pp 501-515.
Ed. Paul JH,. Academic Press
Dugdale RW, Wilkerson FP (1986) The use of 15N to measure nitrogen
uptake in eutrophic oceans: experimental considerations. Limnol.
Oceanogr. 12:196-206.
Dugdale, R.C., Goering, J.J. (1967) Uptake of new and regenerated
forms of nitrogen in primary productivity. Limnol. Oceanogr. 12:196-
202.
Eppley RW, Peterson (1979) Particulate organic matter flux and new
production in the deep ocean. Nature 282: 677-680.
Kanda J, Laws EA, Saino T, Hattori A, (1987) An evaluation of isotope
dilution effect from conventional data sets of 15N uptake
experiments. J. Plank. Res. 9(1):79-90.
Montoya JP, Voss M, Kähler P, Capone D (1996) A simple, high-precision,
high sensitivity tracer assay for N2 fixation. Appl. Environ. Microbiol.
62(3):986-993.
Raimbault P, Garcia N (2007) Carbon and nitrogen uptake in the South
Pacific Ocean: evidence for efficient dinitrogen fixation and
regenerated production leading to large accumulation of dissolved
organic matter in nitrogen-depleted waters. Biogeosciences, 4: 3531–
3579
Weiss RF (1970) The solubility of nitrogen, oxygen and argon in water and
seawater. Deep-Sea Res. 29:459-469.
Zehr JP, Waterbury JB, Turner PJ, Montoya JP, Omoregie E, Steward GF,
Hansen A, Kart DM (2001) Unicellular cyanobacteria fis N2 in the
subtropical North Pacific Ocean. Nature 412:635-638.

209
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo

2. Título de la técnica
Muestreo de metales y vitaminas disueltas

3. Autores del documento y filiación


Antonio Tovar Sánchez. Departamento de Investigación del Cambio
Global, IMEDEA (CSIC-UIB)
Sergio Sañudo-Wilhelmy. Department of Biological Sciences and
Department of Earth Sciences. University of Southern California, USA.

4. Finalidad. Campo de aplicación


Colección de muestras de agua para la determinación de las
concentraciones de
Metales (e.g. Fe, Co, Cu, Pb), y vitaminas (e.g B12, B1) disueltas.

5. Conceptos generales
Tantos los metales traza como las vitaminas juegan un papel
fundamental en los procesos biogeoquímicos relacionados con la
producción primaria oceánica.
Su distribución y disponibilidad son clave para entender el papel que
juega en el funcionamiento de los océanos.

6. Equipamiento necesario
Para el muestreo de agua superficial usaremos el sistema de torpedo
(Figura 1), compuesto por:
- Compresor
- Bomba de diafragma de aire comprimido
- Manguera con tubo de teflón en su interior
- Torpedo

Figura 1. Sistema de torpedo

210
7. Reactivos u otro material fungible
El resto de material necesario para el muestreo consta de (Figura 2):
- Botellas de plásticos (LDPE) de 0.5 L
- Botellas de plástico opacas de 2 L
- Cartuchos de filtración
- Guantes de plástico
- Acido clorhídrico 0.5 N.

Figura 2. Material fungible

8. Descripción de la Técnica

A). Montaje del sistema (VER VIDEO): todo el sistema debería montarse
en la cubierta de proa 10 minutos antes de la hora prevista para el
muestreo. Un extremo del tubo de teflón (ubicado dentro de la
manguera) se encuentra ya conectado al torpedo mientras que el otro
debe conectarse a la bomba de diafragma. Mediante una manguera
de alta presión se conecta la bomba de diafragma al compresor y el
compresor a la corriente eléctrica.

B). Operación de despliegue y inmersión del torpedo: La cabeza del


torpedo se engancha al grillete de la grúa de proa mediante un cabo
de 2 metros de longitud (el cabo evita que el gancho de la grúa toque
y contamine el torpedo). La grúa con su máxima extensión saca el
torpedo por la banda de estribor, alejándolo lo máximo posible del
barco, y sumergiéndolo hasta 1-2 metros de profundidad (Figura 3).

Nota: durante su almacenaje la punta del tubo de teflón suele llevar


una caperuza (tubo de goma) para evitar que entren partículas en el
tubo y se contamine. Asegúrate de quitar esa caperuza antes de lanzar
el torpedo y volver a ponerla una vez finalizado el muestreo.

211
Figura 3. Momento de despliegue del torpedo.

Figura 4. Operación de muestreo de agua

C). Muestreo: Una vez el torpedo está en el agua, el barco debe


navegar entre 2-5 nudos, asegurándonos que el torpedo navega
paralelo al barco sin salir del agua. Se enciende el compresor y una vez
cebado el tubo (puede tardar unos 60-90 segundos) comienza a salir
agua por la bomba. Antes de conectar el cartucho de filtración es
necesario reducir la presión de salida del agua mediante el regulador
del compresor. Una vez fluya el agua y conectado el cartucho de

212
filtración, se deja transcurrir unos 3 minutos antes de llenar las botellas
con la muestra (Figura 4).
Para minimizar la posibilidad de contaminación, el muestreo lo
deberían de realizar siempre dos personas. Una persona (“manos
sucias”) manipula el compresor y abre las bolsas donde se encuentran
las botellas de muestreo, en ningún caso se debe tocar la botella de
muestreo sin guantes. La otra persona (“manos limpias”) siempre
provisto de guantes de plástico llena las botellas y sujeta el filtro. Si por
cualquier razón tocase con los guantes alguna superficie del barco o
material que no estuviese limpio con ácido deberá cambiar de guantes.
Las botellas se enjuagan 3 veces y se llenan (Figura 5). En cada estación
se muestrearán 2 botellas, una de 0.5 L traslúcida para el análisis de
metales y otra de 2 L opaca para el análisis de vitaminas.
Nota: las botellas de 2 L opacas se almacenarán congeladas por lo que
no deben llenarse completamente.

Figura 5. Muestreo de agua (sin filtrar).

D). Almacenamiento: Las botellas de 0.5 L para el análisis de metales son


almacenadas y transportadas en doble bolsa Zipblock (usar las mismas
en las que viene cada botella), guardas en doble bolsa de plástico
negra en el interior de un baúl de plástico.
Las botellas de 2 L para el análisis de vitaminas deben ser almacenadas
y transportadas congeladas, por lo que las botellas se almacenarán en
un baúl de plástico que se ubicará en el interior de la cámara
congeladora del Hespérides.

213
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo, Procesado de muestras y Técnicas analíticas

2. Titulo de la técnica

Sistema para el análisis en continuo de la razón 13C/12C y


concentraciones del CO2 atmosférico y del DIC marino.

3. Autores del documento y filiación

Delgado, A. y Granados A. Laboratorio de Biogeoquímica de Isótopos


Estables. Instituto Andaluz de Ciencias de la Tierra (CSIC), Armilla,
Granada.

Duarte, C. IMEDEA (CSIC), Esporles, Mallorca.

4. Finalidad. Campo de aplicación

Analizar las razones isotópicas 13C/12C del CO2 atmosférico y disuelto


en el agua (parte del DIC) con el fin de monitorizar los flujos de carbono
entre la atmosfera y el océano, y la evolución de la actividad
fotosintética en el medio marino a escala de minutos. Además el
sistema mide la concentración de CO2 con una precisión de <200 ppbv
(12C) y <10 ppbv (13C). Los campos de aplicación serían estudios de flujos
de carbono, estudios del Cambio Global, de la biogeoquímica de los
océanos y de la atmosfera, etc.

5. Conceptos generales

Antes de la revolución industrial la concentración del CO2 en la


atmosfera estaba entorno a 280 ppmV y ahora tenemos unos 385
ppmV. Pero además como el carbón y el petróleo tienen valores
relativamente negativos en δ13C -30 ‰ (V-PDB) frente a los típicos
valores pre-industriales de (-6,5 ‰ vs V-PDB), la contaminación antrópica
ha dado lugar a una atmosfera con valores δ13C cada vez mas
negativos (Efecto Suess), rondando en la actualidad un -8,5 ‰ (V-PDB).
Esta señal se está reflejado en el medio marino. Por otra parte, la propia
actividad fotosintética del fitoplancton, la respiración, etc. dejan una
señal isotópica en el DIC (Dissolved Inorganic Carbon) marino que se
podrá monitorizar con este sistema.

6. Equipamiento necesario

-El G1101 Picarro-i es un analizador en tiempo real que permite


monitorizar tanto la concentración ambiental de CO2 en partes por

214
millón (ppmv), como las razones isotópica del carbono (13C/12C). El
equipo está basado en una técnica espectroscópica novedosa que
analiza el espectro de absorción de la molécula de CO2 cuando incide
un láser infrarrojo cercano. Esto permite analizar la concentración y la
composición isotópica con una gran precisión y sensibilidad, ya que no
interfieren otras especies gaseosas. Además el sistema guarda
automáticamente y periódicamente los datos en el disco duro interno
(Fig. 1).

Sistema de 5 vías para


calibración y
entrada de muestra

gases
calibración

Sistema láser Bomba de vacío


Picarro

Figura 1: Imagen general analizador y sistema calibración.

- Sistema automático de calibración con 5 vías de entrada que permite


programar que gas entrará en cada momento (Fig. 1). Esto facilita la
calibración periódica del equipo con aire de concentración y
composición isotópica conocida (se conectarán dos botellas con
concentraciones de 250 y 500 ppm), pero además dispone de otras tres
vías que permiten la entrada de aire atmosférico o aire que ha
recirculado por le minimodulo (sistema de intercambio de CO2 con el
DIC del agua marina procedente del continuo del Hesperides).

215
-bomba de membrana (A), que nos ayuda a tomar la muestra del aire
atmosférico (la toma esta en la cubierta superior del Hesperides, junto a
la sala de mandos) introducirla en el sistema de calibración, y este a su
vez introducirá en el sistema la muestra o los gases estándar que nos
permiten calibrar el equipo. Esta bomba funciona de forma continua.

-bomba de membrana (B), se encarga de recircular el aire que están en


contacto con el minimodulo intercambiador de CO2. Esto permite que
la respuesta sea casi inmediata en el tiempo, de modo que cuadno el
barco atravieses aguas de concentración de CO2 y/o composición
isotópica diversa sean detectadas sin una deriva de tiempo importante.
Esta bomba funciona de forma continua.

- Minomodulo intercambiador de aire con el continuo (Fig. 2). El agua


del “continuo” del Hespérides se hace pasar por un sistema de
membranas que, gracias su gran superficie específica, permite el
intercambio rápido y eficiente entre los gases disueltos en el agua y el
aire. Por tanto, analizando el aire se obtiene una estima de la
concentración y composición isotópica de los gases disueltos en el
agua.

- Trampa desecante. Los componentes internos del G1101 Picarro-i no


deben estar expuestos a la humedad. Sin embargo, la corriente
continua de aire (circuito cerrado) que constantemente esta
equilibrando con los gases disueltos presentes en el agua marina
procedente del “continuo” está saturada en humedad, por lo que se
coloca esta trampa intermedia (Fig. 2) antes de su entrada en el G1101
Picarro-i.

216
Trampa desecante

Minimodule

Figura 2: detalle de la trampa para eliminar la humedad y del sistema


intercambiador de gases (Minimodule).

7. Reactivos u otro material fungible

- gases de calibración de concentración y composición isotópica


conocida.
- desecante con indicador (puede ser reactivado mediante
calentamiento en estufa a 110ºC).
- 100 metros de tubo de poliuretano de 6 mm.
- Juntas rápidas y conexiones para tubo de poliuretano de 6 mm.
- Bomba de membrana para el sistema de entrada de muestra.

8. Descripción de la Técnica

El sistema quedará montado antes de la expedición de


circunnavegación Malaspina, y se dejará funcionando
automáticamente. El equipo consta de los siguientes instrumentos (ver
figura 1):

- El analizador láser.
- Ordenador y equipo de control.
- Pantalla.
- Sistema de Calibración.

217
- Bomba entrada de muestra.
- Gases de Calibración.
- Minimodule
- Trampa desecante
- Bomba para recircular el aire con el sistema minimodule

El sistema debe de ir montado tal como se observa en las figura 1


y 3, el ordenador debe de ir debajo, y encima el analizador láser.

Para completar todo el montaje del sistema vamos a seguir los


siguientes pasos:

- 1º Debemos de conectar el cable de alimentación, que


conectaremos a la corriente eléctrica al final del proceso de
montaje (ver figura 3).

- 2º Conectamos también el ratón, el teclado, y cable de


transmisión con la pantalla, a la que previamente le hemos
conectado el cable de alimentación, que solo conectaremos a la
corriente eléctrica al final del proceso de montaje (ver figura 3).

CABLE DE ALIMENTACIÓN

RATÓN
TECLADO

PANTALLA

Figura 3: Conexiones básicas del ordenador

218
- 3º Conectaremos el analizador con el ordenador mediante los
siguientes cables, el cable que nos transmite los datos del
analizador al ordenador, la toma de distribución de corriente
entre los dos aparatos, y por último la conexión de la bomba de
vacío con el analizador (Ver figura 4).

- 4º En este lugar, debemos de conectar la salida de gases del


sistema de calibración (out) con el analizador en la posición
(inlet). El sistema está diseñado para conectarlos con tubo de
poliuretano y con juntas rápidas. Debemos de conectar también
el cable RS232 que hace que nuestro programa controle el
sistema de calibración. (Ver figura 5)

- 5º Debemos de conectar la bomba de entrada de muestra, que


nos introduce el gas en el sistema, a través del tubo que esta
conectado hacia el exterior del barco, y la salida la conectamos
al sistema de calibración, en la posición de entrada 3(In 3) (Ver
figura 6 y 8). Este tubo esta conectado a través de una llave en
forma de T, con salida directa a la calle, para evitar sobre
presiones en el aparato. El sistema de calibración toma
automáticamente la alícuota de muestra.

CONEXIÓN BOMBA VACIO


CON ANALIZADOR

SALIDA DATOS ANALIZADOR


AL ORDENADOR

DISTRIBUIDOR CORRIENTE

Figura 4: Conexiones entre los dos sistemas

219
SISTEMA ESTÁNDAR
CALIBRACION GAS

CABLE CONTROL
SISTEMA CALIBRACION

Figura 5: Conexiones sistema de calibración.

ENTRADA AL
SISTEMA DE
CALIBRACION

ENTRADA MUESTRA

SALIDA LIBRE PARA


EVITAR SOBREPRESION SALIDA AL SISTEMA
DE CALIBRACION

Figura 6: Conexiones bomba entrada muestra.

220
- 6º Conectamos cada una de los estándar al sistema de
calibración. Las botellas de los gases estándar, que tienen
concentración y valor isotópico conocido están numeradas del 1
al 2, y debemos de conectarlas mediante los tubos de poliuretano
a las juntas rápidas del sistema de calibración, marcadas como IN
y con números que también van del 1 al 2. Debemos de abrir las
botellas, y asegurarnos que la presión en los reguladores es de 0.5
bares. (Ver figura 7
- 7º Conectamos el circuito de aire atmosférico en la posición “In”
3, tal como se indica en la figura 8.
- 8º Conectamos el circuito cerrado del Minimodule en la posición
“In” 4, tal como se indica en la figura 9.
- 9º Por último, enchufamos el analizador, la bomba de muestreo y
la pantalla a la corriente eléctrica, y nos aseguramos que todos
están en su posición de encendido. El analizador comenzara a
funcionar automáticamente, transcurridos unos minutos desde
que lo conectamos. Y el operario solo tiene que actuar para abrir
la ventana “tools” del programa, seleccionar la ventana “open
valve sequencer Windows”, cargar la secuencia numero 1, y
presionar la ventana “disable sequencer”, de este modo el
sistema comenzara automáticamente a tomar muestras y
estándar según la secuencia que tenemos programada.
Finalizamos la operación con una minimización de la ventana,
para poder ver el grafico que nos muestra los resultados en
tiempo real.

221
1 2

PRESIÓN DE SALIDA MEDIDA CONCENTRACION E


0.5 BAR. ISOTOPICA EN TIEMPO REAL

Figura 7: Conexiones estándar de calibración al sistema

Sistema calibrador Tubo de entrada de aire


y de ingreso de muestra que tiene su toma en las proximidades
de la sala de mando (cubierta superior)

“T”
“In-

Salida ESQUEMA TOMA DE


MUESTRAS DE AIRE
ATMOSFERICO

Figura 8: Esquema de toma de muestras de aire.

222
Sistema calibrador
y de ingreso de muestra

“T”
“In-
Continuo desagüe

ESQUEMA TOMA DE Circuito


MUESTRAS DEL Cerrado
CIRCUITO CERRADO con el
CON EL Minimodule
MINIMODULE

Figura 9: Esquema de toma de muestras de aire en equilibrio con el


Minimodule.

9. Calibración

Hemos diseñado un sistema de calibración y admisión de muestras que


permite controlar en que tiempos el gas que ingresa en el sistema láser
es un patrón o una muestra, y dentro de estas si es aire atmosférico o
aire procedente del minimodule. A posteriori, los datos serán tratados
adecuadamente para obtener las rectas de calibrado periódicas que
nos den unos buenos resultados definitivos, tanto de concentración
como de valor isotópico conocido.

Las botellas de los gases estándar, están numeradas del 1 al 2, y


debemos de conectarlas mediante los tubos de poliuretano a las juntas
rápidas del sistema de calibración, marcadas como IN y con números
que también van del 1 al 2. Debemos de abrir las botellas, y asegurarnos
que la presión en los reguladores es de 0.5 bares. (Ver figura 7)

223
10. Cuadro sinóptico de la técnica

El analizador esta diseñado para funcionar automáticamente, por lo


que no requiere de la intervención del usuario, se pone en marcha en
cuestión de minutos y solo se requiere la intervención de un usuario, si se
produce un fallo o desconexión de la electricidad. En ese caso, el
usuario debe de hacer las siguientes cosas:

- En primer lugar, encender el aparato y esperar unos


minutos, porque automáticamente se carga el programa
de adquisición de datos.

- En segundo lugar, comprobar que también está


encendida la bomba de entrada de muestra (Ver figura 1).

- En tercer lugar, comprobar que las válvulas reguladoras de


presión de los gases de calibración marcan 0.5 Bar (Ver
figura 7).

- En cuarto lugar, abrir la ventana “tools” del programa, y


seleccionar la ventana “open valve sequencer windows”
(ver figura 10)

224
Figura 10: Ventana para abrir el sistema de calibración.
- En quinto lugar, cargar la secuencia número 1, que es la
que tenemos predefinida para esta expedición
oceanográfica (ver figura 11), y por ultimo marcar la
ventana “disable sequencer”, para que la secuencia se
ponga en marcha. (Atención, en la figura 11, los tiempos
no coincidirán con los que aparezcan en el momento de
la expedición, ya que esta foto es de otro experimento de
calibración).

Figura 11: Válvulas de control del Sistema de calibración.

- Para finalizar, minimizar la pantalla “valve sequencer”,


para poder ver cómodamente la pantalla principal del
programa, con los gráficos y los valores correspondientes a
las medidas en tiempo real.

11. Datos

El sistema almacena automáticamente los datos medidos en el


disco duro, y una vez en tierra, analizaremos los resultados obtenidos
para la concentración de CO2 y el valor isotópico del carbono, que irán
correlacionados con la derrota que lleve el barco en todo momento.

225
Estos resultados serán corregidos con las rectas de calibrado que el
sistema realiza diariamente.

Periódicamente (cada semana) se realizarán copias de seguridad en un


disco duro externo mediante uno de los conectores USB que tiene el
ordenador del sistema (basta copiar los ficheros del disco duro del
ordenador).

226
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Titulo de la técnica

Extracción de gases disueltos y su almacenamiento para análisis


isotópico.

3. Autores del documento y filiación

Delgado, A. y Granados A. Laboratorio de Biogeoquímica de Isótopos


Estables. Instituto Andaluz de Ciencias de la Tierra (CSIC), Armilla,
Granada.

4. Finalidad. Campo de aplicación

Método de extracción de gases permanentes (O2, Ar, N2, metano) y


algunos compuestos considerados como VOC (Volatil Organic Carbon),
y su almacenamiento en viales perforables de 10 ml (Fig. 1). La finalidad
principal más que en un estudio cuantitativo esta centrada en obtener
cantidad suficiente de gas para su análisis isotópico (18O/16O, 15N/14N,
13C/12C en metano y VOC). Los campos de aplicación son el estudio de

diversos procesos biogeoquímicos que ocurren el océano.

Fig. 1 Esquema de la botella de muestreo de gases. Gracias a la


aplicación simultanea de vacío y ultrasonidos, los gases se acumulan en
un vial perforable que permite la recuperación de estos.

227
5. Conceptos generales

La técnica clásica normalmente usada para la extracción de gases


implica el transporte de botellas de Pirex de 300 ml que cuentan con
llaves especiales (tipo Louwers-Hapert) para soportar el vacío estático.
Estas ampollas se llenan con 150 ml de agua, de modo que los gases
disueltos se expanden a los otros 150 ml gracias al vacío existente. Sin
embargo, el coste de este tipo de ampollas y el propio sistema de
preparación de muestras limita su uso a perfiles concretos o a muestras
esporádicas en campañas oceanográficas cortas. Durante los últimos
años, se ha comenzado a usar el sistema de “espacio de cabeza” en
viales de 20 a 120 ml, lo que permite analizar la composición isotópica
de los gases que se encuentran en mayores concentraciones, pero
tienen un uso limitado para metano o VOC.

Con objeto de obtener una mayor cantidad de gas, se ha diseñado


para esta campaña botellas de uno y dos litros, que permiten extraer los
gases disueltos mediante el uso combinado de vacío y ultrasonidos, y
almacenarlos en viales de 10 ml. Este sistema tiene la ventaja de que se
libera la botella para un nuevo muestreo, lo que permite la preparación
de un mayor número de muestras. Con esta técnica se pretende extraer
cantidades suficientes de los llamados gases permanentes (O2, Ar, N2,
metano) y algunos compuestos orgánicos gaseosos considerados como
VOC (Volatil Organic Carbon), para su posterior estudio isotópico. El uso
combinado de ultrasonidos y vacío ya ha dido usado con éxito para la
extracción de metano en agua marina (Smith et al., 1991) y, en general,
la agitación y, específicamente, el uso de ultrasonidos facilita la
liberación de los gases disueltos.

La mayor ventaja, es que al partir de una mayor cantidad de agua, 1 o


2 litros, frente a los 150 ml de las técnicas convencionales, se obtiene
una mayor cantidad de gas. Lo que puede resultar espacialmente útil
para el análisis isotópico (18O/16O, 15N/14N, 13C/12C) de algunos
compuestos como metano y VOC.

6. Equipamiento necesario

- Botella de vacío modificada (ver Fig. 1 y 2)


- Tubo de silicona
- Viales perforables de 10 ml
- Jeringa de 60 ml

228
- Jeringa de 15 ml
- Agujas con doble punta
- Agujas 20 G

Fig. 2 Botella usada en la campaña de intercalibración Malaspina en


mayo de 2010. Tras realizar una depresión de 50 ml con la jeringa, se
cierra la llave amarilla, de modo que en la botella queda una
depresión que da lugar a que los gases disueltos se acumulen en la
parte superior (donde se encuentra un vial perforable que permite su
recuperación), proceso que se acelera con un tratamiento de
ultrasonidos.

7. Reactivos u otro material fungible

Agua miliQ (desgasificada), agujas, jeringas, viales

229
8. Calibración

La técnica se calibra en laboratorio partiendo de gases cuya


composición isotópica es bien conocida y sometiéndolos al mismo
proceso.

9. Descripción de la Técnica

Consideraciones previas

La toma de muestras para el estudio isotópico de gases debe ser una


de las primeras, ya que los gases a medida que pasa el tiempo y con el
incremento de temperatura pueden migrar a la parte superior de la
botella Niskin. En cualquier caso, debería tomarse antes de que la
botella Niskin se vacíe hasta su mitad.

Previamente se deben preparar viales, etiquetas, etc. y tener disponible


un par de litros de agua miliQ ya desgasificada (con el mismo
procedimiento que se describe más adelante). De modo que no se
pierda tiempo y, una vez recogidas las muestras, se pueda actuar con
la máxima celeridad en su preparación.

Toma de muestra

1.- Llenar la botella mediante un tubo de silicona que vierta el agua de


la botella Niskin directamente en el fondo, para así evitar que el agua se
agite lo menos posible (Fig. 3).

2.- En roscar el tapón (Bloque B, Fig. 3-1). El tubo unido al tapón con la
llave cerrada, este conjunto permanece lleno de agua. El vial de vidrio
pegado al tapón permanece abierto.

3.- Por el vial de vidrio se termina de enrasar el agua hasta el límite (Fig.
3).

4.- Se dan unos golpecitos a la botella contra el suelo de modo que se


libere cualquier burbuja que pueda haber quedado en el tapón al
cerrarse.

5.- Se enrasa de nuevo el vial y se cierra con firmeza, procurando que


no quede ninguna burbuja. El tapón del vial tendrá un solo uso y se
tirara después de todo el proceso.

6.- Guardar las botellas procedentes de cada una de las botellas Niskin
en cámara frigorífica, a unos 4 o 5 ºC, hasta que le llegue el turno de la
extracción de los gases.

230
7.- Se procederá a la extracción de los gases de forma inmediata.
Comenzando por las aguas más superficiales.

Extracción de los gases

8.- Con ayuda de la jeringa se extraen 50 ml de agua, lo que esta


provocando una depresión equivalente dentro de la botella.
Inmediatamente, cerrar la llave con la situación de la otra mano
haciendo la depresión de 50 ml (Fig. 4).

9.- Una vez cerrada la llave existe una depresión de 50 ml en la botella,


por lo que se aprovecha para dar una tanda de 5 minutos de
ultrasonidos. Se observará que rápidamente aparecen las burbujas
adheridas a las paredes (Fig. 5).

10.- Una vez finalizada la primera serie de ultrasonidos, se retira la botella


y, sobre la mesa de laboratorio, se dan unos golpecitos para acumular
las burbujas pequeñas en una gran burbuja en la parte superior que se
conducirá hasta el vial pegado al tapón.

11.- Se extrae la burbuja con la ayuda de una jeringa de 15 ml que esta


llena de agua miliQ, previamente desgasificada con el mismo método.
El proceso consiste en inyectar agua para así facilitar la extracción del
gas acumulado hacia la misma jeringa (Fig. 6). Dejar una pequeña
cantidad de agua (0,5 o 1 ml) en la jeringa para que constituya una
barrera entre el gas acumulado en la jeringa y el aire exterior (para
evitar visualmente que se produzca cualquier contaminación).
Precaución: procurar que la aguja de la jeringa este firmemente unida a
ella, ajustarla bien antes de realizar todo el proceso.

12.- Inyectar el gas que se ha recuperado con la jeringa en un vial de 10


ml que contiene agua miliQ (previamente desgasificada). Para ello se
perfora el tapón con una aguja (mantener desde ese momento el vial
boca abajo en todo momento), de modo que al inyectar el gas
contenido en la jeringa se salga el agua del vial por sobrepresión.
Cuando quede aproximadamente 0.5 ml de agua se retira
cuidadosamente la aguja (con el tapón aun boca abajo); y se procede
a rellenar el siguiente vial (si es que se ha recuperado más gas de la
botella). IMPORTANTE: la aguja que atraviesa el vial (dedicada a
expulsar el agua) nunca puede estar en contacto con el gas (ya que
comunicaría el gas extraído con el aire de la calle, contaminando la
muestra), siempre debe permanecer en la parte líquida, de modo que
el gas se acumule por encima del agua, y esta constituya su aislante.

13.- Cuando se recupere todo el gas de la botella, se repite el


procedimiento una o dos veces mas desde el paso 8. Generando de

231
nuevo una depresión de 50 ml, se aplican ultrasonidos, etc.
Normalmente, a la tercera vez ya costará bastante obtener más gas por
lo que termina el proceso.

14. Normalmente, de un litro se obtiene un solo vial de 10 ml. Pero si la


cantidad de gas disuelto es mayor se pueden llenar hasta 3 viales. A
cada vial, además del etiquetado correspondiente a la botella Niski en
cuestión, se le añadirá el sufijo “1” si fue el primero en llenarse, “2” si fue
el segundo, etc.

15. Los viales se almacenan boca abajo, de modo que el agua quede
en contacto con el tapón. En ambiente oscuro y en cámara fría.
Debido a que el ambiente será mas frío, y se contrae el pirex y los gases,
es conveniente una vez retirada la aguja que desagua el vial, terminar
por inyectar 0,5 ml más de gas de modo que exista una pequeña
sobrepresión. Añadir para su conservación 10 microlitos de solución
saturada en HgCl.

232
10. Cuadro sinóptico de la técnica

Se resumen 8 pasos importantes a seguir:

1 2 Botella
Niskin

Botella
Niskin

Bloque
B

Tapón del vial

Bloque A

Fig. 3 Esquema de los pasos a seguir. (1) llenar la botella colocando el tubo de silicona
en el fondo para evitar la agitación del agua. (2) Una vez llena la botella colocar el
bloque B (todo el circuito esta lleno de agua, al estar la llave cerrada no se pierde ni
acumula aire en el tubo). Cerrar con firmeza el tapón de la botella (después se hará
vacío y se debe impedir la entrada de aire). Terminar de rellenar el vial, evitando que
quede burbuja. No debería quedar aire, pero es conviene dar unos golpecitos y girar
por si queda alguna burbuja, para que salga. En ese momento incluso se pude perder
algún gas (sobre todo de aguas profunda que viene con mas presión), pero es
preferible perder alguna burbuja a que quede aire ocluido en el tapón.
Alternativamente, se puede llenar la botella desde el inicio, colocando el tubo de
silicona que viene de la botella Niskin en el lugar de la jeringa.

233
3 4 5 minutos ultrasonidos

Baño
Ultrasonidos

Fig. 4 Esquema de los pasos a seguir. (3) Con ayuda de la jeringa de 60 ml se genera
vacío en la botella. Para ello se abre la llave amarilla y la jeringa se expande hasta los
50 ml (cuesta trabajo), en ese momento, y sin relajar la jeringa, se cierra la llave
amarilla. De ese modo se ha generado un vacío en la botella, que da lugar a que el
gas disuelto en el agua se libere formando burbujas que obviamente tienden a ir para
arriba y acumularse en el vial perforable. (4) Acto seguido se introduce la botella en el
baño de ultrasonidos y se sonica durante 5 minutos. Tras este paso aparecerán muchas
más burbujas.

234
Burbujas de gas

Fig. 5 Tras el tratamiento con ultrasonidos aparecen numerosas burbujas. Estas deben
conducirse girando la botella (y dando algunos golpecitos) hacia el vial perforable.

5 Los gases disueltos se van acumulando en el vial

A B C

Fig. 6 Tras el tratamiento con ultrasonidos aparecen numerosas burbujas. Estas deben
conducirse girando la botella (y dando algunos golpecitos) hacia el vial perforable. A
los pocos segundos o minutos (según la practica del operador), se observa como el
gas liberado se concentra en el vial (tendencia A,B,C). Lo que permitirá su extracción
posterior.

235
Se inyecta agua 6
y se extrae el gas

A
B

8
C

Fig. 7 Una vez que el gas se ha llevado hacia el vial perforable, se extrae mediante una
jeringa de 15 ml (6). La jeringa se habrá llenado de agua miliQ ya desgasificada con
una botella similar. El proceso consiste en inyectar agua y cuando quede sobre 1 ml de
agua se extrae el gas. Previamente ya se habrá preparado un vial de 10 ml que esta
lleno de agua miliQ desgasificada (7). A continuación se inyecta el gas en el vial (8) lo
que da lugar a que se desplace el agua y se salgan tantos mililitros de agua como
mililitros de gas se han inyectado. Cuando la cantidad de gas disuelta es alta, puede
ser necesario llenar un segundo vial.

11. Cálculo de los resultados.

Los viales son pesados antes y después, por lo que se calculan


aproximadamente los ml de gas extraído. Pero como se ha indicado
anteriormente, esta metodología esta centrada en obtener muestras de
gas para su posterior análisis isotópico. Por lo que será ya en el
laboratorio cuando se apliquen diferentes metodologías (“purge and
trap”, espacio de cabeza estatico, solid-phase microextraction “SPME”,

236
etc.). para analizar las diferentes razones isotópicas que se pretenden
estudiar.

12. Control de calidad

Las botellas son muy duras (incluido el tapón de teflón) y especificas


para que aguanten vacíos superiores al que se aplicará, sin embargo el
tapón puede no apretarse adecuadamente, lo que se traduciría en que
continuamente se esta succionando aire atmosférico (y se obtienen
rendimientos de gas anormalmente altos). Ese seria el mismo caso de
que se abra algún canalículo que permita la entrada de aire por alguna
junta o por el vial perforable. Sin embargo, esos problemas suelen ocurrir
al inicio, en las primeras semanas de uso. Después solo hay que tener
precaución de no deteriorar la rosca del tapón. El resto de material es
fácilmente sustituible, jeringas, tubos, etc.

13. Referencias

Schmitt, M., Faber, E., Botz, R., Stoffers, P., 1991. Extraction of methane
from seawater using ultrasonic vacuum degassing. Analyt. Chem.
63:529–531.

237
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo, Procesado de muestras y Técnicas analíticas

2. Titulo de la técnica

Composición isotópica del vapor atmosférico.

3. Autores del documento y filiación

Granados, A. y Delgado, A.
Laboratorio de Biogeoquímica de Isótopos Estables
Instituto Andaluz de Ciencias de la Tierra (CSIC), Armilla, Granada

4. Finalidad. Campo de aplicación

Analizar la composición isotópica (D/H, 18O/16O) del vapor de agua


atmosférico. Los campos de aplicación son climatología,
paleoclimatología e Hidrología.

5. Conceptos generales

La mayor parte de las masas nubosas del planeta tienen su origen en la


evaporación de agua oceánica. A lo largo de de todo el ciclo
hidrológico desde la evaporación hasta la precipitación en diferentes
latitudes, los isótopos de ambos elementos están sujetos a los mismos
procesos físicos, por lo que el fraccionamiento isotópico de los isótopos
del oxígeno (18O, 17O, 16O) e hidrogeno (D, H) es paralelo, lo que da
lugar a que la composición isotópica el agua de precipitación de todo
el planeta suela adaptarse bastante bien a la siguiente ecuación:

δD = 8*δ18O + 10 (Craig, 1961)

El término independiente, se ha llamado exceso en deuterio “d” que


suele ser de +10 en la mayor parte de las aguas de precipitación. Sin
embargo, procesos de evaporación de aguas superficiales (lagos, ríos,
etc.) tiende hacia valores menores de 10 e incluso negativos cuando la
evaporación acumulada ha sido importante (Rozanski y Sonntag, 1982;
Schoch-Fisher et al 1994). Este parámetro también es importante para
seguir la trazabilidad del vapor de agua atmosférico y detectar su
origen transpiración de plantas, evaporación de aguas superficiales,
etc. (Moreira et al., 1997; Yepez et al., 2003). Finalmente, resulta también
muy importante para interpretar correctamente la información isotópica
de los sondeos de hielo de la Antártida y Groenlandia. De hecho, se
piensa que en el pasado en épocas glaciares, y dependiendo del
porcentaje de humedad sobre el medio marino, el exceso en deuterio
“d” pudo ser muy diferente del actual. Sin embargo, a pesar de su

238
importancia son pocos los trabajos en los que se ha medido la
composición isotópica del vapor atmosférico en el medio oceánico
(Craig y Gordon, 1965; He et al., 2001), de ahí el interés de incorporar a
la campaña Malaspina este tipo de análisis.

6. Equipamiento necesario

El DLT-100 es un nuevo sistema que permite analizar en tiempo real


tanto la concentración de vapor de agua atmosférico como las
proporciones isotópicas del oxígeno e hidrógeno del agua (Fig. 1).

El equipo está basado en una técnica novedosa que analiza el


espectro de absorción de la molécula de H2O cuando le hacemos
incidir un láser infrarrojo cercano. El gas es distribuido en una cavidad de
medición óptica y tiene un monitor de alta precisión para la longitud de
onda, lo que nos asegura un alto control en el espectro de absorción.
Este sistema ha sido complementado con un sistema automático de
calibración. Además el sistema guarda automáticamente y
periódicamente los datos en el disco duro interno.

El equipo esta conectado a un sistema de ingreso de muestra-


calibración que permite que entre en determinado momentos aire
atmosférico sobre el que se quiere medir la composición isotópica de su
vapor de agua, como vapor de agua procedente de los patrones. El
aire atmosférico ingresa constantemente desde la cubierta del
Hespérides mediante un bomba de membrana (Fig. 2).

7. Reactivos u otro material fungible

La técnica requiere para su correcto funcionamiento de patrones de


calibración de composición isotópica conocida. Estos patrones de
agua se han preparado en el laboratorio para que estén centrados en
el rango de valores que se espera para el vapor de agua atmosférico.

Además la técnica requiere el siguiente material fungible:

- Tubo de TEFLON-PFA 1´58 x 3´18 mm.


- Conexiones y racores swagelok para tubo (varias dimensiones).
- Septum TCS de 6 mm.
- Jeringas Hamilton 1.2 microlitros
- Agua destilada

239
AUTOMUESTEADOR

ANALIZADOR

SISTEMA
CALIBRACIO

Tubo de entrada de aire


Sistema calibrador que tiene su toma en las proximidades
y de ingreso de muestra del Puente de Mando (Cubierta Superior)

“T”
“In-

Salida ESQUEMA TOMA DE


MUESTRAS DE AIRE
ATMOSFERICO

Figura 1: Imagen general analizador y automuestreador, y


esquema del circuito para introducir aire atmosférico en el sistema.

240
8. Descripción de la Técnica

El sistema quedará montado antes de la expedición de


circunnavegación Malaspina, y se dejará funcionando
automáticamente. En cualquier caso, se detalla como montar el
sistema.

El equipo consta de los siguientes instrumentos (ver figura 1):

- El analizador láser DLT-100.


- Automuestreador TCT
- Sistema de Calibración y de ingreso de muestra.

Para completar el montaje del sistema vamos a seguir los


siguientes pasos:

- 1º Conectar el cable de alimentación del instrumento, y a su vez,


conectar la alimentación esclava de la bomba de alimentación.
(ver figura 2). Antes de enchufar a la corriente eléctrica que será
el último paso, asegurarse siempre de utilizar el selector de voltaje,
para seleccionar el voltaje de línea (115 V O 220 V).

- 2º Conectamos el tubo de teflón de 3/8” que comunica la


bomba de vacío con el Analizador LWIA en la posición “TO EXT.
PUMP”. Esta conexión debe de quedar estanca, para ello
utilizaremos la llave de ¼ -1/2 y dejaremos una separación inferior
de 3.5 mm. (ver figura 2).

- 3º Conectamos el desecador de gas compuesto por un bloque


relleno de drierita al analizador en la posición “DRY GAS INLET”,
usando el tubo de teflón adecuado, y la llave correspondiente de
¼ -1/2 y dejaremos una separación inferior de 3.5 mm. En el caso
de que en lugar de la trampra de drierita seleccionemos llevar un
tanque de nitrogeno seco, debemos de asegurarnos que la
presión de la bala no es superior a 0.5 bar. (Ver figura 3).

- 4º En este lugar, conectamos el cable calentador del bloque de


inyección, al analizador en la posición “TO HEATER”. Y
conectamos el tubo de teflón de 1/8” con filtro incorporado, entre
el analizador y el bloque calefactor, con la llave correspondiente
de 1/8” y dejaremos una separación inferior de 3.5 mm (Ver figura
4)

- 5º Por último, conectamos el cable RS232 que comunica el


analizador con el sistema de calibración.

241
TOMA
CORRIENTE

ALIMENTACIO
N BOMBA <3.5 mm

ANALIZADOR

BOMBA VACIO

Figura 2: Conexiones alimentación y vacío.

242
<3.5 mm

PRESIÓN DE SALIDA
0.5 BAR.

Figura 3: Conexión gas seco.

243
BLOQUE
CALEFACTOR

TUBO ENTRADA
MUESTRA

Figura 4: Conexiones del analizador y el inyector.

9. Calibración

La técnica requiere para su correcto funcionamiento de los patrones de


calibración de composición isotópica conocida. Al sistema de medida
le hemos añadido un sistema automático de calibración, ya descrito
detalladamente en el apartado anterior. Este sistema esta desarrollado
para introducir periódicamente alícuotas de patrones de valor isotópico
conocido; y a posteriori, los datos serán tratados adecuadamente para
obtener las rectas de calibrado periódicas que nos den unos buenos
resultados definitivos.

10. Mantenimiento

10. A) Cambio de septum y limpieza del tubo de inyección, y limpieza


de la jeringa de inyección (una vez a la semana):

Cambio de septum:

El septum del bloque del autoinyector, se cambia cada siete días. Es


MUY IMPORTANTE seguir exactamente estos pasos ya que en caso
contrario el equipo se averiará. El proceso a seguir es el siguiente:

244
- En la pantalla principal, aparece la tecla para poder
entrar en la pantalla de configuración para realizar el
cambio de septum. Para ello presionamos “SETUP”; y nos
aparece una nueva pantalla con un faldón, en donde
podemos ver la ventana “CHANGE SEPTUM”. (Ver figura 5 )

SETUP CHANGE SEPTUM

Figura 5: Pantalla de visualización para el cambiado de septum.

- Automáticamente nos sale una nueva pantalla, marcamos inicio


“initiate”, y esperamos que se nos ilumine la tecla “Ready for new
septum”, esto suele tardar unos cinco minutos, ya que es el
periodo en el que el analizador se pone a presión atmosférica y
pierde el vacío. (Ver figura 6)

INITIATE Ready for new septum

Figura 6: Pantalla de visualización para el cambiado de septum.

- Una vez que esta listo para cambiar el septum, debemos de


desenroscar la tuerca donde el septum está alojado. Debemos

245
de tener cuidado, pues la temperatura del bloque de inyección
es de unos 70°C. Eliminamos el antiguo septum, y colocamos uno
nuevo, asegurándonos que la cara del septum que tiene teflón,
queda mirando hacia la zona termica (para abajo). Para ello nos
vamos a ayudar de una aguja intercambiable, que usamos para
centrar el septum en su posición correcta. Una vez cambiado el
septum, colocamos la tuerca en el bloque calefactor y la
apretamos con firmeza, pero a mano, y sacamos y metemos
varias veces la jeringa, para asegurarnos que el septum queda un
poco perforado (facilita la entrada de la aguja fina y delicada de
la jeringa Hamilton de 1,2 microlitros). Aprovechando que hemos
quitado el septum, también vamos a realizar una limpieza del
bloque de grafito donde se produce la vaporización de la
muestra, para ello lo sacamos de su posición y lo limpiamos con
aire seco, por ultimo lo devolvemos a su posición original (Ver
figura 7).

CARA DE
TEFLON

Figura 7: Bloque inyector. Esquema para el cambiado de septum.

- Antes de finalizar el cambio de septum, y aprovechando que el


sistema ha perdido el vacío, procedemos a limpiar también el
tubo de muestra, que va desde el bloque inyector al analizador.
Para ello, desenroscamos el tubo de 1/8” con la llave

246
correspondiente, tanto del bloque inyector como del analizador
(incluyendo el filtro), inmediatamente, le ponemos el tapón al
analizador, para asegurarnos que no le entra porquería al sistema
durante nuestra operación de limpieza. Y a continuación,
limpiamos el tubo desde la posición del analizador, con el bote de
aire seco (Fig. 8). Por último, montamos de nuevo el tubo
(asegurándonos en todo momento que queda el sistema
estanco) y marcamos en el analizador el botón, “septum
cambiado”. Entonces, el instrumento vuelve a coger vacío,
operación que tarda unos cinco minutos aproximadamente.
Pulsamos aceptar para volver al modo de configuración y, por
último, pulsamos salir, para volver a la pantalla principal.

MUY IMPORTANTE PONER


TAPON SIEMPRE QUE SE
QUITA EL FILTRO

<3.5 mm

Figura 8: Esquema para limpieza tubo inyección mediante la botella de


aire seco.

Una vez que hemos finalizado este proceso, solo nos queda limpiar la
jeringa Hamilton de 1.2 microlitros, que es la que nos introduce las
muestras de los patrones de aguas en el sistema. Para ello, limpiamos la
aguja con agua destilada, moviendo y girando varias veces el barrilete
de la jeringa, y notaremos como se va desentrampando la misma con el

247
agua destilada. Si esto no ocurriera, podemos proceder a la limpieza de
la aguja con acetona, repitiendo la misma operación que con el agua
destilada, y terminando con una buena limpieza de agua destilada
para evitar la contaminación de la cámara de medida.

10. B) Ajuste del desplazamiento del láser (una vez a la semana):

Con el paso del tiempo, es probable que el láser se desplace y


descompense de su frecuencia, aprovechando que hemos parado la
secuencia de medida para limpiar el septum y el tubo de muestra, sería
conveniente comprobar que el láser está centrado. Aunque podemos
ver el espectro de absorción continuamente si en la pantalla principal
marcamos “spectrum”, aprovechamos los momentos que hemos
parado la secuencia para ajustarlo.

Para comprobar el ajuste del láser, marcamos la ventana “spectrum,” y


observamos el espectro de absorción de la molécula (ver figura 9). Si el
gran pico central del espectro de absorción se encuentra centrado en
el cuadro gris, no hay necesidad de ajustar el desplazamiento del láser.
Solo hay que ajustar el láser, si el pico central se ha desviado más de
0.25GHz., como se puede ver en la figura 9.

SPECTRUM

Figura 9: Pantalla de visualización del espectro de absorción.

Si es pico está desplazado como podemos ver en el ejemplo de la


figura 9, debemos de marcar la opción “setup”, y cuando nos aparece
la nueva pantalla, marcar la opción “láser offset” (ver figura 10)

248
SETUP LASER OFFSET

Figura 10: Pantalla de visualización para el ajuste del láser.

Una vez que hemos marcado “láser Offset” automáticamente nos


aparece una nueva pantalla (ver figura 11), con ella podemos
desplazar el cuadro de centrado de pico (de color gris) en unidades de
0.25 GHz, numero de unidades que debemos de comprobar a priori al
ver el espectro, ya que hasta que no pongamos una nueva secuencia
de muestras, no vamos a poder ver de nuevo el ajuste del láser, que
debería de quedar como podemos ver en la figura 11.

DESPLAZAMOS

Figura 11: Pantalla de visualización para el ajuste del láser.

10. C) Medida de muestras:

El analizador quedará instalado para la campaña de


circunnavegación, con la secuencia correcta de muestras, para poder
intercalar los patrones entre las diferentes medidas de vapor
atmosférico. No obstante, dado que cada semana hay que cambiar el

249
septum, limpiar el tubo, y ajustar el láser, debemos de conocer como
crear una secuencia de muestras sin problemas.

En la pantalla principal nos aparece la ventana de configuración. Con


esta ventana nosotros podemos crear la secuencia de medida, para
ello le vamos a indicar el número de muestras y sus posiciones, el
número de estándar y sus posiciones, el número de repeticiones en la
medida de cada muestra, etc. (Ver figura 12).

LISTA LISTA
MUESTRAS STANDAR

NUMERO
INYECCIONES
POR
MUESTRA

Figura 12: Pantalla para la configuración de la secuencia de muestras.

En la ventana “sample list”, vamos añadiendo líneas marcando “insert”,


tantas como muestras queremos medir. Después, hacemos lo mismo
para la ventana “standar list” en donde incluimos todos los patrones que
vamos a medir y la posición en la que se encuentran en el
automuestreador. Una vez que hemos nombrado todas las muestras,
marcamos la flecha para pasar las muestras a la secuencia de medida,
y es muy importante también, ajustar el número de repeticiones que
queremos de cada muestra (ver figura 13).

250
PARA PASAR LAS NUMERO DE
MUESTRAS A LA REPETICIONES
SECUENCIA DE MEDIDA

PARA COMENZAR
A MEDIR
Figura 13: Pantalla para la configuración de la secuencia de muestras.

Hacemos la misma operación, tanto para muestras como para


estándar, en sus listas correspondientes, y por último marcamos la
ventana “run” (ver figura 13) para pasar a la ventana definitiva (ver
figura 14), en donde nos aparece exactamente toda nuestra secuencia
de medida, tanto el número de muestras, como el número de estándar,
como el número de repeticiones de cada muestra y estándar, en su
posición correcta en la secuencia de medida. Comprobamos que no
hemos cometido ningún error y, por último, le damos al ”play” para
comenzar a medir. Al pasar unos minutos, veremos como el aparato
empieza a medir automáticamente toda la secuencia, y es muy
importante que nos fijemos que el número de moléculas que se
producen en la vaporización, y que aparecen en la pantalla está entre
2X10e16< moléculas< 4x10e16, ya que si no es así, es posible que
tengamos un problema con el vacío, con la jeringa, con el tubo de
muestra, etc. por lo que debemos de revisar todo de nuevo.

251
NÚMERO DE
MOLÉCULAS

PARA COMENZAR
A MEDIR

Figura 14: Pantalla comienzo de la secuencia de medida.

11. Calculo de los resultados.

El sistema almacena automáticamente los datos medidos en el


disco duro, y una vez en tierra, nosotros analizaremos los resultados
obtenidos para la composición isotópica del vapor de agua, que irán
correlacionados con la derrota que lleve el barco en todo momento.
Estos resultados serán corregidos con las rectas de calibrado que el
sistema va a realizar periódicamente.

12. Referencias

Craig H. 1961. Isotopic variations in meteoric waters. Science 133:1702-

1703.

Craig, H. y Gordon L. I., 1965. Deuterium and Oxygen 18 variations in the


ocean and the marine atmosphere, in Stable Isotopes in
Oceanographic Studies and Paleotemperatures, edited by E.
Tongiorgi, pp. 9-130, Spoleto, Italy.
He, H, Lee X. y Smith R.S., 2001. Deuterium in water vapor evaporated
from a coastal salt marsh. Journal of Geophysical Research. vol. 106,
n.d11, pp. 12183-12191.

252
Keeling, C. D., 1961. The concentration and isotopic abundances of
carbon dioxide and marine air. Geochim. Cosmochim. Acta,
24:277-298.
Moreira, M.Z., Sternberg, L.S.L., Martinelli, L.A., Victoria, R.L, Barbosa, E.M.,
Borates, C.M., Nepstads, A.C. 1997. Contribution of transpiration to
forest ambient vapour based on isotopic measurements. Global
Change Biology 3:439-450.

Rozanski, K. y Sonntag, C., 1982. Vertical distribution of deuterium in


atmospheric water vapour. Tellus, 34:135-141.
Schoch-Fisher, H., Rozanski, K., Jacob, H., Sonntag, C., Jouzel, J.,
Ostlund, G. y Geyh, M. 1984. Hydrometeorological factors
controlling the time variation of D, 18O and 3H in atmospheric water
vapour in the Northern Westwind belt, in Isotope Hydrology, pp. 3-
30, I.A.E.A, Vienna, Austria.

Yepez, E.A., Williams, D.G., Russell, L. S., Guanghui, L., 2003. Partitioning
overstory and understory evapotranspiration in a semiarid savanna
from the isotopic composition of water vapour. Agricultural and
Forest Meteorology, 119: 53-68.

253
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Titulo de la técnica

Medidas de tasas de disipación de energía cinética turbulenta

3. Autores del documento y filiación

CHOUCIÑO VILELA, PALOMA1; FDEZ GRAÑA, ROCÍO2; ; MOURIÑO-CARBALLIDO, BEATRIZ1;


1 Laboratorio de Ecoloxía Mariña (LEM), Facultade de Ciencias do Mar,

Universidade de Vigo, E-36310, Galicia, Spain


2 Grupo de Oceanografía Física, Facultade de Ciencias del Mar, Universidade de

Vigo, E-36310, Galicia, Spain

4. Conceptos generales

La turbulencia representa la canalización de la energía cinética desde las


grandes escalas espaciales en las que se genera (10-1000s km, meso y
macroescala) hacia las pequeñas escalas en las que finalmente se disipa en
forma de calor debido a la acción de la viscosidad (1-10s cm o microescala). La
tasa a la cual tiene lugar la disipación de la energía cinética hacia las pequeñas
escalas se denota como ε. Considerando una serie de simplificaciones
matemáticas se puede asumir que, bajo determinadas circunstancias, la tasa de
generación y disipación de la energía cinética son equivalentes (Kolmogorov,
1941). Por lo tanto la determinación de ε permite caracterizar la energía cinética
asociada al movimiento turbulento. La relación entre ε y las fuerzas de flotabilidad
determina el valor del coeficiente de difusión turbulenta vertical o difusividad
(Kz)(Osborn, 1980).
La difusividad juega un papel clave en la biosfera marina y en la regulación del
clima mediante su implicación en el transporte y almacenaje de calor, gases
disueltos y sales nutrientes (Rahmstorf, 2003). Su influencia en la distribución de
sales nutrientes es fundamental en la fijación de carbono inorgánico mediada por
el fitoplancton y la posterior exportación de carbono orgánico hacia las capas
profundas del océano.

5. Finalidad. Campo de aplicación

Existe un gran desconocimiento acerca de la magnitud y variabilidad de los


procesos de mezcla en el océano. La información obtenida tras cinco décadas
de observaciones indica que los valores de Kz en la termoclina son un orden de
magnitud más pequeños que las estimaciones realizadas a partir de modelos
oceánicos. Esto podría indicar que la mayor parte de los procesos de mezcla
ocurren en una zona diferente del océano o asociados a eventos de naturaleza
episódica (Sriver & Huber, 2007). La escasez de observaciones, junto con la
sensibilidad de los modelos climáticos al valor de Kz, ponen de manifiesto la

254
necesidad urgente de obtener un mayor número de medidas directas de ε
(Wunsch & Ferrari, 2004). Esto se ve facilitado hoy en día por la aparición en el
mercado de diferentes instrumentos que permiten obtener medidas de
microturbulencia. Entre estos equipos se encuentran los perfiladores MST (Micro-
Structure Turbulence profiler) (Prandke & Stips, 1998) y TurboMap (Wolk et al.,
2002). En este capítulo se describe la realización de medidas de tasas de
disipación de energía cinética turbulenta mediante la utilización de un perfilador
MST. Los objetivos concretos de esta actividad son:
1. Obtención de medidas directas de ε a lo largo de grandes escalas
espaciales en océano abierto.
2. Comparación entre las medidas directas de ε y las estimas realizadas
mediante cálculos empíricos.
3. Estudio de la variabilidad de Kz a lo largo de grandes escalas espaciales.
4. Cuantificación de la entrada de nutrientes hacia la capa fótica mediante
procesos de difusión turbulenta.

6. Equipamiento necesario

El sistema de medida incluye, además del perfilador, un torno con el que se


realiza el lanzamiento del equipo al agua, un mando de control y una caja de
alimentación eléctrica para el torno, la unidad de cubierta que recibe los datos
de la sonda, y un ordenador con el que se realiza la adquisición y el procesado
de los datos. El cable que sujeta el aparato es además el cable transmisor de
datos y posee las mismas propiedades de hundimiento que la sonda.
El perfilador MST permite medir la turbulencia de microescala hasta una
profundidad máxima de 500 m. En su extremo inferior va equipado con sensores
de microestructuras (sensor de cizalla airfoil PNS98 (Neumann & Prandke, 1992) y
microtermistor FP07), y un sensor de aceleración para comprobar las inclinaciones
del perfilador al atravesar la columna de agua. Dispone de otros sensores
adicionales como un sensor de turbidez, dispersión de luz y fluorescencia. El
modelo utilizado incorpora además un CTD (Conductivity Temperature Depth) de
alta precisión, lo que permite el registro simultáneo de perfiles de cizalla y
parámetros oceanográficos con una alta resolución vertical.
Los sensores de cizalla PNS están constituidos por una placa pequeña de
piezocerámico (material que al deformarse genera un voltaje) unida mediante
una placa metálica a una pieza de epoxi con forma aerodinámica (airfoil). La
componente transversal del campo de velocidad ejerce una fuerza sobre el airfoil
que se transmite hasta el piezocerámico, dando como resultado una señal de
voltaje proporcional a dicha fuerza (Prandke & Stips, 1996). Las señales de voltaje
son convertidas en variaciones de velocidad con una resolución temporal que
permite medir a escala de cm las fluctuaciones de velocidad que genera la
microturbulencia en el océano.

255
Tabla 1. Descripción de los sensores incorporados en la sonda MST (versión
estándar).

SENSORES DE MICROESTRUCTURAS
Parámetro Principio Elemento Longitud de Constant
sensible la punta del e de
sensor tiempo1
Temperatura Medida de Microtermistor Aprox. 0.3 Aprox. 10
resistencia FP 07 mm ms
(varilla de
vidrio)
Temperatura Medida de voltaje Termopar Aprox. 0.5 Aprox. 6
(alternativo) NiCr-Ni en el mm ms
interior de un
tubo de
acero de ∅
0.25 mm
SENSORES DEL CTD2
Parámetro Principio Rango Precisió Resolució Constant
n n e de
tiempo
Presión Piezoresistenci Definido +/- 0.1% 0.002% de 40 ms
a por el de la la escala
usuario escala total
total
Temperatura Pt 100 - +/-0 0.001ºC 160 ms
2…+38º 0.01ºC
C
Conductivida Celda 0…60 +/- 0.01 0.001 100 ms
d inductiva mS/cm mS/cm mS/cm
SENSOR DE CONTROL
Parámetro Principio Elemento Constante de
sensible tiempo
Perfil de aceleración Medida de la Placa de Approx. 3 ms
horizontal fuerza en una piezocerámico
masa pendular

1. La constante de tiempo hace referencia al tiempo de reacción/respuesta


del sensor a un salto brusco en el parámetro a medir. Por ejemplo, el tiempo
de respuesta del sensor de temperatura es de 10 ms. Esto significa que
cuando se produzca un salto importante en el valor de este parámetro
transcurrirán 10 ms hasta que el sensor muestre el 63% de este cambio. Los
tiempos de respuesta de los sensores de la sonda MST permiten mostrar
estructuras en la estratificación T/S con una resolución vertical de hasta 0.1
m sin pérdida significativa de información (sensores CTD) y 0.02 m para los
sensores de microestructura.

256
2. La sonda MST también está equipada con sensores adicionales de
fluorescencia y turbidez de la empresa Alec Ellectronics, Japón. Los sensores
son calibrados internamente, con una salida máxima de fluorescencia de
200 ppb Uranina y una turbiedez máxima de 200 ppm Caolín.

1.a. 1.c.

Piezocerámico

Material aislante

Placa metálica
F
Airfoil

1 cm

1.b.

Figura 1. a. Rotor y perfilador MST en la popa del barco. b. Extremo inferior del
perfilador donde se encuentran los diferentes sensores. c. Componentes del
sensor de cizalla PNS98 y esquema de las medidas.

257
7. Reactivos u otro material fungible

x CRC, previene fallos electrónicos causados por la penetración de agua o


humedad.
x Grasa de silicona.
x Conectores submarinos.
x Repuestos de los sensores de cizalla.

8. Descripción de la Técnica

La maniobra de lanzamiento de la sonda se realiza desde la popa del barco, con


el motor parado y con el barco abatiendo a favor de la dirección del viento. De
esta manera se evitan posibles interferencias con la turbulencia generada por la
hélice y el roce del cable con el casco. Durante esta operación son necesarias
dos personas, una encargada del control del torno con el que se realiza el
largado del cable, y la otra supervisando la recogida de datos en el ordenador.
El perfilador está diseñado para la toma de datos en caída libre. Se deben de
evitar tensiones en el cable para lo cual es necesario largarlo con suficiente
holgura. La velocidad de caída debe de estar comprendida entre 0.4 y 0.7 m s-1.
Esto se consigue mediante combinaciones de anillas de flotación y peso que se
insertan en el perfilador. Cada anilla de flotación supone una disminución de la
velocidad de 0.3 m s-1 y cada anilla de peso un aumento de 0.1 m s-1. Es
conveniente realizar una prueba para comprobar la velocidad de hundimiento
del perfilador antes de la primera estación, y corregir la flotabilidad siempre que
cambien las condiciones hidrográficas. Dado que la turbulencia es un proceso
intermitente es necesario realizar varios perfiles en cada una de las estaciones,
que posteriormente se promedian.
La adquisición y procesado de los datos se realiza con los programas comerciales
SST-SDA (Standard Data Adquisition) y DATpro de Sea & Sun Technology
(www.sea-sun-tech.com). Ambos programas se ejecutan con Windows
98/2000/XP/7. El primero de ellos permite la adquisición de datos, obteniéndose
un archivo de datos en bruto con extensión *.MRD. Posteriormente con el
programa DATpro los datos se visualizan y se convierten a formato ascii (extensión
*.TOB), se transforma la señal de voltaje a datos físicos y se realiza el control de
calidad de los mismos mediante el filtrado de las perturbaciones de alta y baja
frecuencia. Por último, este programa permite calcular ε y Kz.

9. Calibración

Todos los sensores instalados en el perfilador se calibran inicialmente en fábrica,


desde donde se emite un documento final con los coeficientes de calibración de
cada uno de ellos. En el caso que nos ocupa, la última calibración completa del
sistema fue realizada por la compañía Sea and Sun Technology en abril de 2009.
Para introducir posibles cambios en las calibraciones individuales de cada sensor,
el menú principal del programa de adquisición de datos SST-SDA ofrece la opción

258
calibración (Calibrate). Esta opción permite visualizar y modificar los coeficientes
de calibración de los sensores seleccionando Show Coefficients. Esta selección
abre una ventana de diálogo con un cuadro de listado de los diferentes sensores
que incorpora la sonda. Elegido el sensor de interés, el resto de los campos
muestran los coeficientes de calibración de dicho sensor y permiten introducir las
nuevas calibraciones (Figura 2). Cualquier cambio en los coeficientes de
calibración debe hacerse con extrema precaución, ya que influye directamente
en la conversión de los datos adquiridos (voltaje) a datos físicos.
En el caso de los sensores de cizalla PNS también es necesario ajustar la
sensibilidad. Es importante contabilizar los lances que acumula cada sensor
porque su sensibilidad disminuye con el tiempo y el uso. Las moléculas de agua
penetran a través de los materiales que se utilizan normalmente para aislar el
piezocerámico (goma de silicona, neopreno o poliuretano) reduciendo la
impedancia de esta pieza, lo que se traduce en una pérdida de sensibilidad que
afecta a las medidas. La sensibilidad se calcula y se corrige también en fábrica, y
su valor se tiene en cuenta en el cálculo de las constantes del sensor de cizalla
(ver ecuación 9 del apartado 11)

Figura 2. Coeficientes de calibración emitidos por la compañía para los sensores


de presión y
temperatura (izquierda) y cuadros de diálogo en el programa de adquisición de
datos para introducir los coeficientes de calibración (derecha).

259
10. Cuadro sinóptico de la técnica

INSTALACIÓN DEL
EQUIPO

1. Instalar el torno, que alberga el cable de largado y adquisición de datos, en la


borda del barco, y próximo a éste la caja metálica de alimentación eléctrica.

2. Comprobar las conexiones


• Conectar el cable de largado y adquisición de datos (cable naranja) al
perfilador y a la unidad de cubierta.
• Conectar a la caja de alimentación el motor del torno (cable gris) y el
mando de control del torno.
• Conectar la caja de alimentación a la corriente eléctrica (cable negro).
• Conectar la unidad de cubierta al ordenador (puerto USB) y a la
corriente eléctrica.

3. Encender el ordenador y la unidad de cubierta; comprobar que se reciben los


datos en la pantalla del programa de adquisición.

4. Quitar los tapones protectores de los sensores de cizalla.

5. Introducir manualmente el perfilador en el agua y largar el equipo sin pasar el


cable por el brazo del rotor.

6. Comenzar a grabar los datos al iniciar el largado del equipo.

7. Parar la grabación al alcanzar la profundidad deseada o cuando queden 10


vueltas de cable en el torno (vueltas de seguridad).

8. Recuperar el perfilador pasando el cable por el brazo del torno y cobrarlo a


una velocidad que permita su correcto enrollado en el torno.

9. Con el perfilador de nuevo en superficie repetir la operación un mínimo de 3


veces. Tras el último perfil subir a bordo el perfilador manualmente.

10. Endulzar todo el equipo y lavar con agua destilada todos los sensores.

11. Colocar las protecciones a los sensores de cizalla.

260
MANDO DE CONTROL
TORNO

CAJA DE ALIMENTACIÓN

PERFILADOR UNIDAD DE CUBIERTA

Figura 3. Esquema de los componentes que integran el sistema de medida.

ADQUISICIÓN DE DATOS (Software SST-SDA)

La opción Recording del menú principal del programa de adquisición permite


grabar los datos recibidos desde la sonda. Por defecto aparece activado el
modo de grabación en continuo (Continuous), que almacena todo el conjunto
de datos. En principio es el modo de grabación que interesa; Time Driven
almacena los datos sólo a intervalos de tiempo definidos y Value driven cuando
un sensor determinado registra un valor que no entra en un intervalo definido
previamente (Figura 4). Pulsando sobre Start Recording comienza la grabación de
datos en un archivo temporal. Durante la grabación, la línea de estado muestra
distintos paneles informativos:
Panel1. Indica que se están grabando datos(Recording)
Panel2. Indica el archivo de configuración del sistema por defecto
(Config=MSS016.SPJ)
Panel 3. Muestra el nombre del último archivo de datos en bruto guardado.
Panel 4. Muestra el número de bytes que se van almacenando en el archivo
temporal.
Para saber el momento en el que el perfilador alcanza la profundidad deseada
hay que fijarse en la entrada de datos en pantalla en la columna de presión
(press [dbar]). En ese instante pulsar sobre Stop Recording para finalizar la
grabación (Figura 4). Aparece entonces un cuadro de diálogo que permite editar
el cabecero e introducir información sobre las características de la estación
oceanográfica en cuestión (buque, campaña, operador, posición geográfica y
otros comentarios) (Figura 5).
Al cerrar la ventana de edición del cabecero se presenta la opción de guardarlo
como plantilla, para utilizarlo en otros perfiles, o bien guardarlo sólo como
cabecero para el archivo actual de datos. Tras optar por una de estas dos

261
opciones un último cuadro de diálogo permite nombrar el archivo de datos y
elegir el directorio donde se quiere guardar.

Figura 4. Pantalla y menú principal del programa de adquisición de datos SST-SDA.

Figura 5. Ventana de edición del cabecero.

PROCESADO DE DATOS (Software DATpro)

El primer paso es confirmar la correcta adquisición de datos. Dado que los datos
válidos son aquellos registrados en caída libre del perfilador, habrá que analizar y

262
en ocasiones eliminar los registros al alcanzar el límite de longitud del cable, o
bien al dejar de largar una vez alcanzada la profundidad deseada.
La utilidad Cutgraf permite cortar el registro de datos al inicio y/o al final del perfil
del archivo de datos en bruto (*. MRD) y convertir este archivo a formato ascii (*.
TOB). En su pantalla gráfica se pueden representar un máximo de seis sensores
frente a un eje vertical que muestra el conjunto de registros y, de este modo,
localizar el posible punto de corte (Figura 6).

Esquema1. Modo de operación de la herramienta cutgraf (acompañado de


Figura 6).

El primer paso es seleccionar los archivos de entrada *. MRD que se


quieren cortar (todos los archivos de los perfiles/lances realizados en
una estación). Para ello se utilizan la opción del menú “data→ select
input files for file list/add input files to file list”, o los iconos
correspondientes.
La lista de los archivos seleccionados se muestra en el cuadro de la esquina
superior derecha de la ventana principal. Para realizar la representación
gráfica se hace doble clic en un archivo de esa lista. Los sensores
registrados en el archivo seleccionado se muestran en la ventana debajo
de la lista de archivos.
La representación gráfica se configura a través del cuadro de
diálogo de opciones (“open option dialogbox”). Las entradas de
este cuadro de diálogo son autoexplicativas. Permite seleccionar los
sensores que se quieren representar, hasta un máximo de seis.
Se seleccionan los siguientes sensores:
x Presión. En el perfil de presión se puede observar si el perfilador
ha bajado a una velocidad constante. Cualquiera salto en la
línea de presión indica la existencia de tirones en el cable
durante su descenso, debiendo eliminar el registro de datos a
partir de ese punto.
x Temperatura. Su perfil ofrece una primera visión de la estructura
de la columna de agua y la posición de la termoclina.
x Cizalla (shear). Se debe comprobar que los dos sensores de
cizalla instalados en el perfilador están registrando una señal
parecida.
La función zoom de la pantalla gráfica se activa pulsando el botón
izquierdo del ratón y manteniéndolo mientras se arrastra el cursor por el área
que se desea ampliar. El área seleccionada, indicada por la zona marcada
en rojo, será ampliada. Para desactivar esta función se pulsa el botón
derecho del ratón mientras el cursor se encuentra dentro de la gráfica.
La barra azul de la pantalla gráfica se arrastra con el cursor y se sitúa a la
altura del registro a partir del cual se quiere cortar el perfil. La zona a
eliminar aparece marcada en gris.
El archivo de entrada se sustituye. Para ello la opción “cut data lines
and save output file” permite guardar el nuevo perfil y convertirlo a

263
extensión *.TOB. Este nuevo archivo se guarda por defecto en la
carpeta utilities del programa DATpro.

Figura 6. Menú principal del programa de procesado de datos DATpro y pantalla


gráfica de la herramienta cutgraf.

Diseño de procesos "batch" o procesamientos por lotes

El programa DATpro permite diseñar diferentes batches mediante la combinación


de módulos de cálculo individuales, que se ejecutan sucesivamente para calcular
un parámetro final, en este caso, ε y Kz.

Esquema2. Modo de diseño de un batch (acompañado de Figura 7).

Abrir el cuadro de diálogo de configuración (“edit batch


proccesing file”) con el icono correspondiente de la barra del
menú principal o mediante el menú “edit→batch job”.
Si se desea modificar un batch ya existente seleccionar la opción “load
batch job”, en la esquina superior derecha del cuadro de diálogo abierto. Se
muestra la configuración actual del batch: título (“batch job title”), breve
descripción (“detailed job description”), lista de módulos que lo integran (“list
of modules”), y cuadro con los parámetros del módulo seleccionado
(“parameters of select modul”).
Las opciones “add, insert, delete” permiten modificar la lista de módulos.
Para modificar los parámetro de un módulo, seleccionar el módulo en
particular de la lista con un clic con el botón izquierdo del ratón. Se abre el

264
cuadro de diálogo de configuración de parámetros en la parte inferior
izquierda. Para cambiar el valor o tipo de parámetro, hacer doble clic con el
botón izquierdo sobre cada entrada.
Para guardar la configuración del batch utilizar la opción “save and close”.
Se genera así un archivo con extensión *. MSB que se guarda por defecto en
la carpeta batch del programa DATpro.
Importante: Hay que tener especial cuidado con los nombres de los archivos
de entrada y salida de cada módulo. Los módulos se ejecutan
sucesivamente, y el nombre del archivo de salida de un módulo (“outputfile
*.tob”) tiene que ser igual al nombre del archivo de entrada del módulo
siguiente (“inputfile *.tob”)!

Figura 7. Cuadro de diálogo de configuración de un batch.

Aplicación de un "batch"

Una vez diseñados, los batches se aplican a los archivos de interés.

Esquema3. Modo de aplicación de un batch (acompañado de Figura 8).

El primer paso es seleccionar los archivos *. TOB, obtenidos con la


utilidad cutgraf, sobre los que se quiere ejecutar el batch. Para ello
se crea una lista de archivos de entrada mediante el menú “data→
select input files for file list/add input files to file list” o los iconos

265
correspondientes.
La lista de archivos se muestra en la pestaña “input file list” de la ventana
principal.
Para seleccionar el batch que se quiere ejecutar ir al menú “run →
batch job” o pulsar sobre el icono correspondiente de la barra de
opciones.
Una vez seleccionado aparece el cuadro de diálogo “configure batch job”
con la siguiente información: título (“job title”), apartado de información
(“job info”), directorio de salida (“output directory”), y prefijo del nombre del
archivo de salida (“output file prefix”).
En este caso, tanto el directorio de salida como el prefijo identificador del
archivo de salida deben ser especificados.
Aplicar el batch e iniciar el procesado de datos de los archivos
seleccionados pulsando sobre la opción “star job”.
Importante: El nombre del archivo de salida incluirá el prefijo especificado y
el nombre del archivo de entrada. Si el nombre resultante supera los 8
caracteres, los n primeros caracteres del archivo de entrada se sobrescriben
con el prefijo de salida seleccionado.

Figura 8. Listado de archivos de entrada y cuadro de configuración de los


archivos de salida.

266
11. Calculo de los resultados.

La transformación de la señal de voltaje a datos físicos (cizalla) se basa en el


procedimiento descrito por Prandke & Stips (1996), basado en la teoría de Allen &
Perkins (1952). Para un sensor de cizalla en un flujo no viscoso, de velocidad U y
ángulo de ataque α (Figura 1.c.), la fuerza transversal por unidad de longitud
debida al flujo potencial (fp) se puede expresar como:

1 dA
fp = ρU 2 sen(2α ) (1)
2 dx

donde ρ es la densidad del fluido y dA/dx es la señal de voltaje en la dirección


axial. Para obtener la fuerza transversal total (F) se integra la ecuación (1) a lo
largo del eje x:

1
F= ρU 2 Asen(2α ) (2)
2

Debido a la relación lineal existente entre la respuesta en voltaje (E) y F, la


ecuación (2) se puede escribir como:

E = ρU 2 Ssen(2α ) (3)

donde S es la sensibilidad del sensor, que se determina en el proceso de


calibración del sensor de cizalla en fábrica.
Considerando la ganancia eléctrica total del sensor (G) (relación entre la
amplitud de la señal de salida y entrada) y utilizando la relación angular
sen(2α ) = 2senα cos α , la ecuación anterior se puede escribir como:

E = 2 2 ρGS rmsVu (4)

donde V es la componente axial y u es la componente transversal del campo de


velocidad (Figura 1.c.).
Para obtener la velocidad de cizalla se calcula la derivada temporal. En un
medio que evoluciona lentamente con respecto a la toma de datos se puede
asumir la hipótesis de Taylor. Para medidas de microturbulencia con un perfilador
que se mueva a una velocidad mayor de 0.3 m s-1 se satisface esta condición
(Prandke & Stips, 1996) y las derivadas temporales se pueden transformar en
derivadas espaciales en la dirección del flujo principal.

du dE
= (2 2 ρGS rmsV 2 ) −1 (5)
dz dt

Partiendo de la ecuación (5) calculamos el dato bruto de cizalla (shraw) definido


como:

267
du 1 dshraw
= × (6)
dz ρV 2
dt

Sustituyendo en la ecuación (5):

1
shraw = ×E (7)
(2 2SG)

Considerando la relación entre la salida del convertidor analógico-digital de la


sonda (R) y E:

E = b0 + b1 R (8)

La ecuación (7) se puede escribir como:

1 b0 b1
shraw = × (b0 + b1 R) = + × R = a0 + a1 R (9)
(2 2 SG ) 2 2SG 2 2SG

donde los valores de las constantes del sensor de cizalla para la sonda MST son
b0= 4,577707e-5, b1=9,155423e-5 y G=11. Por lo tanto a0 = S-1 x 1.47133e-6 y a1 = S-1 x
2.94226e-6.

Tabla 2. Descripción de los módulos del batch con el que se inicia el procesado
de datos y se calcula la velocidad de cizalla.

TÍTULO DEL BATCH SHEAR_ACRÓNIMO DE LA CAMPAÑA


FINALIDAD TRANSFORMACIÓN DE LA SEÑAL DE VOLTAJE A DATOS
FÍSICOS (VELOCIDAD DE CIZALLA)
PREFIJO DE SALIDA Sh
ARCHIVOS DE PARTE DEL ACRÓNIMO, Nº DE ESTACIÓN, Nº DE PERFIL
ENTRADA
ARCHIVO DE SALIDA sh, PARTE DEL ACRÓNIMO, Nº DE ESTACIÓN, Nº DE
PERFIL
MÓDULOS DESCRIPCIÓN
Comprobación de la desviación estándar y
eliminación de outliers. Calcula la desviación
estándar por intervalos y elimina los valores que
superan un rango definido como ± δ veces la
Dev_chk
desviación estándar calculada. Por defecto el
intervalo es de 40 registros y δ es igual a 2.7. Se aplica
a los sensores de presión, temperatura,
conductividad, cizalla, y aceleración.
Move_av Elimina ruido de alta frecuencia. Suaviza los valores

268
del sensor o sensores seleccionados utilizando una
media móvil con un ancho de ventana definido. El
tamaño de ventana (N) para el cálculo de la media
debe ser menor que el número total de registros, y un
valor impar. Se aplica al sensor de presión.
Extrae el rango de profundidad útil. Por defecto 10-
400. El valor del límite inferior se recomienda que sea
el doble del calado del barco. El límite superior
variará en función del largado de cable en la
Extract
maniobra de lanzamiento, que a su vez depende del
tiempo disponible para cada lance y de las
condiciones meteorológicas. Se aplica al sensor de
presión.
Añade una constante a uno o más sensores
Addition seleccionados (en este caso los dos sensores de
cizalla) para que puedan ser representados.
Calcula un polinomio de orden n para el sensor
seleccionado (en este caso los sensores de cizalla),
creando dos canales que se nombra como shraw1 y
shraw2. Es necesario especificar las constantes (ao y a1)
Polynom
de cada sensor de cizalla para realizar este cálculo
polinómico. Dichas constantes se calculan a partir de
la sensibilidad del sensor, que es específica para
cada uno de ellos.
Añade un nuevo canal temporal (time) que contiene
marcas de tiempo en un formato específico. Estas
Addtime
marcas comienzan en el primer registro, añadiendo
sucesivamente el intervalo de muestreo (0’9765 ms).
Calcula el gradiente de los canales seleccionados
(shraw1 y shraw2) frente a un sensor específico (time)
Gradient
cuyos valores deben ser equidistantes. Genera dos
nuevos canales que se denominan dudt1 y dudt2.
Calcula la velocidad de cizalla horizontal, du/dz, en
términos de s-1, a partir de la ecuación (6),
du 1 dshraw
= × (6)
dz ρV 2
dt
Shear donde ρ es la densidad media y V es la velocidad de
caída del sensor, calculada a partir del sensor presión
(dbar) y del canal temporal (ms). Se añaden así tres
nuevos canales al archivo de entrada: shear1, shear2
y vel.
Realiza operaciones matemáticas (+, -, x y /) registro
por registro. Calcula la pesudo-cizalla (pseudo-shear)
Com_sens
dividiendo el sensor de aceleración (acc) por el
canal de velocidad de caída (vel). El nuevo canal se

269
denomina pshear y da una idea de las inclinaciones
del perfilador a lo largo de la columna de agua.
Extrae los canales y sensores especificados. El archivo
Sensextr de salida con extensión *.TOB contiene dichos
canales y sensores.

A partir de las medidas de fluctuación de la velocidad de cizalla a pequeña


escala se estima la tasa de disipación de energía cinética turbulenta, definida
como:

∂u i ⎛ ∂u i ∂u j ⎞
ε =ν ⎜ + ⎟⎟ (10)
∂x j ⎜ ∂x
⎝ j ∂xi ⎠

donde ν es la viscosidad cinemática del agua y u es la componente transversal


del campo de velocidad. La barra superior representa la media sobre 12 términos
de fluctuaciones turbulentas en el campo de velocidad, siendo prácticamente
imposible medirlos simultáneamente. Sin embargo, para una turbulencia
isotrópica, la ecuación se simplifica, quedando únicamente un término
independiente. En este caso se utiliza la siguiente fórmula isotrópica (Batchelor,
1953):

⎛ ∂u ⎞
2

ε = 7.5ν ⎜ ⎟ (11)
⎝ ∂z ⎠

donde ∂u/∂z es el perfil vertical de cizalla obtenido con los sensores de la sonda.
La ecuación isotrópica implica considerar todo el rango de longitudes de onda
relevantes para el perfil de cizalla, lo que significa que las medidas del perfilador
deben resolver el espectro completo de fluctuaciones de la velocidad turbulenta.
El espectro universal de energía cinética se divide conceptualmente en tres
regiones. El subrango de energía abarca las grandes escalas de movimiento en
las cuales tiene lugar principalmente la generación de la energía cinética,
mientras que el subrango de disipación incluye las escalas más pequeñas en las
cuales tiene lugar los procesos de disipación de energía debido a la viscosidad. Si
el rango de escalas es suficientemente grande, existe un subrango intermedio
(inercial) en el cual la forma del espectro es independiente de los procesos de
generación y disipación de la energía. Asumiendo una serie de simplificaciones
matemáticas en el subrango inercial la descripción del movimiento turbulento
puede realizarse a partir de la descripción de ε. El límite superior del subrango de
disipación está definido por la longitud de onda de Kolmogorov (kk) (Kolmogorov,
1941) y depende del nivel de turbulencia:
1
1 ⎛ ε ⎞4
kk = ×⎜ ⎟ (12)
2 ∏ ⎝ν 3 ⎠

270
Mientras que el límite superior está claramente definido, el límite inferior es más
complicado de definir. Normalmente se utiliza el valor de 2 cpm que es el número
de onda más bajo que pueden resolver los perfiladores de 1 m de longitud como
el MST (Prandke & Stips, 1996).

Tabla 3. Descripción de los módulos del batch intermedio con el que se calcula la
tasa de disipación de la energía cinética turbulenta (ε).

TÍTULO DEL BATCH EPSILON_ACRÓNIMO DE LA CAMPAÑA


FINALIDAD CÁLCULO DE LA TASA DE DISIPACIÓN DE LA ENERGÍA
CINÉTICA TURBULENTA (ε)
PREFIJO DE SALIDA Ep
ARCHIVOS DE PARTE DEL ACRÓNIMO, Nº DE ESTACIÓN, Nº DE PERFIL
ENTRADA
ARCHIVO DE SALIDA ep, PARTE DEL ACRÓNIMO, Nº DE ESTACIÓN, Nº DE
PERFIL
MÓDULOS DESCRIPCIÓN
Extract Extrae el rango de profundidad útil.
Resta la tendencia lineal de los canales
seleccionados (shear1, shear2 y pshear), calculada a
partir de un determinado intervalo de registros. Se
Detrendn
trata de un filtro paso alto (High Pass Filter, HPF), que
atenúa las componentes de baja frecuencia pero no
las de alta frecuencia.
Corrige el tiempo de respuesta del sensor
seleccionado (temperatura, temp) con un tiempo
constante, incluyendo un filtro de paso bajo (LPF, Low
Response
Pass Filter) caracterizado por permitir el paso de las
frecuencias más bajas y atenuar las frecuencias más
altas.
Calcula la tasa de disipación de la energía cinética
turbulenta (ε) en Wkg-1 y el correspondiente número
de onda de Kolmogoroff en cpm, ecuación (12),
utilizando la ecuación isotrópica, ecuación (11):
3 1/4
kk= 1/(2π) × (ε/ν ) (12)
⎛ ∂u ⎞
2

Dis_spec ε = 7.5ν ⎜ ⎟ (11)


⎝ ∂z ⎠
donde du/dz es la velocidad de cizalla (calculada
con el módulo Shear en el batch anterior) y ν es la
viscosidad cinemática del agua de mar (calculada a
partir de la temperatura).
Crea tres nuevos canales que se nombran como
eps1(~shear1), eps2 (~shear2), peps (~pshear).

271
Calcula la media de dos canales o sensores que
miden el mismo parámetro (eps1 y eps2) tras
comprobar los posibles picos. Para considerar un
pico, el valor de uno de ellos debe diferir del valor del
Smooth otro un factor especificado, tomando en ese caso el
valor mínimo y rechazando el mayor. El objetivo es
eliminar valores erróneos causados por el impacto de
partículas en el perfil de la tasa de disipación. Añade
un nuevo canal, eps.
Añade una constante a los canales seleccionados
Addition
(eps y peps) para que puedan ser representados.
Calcula el logaritmo en base 10 de uno o más
Log_10
canales. En este caso se aplica sobre el canal eps.
Calcula un polinomio de orden n para el canal
seleccionado (eps), creando un canal adicional que
se nombra como epsi. Este polinomio corrige en el
Polynom1 nuevo canal la resolución espacial incompleta
debido al tamaño del propio sensor. En este módulo
se introducen los coeficientes correspondientes al
equipo que se está utilizando (Prandke, 2007)
Calcula un polinomio de orden n para el canal
seleccionado (epsi), creando un canal adicional que
se nombra como epsilo. En este módulo se introducen
los coeficientes correspondientes al número de onda
Polynom2
de corte superior. Para un perfilador con una
velocidad de caída no superior a 0.7 m s-1 se
recomienda un valor de 30 cpm para este límite.
(Prandke, 2008)
Calcula un polinomio de orden n para el canal
seleccionado (epsilo), creando un canal adicional
que se nombra como epsilon. En este módulo se
Polynom3
introducen los coeficientes correspondientes al
número de onda de corte inferior, en este caso, 2
cpm. (Prandke, 2008)
Calcula la inversa del logaritmo en base 10 de uno o
Exp_10 más canales. En este caso se aplica sobre los canales
eps y epsilon.
Calcula valores promedio de los canales en un rango
Press_av de presión definido. De este modo se normaliza la
profundidad de los perfiles a intervalos de 1 m.
Calcula el logaritmo en base 10 de uno o más
Log_10 canales. En este caso se aplica sobre el canal epsilon,
peps, eps1, eps2 y eps.
Elimina los canales seleccionados del archivo de
Delsens
entrada al módulo. Elimina en este caso epsi, epsilo,

272
shear1, shear2, pshear, Kc1, Kc2, kcp, time y ncp.
Calcula la salinidad como función de la temperatura,
la conductividad y la presión. Los datos calculados se
Salinity
añaden al archivo en un nuevo canal que se nombra
como sal.
Calcula la densidad en función de la salinidad y la
temperatura a presión cero. Los datos calculados se
Sigma_t
añaden al archivo en un nuevo canal que se nombra
como sig_t.
Calcula la escala Thorpe, LT, para el canal sig_t,
reordenando el perfil según un algoritmo de burbuja
Thorpe (BubbleSort). Es necesario establecer la dirección de
ordenación según el canal seleccionado (sigma_t:
ascendente).
Calcula la frecuencia de Brünt Väisälä en s-2,
utilizando los canales de presión y sigma_t, aplicando
la siguiente fórmula:
g dρ
BVFD N2 = −
ρ ( z ) dz
donde g=9.80665ms-2. Los datos calculados se
añaden al archivo en un nuevo canal que se nombra
como N^2.
Elimina los canales seleccionados del archivo de
Delsens entrada al módulo. Elimina en este caso el canal
thorpe del archivo de salida.

Finalmente, el coeficiente de difusión turbulenta (kz) se calcula según la


ecuación:
ε
Kz = a 2 (13)
N

donde a es una constante (normalmente 0.2) y N es la frecuencia de Brünt


Väisälä.

273
Tabla 4. Descripción de los módulos del batch final con el que se calculan los
coeficientes de difusión turbulenta (Kz).

TÍTULO DEL BATCH EDDY_ACRÓNIMO DE LA CAMPAÑA


FINALIDAD CÁLCULO DE LOS COEFICIENTES DE DIFUSIÓN
TURBULENTA (Kz)
PREFIJO DE SALIDA Ed
ARCHIVOS DE PARTE DEL ACRÓNIMO, Nº DE ESTACIÓN, Nº DE PERFIL
ENTRADA
ARCHIVO DE SALIDA ed, PARTE DEL ACRÓNIMO, Nº DE ESTACIÓN, Nº DE
PERFIL
MÓDULOS DESCRIPCIÓN
Calcula la inversa del logaritmo en base 10 de uno o
Exp_10 más canales. En este caso se aplica sobre el canal
epsilon.
Realiza operaciones matemáticas (+, -, x y /) línea por
línea. Calcula el cociente (ε/N2) dividiendo el canal
Com_sens
epsilon entre el canal N^2. El nuevo canal se
denomina K_diss.
Multiplica uno o más canales seleccionados por un
valor constante. Multiplica el canal K_diss por la
Mult
constante 0.2 para obtener el canal con los
coeficientes de difusión turbulenta.
Calcula el logaritmo en base 10 de uno o más
Log_10
canales. En este caso se aplica sobre epsilon y K_diss.

Los coeficientes de difusión se combinarán con los datos de concentraciones de


nutrientes con el fin de cuantificar la entrada de nutrientes hacia la capa fótica
mediante procesos de difusión turbulenta. En un siguiente paso se realizarán
estimaciones empíricas de Kz mediante dos procedimientos diferentes: 1) a partir
de los datos de velocidades horizontales medidas por la sonda ADCP, 2) a partir
de coeficientes de arrastre del viento. De esta forma podremos comparar las
medidas directas obtenidas con la sonda MST con las estimaciones empíricas.
Debido al diferente comportamiento físico de los distintos perfiladores y sensores
de cizalla existentes en el mercado, así como a las diferentes condiciones de
medida, no existe un esquema estandarizado para el procesado de los datos. El
procesado definitivo de los datos se realizará a posteriori por personal
especializado. Sin embargo, será necesario realizar un control de calidad de los
datos una vez finalizada cada estación, con el fin de comprobar que los sensores
no han perdido sensibilidad y que no hay ningún tipo de interferencia con la señal
de turbulencia natural que estamos midiendo.

274
12. Control de calidad

Para el control de calidad de los datos se siguen los siguientes pasos:

Comparación del comportamiento espectral de los datos.


La utilidad spectrum del programa DATpro calcula y representa el espectro de
fluctuación de velocidad turbulenta para diferentes rangos de profundidad a
partir del perfil de cizalla, y permite una comparación visual con el espectro
universal de Nasmyth. Al seleccionar los rangos de profundidad, es importante
incluir una zona de alta turbulencia (superficie) y otra de baja turbulencia
(termoclina), para comprobar el comportamiento de los datos en ambas zonas.
No se deben mezclar zonas con diferente turbulencia. El espectro de las
observaciones tiene que seguir, más o menos, la forma del espectro universal
(Esquema 4 y Figura 9).

Esquema 4. Modo de operación de la herramienta spectrum (acompañado de


la Figura 9).

El primer paso es seleccionar los archivos de entrada para aplicar


esta herramienta, que serán los archivos de salida del primer batch.
Para ello se utilizan la opción del menú “file→ select data path”, o el
icono ”select input folder”.
La lista de los archivos seleccionados se muestra en el cuadro de la esquina
superior derecha de la ventana principal. Para realizar la representación
gráfica se hace doble clic en un archivo de esa lista. Los sensores registrados
en el archivo seleccionado se muestran en la ventana debajo de la lista de
archivos.
La representación gráfica se configura a través del cuadro de
diálogo de opciones (“open option dialogbox”). Las entradas de
este cuadro de diálogo son autoexplicativas. Permite definir escalas
y seleccionar los sensores que se quieren representar, que en este
caso serán los sensores de cizalla shear1 y shear2.
Activar el icono “select data range” y, pulsando el botón izquierdo
del ratón, arrastrar el cursor sobre los perfiles de cizalla para
seleccionar el rango de profundidad del que se quiere calcular y
representar el espectro. Dicho rango aparecerá marcado en gris.
El icono “calculate spectrum” calcula y representa el espectro de
fluctuación de velocidad turbulenta del rango seleccionado sobre
el perfil de cizalla.

275
Figura 9. Ventana principal de la herramienta spectrum. En la parte izquierda de
la pantalla se representan los perfiles de cizalla registrados por los dos sensores
que incorpora el perfilador en una estación oceánica. En la parte central de la
ventana la gráfica muestra el espectro de fluctuaciones de velocidad turbulenta
correspondiente al rango seleccionado en los perfiles. En la figura se observa
cómo hasta la longitud de onda de 100 cpm las observaciones siguen el espectro
universal de Nasmyth (isolineas discontinuas).

Comparación de la cizalla con la pseudo-cizalla (o pseudo-shear).


Los sensores de cizalla son sensibles a las vibraciones de la propia sonda al
descender a través de la columna de agua. Para detectar estas posibles
perturbaciones se emplea el pseudo-shear, cociente entre la aceleración del
sensor y la velocidad de caída del mismo, que mide únicamente turbulencias
debidas a las vibraciones del perfilador. De este modo, comparando el pseudo-
shear con la cizalla, se puede distinguir la turbulencia debida a las vibraciones del
perfilador para aquellos casos en los que coincida el aumento de la cizalla y el
pseudo-shear en la misma región.
Para realizar esta comparación se emplea de nuevo la utilidad spectrum, pero en
el cuadro de diálogo de opciones (“open option dialogbox”) se debe seleccionar
el canal pshear y uno de los canales shear (shear1 o shear2). Para detectar las
posibles anomalías en el perfil pshear es útil la función zoom de la pantalla
gráfica, que se activa del mismo modo que en la utilidad cutgraf. Situando el
cursor sobre la anomalía, indica la profundidad a la que se ha registrado.

Comparación entre sensores de cizalla.


Los sensores de cizalla airfoil también son sensibles a las partículas de cierto
tamaño (por ejemplo, partículas de plancton) existentes en el agua. Cuando una
partícula golpea el airfoil, el sensor registra una señal que dependerá de la masa

276
de dicha partícula. Para separar la señal de turbulencia natural de este otro tipo
de señales, el perfilador va equipado con dos sensores de cizalla alineados para
medir la misma componente de cizalla. De este modo, los picos no coherentes en
cada uno de los dos perfiles registrados de forma simultánea pueden ser
identificados y eliminados.
El módulo smooth (tabla 3) se encarga de comprobar la posible existencia de
picos anómalos en los dos canales de tasa de disipación de energía cinética
turbulenta (eps1 y eps2) y calcular la media (eps). Cuando el valor de uno de los
canales es mayor que el valor del otro canal en un factor establecido
(normalmente factor n=5), rechaza el valor mayor y se queda con el valor más
bajo.
La utilidad datgraf del programa DATpro es muy útil para realizar una visualización
rápida de los perfiles de datos, tanto para comprobar la correcta elección del
factor n, como para evaluar con detalle los perfiles bajo determinadas
condiciones oceánicas (abundancia de materia en suspensión, presencia de
determinados organismos, etc.) que reducen la eficacia del módulo smooth.

Esquema 5. Modo de operación de la herramienta datgraf (acompañado de la


Figura 10 y 11)

El primer paso es seleccionar los archivos de entrada para aplicar


esta herramienta, que serán los archivos de salida del útimo batch.
Para ello se utilizan la opción del menú “file→ select data path”, o el
icono ”select input folder”.
La lista de los archivos seleccionados se muestra en el cuadro de la esquina
superior derecha de la ventana principal. Para realizar la representación
gráfica se hace doble clic en un archivo de esa lista. Los sensores registrados
en el archivo seleccionado se muestran en la ventana debajo de la lista de
archivos.
La representación gráfica se configura a través del cuadro de
diálogo de opciones (“open option dialogbox”). Las entradas de
este cuadro de diálogo son autoexplicativas. Permite definir escalas
y seleccionar los sensores o canales que se quieren representar
hasta un máximo de seis. En este caso se seleccionan los canales
eps1, eps2 y eps.
Ofrece diferentes tipos de gráficos, que se pueden elegir con los
iconos de la barra de herramientas. Las más utilizadas:
⋅ “Draw single vertical plot”. Superpone en una única gráfica los
perfiles de los sensores seleccionados.
⋅ “Draw multiple vertical plot”. Representa los perfiles de los
sensores seleccionados en gráficas independientes, hasta un
máximo de seis.

Como se observa en la Figura 10, el pico que aparece en el canal eps1 a 165 m
de profundidad supera en n veces el valor de eps2 a esa misma profundidad, con

277
lo cual, el canal eps adoptará como válido el valor mínimo, y no la media de
ambos.
En la Figura 11 se observa como la abundancia de medusas en una estación
oceánica afecta al registro de datos en el sensor de cizalla situado en la posición
más externa, y por tanto menos protegido. El impacto de estos organismos en el
airfoil del sensor desvirtúa su señal de turbulencia a partir de los 60 metros de
profundidad. A pesar del filtro que supone el módulo smooth, el criterio a seguir en
estos casos es no tener en cuenta el perfil de ese sensor a la hora de calcular el
valor medio eps, porque de lo contrario se estaría sobreestimando el valor de ε.
La manera más sencilla de hacerlo es seleccionar dos veces el canal eps1 en el
cuadro de configuración de parámetros del módulo (Figura 12).

Figura 10. Distribución vertical de la tasa de disipación de energía cinética


turbulenta (ε) calculada a partir de los datos de cizalla registrados por los dos
sensores del perfilador en una estación oceánica, y de la tasa media calculada
con el módulo smooth.

278
Figura 11. Distribución vertical de la tasa de disipación de energía cinética
turbulenta (ε) calculada a partir de los datos de cizalla registrados por los dos
sensores del perfilador en una estación oceánica con presencia importante de
medusas, y de la tasa media calculada con el módulo smooth.

Figura 12. Pantalla de configuración del módulo smooth. Según el criterio


establecido, habría que sustituir eps2 (marcado con un círculo) por eps1.

13. Referencias

1. Allen, H.J., Perkins, E.W. (1952). A study effects of flow over slender inclined
bodies of revolution. U.S. National Advisory Committee for Aeronautics, Report
No.1048.

279
2. Batchelor, G.K. 1953. The Theory of Homogeneous Turbulence. Cambridge, UK:
Cambridge University Press
3. Kolmogorov, A.N. 1941. The local structure of turbulence in a incompressible
viscous fluid for very high Reynolds number. C.R. Acad.Sci.URSS 30:301-305
4. Neuman, T., Prandke, H. (1992). Entwicklung eines Sensors zur Turbulenzmessung
im Meer. University Rostock, Proceedings of the 7. Symposium Maritime
Elektronik, Arbeitskreis Messelektronik, 81-84.
5. Osborn, T.R. (1980). Estimates of the local rate of vertical diffusion from
dissipation measurements. Journal of Physical Oceanography, 10: 83-89.
6. Prandke, H. & Stips, S. 1996. Investigation of microstructure and turbulence in
marine and limnic waters using de MST profiler. European Commission, Joint
Research Centre, Space Applications Institute, Ispra, Technical note No.I.96.87
7. Prandke, H. & Stips, S. 1998. Test measurements with an operational
microstructure-turbulence profiler: Detection limit of dissipation rates. Aquatic
Sciences 60:191-209
8. Prandke, 2007. Correction of the spatial response of shear sensors in dissipation
rate computation procedure. ISW-Wassermesstechnic.
9. Prandke, 2008. Correction of the wave number cut off in dissipation rate
computation procedure. ISW-Wassermesstechnic.
10. Rahmstorf, S. 2003. The current climate. Nature 421:699-699
11. Sriver, R.L., Huber, M. (2007) Observational evidence for an ocean heat pump
induced by tropical cyclones. Nature 447:577-580.Terray, E.S., M. A. Donelan, Y.
C. Agrawal, W. M. Drennan, K. K. Kahma, A. J. Williams III, P. A. Hwang and S. A.
Kitaigorodskii. 1996. Estimates of kinetic energy dissipation under braking waves.
J. Phys. Oceanogr. 26, 792-807.
12. Wolk, F., Yamazaki, H., Seuront, L., Lueck, R.G. 2002. A new free-fall profiler for
measuring biophysical microstructure. Journal of Atmospheric and Oceanic
Technology 19:780-793
13. Wunsch. C., Ferrari, R. 2004. Vertical mixing, energy and the general circulation
of the oceans. Annual Review of Fluid Mechanics 36:281-314

280
BLOQUE 4

CONTAMINANTES Y DEPOSICIÓN ATMOSFÉRICA

MÉTODOS, TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS

281
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Nombre de la técnica

Muestreo de partículas marinas superficiales (5m)

3. Autores del documento y filiación

Jordi Dachs
IDAEA-CSIC, Barcelona, Catalunya, España.

4. Finalidad. Campo de aplicación

Muestreo de partículas marinas mayores que 0.7 micras, aunque el


muestreo es semi-cuantitativo para partículas más pequeñas que 0.7
micras. El objeto es recolectar la mayor cantidad de partículas marinas
para el posterior análisis de compuestos orgánicos biogénicos y
antropogénicos.

5. Conceptos generales
La metodología permite el muestreo de material particulado de
volúmenes de agua grandes (más de 100 L), con el fin de tener
suficiente material para los análisis de compuestos orgánicos. La
conservación de la muestra se realizar de manera que se asegura que
esta no se contamina por contaminantes presentes en la atmósfera
durante el transporte.

6. Equipamiento necesario

La técnica se puede aplicar mediante dos procedimientos.


A) Conectar el portafiltros directamente a la salida de agua del
continuo del buque. Para esto se requiere
- portafiltros de acero inoxidable para filtros de 14 cm
- conexiones de teflon
B) Conectar a un recipiente de acero inoxidable (bidon de 15 L) que
recibe el agua del continuo del buque.
- portafiltros de acero inoxidable para filtros de 14 cm
- conexiones de teflón
- bomba peristática

282
7. Reactivos u otro material fungible

- Filtros GFF de 14 cm (Whatmann), previamente acondicionados.


Los filtros se muflan a 450 C en el laboratorio durante 6 horas.
Posteriormente se envuelven en papel de aluminio. Una vez a
temperatura ambiente se taran y se numeran con el código
correspondiente. Se guardan los filtros envueltos y dentro de una
bolsa zip de forma individual.
- Pinzas de acero inoxidable
- Acetona de alta pureza (Merck)
- Pipetas pasteur previamente muflidas y guardadas en papel de
aluminio y bolsas zip.
- Papel de aluminio
- Bolsas ZIP
- Cinta aislante (a usar como etiqueta)

8. Calibración

El flujo de agua que pasa por el filtro se mide regularmente (cada 30 o


45 min) mediante una proveta. Se mesura el volumen de agua que
pasa en un minuto. Se apunta este volumen en el estadillo de la
muestra.

9. Descripción de la Técnica

1- Se limpian previamente las pinzas con acetona y el portaespumas


también con acetona.
2- Se coge el filtro GFF de 15 mm y se coloca en el portafiltros de
acero inoxidable. Este portafiltros está conectado al sistema de
agua en contínuo.
3- En el caso que no hay también conectada una columna XAD, se
puede filtrar con caudales altos. Se regula la llave de entrada de
agua del continua para caudales de 0.5 l min-1.
4- Se para la filtración cuando se colmata el filtro (caudales menores
de 80 ml min-1).
5- Se abre el portafiltros y se dobla el filtro con unas pinzas
previamente lavadas con acetona.
6- Se envuelve el filtro con papel de aluminio y se pone dentro de
una bolsa zip cerrada herméticamente.
7- Se conservan los filtros congelados a -20 C.

10. Cuadro sinóptico de la técnica


Falta esquema

11. Calculo de los resultados.

283
El volumen se calcula intengrando el flujo por todo el periodo de
muestreo.

12. Control de calidad

En zonas de mucho material particulado es necesario realizar la


calibración del volumen con más asiduidad (cada 20 minutos)

284
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Título de la técnica

Muestreo de compuestos orgánicos en la fase disuelta y en partículas


marinas superficiales (5m)

3. Autores del documento y filiación

Jordi Dachs
IDAEA-CSIC, Barcelona, Catalunya, España.

4. Finalidad. Campo de aplicación

Los compuestos orgánicos semi-volátiles se encuentran en la fase


disuelta y particulada. Aquí se describe el muestreo conjunto de estas
dos fases. La fase disuelta se concentra en un adsorbente XAD-2.
Muestreo de partículas marinas mayores que 0.7 micras, aunque el
muestreo es semi-cuantitativo para partículas más pequeñas que 0.7
micras. El objeto es recolectar la mayor cantidad de partículas marinas
para el posterior análisis de compuestos orgánicos biogénicos y
antropogénicos.

5. Conceptos generales

La metodología permite el muestreo de material particulado y la fase


disuelta de volúmenes de agua grandes (más de 100 L), con el fin de
tener suficiente material para los análisis de compuestos orgánicos. La
conservación de la muestra se realizar de manera que se asegura que
esta no se contamina por contaminantes presentes en la atmósfera
durante el transporte.

6. Equipamiento necesario

La técnica se puede aplicar mediante dos procedimientos.


A) Conectar el portafiltros directamente a la salida de agua del
continuo del buque. Para esto se requiere
- portafiltros de acero inoxidable para filtros de 14 cm
- Columna de acero inoxidable con XAD-2
- conexiones de teflon
B) Conectar a un recipiente de acero inoxidable (bidon de 15 L) que
recibe el agua del continuo del buque.
- portafiltros de acero inoxidable para filtros de 14 cm
- Columna de acero inoxidable con XAD-2

285
- conexiones de teflón
- bomba peristática

7. Reactivos u otro material fungible

- Filtros GFF de 14 cm (Whatmann), previamente acondicionados.


Los filtros se muflan a 450 C en el laboratorio durante 6 horas.
Posteriormente se envuelven en papel de aluminio. Una vez a
temperatura ambiente se taran y se numeran con el código
correspondiente. Se guardan los filtros envueltos y dentro de una
bolsa zip de forma individual.
- Pinzas de acero inoxidable
- Acetona de alta pureza (Merck)
- Pipetas pasteur previamente muflidas y guardadas en papel de
aluminio y bolsas zip.
- Papel de aluminio
- Bolsas ZIP
- Cinta aislante (a usar como etiqueta)

8. Calibración

El flujo de agua que pasa por el filtro se mide regularmente (cada 30 o


45 min) mediante una proveta. Se mesura el volumen de agua que
pasa en un minuto. Se apunta este volumen en el estadillo de la
muestra.

9. Descripción de la Técnica

Instalación de la columna XAD-2

1- Se coge una columna XAD-2 de la cámara frigorífica y se coloca


entre la bomba peristáltica y el portafiltros.
2- Se regula el caudal a 200 ml min-1 o el que dé la bomba
peristáltica.
3- Se muestrean unos 200 L de agua
4- Se mide regularmente el caudal de muestreo y se apunta en el
estadillo.
5- Al final se cierra la columna por los dos lados, se etiqueta y se
guarda en la cámara frigoríifca a 4 C (nunca a -20C).

Instalación del filtro


8- Se limpian previamente las pinzas con acetona y el portaespumas
también con acetona.
9- Se coge el filtro GFF de 15 mm y se coloca en el portafiltros de
acero inoxidable. Este portafiltros está conectado al sistema de

286
agua en contínuo.
10- En el caso que no hay también conectada una columna XAD, se
puede filtrar con caudales altos. Se regula la llave de entrada de
agua del continua para caudales de 0.5 l min-1.
11- Se para la filtración cuando se colmata el filtro (caudales menores
de 80 ml min-1).
12- Se abre el portafiltros y se dobla el filtro con unas pinzas
previamente lavadas con acetona.
13- Se envuelve el filtro con papel de aluminio y se pone dentro de
una bolsa zip cerrada herméticamente.
14- Se conservan los filtros congelados a -20 C.

10. Cuadro sinóptico de la técnica


Falta esquema

11. Calculo de los resultados.

El volumen se calcula intengrando el flujo por todo el periodo de


muestreo.

12. Control de calidad

En zonas de mucho material particulado es necesario realizar la


calibración del volumen con más asiduidad (cada 20 minutos).

287
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Titulo de la técnica

Muestreo de aerosoles.

Este documento se refiere al muestreo de la población total de


aerosoles, TSP (total suspended particles)

3. Autores del documento y filiación

Jordi Dachs
IDAEA-CSIC, Barcelona, Catalunya, España.

4. Finalidad. Campo de aplicación

Esta técnica permite el meustreo de la población general de aerosoles


con tamaños de partícula mayores que 0.7 um, aunque aerosoles más
pequeños (0.3-07 um) pueden también muestrearse semi-
cuantitativamente. Con esta técnica se pretende la recolección de
muestras de aerosoles que permitan después el análisis de una gran
variedad de compuestos (nutrientes, contaminantes orgánicos,
carbonilla, materia orgánica, isótopos del S y el N, etc).

5. Conceptos generales

Los aerosoles presentan un vector importante para el transporte de


materiales a larga distancia. Después del transporte atmosférico puede
depositarse al océano y contribuir al ciclo de los nutrientes, carbono o
contaminantes.

6. Equipamiento necesario

El equipamento necesario de divide entre el aparato de muestreo de


aerosoles, y el fungible necesario para realizar el cambio de muestra.

- Captador de aerosoles de alta capacidad


- Cabezal para aerosoles TSP. Adaptado a filtros de 8 x 10
pulgadas.

El modo de funcionamiento de los captadores está descrito en el


correspondiente manual.

288
7. Reactivos u otro material fungible

- Filtros QMA de 8x 10 pulgadas (Whatmann), previamente


acondicionados. Los filtros se muflan a 450 C en el laboratorio
durante 6 horas. Posteriormente se envuelven en papel de
aluminio. Una vez a temperatura ambiente se taran y se numeran
con el código correspondiente. Se guardan los filtros envueltos y
dentro de una bolsa zip de forma individual.
- Pinzas de acero inoxidable
- Acetona de alta pureza (Merck)
- Pipetas pasteur previamente muflidas y guardadas en papel de
aluminio y bolsas zip.
- Papel de aluminio
- Bolsas ZIP
- Cinta aislante (a usar como etiqueta)

8. Calibración

La calibración del volumen de muestro se realiza automáticamente por


el aparato. El captador de aerosoles pasa una revisión por el fabricante
anualmente donde se comprueba esta auto-calibración siguiendo las
normas ISO correspondientes.

9. Descripción de la Técnica

Instalación del captador de aerosoles: La instalación del captador de


aerosoles se realiza en el sobre-puente. El captador está conectado a
una veleta que desconecta el aparato cuando el aire viene de la mitad
posterior del barco (afectado por los humos de éste). El captador y la
veleta deben estar bien atados/anclados para que no se muevan ni un
milímetro con el movimiento del barco.

Proceso de cambio de filtro


1- Se limpian previamente las pinzas con acetona.
2- Se desenvuelve los filtros. El papel de aluminio se guarda
preferiblemente en una bolsa de plástico.
3- Con las dos pinzas limpias se coge el filtro i se pone en el cabezal
porta-filtros del captador de aerosoles.
4- Se programa el aparato para filtrar 40 m3/hora de aire durante 48
horas.
5- Al empezar, tomar nota del volumen total de aire que indica el
aparato i el número de filtro.
6- Después de 48 horas se abre el cabezal porta filtros, se saca el
filtro con las pinzas y se dobla por la mitad (con los aerosoles
hacia dentro). Finalmente se envuelve el filtro con papel de
aluminio.

289
7- Los filtros envueltos se guardan dentro de bolsas de plástico y
congelados a -20C.
8- IMPORTANTE – Apuntar al final, el volumen de aire filtrado.
9- Comprobar que el “estadillo” está correctamente rellenada.
Todas las casillas de la fila de la muestra deben contener datos.
10- IMPORTANTE - Después de la campaña, las muestras deben
permanecer congeladas hasta que lleguen a Cartagena.

10. Cuadro sinóptico de la técnica

Falta esquema gráfico

11. Calculo de los resultados.

El único cálculo a realizar es el del volumen de aire muestreado, que se


realiza por la sustracción de la lectura de volumen inicial a la del
volumen final.

12. Control de calidad

En control de calidad de la lectura del volumen se realiza por el


fabricante. En el caso de muestreadotes viejos hay que corregir el
volumen muestreado utilizando la ecuación de los gases

290
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Titulo de la técnica

Muestreo de aerosoles PM2.5.

Este documento se refiere al muestreo de la población de aerosoles con


tamaño inferior a 2.5 um, llamado PM2.5

3. Autores del documento y filiación

Jordi Dachs
IDAEA-CSIC, Barcelona, Catalunya, España.

4. Finalidad. Campo de aplicación

Esta técnica permite el meustreo de la población de aerosoles con


tamaños de partícula mayores que 0.7 um y menores que 2.5 um,
aunque aerosoles más pequeños (0.3-07 um) pueden también
muestrearse semi-cuantitativamente. Con esta técnica se pretende la
recolección de muestras de aerosoles que permitan después el análisis
de una gran variedad de compuestos (nutrientes, contaminantes
orgánicos, carbonilla, materia orgánica, isótopos del S y el N, etc).

5. Conceptos generales

Los aerosoles presentan un vector importante para el transporte de


materiales a larga distancia. Después del transporte atmosférico puede
depositarse al océano y contribuir al ciclo de los nutrientes, carbono o
contaminantes. El muestreo de aerosoles pequeños permite evitar el
muestreo de los aerosoles de mayor tamaño y así centrarse en los
aerosoles con mayor capacidad de transporte y que tienen un impacto
en la salud humana mayor.

6. Equipamiento necesario

El equipamento necesario de divide entre el aparato de muestreo de


aerosoles, y el fungible necesario para realizar el cambio de muestra.

- Captador de aerosoles de alta capacidad


- Cabezal para aerosoles PM2.5. Adaptado a filtros de 15 cm de
diametro.

291
El modo de funcionamiento de los captadores está descrito en el
correspondiente manual.

7. Reactivos u otro material fungible

- Filtros GFF de 15 cm (Whatmann), previamente acondicionados.


Los filtros se muflan a 450 C en el laboratorio durante 6 horas.
Posteriormente se envuelven en papel de aluminio. Una vez a
temperatura ambiente se taran y se numeran con el código
correspondiente. Se guardan los filtros envueltos y dentro de una
bolsa zip de forma individual.
- Pinzas de acero inoxidable
- Acetona de alta pureza (Merck)
- Pipetas pasteur previamente muflidas y guardadas en papel de
aluminio y bolsas zip.
- Papel de aluminio
- Bolsas ZIP
- Cinta aislante (a usar como etiqueta)

8. Calibración

La calibración del volumen de muestro se realiza automáticamente por


el aparato. El captador de aerosoles pasa una revisión por el fabricante
anualmente donde se comprueba esta auto-calibración siguiendo las
normas ISO correspondientes.

9. Descripción de la Técnica

Instalación del captador de aerosoles: La instalación del captador de


aerosoles se realiza en el sobre-puente. El captador está conectado a
una veleta que desconecta el aparato cuando el aire viene de la mitad
posterior del barco (afectado por los humos de éste). El captador y la
veleta deben estar bien atados/anclados para que no se muevan ni un
milímetro con el movimiento del barco.

Proceso de cambio de filtro


11- Se limpian previamente las pinzas con acetona.
12- Se desenvuelve los filtros. El papel de aluminio se guarda
preferiblemente en una bolsa de plástico.
13- Con las dos pinzas limpias se coge el filtro i se pone en el cabezal
porta-filtros del captador de aerosoles.
14- Se programa el aparato para filtrar 40 m3/hora de aire durante 48
horas.
15- Al empezar, tomar nota del volumen total de aire que indica el
aparato i el número de filtro.
16- Después de 48 horas se abre el cabezal porta filtros, se saca el
filtro con las pinzas y se dobla por la mitad (con los aerosoles

292
hacia dentro). Finalmente se envuelve el filtro con papel de
aluminio.
17- Los filtros envueltos se guardan dentro de bolsas de plástico y
congelados a -20C.
18- IMPORTANTE – Apuntar al final, el volumen de aire filtrado.
19- Comprobar que el “estadillo” está correctamente rellenada.
Todas las casillas de la fila de la muestra deben contener datos.
20- IMPORTANTE - Después de la campaña, las muestras deben
permanecer congeladas hasta que lleguen a Cartagena.

10. Calculo de los resultados.

El único cálculo a realizar es el del volumen de aire muestreado, que se


realiza por la sustracción de la lectura de volumen inicial a la del
volumen final.

11. Control de calidad

En control de calidad de la lectura del volumen se realiza por el


fabricante. En el caso de muestreadotes viejos hay que corregir el
volumen muestreado utilzando la ecuación de los gases

293
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Titulo de la técnica

Muestreo de aerosoles (TSP) y compuestos semi-volátiles en la fase gas.

3. Autores del documento y filiación

Jordi Dachs
IDAEA-CSIC, Barcelona, Catalunya, España.

4. Finalidad. Campo de aplicación

Esta técnica permite el muestreo de la población de aerosoles con


tamaños de partícula mayores que 0.7 um, aunque aerosoles más
pequeños (0.3-07 um) pueden también muestrearse semi-
cuantitativamente. Además se muestrean simultáneamente los
compuestos semi-volátiles que se encuentran en la fase gas.
Con esta técnica se pretende la recolección de muestras de aerosoles
que permitan después el análisis de contaminantes orgánicos
simultáneamente en la fase aerosol y la fase gas.

5. Conceptos generales

Los contaminantes orgánicos persistentes son semivolátiles, hydrofóbicos


y tienen capacidad para el transporte a larga distancia. Su presencia
en la atmósfera hace que se hayan transportado a todas las zonas del
planeta e impactan los ecosistemas cuando entran en estos mediante
deposición atmosférica. El muestreo simultaneo de las fases gas y
aerosol permite su determinación en la atmósfera y separar las dos fases
es importante para entender y predecir la manera por la que se
depositan, y así entran en los ecosistemas.

6. Equipamiento necesario

El equipamento necesario de divide entre el aparato de muestreo de


aerosoles ( con el porta-espumas para la fase gas), y el fungible
necesario para realizar el cambio de muestra.

- Captador de aerosoles de alta capacidad


- Cabezal para aerosoles TSP Adaptado a filtros de 8x10 pulgadas.
- Porta-espumas para espumas de 10 cm de diámetro y 10 cm de
largo.

294
El modo de funcionamiento de los captadores está descrito en el
correspondiente manual.

7. Reactivos u otro material fungible

- Filtros GFF de 15 cm (Whatmann), previamente acondicionados.


Los filtros se muflan a 450 C en el laboratorio durante 6 horas.
Posteriormente se envuelven en papel de aluminio. Una vez a
temperatura ambiente se taran y se numeran con el código
correspondiente. Se guardan los filtros envueltos y dentro de una
bolsa zip de forma individual.
- Espumas de poliuretano de 10 cm de diámetro y 10 cm de largo.
Las espumas han sido previamente extraídas con
acetona/hexano en Soxlet por 24 horas. Se han secado al vacío
en un desecador y guardado envueltas en papel aluminio y
bolsas zip.
- Pinzas grandes y pequeñas de acero inoxidable
- Acetona de alta pureza (Merck)
- Pipetas pasteur previamente muflidas y guardadas en papel de
aluminio y bolsas zip.
- Papel de aluminio
- Bolsas ZIP
- Cinta aislante (a usar como etiqueta)

8. Calibración

La calibración del volumen de muestro se realiza automáticamente por


el aparato. El captador de aerosoles pasa una revisión por el fabricante
anualmente donde se comprueba esta auto-calibración siguiendo las
normas ISO correspondientes.

9. Descripción de la Técnica

Instalación del captador de aerosoles: La instalación del captador de


aerosoles se realiza en el sobre-puente. El captador está conectado a
una veleta que desconecta el aparato cuando el aire viene de la mitad
posterior del barco (afectado por los humos de éste). El captador y la
veleta deben estar bien atados/anclados para que no se muevan ni un
milímetro con el movimiento del barco. En el caso que se instale el
porta-espumas, el anclaje del sistema es especialmente importante ya
que el captador con porta-espumas y porta-filtros es muy alto y se
mueve fácilmente.

Proceso de cambio de espuma:

1- Se limpian previamente las pinzas con acetona y el

295
portaespumas también con acetona.
2- Se desenvuelve la espuma y se coge con la pinza grande.
3- Se inserta la espuma en el porta-espumas de vidrio, se inserta
éste en el porta espumas de PCV.
4- Se coloca el portaespumas entre el muestreador CAV y el
portafiltros.
5- Se programa el aparato para filtrar 40 m3/hora de aire durante
24 horas.
6- Al empezar, tomar nota del volumen total de aire que indica el
aparato i el número de filtro.
7- Después de 24 horas se abre el cabezal porta filtros, se saca el
filtro con las pinzas y se dobla por la mitad (con los aerosoles
hacia dentro). Finalmente se envuelve el filtro con papel de
aluminio. Se saca la espuma con la pinza previamente lavada
con acetona y se envuelve con papel de aluminio. Después se
guarda dentro de dos bolsas zip. Importante que esté cerrado
herméticamente.
8- Los filtros y espumas envueltos se guardan dentro de bolsas de
plástico y congelados a -20C.
9- IMPORTANTE – Apuntar al final, el volumen de aire filtrado.
10- Comprobar que la tabla está correctamente rellenada. Todas
las casillas de la fila de la muestra deben contener datos.
11- IMPORTANTE - Después de la campaña, las muestras deben
permanecer congeladas hasta que lleguen a Cartagena.

Proceso de cambio de filtro

21- Se limpian previamente las pinzas con acetona.


22- Se desenvuelve los filtros. El papel de aluminio se guarda
preferiblemente en una bolsa de plástico.
23- Con las dos pinzas limpias se coge el filtro i se pone en el cabezal
porta-filtros del captador de aerosoles.
24- Se programa el aparato para filtrar 40 m3/hora de aire durante 48
horas.
25- Al empezar, tomar nota del volumen total de aire que indica el
aparato i el número de filtro.
26- Después de 48 horas se abre el cabezal porta filtros, se saca el
filtro con las pinzas y se dobla por la mitad (con los aerosoles
hacia dentro). Finalmente se envuelve el filtro con papel de
aluminio.
27- Los filtros envueltos se guardan dentro de bolsas de plástico y
congelados a -20C.
28- IMPORTANTE – Apuntar al final, el volumen de aire filtrado.
29- Comprobar que el “estadillo” está correctamente rellenada.
Todas las casillas de la fila de la muestra deben contener datos.

296
30- IMPORTANTE - Después de la campaña, las muestras deben
permanecer congeladas hasta que lleguen a Cartagena.

10. Calculo de los resultados.

El único cálculo a realizar es el del volumen de aire muestreado, que se


realiza por la sustracción de la lectura de volumen inicial a la del
volumen final.

11. Control de calidad

En control de calidad de la lectura del volumen se realiza por el


fabricante. En el caso de muestreadotes viejos hay que corregir el
volumen muestreado utilzando la ecuación de los gases

297
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Titulo de la técnica

Recolección de bioaerosoles atmosféricos sobre el océano

3. Autores del documento y filiación

Jesús María Arrieta (Imedea CSIC-UIB)


Eva Mayol (Imedea CSIC-UIB)

4. Finalidad. Campo de aplicación

Metodología para desarrollar un muestreo de aportes atmosféricos de


origen biológico (bioaerosoles) a lo largo de la derrota a realizar en la
expedición Malaspina. La obtención de un número apropiado de
microorganismos presentes en los aerosoles atmosféricos para
posteriores análisis cualitativos y cuantitativos se ha estimado que ocurre
a las seis horas de continuo muestreo (pruebas realizadas a priori), en
donde el aire debe venir de frente.

5. Conceptos generales

El muestreo de aportes atmosféricos de origen biológico (bioaerosoles)


pretende proporcionar datos sobre la abundancia, calidad y
procedencia de la fracción biológica de los aerosoles atmosféricos. Los
datos que existen al respecto son muy pocos, aunque existen indicios
que apuntan a una gran importancia de estas partículas biológicas
como núcleos de condensación y formación de partículas de hielo en
la atmósfera. Por otro lado, estudios recientes indican que el transporte
atmosférico podría ser un mecanismo importante de dispersión de
poblaciones microbianas, contribuyendo así a la mantención de la
diversidad microbiana en sistemas acuáticos.

6. Equipamiento necesario

Colector de aerosoles (Coriolis Delta). El instrumento se encuentra


equipado con un conjunto de accesorios desprendibles. Estos son:
a) aspiradora, b) cono receptor de muestra, c) botella plástica
portadora de la disolución, d) manguera. El instrumento deberá
montarse con los accesorios, siendo el resultado final tal como aparece
en la siguiente figura:

298
7. Reactivos u otro material fungible

Agua MQ

Cubeta de 10L con ácido (ácido al 37% diluido 100 veces con agua
MQ) para la limpieza de las piezas del colector (24 h sumergidas en
ácido antes de ser ocupadas)

Formaldehído al 37% (para fijar muestras)

Guantes, jeringas con filtro, micropipetas, puntas, calculadora

Solución 1: Consta en 50 ml de agua MQ + 2,5 ml de Triton X-100. Se


mezcla a mano por unos minutos. La solución se filtra con una jeringa a
un tubo falcon de 50 ml. Se guarda a 4ºC.

Solución 2 (a usar en colector): La botella del colector se llena con agua


MQ (250 ml) y se le agregan 250 ul de la solución 1. Esta solución se
hace cada vez que se va a muestrear.

8. Descripción de la Técnica

Estando en la zona anterior del barco (de frente al viento), se procedea


lo siguiente:

299
Se enciende el colector.

Se hace un control (control 1) que consta en dejar el colector en


funcionamiento por 1 min 40 seg o hasta que el colector deje de
bombear agua al cono. Se recoge el volumen colectado en un frasco y
se apunta en el cuaderno este volumen.

Se hace un segundo control (control 2) que consta en programar el


colector para que esté en funcionamiento por 10 min. Se recoge el
volumen colectado en un frasco y se apunta en el cuaderno este
volumen.

Se calcula el volumen necesario de relleno del cono.

Finalmente se realiza la recolección. Para esto se programa al colector


para que esté en funcionamiento por 360 minutos y para que se
autorrellene en X volumen de relleno (ml) por minuto.

Pasada las seis horas se recoge el volumen colectado en un frasco y se


apunta en el cuaderno este volumen.

El volumen final se rellenará hasta alcanzar 10 ml de volumen final,


siempre que haga falta. Para lo cual se usará la misma solución de la
botella. 5 de estos 10 ml serán fijados con 5 gotas de formaldehído al
37% y se guardarán en frío (4ºC). Los 5 ml restantes se usarán para
pruebas de PCR.
Ambos controles se llevan al laboratorio y se fijan con formaldehído al
37% (una gota de formaldehído por ml de muestra).

9. Cuadro sinóptico de la técnica

10. Calculo de los resultados

Para calcular el volumen de disolución, que debe ser bombeado al


cono por minuto, se realiza el siguiente cálculo:
Volumen de relleno (ml) = (volumen control 1 - volumen control 2) / 8.66

300
11. Control de calidad

La calidad de los resultados dependerá de lo prolijo que se haya sido


con la limpieza del instrumento. Así como dependerá del haber
procurado tomar muestras de aire que no fuesen afectadas por fuentes
contaminantes puntuales. Como lo podrían ser los mismos residuos
liberados por el barco a la atmósfera.
Como control de calidad se hace necesario proporcionar blancos en el
estudio previo a cada toma de muestra. Estos blancos consisten en 1)
toma de aire atmosfércio durante 1 min. 40 seg; y 2)toma de aire
atmosférico durante 10 min. Tal como ha sido indicado en el protocolo.

301
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Título de la técnica

Muestreo de compuestos orgánicos en el fitoplancton de la zona fótica


de la columna de agua (hasta el DCM).

3. Autores del documento y filiación

Jordi Dachs
IDAEA-CSIC, Barcelona, Catalunya, España.

4. Finalidad. Campo de aplicación

Los compuestos orgánicos semi-volátiles se encuentran en la fase


disuelta y particulada, y de estas, al ser hidrofóbicos, se concentran al
fitoplancton marino. Aquí se describe la metodología para el muestreo
de muestras de plancton para su posterior analisis en contenido de
contaminantes orgánicos persistentes.

5. Conceptos generales

La metodología permite el muestreo de material particulado


(fitoplancton, partículas grandes, algo de zooplancton) en cantidades
suficientes para el análisis de contaminantes orgánicos.

6. Equipamiento necesario

- Recipiente de vidrio (0.5 L o 1 L) previamente acondicionado. En


orígen será muflado. En el barco se lavará con acetona,
posteriormente con abundante agua de mar del continuo.

- Rede de 60 cm de diámetro y 50 o 100 um de luz de malla.

- peso de 20 kg.

7. Reactivos u otro material fungible

- Varios Filtros GFD de 4.7 cm (Whatmann), previamente


acondicionados. Los filtros se muflan a 450 C en el laboratorio
durante 6 horas. Posteriormente se envuelven en papel de
aluminio. Una vez a temperatura ambiente se taran y se numeran
con el código correspondiente. Se guardan los filtros envueltos y
dentro de una bolsa zip de forma individual.
- Pinzas de acero inoxidable

302
- Acetona de alta pureza (Merck)
- Pipetas pasteur previamente muflidas y guardadas en papel de
aluminio y bolsas zip.
- Papel de aluminio
- Bolsas ZIP pequeñas
- Cinta aislante (a usar como etiqueta)

8. Calibración

Se apuntará en el estadillo la profundidad de los lances y el número de


lances realizados. Para cada filtro GFF se determina el volumen de agua
filtrado y la fraccion que representa respecto al total.

9. Descripción de la Técnica

Lavado del material


- El cubilete de la red se limpia antes de la pesca con acetona y
después con abundante agua demar
- El pote de vidrio se limpia con el mismo proceso.

Pesca vertical

-
1- Se limpia la red y el cubilete con agua de mar
2- Se hacen tantos lances como sea posible hasta debajo del
DCM (a DCM+ 20 m o según indique el ctd). Los lances se
hacen bajando la red a 30-40 m/min y subiendo la red a 20
m/min. Cuando las condiciones de la mar no son buenas, se
sube a velocidades más lentas.
3- En cada lance, se vierte el agua del cubilete en un jarro
previamente muflado en el laboratorio (ver arriba).
4- Se etiqueta el jarro y al final de los lances se lleva al
laboratorio.
5- Se filtra la muestra de plancton con filtros GFD previamente
muflados y pesados. Cuando se colmata se usa otro filtro.
6- Se dobla el filtro con unas pinzas previamente lavadas con
acetona y se guardan en una bolsa zip a -20C.
7- Se apunta toda la información sobre las pescas en el
estadillo.

10. Cuadro sinóptico de la técnica


Falta esquema

303
11. Calculo de los resultados.

El volumen de agua se calcula con el número de lances y la profanidad


de muestreo.

12. Control de calidad

Es necesario realizar los blancos de campo necesarios. Se guardarán


filtros GFD, sin contenido de muestra, para usar como blancos. También
se muestrea agua de mar que ha pasado por el cubilete para
determinar si la red/cubilete contamina la muestra.

304
BLOQUE 5

ÓPTICA, FITOPLANCTON, PRODUCCIÓN Y METABOLISMO


EN EL OCÉANO GLOBAL

MÉTODOS, TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS

305
1. Técnicas Analíticas

2. Determinación de los espectros de absorción de la luz por las partículas

3. Autores del documento y filiación

Cristina Sobrino. Universidad de Vigo


Susana Agustí.Raquel Gutierrez, Instituto Mediterráneo de Estudios Avanzados

4. Finalidad. Campo de aplicación

El espectro de absorción de luz del fitoplancton es un parámetro importante


dentro de los modelos bio-ópticos, especialmente aquellos relacionados con la
interpretación del color del océano. También nos da información acerca de la
estructura de la comunidad fitoplanctónica, la producción primaria y la
penetración de luz en la capa superficial del océano.

5. Conceptos generales

El cálculo del coeficiente de absorción de luz (a(λ)) por las partículas juega un
papel importante en la determinación de la variabilidad óptica de la columna de
agua. Entre los principales contribuyentes a los procesos de absorción de luz en la
columna de agua cabe destacar el papel del fitoplancton. Otros son la materia
inorgánica particulada y la materia detrítica. La contribución de cada uno de
ellos a a(λ) varía dependiendo de la localización, las poblaciones fitoplanctónicas
predominantes y las características de la masa de agua.
La técnica que se describe a continuación consiste en cuantificar la cantidad de
luz que es absorbida por las partículas retenidas en un filtro de fibra de vidrio.

6. Equipamiento necesario

Espectrofotómetro

Equipo de filtración

- bomba eyela
- rampa de filtración
- pinzas de sujeción

306
- soporte y columna de filtración graduada
- tapón con tubo de succión

7. Reactivos u otro material fungible

Filtros 25 mm Whatman GF/F


Agua de mar
Pinzas
Filtros millex 0.2
Jeringas
Placas petri 4 divisiones
Pipetas pasteur
Papel de aluminio
Botes de muestreo
Probeta de plástico 1000 ml
Tubos eppendorf
Pegatinas pequeñas de etiquetado
Lápiz
Bolsas ciplop pequeñas
A. Clorhidrico
Guantes
Material antideslizante

8. Calibración

La propia del espectrofotómetro

9. Descripción de la Técnica

Filtración: Se tomarán muestras de 250 mL a 3L (hasta observar color en el


fitlro), dependiendo de la masa de agua, que se concentrarán por
filtración a baja presión (aprox. 100 mm Hg) en filtros de 25 mm Whatman
GF/F.

Vol. Diámetro de
Fecha Estación Muestra Profundidad (ml) Filtrado(ml) filtración (mm)
24-05-2010 1 1 3 1300 15
24-05-2010 1 2 20 1500 16
24-05-2010 1 3 40 2000 15
24-05-2010 1 4 70 1500 15
24-05-2010 1 5 90 1500 16

Ahí que tener en cuenta a la hora de filtrar que la muestra no se concentre


toda en el mismo punto del filtro.

307
Tras la filtración, el filtro se mantendrá húmedo (añadiendo unas gotas de
agua d emar filtrada) y en oscuridad hasta la lectura, lo más
inmediatamente posible, en el espectrofotómetro.

Lectura en espectrofotómetro: La densidad óptica (DO) de las partículas


concentradas en el filtro se medirá en un espectrofotómetro, a ser posible
de doble haz. Como blanco se utilizará un filtro Whatman GF/F limpio
humedecido en el agua de mar filtrada. Para reducir la dispersión de la luz,
el filtro se colocará sobre la entrada del haz de luz del espectrofotómetro
con la cara con las partículas enfrentadas hacia el haz de luz entrante.

A continuación se medirá la DO en intervalos de 1 nm entre 280 y 750 nm.

# Configuración del espectrofotómetro.


-encender espectrofotómetro
-encender ordenador
-abrir programa UVPC.exe
-comprobar que en en el interior no hay soporte de cubetas, es decir esta vacío.
-Inicialización- Línea base (ajuste de la señal a cero)

-Modo de adquirir-Espectro-Configurar-Parámetros
Elegir los siguientes parámetros
Absorbancia
Rango de registro, Bajo: 0 - Alto: 0.5
Inicio: 750 nm – Fin: 280 nm
Velocidad: rápido
Rendija: 2
Intervalo(nm) : 1
Confirmar: OK

# Obtención de datos
-crear una carpeta en UVPC.exe
-archivo - canal - guardar canal – todos – Ok
-traducción de datos – export ASC II – todo

# Extracción de datos en Excel


-excel- abrir
-datos – obtener datos externos – importar datos
-marcar – abrir
-delimitado
-tabulado-punto y coma
-hoja de cálculo existente
-considerar separadores consecutivos como uno solo
-origen de archivo MS-DOS PC-8

308
-finalizar

Resultado

Long. Onda Abs-sup Abs-20m Abs-35m Abs-50m Abs-60m


750.00 0.0689 0.2691 0.0966 0.1009 0.0865
749.00 0.0674 0.2775 0.0969 0.1016 0.0865
748.00 0.0663 0.2843 0.0964 0.1029 0.0861
747.00 0.0675 0.2927 0.0965 0.1033 0.0857
etc ….. ….. ….. ….. …..

Cálculo del a(⎣): Aplicando la ecuación (1) se calculará la absorción de la


luz por el material particulado.

10. Calculo de los resultados.

Las medidas de DO se transformarán a coeficientes de absorción de la luz


por las partículas (ap(λ), m-1) aplicando la ecuación 1:

ap(λ) = 2.3 ODf(⎣) C / V ß (⎣) Ec. 1

donde ⎣ es la longitud de onda (nm), 2.3 es el factor para convertir el


logaritmo en base 10 al logaritmo natural, ODf(⎣) es la densidad óptica del
filtro con las partículas, a acad longitud d eonda, C es el área del filtrado
(m2), V el volumen de agua filtrada (m3) y ß es el factor de amplificación
del paso de luz de los filtros calculado según Bricaud & Stramski (1990),
siguiendo la ecuacion:

ß (⎣) = 1.63 ODf(⎣) -0.22 Ec. 2

11. Almacenamiento de la muestra

Una vez realizada la medida en el espectrofotómetro se procederá a


guardar el filtro con la muestra en tubos eppendorf, de manera que la cara
del filtro con color quede hacia dentro y procurando que no se doble.

309
Etiquetado del tubo eppendorf:
Se escribirá en pegatinas pequeñas y con lápiz las siguientes anotaciones.

Fecha:
Estación:
Muestra:
Profundidad:

Estás etiquetas irán pegadas en los tubos eppendorf.


Las muestras serán almacenadas en bolsas pequeñas ziplop, donde cada
bolsa corresponderá a una estación y a una temperatura de -20ºC.

12.Limpieza

Todo el material debe estar escrupulosamente limpio, se puede utilizar un baño


con HCL al 37% donde dejaremos el material inmerso hasta previo uso. Lavar bien
con agua destilada.

13. Cuadro sinóptico


Agua de mar
Blanco

Filtración
Filtro Whatman GF/F
Millex 0.2

Muestra

Botellas de muestreo Equipo de filtración Filtro Whatman GF/F Espectrototómetro

310
11. Referencias

Bricaud, A., and D. Stramski (1990). Spectral absorption coefficients of living


phytoplankton and nonalgal biogenous matter: A comparison between the Peru
upwelling area and the Sargasso Sea, Limnology and Oceanography, 35 , 562-582

311
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Título de la técnica

Muestreo de fitoplancton desde las botellas Niskin

3. Autores del documento y filiación

Estrada, Marta
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona

4. Finalidad. Campo de aplicación

Cuantificación de la abundancia fitoplanctónica a partir de muestras de agua


tomadas de las botellas Niskin de la roseta del BIO Hespérides.

Las muestras se introducen en un frasco y se fijan para su estudio posterior


mediante la técnica del microscopio invertido. Para ello, se sedimenta un
volumen de muestra (generalmente unos 100 ml, para aguas oceánicas) en una
cámara de sedimentación compuesta (constan de un cilindro que reposa sobre
una cubeta de 5 mm de alto con un vidrio muy delgado de fondo). Al cabo de
un tiempo (unas 72 horas para 100 m de muestra) , el fondo de la cubeta se
examina a diversos aumentos.

5. Conceptos generales

Este método de muestreo sirve básicamente para estimar la abundancia y


composición de las poblaciones de nano y microfitoplancton; no es adecuado
para picofitoplancton. Hay que tener en cuenta también que una gran parte de
los flagelados desnudos se degradan rápidamente en muestras fijadas.

6. Equipamiento necesario

Botellas Niskin de la roseta (para aguas superficiales sirve cualquier otro sistema,
por ejemplo, un cubo, que permita extraer agua sin agitarla excesivamente).

7. Reactivos u otro material fungible

Botes de vidrio de color ámbar de 250 ml.

Hay que utilizar vidrio de calidad suficiente para evitar el desprendimiento de


láminas. El siguiente material ha dado buen resultado en el IEO:

- Frasco de vidrio con tapa de rosca, boca ancha, color ámbar de Afora, de 125
ml, referencia Afora # LA 80125. Obturador número Afora # LA80010)

312
- Frasco de vidrio, con tapa de rosca, boca ancha color ámbar 250 ml, ("Frasco
Merck"); Afora # LA80250. Obturador (para "Frasco Merck") Afora # LA80011

Fijadores: formol-hexamina (para fabricación del fijador ver protocolo de


cuantificación de fitoplancton mediante el uso de redes)

8. Calibración

No aplicable.

9. Descripción de la Técnica

Se llenarán frascos de vidrio de 250 ml, previamente enjuagados con la misma


agua, con muestras de agua de 5 m, DCM y una profundidad intermedia (250 ml
permitiría replicar la observación microscópica de la muestra, si fuese necesario;
en caso de haber problemas de cantidad de agua de las botellas se podrían
tomar sólo 120 ml de muestra, suficientes para llenar una columna de
sedimentación de 100 ml). Se añadirán 2 ml de formol-hexamina por cada 100 ml
de muestra y se cerrará el frasco herméticamente. Indicar en el frasco la fecha, la
estación/número de CTD y la profundidad de obtención de la muestra.

10. Cuadro sinóptico de la técnica

Toma de la muestra Fijación con 2 ml de Etiquetado y


desde las botellas formol-hexamina por cada almacenamiento de la
Niskin 100 ml de muestra muestra fijada

11. Calculo de los resultados.

No aplicable.

12. Control de calidad

Hay que cuidar de fijar las muestras lo más rápidamente posible y guardarlas al
abrigo de la luz, de excesivo calor y de posibilidades de ocngelación.

313
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Título de la técnica

Muestreo de fitoplancton utilizando redes

3. Autores del documento y filiación

Estrada, Marta
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona

4. Finalidad. Campo de aplicación

Esta metodología de muestreo tiene como objetivo filtrar grandes volúmenes de


agua y concentrar cantidades importantes de microfitoplancton. La principal
desventaja de las redes es que no son adecuadas para muestreos cuantitativos,
entre otras razones porque la composición taxonómica de la comunidad retenida
depende del tamaño de malla y de características de la misma comunidad.
Además, es difícil determinar el volumen de agua filtrado.

5. Conceptos generales

Se trata de un método cualitativo para contribuir a estimar la biodiversidad del


microfitoplancton en la zona de muestreo

6. Equipamiento necesario

Red de fitoplancton de 37 μm de tamaño de poro provista de un peso adecuado


(el tamaño de poro seleccionado representa un compromiso entre el tamaño del
plancton retenido y la posibilidad de filtrar un volumen importante de agua).

7. Reactivos u otro material fungible

Bote de plástico o vidrio de 250 ml para recoger el material biológico.

Fijadores Formol-hexamina y Lugol ácido.

Fabricación de los fijadores:

Formol-hexamina:
Se diluye formol (aldehido fórmico al 40%) con un volumen igual de agua
destilada (se obtiene aldehido fórmico al 20%) y se añaden 100 g de
hexametilentetramina (hexamina) por cada litro de esta solución (puede quedar
polvo sin disolver en el fondo del frasco).

314
Lugol ácido:
Se disuelven 100 g de KI en 1 litro de agua destilada; se disuelven seguidamente
50 g de yodo cristalino y se añaden 100 ml de ácido acético glacial.

8. Descripción de la Técnica

8.1 Arrastres verticales u oblicuos

La red deberá ir provista de un peso adecuado (puede engancharse al final del


cable o de modo que quede por debajo del cubilete). Se bajará la red hasta
unos 200 m y se izará a una velocidad que no supere 0.5 m s-1. Si se necesita más
biomasa, puede hacerse un arrastre oblicuo. En este caso, la bajada e izado de
la red se hacen mientras el barco está en movimiento.

8.2 Arrastres horizontales

Se baja la red a una profundidad determinada (idealmente determinada con un


sensor; si no, se estima a partir de la longitud de cable largado y el ángulo del
cable) se arrastra durante un tiempo a esta profundidad. La velocidad de arrastre
es de unos 2-3 nudos. El tiempo de arrastre depende de la abundancia de
fitoplancton en la zona (por ejemplo, 10 minutos).

Recogida de la muestra

Después del arrastre, se rociará la red con agua de mar para hacer bajar el
material adherido al tejido de la manga hacia el cubilete y se verterá el
contenido de éste en un bote de plástico o de vidrio (de 250 ml), al que se
añadirá la cantidad necesaria de fijador (véase más abajo). Es importante que
las muestras queden bien tapadas; las botellas de plástico suelen dar problemas
en este aspecto. Indicar en el frasco la fecha, la estación, el tipo de pesca y la
profundidad alcanzada.

Fijación de la muestra

No hay un fijador que vaya bien para todos los grupos de fitoplancton. Uno de los
más utilizados es el formol-hexamina. Dinoflagelados y flagelados desnudos se
conservan mejor con Lugol (pero éste, sobre todo si es Lugol ácido, va mal para
los cocolitóforos). A veces, puede ser conveniente conservar muestras duplicadas
en formol-hexamina y en Lugol.

Formol-hexamina: En muestras muy densas se añaden unos 20 ml por 70 ml de


muestra (para muestras de agua no concentradas se utilizan 2 ml de formol-
hexamina por 100 ml de muestra).

Lugol: Se añade la cantidad de fijador necesaria para que la muestra adquiera


un color marrón pálido.

315
Documentación fotográfica de la muestra

Es interesante hacer observaciones de plancton vivo. Para ello, antes de la


fijación se tomará una pequeña cantidad de muestra (unos 2.5 ml) que se
introducirá en la parte del fondo de una cubeta de sedimentación y se observará
con el microscopio invertido. Se tomarán fotografías de conjunto y de organismos
interesantes que se hayan detectado (es importante que el nombre de las fotos
sea suficientemente explícito para que después no haya confusiones).

9. Cuadro sinóptico de la técnica

Arrastre

Lavado a fondo de la red con agua de


mar, concentración del material
biológico en el cubilete y traspaso de
éste al bote de vidrio/plástico
debidamente etiquetado

Creación de dos submuestras


de X ml cada una

Introducción de 2.5 ml de
Fijación. muestra en la cubeta de fondo
de una cámara de
Una submuestras será fijada sedimentación y observación
con formol-hexamina y otra al microscopio invertido.
con Lugol ácido Documentación fotográfica de
la muestra

10. Calculo de los resultados.

Hay que anotar el diámetro y tipo de malla de la red, el tipo de arrastre (vertical,
horizontal, oblicuo), tiempo de arrastre, velocidad del barco, longitud de cable
largado. En teoría, si se observan Nm células en v mililitros de muestra, la
abundancia in situ (Nis) se podría calcular como:
Aa

316
Arrastres verticales (a barco parado)

Nis = (Nm/v)*Vm/(h*πr2), donde Vm es el volumen total de muestra, r es el radio de


la manga y h es la profundidad de muestreo.

Arrastres horizontales y oblicuos

Nis = (Nm/v)*Vm/(s*t*πr2), donde Vm es el volumen total de muestra, s es la


velocidad del barco durante el arrastre, t el tiempo de arrastre y r el radio de la
manga.

En las dos fórmulas anteriores, el paréntesis de la derecha representa el volumen


de agua filtrado por la manga; puede ser estimado directamente si se dispone de
un medidor de flujo.

En la práctica, sin embargo, tales expresiones son poco útiles, porque parte del
agua que pasa por la boca de la malla acaba volviendo hacia afuera sin filtrarse.

11. Control de calidad

Hay que lavar bien las redes después de cada utilización. Esto puede hacerse, en
principio, enjuagando con agua de mar, pero hay que tener en cuenta que este
sistema no elimina del todo la contaminación entre muestras. Si se pasa de una
zona rica a una pobre debería lavarse la red con detergente y agua dulce (para
más detalles véase Tangen, 1978).

El yodo de las muestras fijadas con Lugol es fotosensible y volátil. Hay que cuidar
que las muestras almacenadas queden protegidas de la luz y de temperaturas
demasiado altas o que puedan dar lugar a congelación.

12. Referencias

Tangen, K.- 1978. Nets. En: Sournia, A., (ed.), Phytoplankton Manual. UNESCO, París,
pp. 50-58.

317
1. Metodología de muestreo

2. Título de la técnica

Muestreo de cocolitóforos

3. Autores del documento y filiación

Estrada, Marta
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona

4. Finalidad. Campo de aplicación

Identificación y cuantificación de cocolitóforos. Estas microalgas poseen una


cubierta de plaquitas calcáreas o cocolitos. En muestras de agua fijadas tiene
lugar una importante disolución de estos cocolitos; por ello, en este método, la
muestra de agua se filtra lo más rápidamente posible, sin fijación previa. Es
importante, además, que el lavado sea con agua que no sea ácida; por ello,
debe utilizarse agua mineral adecuada.

El rango de medición depende de la cantidad de agua filtrada y de la


concentración de cocolitóforos en esta agua. estos datos no se suelen conocer
con antelación a la toma de muestras, por lo que aquí se dan recomendaciones
generales.

5. Conceptos generales

Los cocolitóforos caracterizan el grupo funcional de fitoplancton calcificador y


tienen gran importancia en los balances carbónico-carbonatos del oceáno. A
corto plazo, la calcificación asociada a la formación de cocolitos libera CO2 al
medio; a escalas geológicas, sin embargo, la sedimentación de cocolitos al
fondo del océano contribuye a secuestrar una importante cantidad de carbono.

6. Equipamiento necesario

Frascos de plástico de 0.5 l para el muestreo.

Rampa de filtración.

Estufa o fiambrera de plástico en la que se pueda hacer el vacío.

7. Reactivos u otro material fungible

Filtros de policarbonato de 0.6 ó 0.8 μm de diámetro de poro y 25 mm de


diámetro de filtro.

318
Filtros de soporte de ésteres de celulosa (de 3-5 μm de tamaño de poro; este filtro
se puede reutilizar).

Cápsulas de plástico para secar y para guardar los filtros. Sirven cápsulas de Petri.
En cada una de ellas se pueden acondicionar 5-6 filtros que se fijan mediante
cinta adhesiva o un trocito de Post-it enganchado en un extremo.

Agua mineral (no se puede utilizar agua destilada porque disuelve los cocolitos)

8. Calibración

No aplicable. Las muestras se examinan en el laboratorio por medio de un


microscopio electrónico de barrido.

9. Descripción de la Técnica

En las estaciones seleccionadas, se tomarán muestras de 5 m, el DCM y una


profundidad intermedia (si hubiese problemas de volumen de agua, se
podría tomar una muestra del contínuo). Se filtrarán 250-500 ml de agua (el
volumen será mayor en zonas más oligotróficas) a través de filtros de
policarbonato de 0,6 ó 0,8 μm de tamaño de poro y 25 mm de diámetro,
que se colocarán sobre un filtro de soporte de ésteres de celulosa de 3-5
μm de tamaño de poro; este filtro sirve sólo como cojín del filtro superior de
policarbonato y se puede reutilizar (se recomienda este tipo de material
porque es de uso corriente y tiene un grosor adecuado). Una vez filtrada el
agua de mar se lavará el filtro de policarbonato con 1 ml
(aproximadamente) de agua mineral (se puede echar con una pipeta
pasteur). Se saca el filtro, se introduce, con el filtrado en la parte superior,
en una cápsula y se deja secar durante unos minutos (en un desecador o
encima de la poyata, procurando protegerlo del polvo y de vapores
ácidos. Una vez seco, se escribe cuidadosamente el número de
identificación en un extremo del filtro y se introduce éste en una placa de
Petri, a la que se fija con un poco de cinta adhesiva transparente (caben
unos 5-6 filtros en cada placa de Petri). Una vez llena, se sella la placa con
cinta adhesiva. Conviene guardar lal placas de Petri llenas en una estufa a
30-40ºC o en un recipiente hermético hasta su traslado al laboratorio de
tierra. Es importante no invertir el filtro (para evitar pérdidas de material
filtrado) y evitar su exposición a vapores ácidos.

319
10. Cuadro sinóptico de la técnica

Muestra de agua de mar


(V variable desde 0.25 l en
zonas productivas a 0.5 l en
regiones oligotróficas

Filtración a través de un filtro de


policarbonato, 0.6 ó 0.8 μm de poro

Lavado con agua mineral

El filtro se introduce en una cápsula


que se coloca en una estufa a
30-40º C o en una fiambrera en la
que se ha hecho el vacío

11. Calculo de los resultados.

Debe apuntarse el volumen de agua filtrado y la superficie útil de filtración.

12. Control de calidad

Es importante filtrar la muestra con prontitud, mantener limpio el material de


filtración y evitar la exposición del filtro a vapores ácidos.

13. Referencias

Cros, L., Fortuño, J.-M. 2002. Atlas of Northwestern Mediterranean


coccolithophores. Scientia Marina, 66 (Sppl. 1): 1-186.

320
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Título de la técnica

Toma de muestras de fitoplancton mayor de 20 μm para análisis de imagen

3. Autores del documento y filiación

Enrique Moreno-Ostos, José María Blanco Martín, Andreas Reul, Valeriano


Rodríguez y Jaime Rodríguez

Dpto. Ecología y Geología. Universidad de Málaga.

4. Finalidad. Campo de aplicación

Toma de muestras sobre las que posteriormente se llevará a cabo análisis de


imagen que permita extender la información adquirida mediante citometría de
flujo y modelar el espectro de tamaños del fitoplancton completo

5. Conceptos generales

La representación macroscópica del plancton implícita en las distribuciones de


abundancia de los diferentes tamaños de organismos se revela como una
herramienta importante en el estudio de la estructura y del comportamiento
dinámico del ecosistema pelágico, en el que el medio fluido, los organismos vivos
y las partículas no vivas se acoplan a diferentes escalas. Debido a la relevancia
de las relaciones entre tasas fisiológicas y tamaño individual, el enfoque se asienta
sobre bases sólidas de carácter termodinámico y evolutivo. El estudio de la
estructura de tamaños del plancton sirve de escenario para el análisis de
conceptos, teorías y observaciones que entremezclan ecología, biología
evolutiva, teoría de la información y termodinámica en busca de una única,
sencilla y profunda (aunque elusiva) explicación de la diversidad y complejidad
de los sistemas naturales. Al mismo tiempo, la aplicación del enfoque en el terreno
de lo empírico lo muestra como una herramienta excelente en el estudio de los
ecosistemas pelágicos y comunidades planctónicas a través del acoplamiento
entre Física y Biología a diferentes escalas. La elaboración de los espectros de
tamaño requiere extender la información de abundancia-tamaño recabada
mediante citometría de flujo (rango aproximado 1-15 micras) a grupos de
microalgas de mayor tamaño (rango de células mayores de 15 micras) utilizando
para ello procedimientos de Análisis de Imagen.

321
6. Equipamiento necesario

Dispositivo de filtración

7. Reactivos u otro material fungible

Frascos de vidrio color topacio de 125 ml de volumen.


Mallas de 20 μm de tamaño de poro
Lugol acético

8. Descripción de la Técnica

• Origen del material biológico: La profundidad de toma de las muestras


corresponderá, en términos generales, a superficie, DCM y una profundidad
intermedia entre ambas. La elección de profundidades debe hacerse de forma
congruente con el resto de variables fitoplanctónicas analizadas, tales como
pigmentos, viabilidad celular, metabolismo y producción primaria.

• Tamaño de la muestra: Para garantizar la presencia en cantidades fiables de


células grandes el volumen de muestra debe ser de 4 litros

• Proceso de la muestra a bordo:


Una vez tomadas las muestras se procederá a su filtración a través de mallas de
20 micras de diámetro de poro. El material retenido en el filtro se lavará con agua
de mar filtrada sobre un frasco de cristal color topacio de 125 mL de volumen.
Seguidamente se fijará el material obtenido utilizando para ello 2 mL de lugol
acético.

• Etiquetado de la muestra:

Una vez fijada la muestra deberá ser convenientemente etiquetada. La etiqueta


deberá presentar la siguiente información:

Fecha (dd.mm.aaaa)
Leg
Estación (número y coordenadas)
Profundidad

Finalmente, la muestra fijada y etiquetada se guardará dentro de una caja de


plástico en un baúl especialmente habilitado al efecto. Las cajas de plástico
dentro del baúl general también presentan una etiqueta que habrá que rellenar
al completarla. Una vez completada cada caja de plástico, deberá pasar al
fondo del baúl ocupando el lugar de una nueva una caja de frascos vacíos que
pasará a la capa superficial del baúl para ser rellena de muestras.

• Proceso en el laboratorio: Una vez en el laboratorio de Análisis de Imagen de la


Universidad de Málaga, se procederá al recuento y medida de las distintas

322
células utilizando para ello un microscopio invertido Leica dotado de una cámara
digital AVT Pike 145C y un sistema informático de alto rendimiento provisto de
Software específico para Análisis de Imagen semiautomático interactivo con el
usuario, que debe reconocer los grupos y características celulares.

• Final: La tarea se completará con el acoplamiento de los datos de Citometría


de Flujo y de Análisis de Imagen para modelar el espectro de
abundancia/tamaño para la comunidad de fotoautótrofos.

9. Cuadro sinóptico de la técnica

323
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Técnicas analíticas

2. Titulo de la técnica

Cuantificación del metabolismo de la comunidad pelágica mediante el método


Winkler

3. Autores del documento y filiación

Nuria Navarro
Universidad Rey Juan Carlos (URJC)

4. Finalidad. Campo de aplicación

Metodología para la determinación de las tasas de producción primaria bruta,


neta y respiración de la comunidad planctónica mediante el método Winkler.
Con ello se consigue una estima de la variación y biogeografía del metabolismo
de la comunidad pelágica.

5. Conceptos generales

Un predominio de la respiración sobre la producción planctónica (comunidad


heterotrófica) se traduciría en un flujo de CO2 hacia la atmósfera, que será hacia
el océano cuando dominen los procesos autotróficos, con importantes
consecuencias en el balance de carbono global. Por tanto es crucial evaluar el
metabolismo de las comunidades planctónicas, es decir, cuantificar la
producción bruta (GPP), la producción neta (NCP) y la respiración (R) del
plancton.

6. Equipamiento necesario

• Incubadores de cubierta: un tanque superficial refrigerado con agua del


continuo para las incubaciones de superficie e incubadores cilíndricos de
metacrilato para las otras 2 profundidades (DCM e intermedia) con
refrigeradores en cubierta.

324
• 2 Refrigeradores de cubierta + 2 bombas
• Mallas de distinta transparencia
• Titroprocesador (dos): Titrino 716 DMS (Metrohm) y Titrando 808 (Metrohm)

Es importante montar correctamente los tituladores, prestando atención a la


conexión del electrodo. El electrodo a utilizar es el Pt Combinado.

Montaje y utilización de los titroprocesadores

TITRINO 716 DMS

Es muy importante realizar correctamente las conexiones en la parte trasera del


titulador.
ELECTRODO

325
1. Encender el titrino en la parte posterior izquierda
2. Aparecerá una pantalla de System test, seguida de la pantalla principal de
medida. Aquí en la parte superior de la derecha aparece el método que está
cargado. Para esta campaña usar el método OXIGENUR.

3. Si no aparece este método apretar en el mando de control el botón del


número 3 (tiene escrito User method).
4. Aparecerá una pantalla que te indica cargar método => apretar enter del
mando de control

5. Aparecerá una nueva pantalla donde en la parte inferior derecha aparecen


los métodos que el Titrino tiene cargados. Para pasar de uno a otro y buscar el
OXIGENUR apretar select hasta que encontremos el método.
6. Una vez que lo hemos encontrado, apretar en enter y se carga el método.
7. Aparecerá en el cuadro de control la pantalla con el método cargado.
8. Para hacer el lavado de la bureta y de las tuberías mantener apretador el
botón DOS del mando de control o de la base del titrino. Cuando se ha vaciado
aparecerá una pantalla que te indica Cylinder empty. Apretar a STOP (Fill) y la
bureta se empezará a cargar con el tiosulfato de la botella.
9. Repetir este paso unas 3 ó 4 veces para hacer un buen lavado.
10. Para empezar con las valoraciones apretar START.

326
11. Cuando la muestra esté valorada la bureta se rellenará automáticamente y
aparecerá en la pantalla los ml necesarios para la valoración del iodo y los mV.
12. Apuntar tanto en el estadillo de papel como en la hoja de cálculo los ml
utilizados.
13. Una vez terminadas las muestras y tras la colocación del dosificador y del
electrodo en su sitio, se apagará el Titrino desplazando el botón de encendido
hacia abajo (está situado en la parte posterior izquierda de la base del aparato).

TITRANDO 808

Es muy importante realizar correctamente las conexiones en la parte trasera del


titulador.

ELECTRODO
TOUCH CONTROL

1) Para encender el titrando hay que desplazar el botón de la parte posterior


derecha del Touch Control.
2) Una vez encendido aparece una ventana que dice que “el archivo no se
corresponde con el tipo de archivo… “. Apretar OK
3) Después, aparece una pantalla “005-110” que dice “existe nuevo reactivo
titrando… Quiere copiar los datos” Apretar NO
4) Aparece una ventana de preparar dosificador => OK y ya aparece la ventana
principal de medida. En esta pantalla en la sección del current method tiene que
poner: O2 Malaspina.

327
Si es así, el sistema ya está listo.

Si no es así, ir a Load Method => Internal memory=> Main group => show files
(pantalla táctil inferior derecha) => O2 Malaspina => Load

5) Una vez que el método está correctamente cargado hay que hacer un lavado
de la bureta con el tiosulfato que se va a usar en las valoraciones. Para ello
apretar el botón de Manual =>Dosing =>Prepare. Aparecer una pantalla que dice
que hay que comprobar que el dosificador no apunte directamente al electrodo.
Si esto es así, apretar OK y el titrando hará una vaciado doble de la bureta.
Repetir este paso unas 3 ó 4 veces.

328
6) Para volver a la pantalla principal donde está el método cargado, apretar
Home.

7) Desde esta pantalla es desde donde se va a proceder a hacer la valoración.


Para que empiece la valoración apretar Start. El Titrando empezará la valoración
y se podrá ver en el Touch Control la curva de cambio de potencial. Cuando la
valoración acabe, aparecerá una pantalla de Filling seguida de una pantalla
donde nos indica los ml de tiosulfato necesarios para la valoración del iodo y los
mV. Anotar los ml en el estadillo de papel y en la hoja de cálculo del ordenador.
8) Para proseguir con la siguiente muestra repetir el paso 7.
9) Una vez terminadas las muestras y tras la colocación del dosificador y del
electrodo en su sitio, se apagará el Titrando desplazando el botón de encendido
hacia la otra dirección (está situado en la parte posterior derecha del Touch
Control).

7. Reactivos u otro material fungible

Se llevarán reactivos preparados para 1 tramo y pesados para toda la campaña


(aprovechando algún día en puerto). Para prepararlos se usará el agitador
magnético. Se guardarán en botellas de 1 L bien cerradas y color ámbar.

• Solución de Tiosulfato (0.01 N)

Disolver 2.9 g de Tiosulfato de Sodio pentahidrato, Na2S2O3.5H2O, y 1 g de


Carbonato Sódico, Na2CO3, en 1 L de agua destilada. Añadir una gota de
Carbono Bisulfuro.

• Solución de Sulfato de Manganeso (reactivo 1)

Disolver 365 g de Sulfato de Manganeso monohidrato, MnSO4.H2O, en 1 L de agua


destilada.

329
• Solución de Hidróxido de Sodio Iodo (reactivo 2)

Disolver 320 g de NaOH en 500 mL de agua destilada. Añadir en pequeñas


cantidades y esperar a su disolución antes de añadir más cantidad. Después
añadir 600 g de Ioduro de Sodio, NaI, cuando la solución está todavía caliente.
Completar hasta 1 L con agua destilada.

• Acido Sulfúrico (10 N)

Añadir poco a poco 280 ml de Acido Sulfúrico concentrado a 500 mL de agua


destilada. Esperar que se enfríe y completar hasta 1 L con agua destilada.
También se puede comprar directamente ácido sulfúrico 10 N (más
recomendable).

• Solución patrón de Iodato Potásico( 0.01 N)

Secar Iodato Potásico, KIO3, en la estufa a 105º C durante 1 hora, y pesar


exactamente 0.3567 g. Una vez enfriado, disolver en agua destilada (200-300 mL)
calentando si es necesario; dejar enfriar y completar hasta 1 L con agua
destilada.

8. Calibración

Valoración de la solución de Tiosulfato Sódico

Hay que valorar diariamente todas las botellas de tiosulfato que se utilicen. Se
llenan 6-71 botellas Winkler (125 mL) de agua destilada sin O2 (hervida), y se
añaden los reactivos en orden inverso, es decir:

- 1 mL de Acido Sulfúrico 10 N. Agitar suavemente


- 1 mL de Hidróxido Sódico Iodo. Agitar suavemente
- 1 mL de Sulfato de manganeso

Se agitan y se toman 50 mL, a los que se agregan 5 mL de solución 0.01 N de KIO3.


Se deja reposar unos 2 minutos en la oscuridad, y se titula con el tiosulfato que se
quiere valorar.

La normalidad exacta del tiosulfato vendrá dada por la fórmula:

N = (5/V) x 0.01

V = mL de tiosulfato añadidos por el titulador

1El número de réplicas lo determinará el coeficiente de variación (error)


calculado. Tomaremos como valor válido del tiosulfato cuando el error de la
media sea del orden de 10-5 -10-6

330
9. Descripción de la Técnica

• Preparación de las muestras

El agua para las medidas de metabolismo de 3 profundidades (superficie -5 m-,


intermedia- 20% luz- y DCM -o 1% luz-) se sifona a cada botella DBO (125 mL),
usando un tubo flexible cuya punta dejaremos en el fondo de cada botella, para
que el flujo sea sin turbulencias y no gane oxígeno. El agua de superficie se
recogerá de un botellón lanzado en paralelo con la roseta mientras que las
botellas del DCM y del 10% de luz se cogerán de dos botellas Niskin. En uno de los
extremos del tubo se coloca una malla de 240 micras para prevenir la presencia
de organismos más grandes en la muestra. Dejaremos que se desborde unos
segundos (alrededor de dos veces el volumen de la botella) antes de colocar el
tapón con cuidado de no atrapar burbujas. En la profundidad de superficie se
llenaran, además, 5 botellas de cuarzo.

• Incubación

Después de llenar 21 botellas por cada profundidad (excepto superficie que


tendrá 21 botellas vidrio + 5 botellas de cuarzo), se fijan las 7 botellas iniciales, se
dejan en agua y tapadas, e inmediatamente después se trasladan 7
transparentes y 7 oscuras por profundidad a los incubadores de cubierta. Las
botellas de superficie se incubaran en un tanque metidas en redes (las oscuras se
envuelven en bolsa de tela negra o plástico negro) mientras que las restantes
profundidades irán en incubadores cilíndricos de metacrilato (las botellas oscuras
en los incubadores opacos). La temperatura de la superficie se consigue
haciendo circular agua de superficie del sistema del continuo en el tanque. La
temperatura de las otras profundidades se consigue utilizando los refrigeradores
de cubierta que consiguen enfriar la temperatura del agua de un tanque de
hasta 100 L hasta unos 8-10 ºC en la cubierta del buque. La luz se consigue
mediante mallas de diferente transparencia.

• Fijación

La concentración de oxigeno disuelto se determina mediante la técnica Winkler,


siguiendo las recomendaciones de Carritt & Carpenter (1966), mediante un
sistema de titración con detección potenciométrica (electrodo redox) (Oudot et
al. 1988). Se utilizarán 2 titroprocesadores simultáneamente.

Hay que abrir el tapón del electrodo


antes del análisis, y cerrarlo cuando
se terminen los análisis del día.

331
Las 7 botellas iniciales transparentes por profundidad se fijan con los reactivos
como se indica a continuación. Tras el proceso conoceremos el oxígeno inicial
presente en la muestra. 24 h después, se titulan igualmente las botellas incubadas,
y así se obtiene el oxígeno presente en el agua después de un día de respiración
y fotosíntesis (botellas claras) y de sólo respiración (botellas oscuras).

A cada botella DBO se le añade 1 mL de solución de Sulfato de Manganeso y


seguidamente 1 mL de solución de Hidróxido Sódico Iodo. Añadir con la punta de
la pipeta por debajo del agua en la botella DBO. Tapar con cuidado de que no
queden burbujas y agitar vigorosamente hasta que el precipitado esté
completamente dispersado.

Dejar que el precipitado sedimente al menos un tercio de la botella (al menos 6-8
horas). Se debe titular una vez se ha sedimentado ya que si se deja más tiempo
los errores aumentan.

Cuando el precipitado ha sedimentado, añadir 1 mL de Acido Sulfúrico 10 N


colocando la punta de la pipeta por debajo de la superficie del agua. Tapar y
agitar vigorosamente hasta que el precipitado se disuelva. Esperar un par de
minutos.

Coger 50 mL con una pipeta aforada y trasladar a un vaso de plástico del


titulador. Colocar el vaso en el brazo del titulador y comenzar la titulación con
solución de tiosulfato. Este paso debe ser rápido para evitar que el iodo se
volatilice. Limpiar el electrodo con agua destilada después de cada muestra.

• Principio teórico

La muestra se trata con excesos de sulfato manganoso y una base fuerte de iodo.
El hidróxido de manganeso que se forma reacciona con el oxígeno disuelto en la
muestra y forma un precipitado. Tras acidificación, en presencia de Ioduro, se
libera Iodo en cantidad equivalente al oxígeno disuelto originalmente presente en
la muestra. La cantidad de Iodo liberado se calcula mediante la titulación con
tiosulfato sódico.

Las reacciones estequiométricas muestran que un equivalente de tiosulfato


corresponde a 1/4 mol de O2.

MnSO4 +2 NaOH Æ Mn(OH)2 + Na2SO4

2 Mn(OH)2 (2 Mn2+) + O2 ÅÆ 2 MnO(OH)2 (2 Mn4+ y 2 O2-)

2 Mn4+ + 4 I- + H2 SO4 Æ 2 Mn2+ + 2 I2 + H2O

2 I2 + 4 S2O32- Æ 4 I- + 2 S4O62-

332
10. Cuadro sinóptico de la técnica

Æ Æ

Llenado 21 botellas DBO Determinación de la concentración


por cada profundidad de O2 inicial (7 botellas iniciales por
(excepto superficie que profundidad)
tendrá 21 botellas vidrio +
5 botellas de cuarzo)

Incubación en cubierta Determinación de la concentración


durante 24 h (7 botellas de O2 final
transparentes + 7 oscuras
por profundidad)

11. Calculo de los resultados.

Para calcular la concentración de oxígeno disuelto se aplica la siguiente fórmula:

mg/L Oxígeno Disuelto = (N x V x 8 x 1000)/S

N = Normalidad del tiosulfato


V = mL de tiosulfato añadidos por el titulador
S = mL de muestra utilizados en la titulación (50 mL)

Restando el oxígeno presente en las botellas claras del inicial se obtiene la


producción neta de la comunidad (NCP); y restando al inicial el oxígeno en las
botellas oscuras se obtiene la respiración de la comunidad (R). La producción
primaria bruta (GPP) se calcula como la suma de R y NCP.

333
12. Control de calidad

La manipulación de las muestras es fundamental para evitar errores en la


determinación. Al llenar las botellas DBO hay que usar un tubo flexible cuya punta
dejaremos en el fondo de cada botella, para que el flujo sea sin turbulencias y no
gane oxígeno. Dejaremos que se desborde un volumen de aproximadamente dos
veces el volumen de la botella antes de colocar el tapón, evitando que queden
burbujas de aire.
Los reactivos se añaden con la punta de la pipeta por debajo del agua en la
botella DBO y se tapan con cuidado para que no queden burbujas.
Hay que revisar bien los tubos del titroprocesador para que no haya ninguna
burbuja de aire en el sistema.

Hay que revisar, antes de medir, que el electrodo está relleno de electrolito hasta
la línea roja.

Es importante realizar la valoración de las muestras iniciales y finales con la misma


solución de tiosulfato. La precisión alcanzada en medidas repetidas debe ser
mejor que 0,01 ml l-1 (0.014 mg l-1), aunque dependiendo de las condiciones del
mar y el rendimiento del valorador, la precisión puede variar entre 0.005 y 0.03 ml l-
1 (0.007 y 0.042 mg l-1) (Knap et al. 1996).

Apuntar todas las incidencias, anotaciones, cometarios… y asegurarse que las


recibe el siguiente participante.

334
Limpieza: Hay que limpiar los dosificadores diariamente con acido diluido en
agua destilada y después aclararlos con agua destilada.
Las botellas DOB se limpian diariamente con agua destilada y se dejan limpias
para el siguiente muestreo.
Al terminar cada tramo de campaña hay que desmontar y limpiar todos los
tituladores con agua destilada.

HERRAMIENTA
PARA
DESMONTAR
LA BURETA

13. Referencias

Carritt DE, Carpenter JH (1966) Comparison and evaluation of currently employed


modifications of the Winkler method for determining dissolved oxygen in seawater;
a NASCO Report. J Mar Res 24: 286–319

Knap, A, Michaels A, Close A, Ducklow H and Dickson A (eds.). (1996). Protocols for
the Joint Global Ocean Flux Study (JGOFS) Core Measurements. JGOFS Report Nr.
19, vi+170 pp. Reprint of the IOC Manuals and Guides No. 29, UNESCO 1994.

Oudot C, Gerard R, Morin P, Gningue I (1988) Precise shipboard determination of


dissolved oxygen (Winkler procedure) for productivity studies with a commercial
system. Limnol Oceanogr 33:146–150.

335
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Determinación experimental de una tasa metabólica

2. Titulo de la técnica

Determinación de la producción primaria fraccionada por tamaños

3. Autores del documento y filiación

Cermeño, P., Fernández, A., Marañón, E. (Universidad de Vigo)

4. Conceptos generales

El fitoplancton es el principal responsable de la producción primaria en el océano,


realizando anualmente una fijación de carbono de unas 45 GtC, casi la mitad de
la producción primaria global del planeta. La mayor parte de la producción
primaria fitoplanctónica es reciclada dentro de la propia capa fótica a través de
redes tróficas microbianas. Sin embargo, una fracción del carbono fijado
fotosintéticamente es exportada hacia niveles tróficos superiores y el océano
profundo, sustentando las pesquerías y contribuyendo a la retirada de CO2
atmosférico. El reparto de la producción primaria en diferentes clases de tamaño
de fitoplancton es una variable clave para comprender el destino del material
fotosintetizado y determina en gran medida la estructura trófica de la comunidad
planctónica y su capacidad para la exportación de carbono.

5. Finalidad. Campo de aplicación

La producción de carbono orgánico es una variable esencial para estudiar la


fisiología de las poblaciones de fitoplancton marino, entender el funcionamiento
ecológico de las comunidades planctónicas y cuantificar los flujos
biogeoquímicos en el océano.

6. Equipamiento necesario

Incubadores cilíndricos provistos de filtros azules y de densidad neutra y


conectados mediante un sistema de recirculación de agua a través de
refrigeradores (Fig. 1). Micropipetas. Sistema de filtración en cascada (Fig. 2).
Bomba de vacío. Contador de centelleo líquido para medir la radiactividad de
emisores beta.

7. Descripción de la Técnica

Preparación de la solución stock de NaH14CO3. Utilizando agua milliQ llevada a


pH ≈ 10 con NaCO3, filtrada por 0.2 µm y autoclavada, se diluye la solución
original de NaH14CO3 hasta obtener una concentración nominal de ≈ 100
µCi/mL.

336
Recogida de muestras. Las muestras se tomarán directamente de las botellas
Niskin. Se tomarán muestras de 5 profundidades (superficie, DCM y 3 intermedias),
preferiblemente al amanecer y con precaución para evitar la exposición de las
células a luces intensas. El muestreo

Incubación. Por cada profundidad se llenan con la muestra 4 botellas de


policarbonato tipo Corning (3 claras y 1 oscuras), previamente lavadas con HCl
(5%). Se inoculan con 100-200 μL (10-20 μCi) de la solución de 14C y se colocan en
el incubador durante unas 12 horas (amanecer-anochecer).

Figura 1. Incubadores de cubierta provistos de filtros azules y de densidad neutra y conectados


mediante un sistema de recirculación de agua a través de refrigeradores (Foto: Ana Fernández)

Filtración. Tras terminar la incubación se filtra todo el volumen de las botellas a


través de una serie de filtros de policarbonato de tamaño de poro decreciente
(20, 2 y 0.2 µm). Se empleará un sistema de copas de policarbonato enroscables
(Sartorius), que permite el acoplamiento de varios filtros en la misma torre (Fig. 2).
Se cuidará de que la presión de vacío sea baja (<100 mm Hg).

Figura 2. Sistema de filtracion en cascada con copas de policarbonato (Foto: Ana Fernández).

337
Procesado de los filtros. Para eliminar el 14C inorgánico retenido, los filtros se
exponen a vapores de HCl concentrado durante 12 horas en la campana de
gases del laboratorio de radiactividad. Luego, se colocan en viales de centelleo
de 4 mL de capacidad y se añaden 3.5 mL de líquido de centelleo. Las muestras
se almacenan al menos durante 12 horas en oscuridad previamente a su medida
en un contador de partículas beta (Fig. 3). La figura 4 muestra un esquema
general de todo el procedimiento.

Figura 3. Captura de pantalla del monitor conectado al contador de partículas beta donde se
muestran los dos criterios usados para determinar el tiempo de contaje de las muestras, tiempo
máximo de medida (180 segundos en este caso) y umbral de error en la precisión de la medida
(1%). El contaje se detiene en el momento en que se alcanza uno de estos criterios.

8. Reactivos u otro material fungible

Solución de NaH14CO3, botellas de incubación, filtros de policarbonato, viales de


centelleo de 4 mL, líquido de centelleo, HCl concentrado.

9. Cálculo de los resultados.

Para obtener la tasa de producción primaria particulada se tiene en cuenta la


concentración de carbono inorgánico disuelto (CID) en el agua (25700 μg/L si no
hay datos reales), los DPMs añadidos y medidos y el tiempo de incubación. A la
actividad de cada muestra se le resta el valor obtenido con la botella negra.

Tasa de producción (μg C L-1 d-1) =CID (μg C L-1) * (DPMmuestra – DPMnegra) /
DPMañadidos * tiempo incubación (1 día)

338
Figura 4. Esquema general que muestra los diferentes pasos a seguir para la determinación de la
producción primaria fraccionada por tamaños.

10. Referencias

Marañón, E., Holligan, P. M., Barciela, R., González, N., Mouriño, B., Pazó, M. J.,
Varela, M. (2001) Patterns of phytoplankton size–structure and productivity in
contrasting open ocean environments. Marine Ecology Progress Series, 216, 43-56

Williams, P. J. Le B., Thomas, D. N., C. S. Reynolds (eds). Phytoplankton productivity.


Carbon assimilation in marine and freshwater ecosystems. Blackwell Science.
Oxford. pp. 386.

339
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento

Determinación experimental de una tasa metabólica

2. Titulo de la técnica

Determinación de la producción fotosintética de carbono orgánico disuelto

3. Autores del documento y filiación

Cermeño, P., Fernández, A., Marañón, E. (Universidad de Vigo)

4. Conceptos generales

Parte de los productos recientes de la fotosíntesis realizada por el fitoplancton


pueden ser liberados al medio en forma de materia orgánica disuelta, mediante
diferentes mecanismos como la exudación o la lisis celular. La producción de
carbono orgánico disuelto constituye de media entre un 20 y un 40 % de la
producción de carbono orgánico total del fitoplancton, por lo que su
determinación es esencial para caracterizar la productividad marina.

5. Finalidad. Campo de aplicación

La producción de carbono orgánico es una variable fundamental para estudiar


la fisiología de las poblaciones de fitoplancton marino, entender el
funcionamiento ecológico de las comunidades planctónicas y cuantificar los
flujos biogeoquímico en el océano.

6. Equipamiento necesario

Incubadores cilíndricos provistos de filtros azules y de densidad neutra y


conectados mediante un sistema de recirculación de agua a través de
refrigeradores. Micropipetas. Sistema de filtración circular con copas de acero y
colectores inferiores para recoger los filtrados (Fig. 1). Bomba de vacío. Contador
de partículas beta.

7. Descripción de la técnica

Preparación de la solución stock de NaH14CO3. Utilizando agua milliQ llevada a


pH ≈ 10 con NaCO3 y autoclavada se diluye la solución original de NaH14CO3
hasta obtener una concentración nominal de ≈ 100 µCi/mL.

Recogida de muestras. Las muestras se tomarán directamente de las botellas


Niskin. Se tomarán muestras de 3 profundidades [superficie, DCM (1% PAR) y una
profundidad intermedia que corresponda con el 20% de PAR], preferiblemente al

340
amanecer y con precaución para evitar la exposición de las células a luces
intensas.

Incubación. Por cada profundidad analizar se llenan con la muestra 4 botellas de


policarbonato tipo Corning (3 claras y 1 oscura), previamente lavadas con HCl
(5%). Se inoculan con 150-200 μL (15-20 μCi) de la solución de 14C y se colocan en
el incubador durante unas 12 horas (incubación amanecer-anochecer). Se
simularán las condiciones de luz y temperatura de la misma manera explicada
para el caso de la producción primaria fraccionada por tamaños.

Filtración. Terminada la incubación se toma 1 submuestra de 5 mL de cada


botella y se filtra a través de filtros de policarbonato de 0.2 μm de tamaño de
poro, usando una presión de vacío muy baja (<50 mm Hg). El filtrado se recoge en
viales de centelleo de plástico de 20 mL.

Figura 1. Rampa de filtración circular con copas de acero y colectores de filtrados en la parte
inferior. (Foto: Ana Fernández)

Procesado de filtros y filtrados. Los filtros se procesan de la misma forma descrita


para la determinación de producción primaria particulada. A los filtrados, justo
después de la filtración, se añaden 100-150 μL de HCl 50%. Luego se dejan los
viales abiertos en agitación orbital moderada durante toda la noche (Fig. 2). Al
día siguiente, se añade a cada vial 10 mL de líquido de centelleo Ultima Gold XR y
se agita enérgicamente. Tras un reposo en oscuridad de unas 12-24 horas, la
radiactividad en filtros y filtrados se mide en un contador de partículas beta.

Procesado de muestras para TOC. En algunas estaciones y profundidades, de


cada botella de incubación se toma una submuestra de 5 mL, se coloca
directamente en un vial de centelleo de 20 mL y se procesa como si fuera un
filtrado. Esta muestra permitirá determinar la producción total de carbono
orgánico particulado y disuelto (TOC). La figura 3 muestra un esquema general de
todo el procedimiento.

341
Figura 2. Agitador orbital usado en la eliminación de 14C de los filtrados, que se realiza
en el interior de la campana de extracción de gases. (Foto: Ana Fernández)

Figura 3. Esquema general del procedimiento para la determinación de la producción


fotosintética de carbono orgánico.

342
8. Reactivos u otro material fungible

Solución de NaH14CO3, botellas de incubación, filtros de policarbonato, viales de


centelleo de 4 y 20 mL, líquido de centelleo, HCl concentrado.

9. Calculo de los resultados.

Para obtener las tasas de producción de COD se tiene en cuenta la


concentración de CID en el agua (25700 μg/L si no hay datos reales), los DPMs
añadidos y medidos, el tiempo de incubación y el volumen filtrado (5 mL) en
relación al volumen total de la botella (72 mL). A la actividad de cada muestra se
le resta la actividad medida en la botella negra.

Tasa de producción (μgC L-1 d-1) = [Vol botella (mL) / Vol filtrado (mL)] * CID (μg C
L-1) * (DPMmuestra – DPMnegra) / DPMañadidos * tiempo incubación (1 día)

10. Referencias

Marañón, E., Cermeño, P., Fernández, E., Rodríguez, J., Zabala, L. (2004)
Significance and mechanisms of photosynthetic production of dissolved organic
carbon in a coastal eutrophic ecosystem. Limnology and Oceanography, 49,
1652-1666.

343
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo, procesado de muestras y técnica analítica.

2. Titulo de la técnica

GPP-18O

3. Autores del documento y filiación

Delgado, A. y Granados A. Laboratorio de Biogeoquímica de Isótopos Estables.


Instituto Andaluz de Ciencias de la Tierra (CSIC)

Navarro, N. Universidad Rey Juan Carlos

4. Finalidad. Campo de aplicación

Calcular la producción bruta primaria trazando el agua con el isótopo 18O.

5. Conceptos generales

Se basa en marcar el agua con 18O de modo que podamos detectar el nuevo O2
producido durante la fotosíntesis que procede del oxígeno del agua que ha sido
marcado. Por tanto estamos midiendo la generación de oxígeno fotosintético
producido durante el día, ya que por la noche solo se consume oxígeno (Grande
et al., 1991).

6. Equipamiento necesario

- Espectrómetro de masas de razones isotópicas (Delta Plus XP)

- GasBench: sistema para separación de gases que incluye una columna


cromatográfica (molecular sieve 5A) de 25 m.

(Estos equipos por su tamaño y sensibilidad a los movimientos no es posible


montarlos en el barco)

7. Reactivos u otro material fungible

- Viales con cierre hermético que impida cualquier permeabilidad de los gases

- Agua marcada al 97% en 18O

- Solución saturada en HgCl

344
8. Descripción de la Técnica

- En cada profundidad se llenan 6 viales de 27 ml (cuidando de que no quede


ninguna burbuja de aire).

- 3 viales son envenenados inmediatamente con una solución saturada en HgCl


(6,5%)1 y almacenados en oscuridad (para este tamaño de vial, 10 μl de solución
saturada en HgCl son suficientes, se pueden añadir 25 μl para estar más seguros).
Agitar.

- 3 viales son marcados con H218O (25 μl; ≈ 1 μl /ml) enriquecida al 97% en 18O de
modo que el agua oceánica pase de tener un valor δ18O de ≈ 0‰ (V-SMOW)
hasta alcanzar un valor comprendido entre +300 ‰ y +500 ‰ (V-SMOW). Agitar.

- Las muestras se exponen desde la salida hasta la puesta de sol en los


incubadores de cubierta correspondientes a cada profundidad.

- A continuación son envenenadas con HgCl para paralizar toda actividad


biológica (sobre 1 μl de solución saturada por cada mililitro).

- Después, ya en el laboratorio de Biogeoquímica de Isótopos Estables del Instituto


Andaluz de Ciencias de la Tierra (IACT-CSIC), se generará en cada vial un espacio
de cabeza de 500 µl con helio (evitando cualquier contaminación con oxígeno
atmosférico). Se deja equilibrar durante 24 horas, de este modo se establece un
equilibrio entre los gases disueltos en el agua y el espacio de cabeza (que
originariamente era helio 100% y después contendrá una proporción de todos los
gases que contiene el agua disueltos (incluido el O2). El oxígeno se separa de N2 y
Ar mediante columna cromatográfica (Révész et al., 1999; Tobias et al., 2007) y su
razón isotópica se determinará en un espectrómetro de masas Delta Plus XP,
ambos sistemas están conectados con un sistema de flujo continuo de He que
arrastra a los gases objeto de estudio. El agua que se ha extraído para generar el

1
Añadir en un vial HgCl en exceso de modo que una vez añadida el agua desionizada quede en el fondo siempre una
cantidad de precipitado blanco sin disolver. También es posible usar una solución saturada al 50% ya que con la
saturada se puede arrastrar el material sólido con la pipeta si no se tiene cuidado. ATENCION: el cloruro de mercurio es
muy toxico, usar guantes y lavar las manos después de su utilización.

345
espacio de cabeza (500 µl) se usa para el análisis isotópico del oxígeno del agua
(mediante el típico equilibrio CO2-agua).

9. Calibración

El gas de referencia es oxígeno (botellas de 50 litros de O2 99,999%, calidad C-50)


que han sido calibradas con patrones internacionales facilitados por la IAEA y con
aire atmosférico. Además en cada serie de experimentos se toman “blancos”
muestras con el mismo tratamiento pero sin oxigeno marcado, que son
envenenadas con HgCl en el minuto cero.

10. Calculo de los resultados.

La GPP-18O se calcula a partir del valor isotópico obtenido en el O2 disuelto,


siguiendo la ecuaciones de Dickson et al. (2001) y Kiddon et al. (1995). La
desviación estándar (STD) esta basada en propagación de errores asumiendo
que los errores de las medidas son independientes.

Kiddon et al., (1995):

donde δ18O-O2init and δ18O-O2final son las medidas δ18O-O2 antes y después de la
incubación. δ18O-H2O es la composición isotópica alcanzada por el agua tras ser
marcada y [O2]init es la concentración de oxigeno antes de la incubación (mmol
O2 m–3).

Además se medirá la producción neta de O2 con el cambio en las razones O2/Ar


antes y después de la incubación.

Los subíndices “i” y “f” indica inicial y final

Para ello se analizarán las razones O2/N2 y O2/Ar, por lo que se necesita medir el
δO2/N2 (masas 32/29) y δO2/Ar. Cada medida se comparará (patrón interno) con
aire sintético puro de composición conocida (Sowers et al., 1989; Emerson et al.,
1991).

346
11. Referencias.

Emerson, S., Quay, P., Stump, C., Wilbur, D., Knox, M., 1991. O2, Ar, N2 and 222Rn in
surface waters of the subarctic ocean: net biological O2 production, Global
Biogeochemical Cycles 5:49-69.
Epstein, S. y Mayeda, T.K. 1953. Variation of the 18O/16O ratio in natural waters.
Geochim. Cosmochim. Acta. 4: 213-224.
Grande, K.D., Bender, M.L., Irwin, B., Platt, T., 1991. A comparison of net and gross
rates of oxygen production as a function of light intensity in some natural
plankton populations and in a Synechococcus culture. Journal of Plankton
Research 13:1-16.
Kiddon J., Bender M.L, Marra J., 1995 Production and respiration in the 1989 North-
Atlantic spring bloom: an analysis of irradiance-dependent changes. Deep-
Sea Res I 42: 553–576.
Sowers, T., Bender, M., Raynaud, D., 1989. Elemental and isotopic composition of
occluded O2 and N2 in polar ice. Journal of Geophysical Research 94:5137-
5150.
Révész, K., Böhlke, J.K., Smith, R.L., Yoshinari, T., 1999. Stable isotope composition of
dissolved O2 undergoing respiration in a ground-water contamination
gradient, in Morganwalp, D.W. and Buxton, H.T. (Eds.), U.S. Geological Survey
Toxic Substances Hydrology Program--Proceedings of the Technical Meeting,
Charleston, South Carolina, March 8-12, 1999. U.S. Geological Survey Water-
Resources Investigations Report 99-4018C, p. 323-328.
Tobias, C.R., Böhlke, J.K., Harvey, J.W., 2007. The oxygen-18 isotope approach for
measuring aquatic metabolism in high-productivity waters. Limnology and
ceanography 52, 1439-1453.

347
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento

Técnicas analíticas

2. Título de la técnica

Determinación fluorimétrica de la concentración de clorofila a

3. Autores del documento y filiación

Estrada, Marta
Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona.

4. Finalidad. Campo de aplicación

Determinación fluorimétrica de la concentración de clorofila a (Clor a) en un


extracto acetónico.

Este método (Yentsch y Menzel, 1963) permite obtener estimaciones de la


concentración de clorofila con pequeñas cantidades de muestra y es apto para
el procesado de un número importante de muestras. El método permite detectar
concentraciones de clorofila a del orden de 0.01 mg m-3.

5. Conceptos generales

La concentración de Clor a permite estimar la cantidad de biomasa


fitoplanctónica en una muestra de agua. El método se basa en que la Clor a (y
otros pigmentos algales) emiten fluorescencia en longitudes de onda rojas
cuando son excitadas por luz azul. En diversas aplicaciones del método, la
relación entre la magnitud de la fluorescencia antes y después de acidificar el
extracto acetónico (Rb/Ra) se utiliza para calcular la concentración de
feopigmentos. La acidificación convierte en feopigmento toda la clorofila
presente en la muestra y el cálculo de las concentraciones de clorofila y
feopigmentos se basa en las diferencias de intensidad relativa de la fluorescencia
de la Clor a pura y de los feopigmentos. Sin embargo, no se recomienda la
aplicación general de fórmulas basadas en el método de acidificación porque
puede haber interferencias de otros pigmentos (por ejemplo, clorofila b) que
falseen los resultados. De todos modos, en este protocolo se conserva el paso de
acidificación de la muestra porque el índice Rb/Ra proporciona cierta
información sobre las propiedades del extracto y porque puede servir para hacer
comparaciones con estudios que sí lo hayan utilizado. El presente método no
incluye trituración del filtro ni centrifugación del extracto, operaciones que
permiten un ligero incremento de la eficiencia de extracción de clorofila, pero al
precio de un importante aumento del tiempo de manipulación de cada muestra.

Para la determinación de Clor a total se utilizarán filtros de fibra de vidrio de 25


mm de diámetro (Whatman GF/F). Adicionalmente, las determinaciones de

348
clorofila que correspondan a las profundidades de producción primaria se
realizarán también utilizando filtros de policarbonato de 20, 2 y 0.2 μm de tamaño
de poro y 47 mm de diámetro (según la fracción de tamaño considerada), del
mismo tipo de los utilizados para producción.

6. Equipamiento necesario

Rampa de filtración secuencial.


Dosificador para acetona 90%.
Fluorómetro Turner Designs, equipado con portacubetas para muestras
individuales.

7. Reactivos u otro material fungible

Frascos de plástico para muestreo.

Filtros.

Tubos de centrífuga de 15 ml para extracción.

Acetona 90%.

Standard de clorofila de Anacystis nidulans (Sigma Chemical Company).

Ácido Clorhídrico 10%.

Tubos de vidrio para lectura de la fluorescencia en el fluorómetro Turner Designs.

Preparación de los reactivos

Para preparar acetona al 90% mezclar 1000 ml de acetona con 110 cm3 de agua
MilliQ. En una botella nueva de acetona, queda normalmente suficiente espacio
vacío para añadir el agua MilliQ dentro de la misma botella.

Para preparar ácido clorhídrico al 10 % hay que añadir 10 ml de ácido clorhídrico


concentrado a 90 ml de agua MilliQ.

8. Calibración

El fluorómetro puede calibrarse con un standard de Clor a pura (Sigma).


Adicionalmente puede usarse un extracto acetónico (obtenido tras filtración de
agua de mar) cuya concentración de Clor a se haya medido en un
espectrofotómetro. Se recomienda comprobar la calibración al menos una vez
en cada etapa.

Calibración con Clor a pura

349
Se disuelve el standard en acetona 90% y al cabo de unas dos horas se mide su
concentración mediante un espectrofotómetro, mediante la fórmula;

Clor a (mg l-1) = (Amax-A750)/(E*C)*(1000 mg/1 g)

donde Amax es la absorbancia en el máximo de absorción (664 nm), A750 es la


absorbancia a 750 nm, que se usa para corregir la turbidez, E es el coeficiente de
extinción de la Clor a en acetona 90% a 664 nm (87.67 l mg-1 cm-1) y C (cm) es la
longitud de camino óptico en la cubeta.

A partir de este standard se preparan cinco diluciones y se lee su fluorescencia,


antes y después de acidificar con 3 gotas de HCl 10%. El factor de calibración se
calcula como la pendiente de la lectura del fluorómetro en relación con el
contenido de Clor a en cada dilución.

Calibración con un extracto acetónico concentrado

Se filtran 1-5 litros de agua de mar (según la abundancia de fitoplancton) sobre


un filtro Whatman GF/F de 47 mm de diámetro, que se congela y se trata (véase
sección 9) como los filtros destinados a fluorimetría (excepto que el volumen de
acetona ha de ser de unos 7 ml).

Mediante un espectrofotómetro se mide la abosrbancia del extracto a 750, 664,


647 y 630 nm. La concentración de Clor a de este extracto se calcula a partir de
la fórmula tricromática de Jeffrey y Humphrey (1975):

Clor a (mg l-1) = (11.85 (A664 –A750) - 1.54 (A647 –A750) - 0.08 (A 630- A750))/C

donde C es el camino óptico (en cm) de la cubeta.

A partir de este punto, se calcula el factor del fluorómetro como se indica en la


sección anterior.

9. Descripción de la Técnica

9.1 Muestreo

Se tomarán muestras de agua de las mismas 5 profundidades de producción


primaria (y si es posible de las mismas botellas Niskin) y de 5 profundidades
adicionales (el conjunto de 10 niveles será el mismo seleccionado para
picofitoplancton). Se procurará que las muestras no queden expuestas a
iluminación intensa.

9.2 Filtración

-Determinación de clorofila total (en principio para las 10 profundidades):

350
Filtrar 200-500 ml de agua (la cantidad puede variar en función de la
concentración de clorofila y del factor del fluorómetro) a través de un filtro GF/F
de 25 mm de diámetro. Con este filtro se analizará la clorofila a total. La presión
de vacío ha de ser inferior a 100 mm Hg.

- Profundidades de producción primaria:

En las tres profundidades con fraccionamiento: Filtrar 200-500 ml de agua a través


de una rampa de filtración con una secuencia de filtros de policarbonato de 20, 2
y 0.2 μm de tamaño de poro y 47 mm de diámetro. La presión de vacío ha de ser
inferior a 100 mm Hg.

En las dos profundidades sin fraccionamiento: Filtrar 200-500 ml de agua a través


de un filtro de policarbonato de 0.2 μm de tamaño de poro y 47 mm de diámetro.
La presión de vacío ha de ser inferior a 100 mm Hg.

Se compararán las determinaciones de clorofila total derivadas de filtros GF/F con


las obtenidas directamente mediante filtros de policarbonato de 0.2 μm o a partir
de la suma de fracciones. Si la correspondencia es satisfactoria, podría eliminarse
la repetición de los filtros de GF/F para las clorofilas totales de algunas de las
profundidades de producción primaria.

9.3 Congelación de los filtros

- Anotar el volumen filtrado de cada muestra y fracción en el estadillo (véase


anexo).

- Doblar el filtro dejando el filtrado en la parte interior (se debe evitar que el
filtrado toque el papel de plata).

- Envolver el filtro en papel de plata y apuntar el número de tirada de CTD, la


profundidad y la fraccion.

- Congelar los filtros a -20º C como minimo durante 6 horas (si conviene se pueden
tener congelados durante más tiempo).

9.4 Preparación del extracto acetónico

Antes de sacar los filtros del congelador hay que llenar de acetona 90%, con el
dosificador, los tubos blancos de centrifuga. El volumen de acetona debe ser de
5-7 ml (5 ml son suficientes; comprobad el volumen que sale del dosificador dos o
tres veces con un tubo graduado de vidrio hasta que el volumen salga constante
(la primera tirada siempre tiene menos volumen). Tapad siempre muy bien los
tubos (la acetona se evapora muy rápidamente). Anotad el volumen de acetona
en el estadillo.

351
- Sacad los filtros del congelador e introducidlos en los tubos cuidando de que el
filtro esté completamente sumergido en la acetona; apuntad el número de tubo
que tiene cada muestra y fracción en el estadillo.

- Dejad los tubos a oscuras y en la nevera unas 24 horas.

9.5 Lectura de la fluorescencia

- Sacad los tubos de la nevera y agitadlos suavemente, cuidando de que el filtro


vuelva a quedar sumergido. Dejad los tubos a temperatura ambiente durante
una hora antes de leerlos.

- Poned en marcha el fluorómetro al menos 30 minutos antes de leer las clorofilas


(se debe enchufar el transformador a la corriente y apretar el botón rojo del
fluorometro).

- Llenad un tubo de vidrio con acetona, introducidlo en el fluorómetro y leed la


señal (esto será el blanco y lo debéis anotar en la columna correspondiente).

- Verted la acetona de la muestra en un tubo de vidrio y leed la señal; apuntad la


lectura en la columna del estadillo Rb (lectura antes de la acidificación), sacad el
tubo y añadid 3 gotas de acido clorhídrico 10%, Volved a leer después de añadir
el acido y apuntad la lectura en la columna Rac (lectura después de la
acidificación). Después de leer las muestras apagad el fluorómetro (botón rojo) y
desenchufad el transformador de la corriente.

- Lavad los tubos con agua del grifo (unas 4 o 5 veces) y con agua MiliQ (una
vez). NUNCA uséis ácido para lavar los tubos de clorofila.

- Copiad los valores de volumen filtrado, volumen de extracción (= volumen


acetona), blanco y lecturas en el estadillo Excel de clorofilas y arrastar las formulas
de los cálculos.

Notas:
Usad siempre lápiz para cualquier anotación del análisis de clorofila (si se cayera
una gota de acetona sobre bolígrafo o rotulador, perderíais la información)
Trabajad tan a obscuras como sea posible.
Los filtros de policarbonato se manipulan mejor si se humedecen con agua de
mar filtrada.

352
10. Cuadro sinóptico de la técnica

Toma de muestras de
agua de la roseta

En profundidades En todas las


donde se analiza profundidades
Producción Primaria

Análisis de Chl a total


Fraccionada por tamaños Sin fraccionar por
Filtrar 200-500 ml de agua Filtrar 200-500 ml de agua Filtrar 200-500 ml de agua
a través de una secuencia a través de un filtro de a través de filtros GF/F
de filtros de policarbonato policarbonato 0.2 μm
de 20, 2 y 0.2 μm

Anotar el volumen de agua filtrado de


cada muestra y fracción de tamaño

Congelación de los
filtros a -20ºC

6 horas (mínimo)

Sacar los filtros del congelador e


introducirlos en tubos de centrífuga
con 5-7 ml de acetona 90% (Anotar
el V exacto de acetona utilizado)

22-23 horas

Lectura en el
fluorómetro

11. Calculo de los resultados.

La concentracion de Clor a en la muestra de agua se calcula mediante la


fórmula:

Clor a (mg m-3) = F*(Rb-B)*Ve/Vm,

353
donde F es el factor del fluorómetro, Rb la lectura de al fluorescencia antes de
acidificar, B es la lectura correspondiente al blanco de acetona 90%, Ve es el
volumen de extracto acetónica en ml y Vm el volumen de muestra filtrado en l.

12. Control de calidad

En general, se trata de un método muy robusto. Como control de calidad es útil


procesar muestras duplicadas extraidas del mismo frasco de muestreo. También
es interesante procesar frascos de muestreo duplicados, procedentes de la misma
botella Niskin, pero en este caso ya entran fuentes de variabilidad adicionales a
las del análisis propiamente dicho.

13. Referencias

Jeffrey, S. W., Humphrey, G. F. (1975) New spectrophotometric equations for


determining chlorophylls a, b, c1 and c2 in higher plants, algae and natural
phytoplankton. Biochem. Physiol. Pflanzen. 167, 191 – 194.

Knap, A., Michaels, A., Close, A. , Ducklow, H., Dickson, A. (eds.)- 1996. Protocols
for the Joint Global Ocean Flux Study (JGOFS) Core Measurements. JGOFS Report
Nr. 19, vi+170 pp.

Yentsch, C.S., Menzel, D.W.- 1963. A method for the determination of


phytoplankton chlorophyll and phaeophytin by fluorescence. Deep-Sea Res.
101:23–32.

Apéndice

Clorofila_estadillo.xls

354
1. Metodología de muestreo y Técnica analítica

2. Toma de muestras para análisis de pigmentos mediante HPLC

3. Autores del documento y filiación

Francisco Rodríguez Hernández1, Mikel Latasa Arcalís2


1 Centro oceanográfico de Vigo (IEO)
2 Centro oceanográfico de Gijón (IEO)

4. Finalidad. Campo de aplicación

Toma de muestras sobre las que posteriormente se llevará a cabo análisis de


pigmentos fotosintéticos (clorofilas y carotenoides) del fitoplancton, empleando
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC).

5. Conceptos generales

Uno de los objetivos principales en los estudios de oceanografía biológica es


determinar la abundancia y distribución de los diferentes grupos taxonómicos del
fitoplancton. Para ello se emplean múltiples técnicas basadas en el análisis
taxonómico mediante características morfológicas, genéticas y químicas. El
análisis de la composición de pigmentos mediante HPLC pertenece a esta última
categoría, ya que permite la cuantificación de compuestos individuales, clorofilas
y carotenoides. Su gran diversidad y distribución desigual entre las clases algales
(e incluso géneros y especies concretas) confiere a los pigmentos un valor quimio-
taxonómico y nos permiten reconstruir la composición de grupos en muestras
naturales. El procesado e interpretación de los datos requiere conocimientos
sobre la composición pigmentaria en cultivos de laboratorio así como la
utilización de herramientas analíticas como regresión múltiple o programas
específicos (software CHEMTAX: Chemical Taxonomy).

6. Equipamiento necesario

Rampas de filtración; bomba de vacío; congelador (-20 y -80ºC).

7. Reactivos u otro material fungible

Botellas de muestreo de 2 L. Tubo de silicona.


Filtros Whatman de fibra de vidrio (25 y 47 mm; tipo Whatman GF/F) y
policarbonato (47 mm, 5 micras de poro; tipo Nucleopore).
Tubos eppendorf (ó crioviales 2 mL) y pinzas metálicas tipo Millipore.
Frasco lavador. Papel de filtro de laboratorio.
Conexiones para tubos de silicona.

355
8. Descripción de la Técnica

Se harán filtraciones para muestras de pigmentos totales y para muestras de


pigmentos fraccionadas por tamaño. Las muestras se recogerán a las
profundidades seleccionadas en las medidas de producción primaria (al menos 5
profundidades, incluyendo 5 m y el DCM). Para pigmentos totales, la filtración por
filtros Whatman GF/F de 25 mm de diámetro se realizará empleando bombas
EYELA y rampas de filtración para volúmenes grandes (hasta 4 litros). La presión de
filtrado no deberá exceder 0.03 MPa. El volumen de agua filtrada dependerá de
la clorofila a estimada mediante el fluorómetro acoplado al CTD (desde 1.5 litros
en las zonas más productivas hasta 4 litros en regiones oligotróficas). A las
profundidades de 5 m y del DCM se harán filtraciones fraccionadas mediante
filtración secuencial a través de filtros Nucleopore de 5 micras y filtros Whatman
GF/F de 47 mm de diámetro. Elegimos 5 micras para separar el nanoplancton y
microplancton de mayor tamaño para facilitar el filtrado de grandes volúmenes
respecto a los filtros de 2 micras. De este modo podemos separar la fracción de
picoplancton y pequeño nanoplancton respecto al total. Se utilizará la misma
presión que para las muestras de pigmentos totales.

Preparación para la toma de la muestra

• Preparar un frasco lavador con agua de mar filtrada.

• Preparar un estadillo en el que se detallarán las estaciones, profundidades y


fracciones de tamaño muestreadas, hora y día del muestreo, así como un
apartado para observaciones.
Antes de cada filtración hay que tener disponible sobre la poyata un número
suficiente de crioviales de 2mL ó microtubos eppendorf en una gradilla protegida
de la luz. El etiquetado de los mismos deberá incluir el nº de estación, profundidad
y fracción de tamaño. Dichos códigos deben coincidir con los especificados en el
estadillo de muestras.

• Colocar los filtros y las torres de filtración. Para la filtración secuencial colocar 2 o
3 soportes Sartorius en serie (tener en cuenta las condiciones de balanceo del
barco cuando se quiera poner 3 soportes en serie). Colocar el filtro con poro
menor en el soporte más bajo y el de poro mayor en el soporte más alto.

Toma de la muestra

• Origen del material biológico: La profundidad de toma de las muestras


corresponderá a aquellas seleccionadas en las medidas de producción primaria
(generalmente 5 profundidades, entre 5m y el DCM). La elección de
profundidades debe hacerse de forma congruente con el resto de variables
fitoplanctónicas analizadas, tales como citometría, viabilidad celular,
metabolismo y producción primaria.

• Tamaño de la muestra: Para asegurar la filtración de una cantidad suficiente de

356
células que permita obtener una señal cuantificable mediante HPLC es
aconsejable comprobar la clorofila (Chl) a estimada mediante el fluorómetro
acoplado al CTD. Volúmenes de 1.5 L son suficientes para zonas productivas (>
0.25 μg/L Chl a) pero puede necesitarse 2 botellas por profundidad (hasta 4 L) en
regiones oligotróficas.

• En las profundidades de superficie y DCM se debe tomar el doble de muestra


para llevar a cabo la filtración secuencial (fraccionamiento de tamaño) en estas
2 profundidades.

• Toma de muestra: se realizará con tubos de silicona de 8 mm de diámetro


interno. Enjuagar 1 vez la botella con la muestra y llenar y tapar la botella
protegiéndola de la luz directa.

Filtración de la muestra

• Se realizarán filtraciones "directas" y en serie mediante las rampas de filtración y


los tamaños y tipos de filtro indicados anteriormente.

Filtración por filtros de 25 mm (directa).

1.- Llenar todas las torres Millipore con agua filtrada y con las llaves de paso de
la rampa cerradas. Encender la bomba Eyela que debe contener agua
para que succione y un tubo de vaciado hasta la pica.
2.- Comprobar ahora y no durante la filtración que la presión que marca el
manómetro de la bomba Eyela oscila alrededor de 0.025 MPa. Ojo que la
regulación es poco precisa. Para evitar en lo posible la rotura de células es
aconsejable que la presión de vacío no supere 0.03 MPa. En cualquier caso,
el proceso de filtración no debe durar más de 90 min y se debe incrementar
la presión o parar la filtración (y medir y anotar el volumen no filtrado)
cuando se supere este tiempo.
3.- Colocar un tubo de los tubo/conexión en la botella de muestra.
4.- Abrir la llave de paso de la rampa.
5.- Cuando comience a succionar colocar el tapón del tubo/conexión y
asegurarse que succiona la muestra.
6.- Continuar con todas las botellas como en la Fig.1.

357
Filtración secuencial por filtros de 47 mm.

1.- Mantener las llaves de paso cerradas.


2.- Retirar uno de los 3 tapones de las tapas de las torres Sartorius.
3.- Verter la muestra y dejar que la(s) copa(s) inferior se llene por gravedad.
4.- Una vez llena la copa inferior, abrir la llave de paso.
5.- Ir rellenando la copa superior.

• Mantener siempre el filtro mojado. Si la columna de agua por encima del filtro es
<1 cm cerrar la llave de paso, retirar el tapón, rellenar la torre con agua de mar
filtrada, abrir la llave y colocar el tapón.

• Comprobar que la presión de la bomba no varía durante el proceso de


filtración. El manómetro no lee de forma correcta cuando succiona agua;
asegurarse que el valor mínimo que marca es aproximadamente 0.025 MPa. Si
existe alguna fuga, intentar arreglarla. Si no es posible, utilizar los 2 succionadores
de la bomba Eyela con una conexión Y (mirar las instrucciones de la bomba en
caso de duda). Fig. 2.

358
• Comprobar que los filtros están secos antes de retirar las copas de filtración. Las
pinzas de punta plana tipo Millipore son más cómodas para manipular los filtros,
que deberán ser doblados cuidadosamente sin tocar la parte central superior que
contiene la muestra. Una vez doblados, presionar sobre el filtro usando papel de
laboratorio hasta que no deje restos de humedad. Debe evitarse el agua residual
del filtro ya que interfiere en el proceso de extracción de pigmentos. Introducir los
filtros lo más pronto posible en los microtubos y protegerlos del exceso de luz
durante su manipulación. Es importante congelar las muestras inmediatamente
tras su recogida a -20ºC (< 2 horas), hasta que acaben de filtrarse todas las
muestras de la estación que es cuando se trasladarán de forma definitiva a -80ºC
en cada campaña.

• Proceso en el laboratorio: Se realiza la extracción de la muestra mediante


disolventes orgánicos (metanol 95% ó acetona 90%) y el análisis mediante HPLC
empleando métodos previamente publicados (Zapata et al 2000).

• Final: La tarea se completará con la cuantificación de pigmentos (en base a la


calibración previa del sistema con patrones comerciales de pigmentos) y la
reconstrucción de la composición de grupos del fitoplancton utilizando el
programa CHEMTAX y/ó herramientas de regresión múltiple.

359
9. Cuadro sinóptico de la técnica

1. Etiquetado previo de tubos 2. Filtración en serie


(<0.025MPa)
Estación
Profundidad
Fracción tamaño

IMPORTANTE: Evitar el exceso 3. Doblar y secar los filtros con papel de laboratorio.
de luz y temperatura durante la
manipulación y filtrado de las
muestras

4. Congelar a -20ºC ó -80ºC si es


posible.

10. Referencias

Zapata, M., Rodríguez, F., & Garrido, J. L. (2000). Separation of chlorophylls and
carotenoids from marine phytoplankton: a new HPLC method using a reversed
phase C8 column and pyridinecontaining mobile phases. Marine Ecology Progress
Series 195, 29–45.

360
1. Técnicas analíticas

2. Tasas de predación y crecimiento del fitoplancton mediante técnicas de


dilución

3. Autores del documento y filiación


Susana Agustí, IMEDEA- CSIC

4. Finalidad. Campo de aplicación

El objetivo es cuantificar las tasas de crecimiento y de pérdidas del fitoplancton


por la predación del microzooplancton. Se utilizará el método de la dilución
(Landry & Hassett 1982, Landry 1995) en el que se utiliza agua de mar filtrada para
crear un gradiente de diluciones de forma que se crea un gradiente equivalente
en la presión de predación del microzooplancton sobre el fitoplancton. La tasa
de predación se calcula examinando la tasa de crecimiento del fitoplancton en
el gradiente de diluciones.

5. Conceptos generales

En la técnica de la dilución, la mortalidad por pastoreo es proporcional al


efecto de la dilución, de forma que las muestras mas diluidas deberían tener
menos depredadores y presentar una tasa de crecimiento mayor que muestras
no diluidas. La tasa de crecimiento del fitoplancton es independiente del efecto
de la dilución, es decir, es constante con relación a su abundancia. La técnica
descrita en los años 80 (Landry & Hassett, 1982) ha ido perfeccionandose desde
entonces tras varias revisiones y artículos que han examinado críticamente los
resultados, en función a cambios en las condiciones de incubación, y en los
cálculos de las tasas (ej. Landry 1993, Landry et al. 1995, Calbet & Landry 2004,
Dolan & McKeon 2005, Landry & Calbet 2005). A las diluciones se les añade
nutrientes para homogeneizar el crecimiento del fitoplancton, y evitar respuestas
al aumento de nutrientes en las diluciones mayores de aguas con limitación
nutritiva. En estos casos, el y-intercepto de la regresión de diluciones puede no
ser representativo de la tasa de crecimiento real. Por esta razón, se añade un
control sin nutrientes para calcular la tasa neta de crecimiento del fitoplancton, y
compararla con la tasa inmediata con adición de nutrientes.
La asunción de que la tasa de grazing varía proporcionalmente a la
dilución tiene sin embargo algunos problemas conceptuales y metodológicos,
Principalmente, es dificil que la densidad de predadores se mantenga
proporcional entre las diluciones con relación a la proporción inicial. Por
ejemplo, la abundancia de los flagelados, puede descompensarse debido a que
tambien son presas de los ciliados, y dado que los flagelados y los ciliados

361
(componente principal del microzooplancton) tienen un potencial de altas tasas
de crecimiento esta descompensacion puede aumentar con el tiempo del
experimento.

6. Equipamiento necesario

Citometro de flujo
Fluorometro Turner Designs
Tanque y sistema de incubacion en la cubierta del barco
Rampa y soportes de fitlracion
Bomba de vacio
Bomba de agua
Bomba peristáltica

7. Reactivos u otro material fungible

Reactivos.-

Acetona 90%
Glutaraldehido (1% en muestra)
Acido clorhídrico (para lavar)
Soluciones de nutrientes: 0.5 µM N-amonio (concentración final en la muestra) y
0.03 µM de fosfato (concentración final en la muestra)

Fungible.-
El necesario para contajes de picoplancton en el citometro de flujo:
tubos Falcon, gradillas, pipetas automaticas, puntas, Beads calibracion, vortex,
etc.
Dispensador Glutaraldehido
El material necesario para Analisis de clorofila:
tubos centrifuga, cubetas de fluorometro, filtros wahtman 25 mm, acetona 90%,
pipetas pasteur, dispensador
Cartuchos de 0.2 µm
Botes de Cuarzo 2 L
Botes de Policarbonato 2 L
Garrafas de 20 L x2
Garrafas de 10 L x2

8. Calibración

No se realiza.

- Descripción de la Técnica

362
Se aplicará el método modificado de dilución (Landry 1993, Landry et al. 1994)
siguiendo los procedimientos descritos en Agawin y Agustí (2005). Para cada
experimento se muestrea agua de superficie con el botellon Niskin de 30L, de los
que se recogerán 22 L de los cuales 8 L se filtrarán por 0.2 µm. Se utilizaran 5
botellas de 2L de policarbonato Nalgene (opacas a la radiación UV), y 5 botellas
de cuarzo de 2 L (transparentes a la radiación UV), utilizando 4 y 4 de cada tipo
para las diluciones enriquecidas con nutrientes. Diferentes volúmenes de agua
filtrada y sin filtrar se dispensaran en cada botella para conseguir abundancias
aproximadas al 25, 50, 75 y 100% los contenidos ambientales, para cada serie de
botellas de cuarzo o policarbonato. A cada botella se añadirán 0.5 µM N-amonio
y 0.03 µM de fosfato (concentraciones finales). Una botella de policarbonato se
llenará de agua de mar filtrada por 0.2 µm para cuantificar las células que han
podido pasar el filtro. 1 botella de cuarzo y otra de policarbonato se llenarán de
agua de mar utilizarán como control 100% sin adición de nutrientes. Las botellas
se incubarán en cubierta en tanques con circuito de circulación de agua de
superficie y expuestas a la radiación solar. Periódicamente, se analizará el efecto
combinado de la temperatura, para lo cuál se realizará la incubación del mismo
esquema de experimento pero utilizando el doble de botellas que serán
incubadas a dos temperaturas diferentes, a temperatura ambiente y a una
temperatura 2-3ºC por encima de la temperatura ambiente del agua de
superficie, para lo que se utilizarán los enfriadores de superficie del BIO Hespérides.

Las botellas se incubarán durante 24 horas. Se tomaran submuestras de


50-100 ml de cada botella al inicio, y a las 24 horas, para el análisis fluorométrico
de la concentración de clorofila a (según el método descrito previamente). El
análisis de la respuesta de las poblaciones de picofitoplancton se analizará en
submuestras duplicadas de 2 ml, que se tomarán en los mismos intervalos de
muestreo, y que serán fijadas con glutaraldehído (1% concentración final) y
congeladas a –80 ˚C hasta su análisis en el citómetro de flujo. En algunos
experimentos, las muestras se analizarán en vivo, para cuantificar los cambios en
la proporción de células vivas, siguiendo el método de la digestión celular,
descrito con anterioridad.

363
10. Cuadro sinóptico de la técnica

11. Calculo de los resultados.

En cada tratamiento o dilución, se mide la concentración de clorofila y la


abundancia de las distintas poblaciones de pico-fitoplancton al inicio y después

364
del tiempo de incubación (24 o 48 h) y se calcula la tasa neta de crecimiento
(µDx, Ec. 1) a partir de los cambios observados entre las medidas iniciales y al final
de la incubación.

La tasa de predación (g) se calcula como la pendiente de la regresión


entre la tasa neta de crecimiento aparente (µn) y el factor de dilución (D, Figura
1). Esta pendiente es la tasa de predación instantánea, de forma que cuando en
un experimento la pendiente no es significativa, se asume que la tasa de
predación es 0 o indetectable (Landry & Calbet 2005). El intercepto de la
regresión entre la tasa de crecimiento en cada dilución y el factor de dilución, es
equivalente a la tasa bruta con nutrientes. La tasa bruta se calcula a partir de la
suma de la tasa de predación y la tasa media neta calculada en las botellas sin
adicción de nutrientes.

12. Control de calidad

La técnica es ta sometida a los errores ya descritos con anterioridad. Los


resultados se compararan con las tasas de crecimiento obtenidas con otros
métodos.

365
13. Referencias

Agawin, NS, Agustí, S. 2005. Prochlorococcus and Synechococcus cells in the


central Atlantic Ocean: distribution, growth, and mortality (grazing) rates. Vie et
Milieu, 55:165-175

Calbet, A. and Landry, M. R. 2004. Phytoplankton growth, microzoo- plankton


grazing and carbon cycling in marine systems, Limnol. Oceanogr., 49, 51–57.

Dolan, J. R. and McKeon, K. 2005 .The reliability of grazing rate estimates from
dilution experiments: Have we over-estimated rates of organic carbon
consumption by microzooplankton?, Ocean Sci., 1, 1–7,

Landry, M R., Hassett, R. P. (1982).Estlrnating the grazlng impact of marine micro-


zooplankton. Mar. Biol. 67: 283-288

Landry, M. R. (1994). Methods and controls for measuring the grazing impact of
planktonic protists. Mar. microb. Food Webs 8: 37-57

Landry MR, Kirshtein J, Constantinou J 1995. A refined dilution technique for


measuring the community grazing impact of microzooplankton, with experimental
tests in the central equatorial Pacific. Mar Ecol Prog Ser 120: 53-63.

Landry, M. R. and Calbet, A. 2005. Reality checks on microbial food web


interactions in dilution experiments: responses to the comments of Dolan and
McKeon. Ocean Science, 1, 39–44.

366
1. Técnicas analíticas

2. Tasa bruta de crecimiento del pico-fitoplancton mediante análisis del índice


mitótico

3. Autores del documento y filiación


Susana Agustí, IMEDEA- CSIC

4. Finalidad. Campo de aplicación


Cuantificación de las tasas de crecimiento del fitoplancton mediante el análisis
de división celular aplicando el método del indice mitótico. El método permite
cuantificar la tasa bruta de crecimiento. Contribuye a alcanzar los Objetivos de
Dinámica de Poblaciones del Bloque 5.

5. Conceptos generales
El crecimiento y la división celular del pico-fitoplancton (células ≤ 2 µm
diámetro)que domina el océano oligotrófico (ej. Agawin et al. 1998) están
sincronizadas en la naturaleza con el ciclo dia-noche (Liu et al. 1998, Vaulot and
Marie 1999). p icoplanct plancton pifinirá de forma general la variable o proceso
a la que va aplicada la metodología y su relevancia en procesos biológicos,
químicos, físicos, etc.

6. Equipamiento necesario
Sistema de incubación. Tanque, enfriador de cubierta, Botellas de 2 L Colector de
fracciones Gilson. -
Bomba peristáltica
Congelador -80ºC
Vortex
Citómetro de Flujo

7. Reactivos u otro material fungible


Reactivos:
Glutaraldehido (1% concentración final en la muestra)
SYBR-GREEN I (Molecular Probes)
RNAse A (Sigma R-4875), preparada en soluciónn1:1 (wt/wt l-1);
RNAse B (Sigma R-5750), preparada en soluciónn1:1 (wt/wt l-1);
Citrato potásico (concentración final de 25 mM)
ClH (para lavado)
Tubo silicona (30 m)
Tubos conicos 15 ml
Tubos Falcon
Pipeta automática 1000-5000 µl
Pipeta automática 100-1000 µl
Pipeta automática 10-100 µl

367
8. Calibración
No se realiza, se utilizan los valores arbitrarios de fluorescencia verde por célula
obtenidos en el citómetro de flujo.

9. Descripción de la Técnica
La cuantificación de la tasa de crecimiento de las poblaciones de pico-
cianobacterias se estimará mediante el análisis de su ciclo de división celular. Se
analizarán con preferencia tasas en poblaciones superficiales, aunque es
probable que se incluyan también estimas de otras profundidades. Se estima
realizar las estimas con una frecuencia de una de cada tres estaciones a lo largo
de todas las campañas de la expedición Malaspina.
Muestreo e incubación. Para cada experimento, 2-L de agua de superficie se
dispensaran por duplicado en botellas de 2-L PC Nalgene bottles lavadas al
acido. Las botellas se incubarán durante 24 horas en cubierta en un tanque con
un circuito de agua de superficie para mantener la temperatura y expuestas a
iluminación solar natural.
Cada 2 horas, las poblaciones se muestrearan utilizando la bomba peristáltica y
un muestreador automático programable, y las submuestras fijadas con
glutaraldehido (1% concentración final) y congeladas a -80 ˚C hasta su análisis en
un citómetro de flujo (Agawin and Agustí 2005).
Análisis. Las muestras se descongelan a temperatura ambiente y se incuban a
37ºC durante 30 minutos en presencia de 0.1 g l-1 de solucion RNAse A y B, para

Figura 1. Fluorescencia verde de celulas de Prochlorococcus con ADN teñido con


SYBRgreen1, y los cambios observados durante el ciclo-dia noche (Agawin and
Agustí 2005).

368
eliminar RNA y ácidos nucleicos ribosómicos. Posteriormente, se añade citrato
potasico (concentración final de 25 mM) y SYBR-GREEN I (concentracion final de
10-4 de la solución comercial) para tinción del ADN y se incuba durante mas de 15
minutos a temperatura ambiente en la oscuridad antes de su análisis por
citometría de flujo (Marie et al. 1997). La adquisición logaritmica o linear en el
citometro de flujo debe hacerse en función del modelo que se utilice
(FACSCalibur o FACSAria) con el análisis de los datos del ciclo en modo linear. Los
valores de fluorescencia verde por célula, son equivalentes a la concentración de
ADN celular, aumentando en 2 veces en forma linear en la fase G2-M con
respecto a la fase G1. Las poblaciones de Synechococcus y Prochlorococcus se
identifican en función de sus señales de scattering (SSC), y fluorescencias roja y
naranja comos e describe en la ficha de contajes de picofitoplancton mediante
citometria de flujo.

10. Cuadro sinóptico de la técnica

11. Calculo de los resultados.


Para el análisis del ciclo celular se utilizará el programa ModFit LT (Verity Software
House, Inc. 1995) o un software similar, para estimar los porcentajes de células en
las fases G1, G2-M, y S. Estimas d e las tasas de crecimiento. La tasa

369
medias de crecimiento especifico de las distintas poblaciones se calcularan
siguiendo el método de Liu et al. (1997):

1 24

(Ts+ T G 2 M) ∫0
μ= ln[1 + fs(t) + fG 2M (t)]dt

donde µ es la tasa de crecimiento, Ts + TG2M es la duración de la mitosis estimada


gráficamente como el lag temporal entre la fase S (fraccion máxima) y la fase
G2+M (fraccion máxima), multiplicado este tiempo por 2 (Carpenter and Chang
1988). fs(ti) y fG2M(ti) son las fracciones de las células en S y G2+M en cada
intervalo de muestreo.

12. Control de calidad


Los resultados son fiables, indicando que la tinción del ADN y detección de las
fases de síntesis y mitosis está siendo óptima, cuando el aumento en la
fluorescencia de las células en la fase G2-M con respecto a la fluorescencia en la
fase G1, es de 2 ± 0.5 veces.

13. Referencias

Agawin, N.S., Duarte C.M. and S. Agustí. 1998. Growth and abundance of
Synechococcus sp. in a Mediterranean Bay : Seasonality and relationship with
temperature. Mar. Ecol. Prog. Ser.170: 45-53

Agawin, NSR, S. Agustí. 2005. Prochlorococcus and Synechococcus cells in the


Central Atlantic ocean: distribution, growth and mortality grazing rates. Vie et
Milieu 55: 165-175. Pico-phytoplankton Special Issue.

Liu, H., Landry, M.R., Vaulot, D., Campbell, L., 1999. Prochlorococcus growth rates
in the central equatorial Pacific: An application of the fmax approach. Journal of
Geophysical Research 104, 3391-3399.

Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D., 1997. Enumaration and cell cycle
Analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the
nucleic acid stain SYBR Green I. Appl.Envir.Microbiol. 63, 186-193.

Vaulot, D., Marie, D., 1999. Diel variability of photosynthetic picoplankton in the
equatorial Pacific. Journal of Geophysical Research 104, 3297-3310.

370
1. Técnicas analíticas

2. Cuantificación de la abundancia de células vivas y muertas de las


comunidades de picoplancton

3. Autores del documento y filiación


Susana Agustí. IMEDEA, CSIC

4. Finalidad. Campo de aplicación

Determinación de la abundancia de células vivas y muertas de las comunidades


picoplanctónicas del Océano.

5. Conceptos generales

Cuantificar la abundancia de celulas vivas y muertas del fitoplancton in situ es


importante para conocer el papel de la mortalidad celular como proceso de
perdidas de las poblaciones naturales. Además, analizar el porcentaje de células
vivas en las poblaciones naturales de picoplancton, ha demostrado ser una
herramienta útil para identificar las relaciones de competencia o coexistencia del
picofitoplancton in situ (Agustí 2004) ya que permite identificar el grado de éxito
en la supervivencia de las distintas poblaciones de la comunidad de
picofitoplancton en relacion a las condiciones naturales de luz (Agustí 2004),
niveles nutritivos y temperatura (Agustí y Sánchez 2002, Alonso-Laita et al. 2005,
Alonso-Laita y Agustí 2006, Lasternas et al. En Prensa), e identificar la segregación
de nichos o la competencia por los recursos in situ, lo que hasta ahora no habia
sido posible.
En las campañas Malaspina la abundancia de céluas vivas en las
poblaciones de picofitoplancton se analizará aplicando el método de la digestón
celular (CDA = Cell Digestion Assay) que es un test de la permeabilidad de la
membrana de las células (Darzynkiewicz et al. 1994).

Figura 1. Cultivo de
Amphidinium carterae al
que se le ha aplicado el
método CDA (Cell Digestion
Assay) para identificar y
cuantificar la abundancia
de células vivas.
Las flechas negras señalan
células muertas que están
siendo digeridas por las
enzimas. Las flechas rojas
señalan células vivas
intactas.

371
La pérdida en la capacidad de mantener la homeostasis, resultando en un
aumento en la permeabilidad de la membrana celular, caracteriza a las células
muertas, incluyendo tanto a las células que mueren por procesos necróticos
como por apoptosis (ej. Wyllie et al. 1980, Ellis et al. 1991, Darzynkiewicz et al.
1994).
El CDA, fue adaptado para su aplicación a comunidades de fitoplancton
por Agustí y Sánchez (2002) y consiste en la adición de una serie de enzimas
digestivas (DNasa + trypsin) a las muestras, de forma que las células muertas con
una mayor permeabilidad de la membrana no pueden evitar que las enzimas
entren en la célula. Las enzimas una vez dentro de la célula la digieren
eliminándola (Figura 1). Tras la incubación con DNasa + trypsin las células que
restan en la muestra son solamente las células vivas, que poseían membranas
íntegras.

Blank sample
1000 1000
Eukaryotic
800 800

600 Beads 600 Cyanobacteria

400 400
Prochlorophytes Beads
200 200

0 0
0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000
SSC FL2

Cell digestion assay


1000 1000
Eukaryotic
800 800

600 Beads 600 Cyanobacteria

400 400

Prochlorophytes Beads
200 200

0 0
0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000
SSC FL2

Figura 2. Scatter Plot del Citometro FACSCalibur de los blancos y las muestras tras aplicar
el CDA, en una muestra del Atlantco Tropical mostrando las señales de las poblaciones
de Synechococcus, Prochlorococcus y de pico-Eucariotas.

372
Además, tras el CDA las células vivas permanecen intactas, de forma que
mantienen sus propiedades morfológicas, ópticas y su fluorescencia natural,
siendo fáciles de identificar utilizando un citometro de flujo (Figura 2). La ventaja
del CDA es que al no utilizar tinciones, las señales de fluorescencia roja (FL3),
naranja (FL2) o verde (FL!) de las células vivas permanecen similares a las de las
poblaciones sin tratar, resultando inequívoca su identificación y cuantificación.

6. Equipamiento necesario

Citómetro de flujo
Baño seco
Vortex

7. Reactivos u otro material fungible

Soluciones stock: Solución DNAsa I, 400µg de DNAsa / ml en HBSS ( 0.0004 g por


cada ml HBSS) Solución de Trypsin , 1% de Trypsin en HBSS (0.01 g por cada ml
HBSS)
Tubos Falcon
Pipeta automatica 100-1000 µl
Pipeta automática 10-100 µl
Solucion de Beads fluorescentes -1 µm diámetro (capitulo citometría)
Hielo picado

8. Calibración

Calibración de citometría de flujo como quedó registrada en la ficha X

9. Descripción de la Técnica

Enseguida de efectuar el muestreo, incubar por replicado 1 ml de agua de mar


en tubos Falcon de cada profundidad con 0.2 ml de solución DNAsa a 35ºC
durante 15 minutos, pasados los 15 minutos añadir 0.2 ml de solución de Trypsin e
incubar durante 30 minutos más a 35ºC. Pasado este tiempo agitar en un vortex y
colocar los tubos en hielo para parar la reacción, aunque este procedimiento no
es necesario si las muestras se pasan al citómetro seguidamente. Leer las
muestras en vivo en el citómetro de flujo. Añadir a las muestras la solución de
Beads calibrada para cuantificar las células. Paralelamente, 2 blancos de 1 ml de
muestra en fresco (sin fijar) de cada profundidad se analizan en el citómetro de
flujo. Las células de los blancos representan el total de la población (células
muertas+vivas), mientras que las células tras el ensayo de la digestión enzimática
representan las células vivas.
Temperatura de incubación: Uso Standard: 35ºC Especies polares o de aguas frías
(menos de 10ºC): 25ºC (Llabrés & Agustí, 2008).

373
Las soluciones de enzimas después de preparadas deben filtrarse por 0.2 µm,
distribuirse en alícuotas de pequeño volumen (ej. 2-5 ml) y guardar congeladas a -
20 o -25ºC hasta su uso.

10. Cuadro sinóptico de la técnica

2 MUESTRA 2 BLANCOS

1 ml de agua de mar 1 ml de agua 1 ml de


+ de mar sin agua de
0.2 ml solución fijar mar sin
DNAsa fijar

Incubación durante 15
minutos a 35ºC

Añadir 0.2 ml de
solución Trypsin
Medida directa en
citómetro
Incubación durante 30
minutos a 35ºC

Parar la reacción
aplicando los tubos de
hielo

Lectura in vivo de la abundancia de picofitoplancton mediante citometría de


flujo

374
11. Calculo de los resultados.

La abundancia celular obtenida en los blancos (promedio) representa el total de


la población (células muertas+vivas), mientras que las células tras el ensayo de la
digestión enzimática representan las células vivas. La abundancia de células
muertas se obtiene restando a la abundancia total la abundancia de células
vivas.

12. Control de calidad

- En aguas cuya temperatura sea menor de 10ªC la temperatura de incubación


debe reducirse a 25ªC (Llabrés y Agustí 2008). Si se recorren aguas de
temperaturas menores de 15ºC, convendria hacer un test de fiabilidad incubando
paralelamente muestras a 35 y a 25ªC para comprobar que la precisión y
fiabilidad de los resultados no está alterado por la temperatura de incubación.

- Dejar a temperatura ambiente unos minutos, tanto las muestras que acaban de
incubar a 35ºC, como las que han estado en hielo para detener las reacciones
enzimáticas. Este procedimiento conviene antes de leerlas en el citometro de
flujo para no alterar la viscosidad de la muestra que puede alterar un poco la
velocidad del flujo, y también para evitar en poblaciones de Prochlorococcus,
que su señal de SSC (Side Sacttering) puede variar si las muestras estan frias (baño
de hielo).

- Un test de calidad para comprobar la eficiencia de los reactivos, se realizará


periódicamente a bordo, y siempre que se encuentre algún resultado irregular,
comparando los resultados del CDA con los obtenidos aplicando un método
independiente de cuantificación de células vivas. El test se realizara utilizando la
tinción vital Back-light Kit (Molecular Probes) siguiendo el protocolo descrito en
Llabrés y Agustí (2008). El test se realizará a bordo en el microscopio de
epifluorescencia en poblaciones de Synechococcus ya que los picoEukariotas
pueden ser poco abundantes impidiendo la obtención de resultados
estadísticamente fiables.

13. Referencias

Agustí S, Sánchez CM (2002) Cell viability in natural phytoplankton


communities quantified by a membrane permeability probe. Limnol Oceanogr
47:818-828
Agustí, S (2004) Viability and niche segregation of Prochlorococcus and
Synechoccoccus cells across the central Atlantic Ocean. Aquat. Mic. Ecol. 36: 53–
59
Alonso-Laita, P., N. Navarro, C.M. Duarte, S. Agustí (2005) Seasonality of pico-
phytoplankton abundance and cell death in a Mediterranean bay (Bay of Palma,
Majorca Island). Vie et Milieu 55: 177-184. Pico-phytoplankton Special Issue.

375
Alonso-Laita, P., S. Agustí (2006) Contrasting patterns of phytoplankton
viability in the subtropical NE Atlantic Ocean. Aquatic Microbial Ecology 43: 67-78.
Darzynkiewicz Z, Li X, Gong J (1994) Assays of cell viability: Discrimination of
cells dying by apoptosis. In: Darzynkiewicz Z, Robinson JP, Crissman HA (eds)
Methods in cell biology. Academic Press, San Diego, p 5-38
Ellis RE, Yuan J, Horvitz HR (1991) Mechanisms and functions of cell death.
Annual Review of Cell Biology, 7: 663-698
Lasternas, S, S Agustí, CM Duarte (2010) Phyto- and Bacterioplankton
abundance and viability across the Mediterranean Sea. Aquatic Microbial
Ecology, In revision.
Llabrés M, S Agustí. 2008. Extending the Cell Digestion Assay to Quantify
Dead Phytoplankton Cells in Cold and Polar Waters. Limnology and
Oceanography: Methods 6: 659–666.Agustí, 2008
Wyllie AH, Kerr J.F.R., Currie AR (1980) Cell death: the significance of
apoptosis. International Review of Cytology, 68: 251-306

376
1. Técnicas analíticas.

2. Título.

Tasas de lisis celular del fitoplancton

3. Autores del documento y filiación


Susana Agustí, IMEDEA- CSIC

4. Finalidad. Campo de aplicación

El objetivo es cuantificar las tasas de pérdidas del fitoplancton debidas a la


mortalidad celular. Se utilizará el método basado en la cuantificación de las
esterasas disueltas (vanBoeckel et al. 1992), siguiendo el procedimiento descrito
en Agustí et al. (1998). Este método, es el único descrito hasta ahora que
permite cuantificar las tasas de lisis en comunidades naturales de fitoplancton.

5. Conceptos generales

El método se basa en la medida de la actividad esterasa disuelta en el agua


como trazador de la lisis celular del fitoplancton, ya que las enzimas esterasas son
estrictamente citoplasmáticas, y aparecen en el medio tras la lisis celular o por
daños a la membrana (e.g., Rotman and Papermaster 1966). El método
cuantifica la abundacia de la enzima disuelta en el agua cuantificando su
actividad a 20ºC y en condiciones de saturación de sustrato. En presencia de
fluoresceina di-acetato (FDA) que se añade como sustrato, las esterasas rompen
el acetato y se libera el compuesto flurescente Fluoresceina. La fluoresceina se
acumula en las muestras como producto de la reacción entre la actividad
esterasa y la FDA y aumenta al aumentar la concnetracion de FDA siguiendo la
cinética enzimática de Michaelis-Menten (Rotman and Papermaster 1966).

6. Equipamiento necesario

Baño seco
Pipeta automática volumen variable 1-5 ml
Pipeta multidispensadora
Vortex
Espectrofluorimetro:
Se utilizara el equipo del Hesperides, Perkin Elmer LS . Se opreda desde el
ordenador y para colocar la cubeta debe abrirse la puerta azul situada en la
parte delantera del aparato (ver esquema).

377
En el escritorio del ordenador se selecciona el programa FL WinLab.

En Methods, se abre el metodo “malaspina esterasas.mth”

En este fichero ya estan especificados los parametros “set up”, incluyendo la


longitud de onda de excitacion (451 nm) y la longitud de onda de emision (510)
correctas. Habria que ajustar el slit de excitacion y emision adecuadamente en
función a la fluorescencia de las muestras. Por defecto el metodo tiene
seleccionado 10 nm en excitacion (probablemente correcto) y 10 nm en
emisison, este ultimo probablemente habria que aumentarlo a 20 nm. Una vez
seleccionados los parametros se coloca la muestra en el portacubetas, se cierra

378
la puerta y se hace click sobre el semaforo, que pasa de verde a rojo mientras
hace la lectura, cuyo valor aparece en el recuadro negro situado a la derecha
de Intensity (en letras rojas). Se toma nota de la lectura, y se cambia la muestra,
que se vuelve a leer siguiendo el mismo procedimeinto hasta completar todas las
profundidades/replicas. Una vez finalizadas la smeustras, se cuantiifca la
intensidad de la fluorescencia del standard de fluoresceina.

379
7. Reactivos u otro material fungible

Reactivos.-
Solución 2 mM de FDA (fluoresceina-di-acetato, 0.0416 gr en 50 ml Acetona
100%)Solución 20 mM de EDTA (0.3724 gr en 50 ml agua destilada)
Fluoresceina, para calibración (ALDRICH ref# 16.630-8, MW = 376.28)
Soluciones I, II y III del medio F/2
Acido cloridrico para lavado

Material Fungible.-
Pipetas pasteur
Jeringas y Millex 0.2 µm
Tubos 15 ml (100)
Gradillas
Botes vidrio 1 L (2) y 250 ml (4)
cubetas 1 cm todos los lados claros

8. Calibración
La actividad esterasa disuelta se cuantifica como la concentración de
fluoresceína liberada en las muestras por unidad de tiempo (a 20ºC, y durante
una hora de incubación en nuestro caso). Se prepara una solución standard se
fluoresceina que debe medirse debe medirse ene le estectrofluorimetro tras cada
serie de medidas. El standard de fluoresceína se prepara en agua destilada en
concentraciones de 10 nM a 1000 nM. El standard a oscuras y refrigerado es
estable durante meses.

9. Descripción de la Técnica

Se cuantiifcara en perfiles verticales en la columna de agua desde la superficie


hasta los 150-200 m de profundidad en todas las estaciones coincidiendo con las
profundidades de medida de picofitoplancton y clorofila por fliorometria. Se
tomarán 50 ml de agua de las botellas Niskin de cada profundidad en botes
osuros lavados al ácido. Con el fin de realizar un blanco de reactivos, se
muestreara regularmente (al menos 2 veces en cada leg) 50 ml de una
profundidad > 2000 m, libre de esterasas disueltas en la que se analizara la DEA y
se tomara como blanco de referencia.
Inmediatamente despues del meustreo, tomar un volumen de agua de cada
profundidad muestreada con la jeringa y filtrar por 0.2 µm utilizando un Millex para
medir la actividad esterasa disuelta (DEA). Distribuir 5 ml del agua de mar filtrada
por triplicado en tubos de vidrio. Añadir 50 µL de EDTA y 50 µL de FDA a cada
tubo con la pipeta multidispensadora. Agitar en un vortex e incubar en un baño
a 20ºC durante exactamente una hora. Pasado este tiempo, medir
inmediatamente la fluorescencia en un espectrofluorimetro a 451 nm de
excitación y a 510 nm de emisión. Las esterasas particuladas (PEA) se derivaran
de la concentración de clorofila a, utilizando los cocientes PEA/Chla publicados
por Agustí and Duarte (2002).

380
10. Cuadro sinóptico de la técnica

11. Calculo de los resultados.

Tasas de decay de la DEA. - Se realizarán medidas de la pérdida de actividad de


la enzima (> 4 en cada leg). Las enzimas una vez liberadas al medio tras la lisis
pierden actividad por diversas causas (químicas y biológicas). Las medidas
consistirán en añadir esterasas disueltas, derivadas de un cultivo de fitoplancton
qiue se mantendra a bordo añadiendo medio de cultivo f/2 al agua de mar, a
muestras de agua de 250 ml de la superficie y del DCM que se incuban a
temperatura “in situ” . Se cuantificrá la pérdida de actividad (DEA) de cada
muestra a intervalos de tiempo creciente (0, 1, 3, 6, 12, y 24, h) para obtener una
curva de pérdida de actividad exponencial, aplicando la ecuación descrita en
Agustí et al. (1998).

Cálculo de las tasas de lisis del fitoplancton. Se calcularán para cada


profundidad a partir de los valores de DEA, PEA y tasa de pérdida de actividad,
según se describe en Agustí et al. (1998).

La tasa de lisis del fitoplancton (µL d-1) se calcula como la disminución en la


actividad esterasa particulada (PEA) con el tiempo (t), devido a la produccion de
esterasas disueltas durante al lisis celular, siguiendo la ecuacion:

381
Ec. 1

donde PEAo es la Actividad de esterasa particuladas en el tiempo inicial, y PEAt


despeus del tiempo t, siendo t igual a un dia.

La tasa a la que la actividad esterasa (EA) desaparece una vez excretada al


medio (experiemtnos de desaparición de la actividad d e la enzima), se calcula
en base a los cambios en EA disuelta en un tiempo t (horas),

EA o
Ln ( )
EA t
µ(loss) EA (h -1 ) =
t Ec. (2)

µ(loss)EA se utiliza paar clacular la vida media (T1/2) de la DEA en el agua


de mar (ecuación 3),

T1/2 ( h ) = Ln(0.5) / µ(loss)EA Ec. (3)

La producción de esterasas disueltas (EA (Prod.) en un dia se calcula a partir de la


vida media

Ec. (4)

y la tasa de lisis del fitoplancton (µL) se calcula, usando Ec. (1), remmplazando
PEAt por PEAo - EA(Prod.)

Ec. (5)

Se asume que la tasa de desaparición de la enzima disuelta esta en steady state


a una escala de horas, es decir, que la perdida de la enzima y su producción
estan en eauilibrio (ej. Agustí et al. 1998).

382
12. Control de calidad

Los valores mínimos de blanco de referencia (fluorescencia de reactivos) para


DEA publicados correspondientes a agua profunda (500 m) del océano Atlántico
son de 15.2 ± 0.6 nmol fluoresceina L -1 h-1. Los valores obtenidos por tanto deben
superiores a este valor de referencia.

13. Referencias

Agustí, S., Satta, M.P., Mura, M.P. and E. Benavent. 1998. Dissolved esterase activity
as tracer of phytoplankton lysis: Evidence of high phytoplankton lysis rates in the
NW Mediterranean. Limnology and Oceanography 43: 1836-1849.

Agustí S. and C.M. Duarte. 2002. Addressing uncertainties in the assessment of


phytoplankton lysis rates in the sea. Limnology and Oceanography 47: 921-924

Rotman, B., Papermaster, B.W., 1966. Membrane properties of living mammalian


cells as studied by enzymatic hydrolysis of fluorogenic esters.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55, 134-141.

van Boekel, W.H.M., Hansen, F.C., Riegman, R., Back, R.P.M., 1992. Lysis-induced
decline of a phaeocystis spring bloom and coupling with the microbial foodweb.
Mar Ecol Prog Ser 81, 269-276.

383
1. Técnicas analíticas

2. Determinación de la abundancia de nano y picofitoplancton mediante


citometría de flujo

3. Autores del documento y filiación

Lubián Chaichío, L. M.
Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía (CSIC)

4. Finalidad. Campo de aplicación

Análisis y cuantificación de la abundancia de poblaciones de nano y


picofitoplancton mediante el uso de citometría de flujo.

5. Conceptos generales

La citometría de flujo es una técnica diseñada para analizar las señales ópticas
producidas al incidir sobre cada célula uno o más haces de luz láser a una
determinada longitud de onda. La sucesión de células a través de los haces de
luz se consigue mediante un sistema de fluidos en régimen laminar coaxial. Las
señales son fundamentalmente de dos tipos: dispersión de la luz, indicadoras del
tamaño y la estructura celulares, y la emisión de fluorescencia producida por los
propios componentes celulares o de compuestos añadidos para caracterizar
moléculas específicas de la célula.

6. Equipamiento necesario

Se prevé que el BIO Hespérides esté equipado para esta campaña al menos de
un citómetro de flujo FACScalibur (Beckton-Dickinson) provisto de un láser de
argón de 488 nm y un diodo rojo de 633 nm de longitudes de onda de excitación.

7. Reactivos u otro material fungible

Agua MilliQ
Fijadores Paraformaldehido y/o Glutaraldehido

Preparación de 1 L de P+G (paraformaldehido + glutaraldehido):

- Pesar 100 g de paraformaldehido (Sigma P6148).

- Añadirlo a 880 ml de agua MilliQ en un vaso de precipitados, cubierto con


Parafilm (para reducir la evaporación del agua) que contenga una mosca
magnética. El agua debe estar muy caliente, casi en ebullición.

- Dejarlo agitándose en una placa calefactora (90º C) durante un mínimo de 24 h


en una campana de gases.Después de que se disuelva completamente (puede

384
durar 3 días), añadir 100 ml de PBS (solución tampón de fosfato). El PBS se prepara
con 1 pastilla de Sigma P4417 disuelta en 200 ml de agua MilliQ. Añadir 20 ml de
glutaraldehido al 25%. Filtrar a través de un filtro de policarbonato de 0.2 µm.
¡OJO!: El aparato de filtración utilizado no podrá usarse ya para otra cosa.

- Distribuir en tubos de plástico (preferiblemente entre 5 y 20 ml). Congelar los


tubos a –70ºC. Guardar los tubos a –20ºC. Una vez descongelados, los tubos
deben conservarse a 4ºC y usarse en el plazo máximo de una semana.
De este cóctel se añade a la muestra en una proporción de 1:10

8. Calibración

Existen en el mercado numerosas esferas de calibración, tanto de tamaño de la


partícula como de señales de fluorescencia para las diferentes longitudes de
onda de excitación. Para la calibración de las señales de SSC y FSC (ver más
adelante) se suelen utilizar cultivos puros de microalgas de diferente tamaño
conocido. Los calibradores para las señales de fluorescencia, solo sirven para
comprobar el nivel y la adecuación de las fuentes de excitación y señales de
emisión (fotomultiplicadores) del aparato. Hay que tener en cuenta que la
citometría de flujo sólo da medidas relativas de dispersión de luz y fluorescencia,
en función de los settings utilizados.

9. Descripción de la Técnica

Un ejemplo de las profundidades a las que se pueden tomar las muestras puede
ser (m): 5 – 10 – 25 – 50 – 75 – 100 – 130 – 160 – 200 y DCM.

El volumen de muestra necesario para el análisis citométrico es de 1 a 3 mL,


aunque por comodidad y sobre todo si la muestra se filtra, se fija, o se añade
algún fluorocromo se suele utilizar más volumen. En el caso de que haya mucho
microfitoplancton u otro material particulado que pueda obturar la entrada de
muestra en el aparato, se debe filtrar por malla de 20 µm de poro.

Si el análisis de las muestras va a ser inmediato, conviene no fijarlas. No obstante,


el tiempo de adquisición en cada análisis suele ser de varios minutos por lo que el
tiempo transcurrido desde el análisis de la primera profundidad hasta la última
puede ser de más de una hora, con el consiguiente deterioro de las poblaciones
más delicadas (flagelados). Lo más conveniente sería fijarlas con un buen fijador,
como el que se utilizaría si fuéramos a conservar las muestras congeladas hasta su
análisis posterior. Este fijador es 1% de paraformaldehido + 0,05% de
glutaraldehído (modo de preparación descrito anteriormente).

Las señales ópticas que se miden en el citómetro son:


· FSC (dispersión frontal de la luz) que da información sobre el tamaño celular
· SSC (dispersión lateral de la luz) que da información sobre el tamaño y la
estructura celulares
· FL1 (fluorescencia en el intervalo de 530±15 nm de longitudes de onda). Esta

385
señal se utiliza para analizar señales fluorescentes procedentes de fluorocromos
añadidos para marcar las células, ya que éstas no poseen compuestos
fluorescentes a estas longitudes de onda.
· FL2 (fluorescencia en el intervalo de 585±20 nm de longitudes de onda), que en
células del fitoplancton va a corresponder a la fluorescencia debida a la
ficoeritrina.
· FL3 (fluorescencia a ≥ 635 nm de longitud de onda), que en corresponde a la
fluorescencia debida a la clorofila
· FL4 (fluorescencia en el intervalo de 669±16 nm de longitudes de onda), que
corresponde a la fluorescencia debida a la ficocianina, si bien hay que tener en
cuenta que interfiere la fluorescencia de la clorofila.

La señal de FSC se mide con un fotodiodo y el resto con fotomultiplicadores, por


lo que las intensidades de las señales pueden ser modificadas a voluntad por el
citometrista. Las señales analógicas son finalmente transformadas en digitales y
procesadas con un programa informático adecuado, que en el caso del
citómetro FACScalibur es el programa “Cell Quest” (ver cuadro sinóptico). El flujo
a utilizar es el indicado como “high” y que corresponde nominalmente a 1 µL s-1.
No obstante, conviene al comienzo de la campaña hacer una calibración,
midiendo la pérdida de volumen de un blanco (agua MILLI-Q) durante un tiempo
determinado (por ejemplo: 5 minutos).

Los “settings” a utilizar suelen ser de dos tipos ya que es difícil abarcar todos los
tamaños, uno para caracterizar las poblaciones del nanofitoplancton y otro para
las del picofitoplancton y que se podrían denominar como “nanosetting” y
“picosetting”, respectivamente. Como en esta campaña se van a usar dos
citómetros del mismo modelo, uno adquirido recientemente y el otro adquirido
hace años, hay notables diferencias en las intensidades de las señales, por lo que
hay que utilizar settings distintos, al menos para en nanofitoplancton.

Dos configuraciones estándar de los settings pueden ser:

nanosetting picosetting
Citómetro Citómetro
antiguo nuevo
FSC E01 E01 E00
SSC 300 225 550
FL1 660 660 752
FL2 580 450 705
FL3 400 270 625
FL4 550 300 705
Threshold 52 52 100

386
El tiempo de adquisición puede variar dependiendo de la concentración de
células entre 5 y 10 minutos. En aguas oceánicas oligotróficas se utilizaría un
tiempo de 10 minutos. El número de células analizadas estará comprendido entre
1000 y 20000.

10. Cuadro sinóptico de la técnica

1.- Comprobar los niveles del líquido envolvente y


el de residuos (rellenar y vaciar, respectivamente,
si es necesario).

2.- Presurizar el sistema de fluidos pulsando vent


valve y poner en marcha el citómetro. Pulsar
prime para purgar el sistema y comprobar que el
circuito no tiene burbujas de aire.

3.- Encender el ordenador.

4.- Colocar un tubo con agua en el aspirador de la


muestra, poner el flujo en la posición high y dejar
Manejo del software “Cell Quest Pro”
correr durante unos minutos.
1.- Se abre el programa y en la ventana que
aparece en blanco se ponen todas las
representaciones que queramos hacer
durante el análisis (histogramas de
frecuencias respecto a una señal, nubes de
puntos enfrentando dos señales, etc).

2.- Un vez que lo tenemos podremos


guardarlo como plantilla para futuros
análisis (picando en la barra de
herramientas “File” y luego “Open
Document”).

3.-Conectamos el programa al citómetro


picando en la barra “Acquire” y luego en
“Connect to cytometer”. Se abre un
cuadro “Acquisition / Analysis”.

387
4.- Conviene abrir dos ventanas más “Acquire – Counters” para saber en cada momento el régimen
de recuento de partículas, y “Cytometer” – “Status” para saber el estado del láser principal y los
contenedores de fluidos.

5.- Para seleccionar los settings y umbral a utilizar ir a “Cytometer – Detector/Amps” y


“Threshold”, respectivamente y elegir los valores de voltaje. En el caso de los detectores elegir
siempre escala logarítmica y si el citómetro posee un segundo láser (diodo) seleccionar “Four
color” y en FL4 su correspondiente voltaje. En el caso del umbral escoger la señal y el valor (para
el análisis de fitoplancton elegir siempre la señal de FL3).
388
6.- Una vez elegidos los settings y el
nivel de umbral, aparecerán en una
ventana que podremos abrir picando
“Cytometer – Instruments Settings”
desde que podremos archivar (save)
para utilizarla directamente sin pasar
por los pasos anteriores. Para ello,
desde esta ventana se pulsa “Open”,
se busca el archivo en la carpeta
donde la hemos guardado y lo
abrimos. Una vez abierto, aparecerá
los valores en el cuadro
“Instruments Settings” y a
continuación pulsar “Set”, esperar
a que se cargue y luego “Done”.
Este último paso es MUY
IMPORTANTE, porque si no no se
cargan los settings seleccionados.

389
7.- Antes de analizar la muestra se
debe pulsar el la barra “Acquire –
Acquisiton & Storage” y se abrirá una
ventana en el que tendremos la opción
de escoger entre analizar la muestra
por tiempo de adquisición o por
número de eventos. Lo normal en el
análisis del fitoplancton es escoger la
primera opción. Para ello, señalamos
en “Collection Criteria” la opción
“Event Count or Time” por lo que
estaremos obligados a poner un
número de eventos en la casilla
correspondiente muy alto para
asegurarnos de que el tiempo
transcurrido en el análisis no se vea
interrumpido por la barrera del número
de eventos. El tiempo de adquisición
depende de la riqueza del fitoplancton,
como se ha señalado anteriormente
(entre 5 y 10 minutos).

8.- Finalmente, en la ventana abierta


inicialmente de “Acquisition /
Analysis” se escoge la carpeta
(“Directory”) y el nombre del fichero
(“File”) donde guardar los datos.
Mientras está señalado “Setup” no
se guardará nada en fichero
aunque si podremos ver en
pantalla las señales obtenidas
durante el análisis. Para guardar
datos tiene que desactivar el
“Setup”.
Cuando ha finalizado el análisis, conviene hacer un protocolo de lavado con
agua MILLI-Q durante al menos 10 minutos, luego despresurizar el sistema, cerrar el
programa y apagar el ordenador y el citómetro.

390
11. Cálculo de los resultados.

Una vez obtenidos los citogramas, debemos identificar las distintas poblaciones y
marcarlas (opciones en la barra de tareas de la izquierda). Los distintos parámetros
estadísticos se obtienen en la opción “Stats” y se pueden exportar (picar en “File –
Export Statistics”) y pasarlo a un archivo excel.
Sabiendo el número de eventos registrados para cada población, el tiempo de
adquisición de muestra y el flujo utilizado, se calcula la densidad de células
existentes en cada caso.

12. Control de calidad

El nivel de precisión y fiabilidad de los resultados va a depender en gran


medida de la experiencia del citometrista. Algunas poblaciones del nano y
picofitoplacton como criptofíceas y cianobacterias se pueden distinguir
claramente por la presencia de determinados pigmentos como ficoeritrina y
ficocianina, y por su tamaño. En otros casos pueden aparecer poblaciones del
nanofitoplancton que se solapan entre sí y es más difícil discriminarlas. Es
conveniente analizar en el mismo citómetro varias especies conocidas del

391
nano y picofitoplancton procedentes de cultivos y nos pueden servir de
patrones, en particular del tamaño de las poblaciones analizadas procedentes
de muestras naturales. Las especies de referencia pueden ser las siguientes:
Synechococcus sp., Nannochlororis oculata, Nannochloropsis gaditana,
Isochrysis galbana, Chaetoceros gracilis, Rhodomonas salina, Tetraselmis
suecica y Gyrodinium sp.

13. Referencias

Collier, JL Flow cytometry and the single cell in phycology Journal of Phycology, 36 (4):
628-644. 2000.

Marie, D., Simon, N. and Vaulot, D. Phytoplankton cell counting by flow cytometry. In Algal
culturing techniques, vol. 27 (ed. R. Andersen), pp. 253-267: Academic Press. 2005.

Rodríguez, J., Blanco, J.M., Jiménez-Gómez, F., Echevarría, F., Gil, J., Rodríguez, V., Ruiz, J.,
Bautista, B., Guerrero, F. Patterns in the size structure of the phytoplankton
community in the deep fluorescence maximum of the Alboran Sea (southwestern
Mediterranean). Deep-Sea Research I 45, 1577–1593. 1998.

392
BLOQUE 6

BIODIVERSIDAD MICROBIANA Y FUNCIÓN ECOLÓGICA

MÉTODOS, TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS

393
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

“Estudio de las bacterias aeróbicas anoxigénicas fototróficas (AAPs)”

2. Titulo de la técnica

“Determinación de la abundancia y contenido de pigmento de las


bacterias aeróbicas anoxigénicas fototróficas”

3. Autores del documento y filiación

Isabel Ferrera iferrera@icm.csic.es

4. Finalidad. Campo de aplicación

Se trata de determinar la abundancia de AAPs mediante microscopia


de infrarojo y de medir la concentración de pigmento (Bacterioclorofila
a) en el agua de mar.

Ambos protocolos incluyen dos partes, la recogida de muestras que se


realizará en el barco, y el análisis que en ambos casos tiene que
efectuarse una vez las muestras estén en el laboratorio.

5. Conceptos generales
Las bacterias aeróbicas anoxigénicas fototróficas (AAPs)
constituyen un grupo de microorganismos mixotróficos que contienen
bacterioclorofila a (Bchla). Aunque no son capaces de fijar CO2, estos
organismos pueden utilizar la luz para generar ATP lo que les aporta una
ventaja ecológica frente a otros heterótrofos cuando la disponibilidad
de C orgánico es limitada. Sin embargo, su relevancia en el océano no
está del todo clara. Durante la expedición Malaspina se recogerán
muestras para estudiar la abundancia de estos microorganismos
mediante microscopia de infrarojo (AAP-DAPIs) y para medir la
concentración de Bchla mediante HPLC (High-performance liquid
chromatography).
 
6. AAP-DAPIs:

6.1. Equipamiento necesario:

394
• Pipetas
• Sistema de filtración (torre de filtración y bomba de vacío)
• Microscopio de epifluorescencia con cámara y filtros sensibles al
infrarojo

6.2. Reactivos u otro material fungible

• Pinzas
• Tubos Falcon de 15 mL
• Solución de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)
• Aceite de inmersión
• Formaldehído (37%)
• Filtros de policarbonato blancos de 0.2 µm de tamaño de poro
• Filtros de acetato de celulosa de 0.8 µm de tamaño de poro
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Puntas de pipeta estériles
• Cajas para guardar portaobjetos
 
6.3. Descripción de la Técnica

- Se toman 14.5 ml de muestra y se fija con 0.75 ml de formaldehído 37%


(concentración final 2%) en un tubo Falcon de 15ml. Se guarda la
muestra a 4ºC entre 1 y 48h.
- Se pone un filtro de acetato de celulosa de 0.8 µm de tamaño de poro
en la torre de filtración que servirá de soporte del filtro de policarbonato.
- Encima del filtro de acetato de celulosa, se pone un filtro de
policarbonato blanco de 0.2 µm de tamaño de poro.
-Se agita suavemente la muestra y se añade la muestra a la torre de
filtración. Se añaden 50 µl de una solución de DAPI (0.5mg/ml). Se deja 5
minutos y se acaba de filtrar la muestra. Se harán dos replicas para
cada muestra, en una se filtrarán 5ml y en la otra 10 ml.
- Terminada la filtración de pone el filtro sobre un portaobjetos, se añade
una gota de aceite de inmersión y se cubre con un cubreobjetos.
- Las muestras se guardan congeladas hasta su posterior análisis en el
laboratorio en tierra.
- Una vez en el laboratorio, se dejan descongelar las muestras.
- Las muestras se observarán en un microscopio de epifluorescencia
(Olympus BX51TF) equipado con una objetivo que permita el paso del
infrarojo (Olympus Universal Planapochromat 100×/1.35 OIL IR). El sistema
de iluminación necesario consiste en una lampara de mercurio. El

395
microscopio tiene que estar adaptado con 3 sets de filtros: (1) DAPI, (2)
Clorofila, y (3) Infrarojo.
-Se tomarán 3 imágenes de fluorescencia con una cámara que permita
el paso del infrarojo (B/W CCD camera F-ViewII).
-Primero, se tomará una imagen en la parte azul del espectro de luz con
una exposición de 100–200 ms, para calcular el número total de
bacterias (DAPI).
-Segundo, se tomará una imagen en la parte roja, con 0.5-1 segundo
de exposición para calcular las células que emiten autoflorescencia
debido a la clorofila (Chla).
-Por último, se capturará una imagen en el infrarojo (10 s exposición)
para calcular tanto la presencia de bacterioclorofila (Bchla) como
clorofila.
-Mediante un programa de análisis de imagen (Cell F, Olympus) se
sobreponen las tres imágenes para componer una sola. Ésta nos permite
distinguir las células que tienen Bchla de las que tienen Chla, y obtener
recuentos del número total de bacterias, picocianobacterias (Chla) y
AAPs (células que emiten en el IR pero no en canal de la Chla).
-Se contarán entre 500-1000 células en un mínimo de 10 imágenes
distintas, y teniendo en cuenta el volumen de muestra filtrado y el área
de filtro contada se calcula la concentración bacterias totales,
picocianobacterias y de AAPs en la muestra original.

7. Bchla:

7.1. Equipamiento necesario:

• Probeta
• Botella Nalgene de 2L
• Sistema de filtración (torre de filtración y bomba de vacío)
• Sistema de cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC)

7.2. Reactivos u otro material fungible:

396
• Pinzas
• Filtros de fibra de vidrio de 47 mm de diámetro (GF/F)
• Papel aluminio
• Metanol
• Acetato de tetrabutilamonio
• Papel secante
• Tubos de 5 ml

7.3. Descripción de la Técnica:

- Se toma un volumen de muestra de 2L de muestra en una botella


Nalgene y se protege de la luz directa.
- En una torre de filtración conectada a una bomba de vacío, se
colocan dos filtros GF/F en sándwich, es decir, uno encima de otro.
-Se filtran los 2L de muestra, se seca el filtro con papel secante y se
congela en nitrógeno líquido envueltos en papel de aluminio. Los filtros
se guardan en el congelador a -80ºC hasta su llegada al laboratorio.
-Una vez en el laboratorio, los filtros se extraen en tubos de 5 ml con 3 ml
de metanol durante un mínimo de 1 hora.
-El extracto de metanol se inyecta a un sistema de cromatografía
líquida de acuerdo con el método descrito por Van Heukelem and
Thomas (2001).
-La separación de la muestra se consigue a los 28 min de elución en
gradiente de una mezcla de acetato de tetrabutilamonio:metanol
(30:70) y metanol al 100%.
- La BChl a se detecta at 770 nm usando un detector con un límite de
detección de 0.1 ng/l.

8. Referencias:

Koblízek M, Mazín M, Ras J, Poulton AJ, Prásil O (2007) Rapid growth rates
of aerobic anoxygenic prototrophs in the ocean. Environ Microbiol
9:2401-2406.

Masin M, Zdun A, Ston-Egiert J, Nausch M, Labrenz M, Moulisova V,


Koblizek M (2006) Seasonal changes and diversity of aerobic anoxygenic
phototrophs in the Baltic Sea. Aquat Microb Ecol 45:247-254.

Van Heukelem L & Thomas CS (2001) Computer-assisted high-


performance liquid chromatography method development with

397
applications to the isolation and analysis of phytoplankton pigments. J
Chromatogr A 910:31–49.

Yurkov V, Csotonyi JT (2008). New Light on Aerobic Anoxygenic


Phototrophs. In Advances in Photosynthesis and Respiration. Springer.
Vol. 28, 1, 31-55

398
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Titulo de la técnica
Concentración de biomasa de picoeucariotas, bacterias y virus marinos
para la extracción de ácidos nucléicos

3. Autores del documento y filiación


Jesús M. Arrieta, IMEDEA, CSIC-UIB; email: txetxu@imedea.uib-csic.es
Silvia G. Acinas, ICM, CSIC; email: sacinas@icm.csic.es
Ramón Massana, ICM, CSIC; email: ramonm@cmima.csic.es
Dolors Vaqué, ICM, CSIC; email: dolors@icm.csic.es

4. Finalidad. Campo de aplicación

La finalidad de este proceso es la obtención de biomasa microbiana


para la extracción de ácidos nucléicos (ADN y ARN) que serán utilizados
posteriormente para diferentes análisis moleculares y genómicos.

5. Conceptos generales
Los microorganismos median procesos críticos para el funcionamiento
de los ecosistemas marinos y comprenden la mayor parte de la biomasa
presente en los océanos. También sabemos que las bacterias marinas (y
en general los microorganismos marinos) encierran una enorme
diversidad, pero su pequeño tamaño, resulta imposible distinguirlos por
su morfología. Es por esto que desde los inicios de la microbiología, se
han usado otros criterios para su identificación como la capacidad de
metabolizar determinados compuestos. Estas técnicas clásicas de
identificación requieren el establecimiento de cultivos puros, y dado
que la mayor parte de las bacterias marinas no pueden cultivarse aún,
no son adecuadas para determinar la diversidad de una muestra
natural. Actualmente los métodos preferidos para determinar la
diversidad de las comunidades procarioticas marinas se basan en la
determinación de diferencias en la secuencia de uno o más genes,
normalmente el gen del ARN ribosómico 16S.
De forma similar, la estructura de las comunidades de picoeucariotas o
virus se basa en análisis moleculares adaptados para estos grupos.
Por otro lado el análisis del ARN presente en una muestra de agua
natural puede dar importantes indicaciones sobre la actividad de los
microorganismos presentes. Dada su corta vida, el ARN mensajero
refleja la expresión genética en tiempo real, de esta manera se puede
identificar la actividad determinados genes asociados a procesos de
interés biogeoquímico y en algunos casos la identidad de los
microorganismos implicados. El ARN ribosómico también puede utilizarse
como indicador de los tipos de procariotas potencialmente más activos
a nivel metabólico. Además del análisis de un gen o genes en
Malaspina abordaremos una estrategia también genómica mediante la

399
realización del metagenoma (secuenciación parcial de los genes
inherentes en una comunidad microbiana) y del metatranscriptoma
para ver la diversidad funcional de dicha comunidad.

6. Equipamiento necesario

Se usarán dos sistemas diferentes de filtración:

Sistema de filtración para pequeños volúmenes


El sistema de filtración puede procesar cuatro muestras en paralelo.
Cada línea de filtración está equipada con dos filtros , el primero (más
cercano a la bomba) de policarbonato de 3µm de tamaño de poro
donde recogeremos los picoeucariotas y el siguiente de policarbonato
de 0.22µm de tamaño de poro donde se recogerán los procariotas.
Obviamente, es muy importante mantener este orden, pero es uno de
los errores más fáciles de cometer. Utilizaremos este sistema para filtrar
un máximo de 20-25 litros de agua de mar. Este sistema se utiliza para
concentrar la biomasa microbiana y su posterior extraccion de DNA
para posteriores análisis dependientes de PCR (genotecas ambientales,
ARISA, tRFLPs, etc..).

Figura 1. Sistema de filtración para pequeños volúmenes

Sistema de filtración de grandes volúmenes

Usaremos este sistema para recolectar grandes volúmenes de muestra


(hasta 100 L) para metagenómica (metaG) y también para el muestreo

400
rápido de ARN para realizar screeening funcional y metatranscriptómica
(metaT). También utilizaremos este sistema para la recolección de virus
precipitados con FeCl3.
Este sistema consta de una bomba peristáltica y dos soportes de
filtración de 142mm de diámetro.

Figura 2. Sistema de filtración de grandes volúmenes.

7. Reactivos u otro material fungible.

Material de plástico:
• Garrafas 12 X 20L . Para la toma de muestras de ADN para
metagenómica.
• Garrafas 4X10L y 4X 20L: Para las muestras de ADN/ARN de
pequeño volumen y concentrado de virus (20L).
• Puntas de pipeta, tubos de centrífuga de 2, 15 y 50 ml.

Filtros:
Picoeucariotas y procariotas:
1)Para el sistema de filtración de pequeño volumen (4 cabezales):
• filtros de policarbonato de 47mm de diámetro y 3µm de tamaño
de poro
• filtros de policarbonato de 47mm de diámetro y 0,22µm de poro
2) Para el sistema de filtración de gran volumen:
• Filtros de policarbonato de 142mm de diámetro y 3 µm de poro
• Filtros de Millipore Express de 142mm de diámetro y 0,22 µm de
poro
• Filtros de policarbonato de 142mm de diámetro y 0.8 µm de poro
• Filtros de policarbonato de 142mm de diámetro y 0.22 µm de poro
Concentración de Virus:
• Filtros de policarbonato de 142mm de diámetro y 1µm de poro
• Filtros de soporte Pall Supor-800 filter (cat.no.60114; 142mm, 0.8µm).

401
Reactivos:
• RNALater™ : Solución comercial (Ambion)
• Solución de FeCl3 para la precipitación de virus.
(Protocolo todavía no publicado cortesía de Matt Sullivan, Arizona
University (US) colaboración con ICM)
Solución stock 10g Fe/L
FeCl3-6H2O (FW=270.3) 4.83g
Q-water 100ml
Preparar en tierra y almacenar a 4oC o temperatura ambiente.
8. Calibración

Es importante tener un volumen suficiente de muestra que garantice


una cantidad mínima de ADN/ARN. Se necesitarán al menos 12 litros
para fingerprinting y técnicas basadas en PCR. Para metagenómica
serán necesarios un mínimo de 100 L.

9. Descripción de la Técnica

El proceso a bordo consiste fundamentalmente en recolectar biomasa


por filtración, los protocolos difieren según la cantidad de muestra
disponible y el uso final que se vaya a dar a la biomasa recolectada.
Todo el material en contacto con la muestra (garrafas, tubos del sistema
de filtración, portafiltros etc) se desinfectará entre diferentes muestras
utilizando una solución de lejía (10% de la solución comercial)
aclarando posteriormente con un pequeño volumen de muestra.

Filtración para RNA screening funcional (12L) y metatranscriptómica


(metaT)

Es esencial trabajar muy rápido para evitar cambios en los patrones de


transcripción. Estas muestras serán procesadas SIEMPRE en primer lugar y
se mantendrán en una nevera con hielo en todo momento. Idealmente
no deberían transcurrir más de 10-15 minutos entre la toma de la
muestra y el final del proceso de filtración.

Procedimiento
-Tomar las muestras de la roseta, utilizando una malla de 200µm a la
salida de la botella.
-Ajustar una malla de 20µm en el tubo de toma de muestra del sistema
de filtración de grandes volúmenes. Colocar un filtro de policarbonato
de 142 mm de diámetro y 3µm de tamaño de poro en el portafiltos
(OVNI) más cercano a la bomba peristáltica y otro filtro (Millipore Express
plus) de 142 mm de diámetro y 0.22 µm de tamaño de poro en el
siguiente portafiltros.
-Comenzar la filtración purgando el aire del sistema mediante los
tornillos de purga de ambos portafiltros.

402
-Filtra la muestra tan rápido como sea posible, pero manteniedo la
presión por debajo de los 13-15 psi, tiempo máximo de filtración 15 min.
-Recoge el volumen filtrado en una garrafa limpia para la
concentración de biomasa vírica (comprobar necesidades con la
persona a cargo de los virus).

Volumen de filtración: Filtrar 12 litros de muestra o 15 minutos máximo, lo


primero que ocurra. Comprobar y anotar el volumen filtrado.
-Guardar los filtros por separado en tubos de 10 o 15 mL (filtros de
policarbonato) o de 50 mL (Express Filters) convenientemente
identificados, congelar por inmersión en nitrógeno líquido y almacenar a
-80ºC.

Toma de muestras de ADN de perfiles de la roseta (12L)

Aquí el objetivo es recuperar una cantidad suficiente de biomasa para


ser utilizada en técnicas que dependen de la amplificación por PCR,
por ello tomaremos un volumen relativamente pequeño de agua e
intentaremos procesar un número mayor de muestras, para ello
utilizaremos el sistema de filtración de pequeños volúmenes que nos
permite procesar cuatro muestras en paralelo.

Procedimiento:
-Tomar las muestras de la roseta y mantenter en hielo o en nevera hasta
el momento de la filtración. La prioridad son las muestras de ARN, pero
la filtración de estas muestras no debería demorarse más de uin par de
horas.
-Prepara el sistema de bombeo con una malla de 20µm en la entrada el
tubo, un filtro de policarbonato de 3µm de poro en el portafiltros más
cercano a la bomba peristáltica y otro de 2µm de poro en el siguiente
portafiltros.
-Comenzar la filtración purgando el aire del sistema mediante los
tornillos de purga de ambos portafiltros.
- Mantener la tasa de filtración a unos 50-100 ml min-1 (puede llevar una
hora)

Volumen de filtración: Cuando ta tasa de filtración se ralentice, cambiar


el filtro de 3µm, si no mejora, anotar el volumen filtrado y parar la
filtración. Si has usado más de un filtro de 3µm, guárdalos juntos en el
mismo criovial.
-Guardar los filtros por separado (0.22µn y 3µm) en crioviales de 2 mL
convenientemente identificados, congelar por inmersión en nitrógeno
líquido y almacenar a -80ºC.

403
Filtración de ADN para metagenómica (120-240L)

El principal objetivo aquí es recuperar la mayor cantidad de biomasa de


procariotas y picoeucariotas que podamos. Dado que las abundancias
en las capas profundas del océano son muy bajas, necesitaremos al
menos 100 L de muestra para obtener una cantidad suficiente de ADN.

Procedimiento
-Tomar las muestras de la roseta, utilizando una malla de 200µm a la
salida de la botella, se tomarán >=100L de muestra siempre que sea
posible. Como no es posible comenzar la filtración inmediatamente ya
que primero hay que filtrar las muestas de ARN para
metatranscriptómica, se intentará mantener las muestras en hielo o
nevera.
-Ajustar una malla de 20µm en el tubo de toma de muestra del sistema
de filtración de grandes volúmenes. Colocar un filtro de policarbonato
de 142 mm de diámetro y 0.8 µm de tamaño de poro en el portafiltos
(OVNI) más cercano a la bomba peristáltica y otro filtro (Millipore Express
plus) de 142 mm de diámetro y 0.22 µm de tamaño de poro en el
siguiente portafiltros. Tener en cuenta que los 0.22 µm de Millipore
Express Filter y los de policarbonato de 0.22 µm SON DISTINTOS y se usan
para análisis distintos.
-Comenzar la filtración purgando el aire del sistema mediante los
tornillos de purga de ambos portafiltros.
-Filtra la muestra tan rápido como sea posible, pero manteniedo la
presión por debajo de los 13-15 psi. Si la tasa de filtración disminuye,
cambia de filtros (máximo dos filtros de cada tamaño de poro por
muestra). Los filtros del mismo tamaño de poro se almacenan juntos en
el mismo tubo de 15 mL. Para los filtros Express Filter guardarlos en un
tubo de 50 mL.
-Recoge el volumen filtrado en varias garrafas limpias para la
concentración de biomasa vírica.

Volumen de filtración: En algunas estaciones habrá ~248 L disponibles, lo


cual será suficiente para hacer dos réplicas. Comprobar y anotar el
volumen filtrado.
- Guardar los filtros por separado en tubos de 10 -15 mL (filtros de
policarbonato) o de 50 mL (Express Filters) convenientemente
identificados. Congelar por inmersión en nitrógeno líquido y
almacenarlos a -80ºC (no hace falta usar RNA later). Los criotubos de 10
mL que contienen los filtros de 0.8µm se congelan por inmersión en
nitrógeno líquido y se almacenan a -80ºC.

IMPORTANTE: El filtrado se utilizará posteriormente para la concentración


de virus, por tanto se almacenará en garrafas limpias de 20L (4 X20L).

404
Concentración de virus para metagenómica

Esta técnica toma como punto de partida el agua filtrada de las


muestras de metagenómica de prokaryotas. Este agua, que ya ha sido
filtrada por 0.22µm, contiene la mayor parte de los virus. Para acelerar el
proceso de filtración, precipitaremos primero los virus utilizando una
solución de FeCl3 y recuperaremos el precipitado por filtración utilizando
el sistema de filtración de grandes volúmenes.

Procedimiento:
-Tomar 80 L (cuatro garrafas de 20L) de agua filtrada por 0.22µm
procedentes de la filtración para metagenómica.
-Añadir 2 mL de la solución de FeCl3 y agitar vigorosamente.
-Dejar reposar durante al menos una hora a temperatura ambiente (o
toda la noche a 4ºC).
-Filtrar utilizando el sistema de filtración de grandes volúmenes. En este
caso se utilizará sólo un porta filtros equipado con dos filtros, primero
pondremos un filtro de soporte (Pall Suppor 142mm diámetro, 0.8µm
tamaño de poro) y directamente encima de este un filtro de 142mm de
policarbonato y 1µm de tamaño de poro.
-El precipitado se acumulará sobre el filtro de policarbonato. Cuando
baje la velocidad, se cambiará sólo el filtro de policarbonato (no es
necesario cambiar el filtro de soporte) y se almacenará en un tubo de
centrífuga de 50mL teniendo especial cuidado de no perder nada del
precipitado. Serán necesarios unos tres filtros por cada 20L, que se
pueden almacenar juntos en el mismo tubo, en total cuatro tubos
conteniendo 3 filtros cada uno. Los tubos conteniendo los filtros con el
precipitado se almacenarán a 4ºC.
-Es muy importante limpiar bien (con agua) todos los restos de
precipitado al acabar la filtración, ya que si no se hace quedarán
manchas muy difíciles de limpiar al día siguiente.

Volumen de filtración: 80L de agua prefiltrada por 0.22µm.

10. Cuadro sinóptico de la técnica

405
Figura 3 Cuadro sinóptico filtración ADN pequeños volúmenes

406
Figura 4. Cuadro sinóptico filtración ARN para metatranscriptómica

407
(Malla 200µm) Bomba peristáltica Filtrar a 11-13 psi máximo
Malla 20µm
Filtro 142 mm ø Filtro 142 mm ø
0.8 µm poro 0.22µm poro

Muestra
~100 L

! !
Filtrado
Guardar filtros en tubos 50mL

El agua filtrada será utilizada


para extraer biomasa vírica.
¡NO TIRAR!

Añadir 10 mL RNALater
Congelar en N2 líquido

-20ºC
-80ºC
Almacenar a -20ºC Almacenar a -80ºC

USA GUANTES EN TODO MOMENTO!!!

Figura 5. Cuadro sinóptico filtración ADN para metagenómica (UTILIZAR EXPRESS PLUS
FILTER DE 0.22 um)

408
Figura 6. Cuadro sinóptico concentración de virus para metagenómica

409
11. Calculo de los resultados.
Expresiones matemáticas, cambio de unidades, macros en Excel.
No hace falta

12. Control de calidad


Indicar precisión y fiabilidad de los resultados. Posibles errores que
pueden cometerse. Pruebas de control de calidad de los datos.
No hace falta

13. Referencias

Massana R, Murray AE, Preston CM, DeLong EF (1997) Vertical distribution


and phylogenetic characterization of marine planktonic Archaea in the
Santa Barbara Channel.Appl Environ Microbiol 63:50–56

Silvia G. Acinas, Francisco Rodríguez-Valera, Carlos Pedrós-Alió. 1997.


Spatial and temporal variation in marine bacterioplankton diversity as
shown by RFLP fingerprinting of PCR amplified 16S rDNA. FEMS
Microbiology Ecology 24: 27-40.

Silvia G. Acinas, Josefa Antón and Francisco Rodríguez-Valera.1999.


Diversity of Free-living and Attached Bacteria in Offshore Western
Mediterranean Waters as depicted by Analysis of Genes Encoding 16S
rRNA. Applied and Environmental Microbiology. 65: 514-522.

Moeseneder MM, Arrieta JM, Muyzer G, Winter C, Herndl GJ (1999)


Optimization of terminal-restriction fragment length polymorphism
analysis for complex marine bacterioplankton communities and
comparison with denaturing gradient gel electrophoresis. Appl. Environ.
Microbiol. 65:3518-3525.

410
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Técnicas analíticas

2. Titulo de la técnica
Determinación de la diversidad funcional del bacterioplancton marino

3. Autores del documento y filiación


Maria Montserrat Sala
Institut de Ciències del Mar (CSIC). Passeig Marítim de la Barceloneta 37-
49, 08003 Barcelona.

4. Finalidad. Campo de aplicación


Estimar la diversidad funcional del bacterioplancton marino mediante el
test de la utilización de un total de más de 100 fuentes de carbono
diferente en placas Biolog.

5. Conceptos generales
Las bacterias heterotróficas juegan un papel fundamental en los
procesos biogeoquímicos de los ecosistemas acuáticos, ya que son los
consumidores principales de la materia orgánica disuelta (DOM). La
disponibilidad de esta DOM y su composición influyen enormemente en
la actividad del bacterioplancton y en la diversidad filogenética (Eiler et
al 2003), y pueden influir también sobre la diversidad funcional de la
comunidad microbiana.
El ensayo de la utilización de fuentes de carbono de la materia
orgánica se ha hecho generalmente mediante cultivos de
enriquecimiento en los que se ofrece un nutriente y se monitoriza los
cambios en la producción y/o en la concentración bacteriana durante
la incubación. Sin embargo, estos experimentos son laboriosos y
permiten el ensayo de un número limitado de substatos. Las placas
Biolog representan una miniaturización de éstos enriquecimientos y, de
manera muy simple permiten el ensayo de la utilización de casi un
centenar de substratos simultáneamente. Aunque las placas Biolog
fueron inicialmente creadas para la identificación de microorganismos
de interés médico, Garland and Mills (1991) propusieron el uso de las
placas Biolog para determinar la diversidad funcional de
microorganismos en muestras ambientales, basándose en los perfiles de
utilización de fuentes de carbono. Desde su aplicación en muestras
naturales, las placas Biologs han sido una herramienta muy útil para
detectar diferencias en la utililzación de fuentes de carbono por las
comunidades microbianas. Aunque su principal aplicación ha sido en
ecosistemas terrestres (ver revisión en Preston-Mafham et al. 2002), su
espectro de aplicación en ecosistemas acuáticos abarca ambientes
tan distintos como lagos (Grover & Chrzanowski 2000), ríos (Sinsabaugh
and Foreman 2001)y distintos ecosistemas marinos como el Mar

411
Mediterráneo (Sala et al. 2005a, 2006), el océano Antártico (Sala et al.
2005) o el océano Ártico (Sala et al. 2008, 2011)
Las placas generalmente más utilizadas han sido, junto a las Biolog-Eco,
las placas Biolog-GN2 que permiten el ensayo simultáneo de 96 fuentes
de carbono. Estas placas están principalmente indicadas para el
ensayo del uso de monómeros. Por ello, durante la campanya
Malaspina prentendemos ampliar el abanico de fuentes testadas
mediante el uso de placas MT para crear las placas Ocean (Fernández-
Gómez et al. Submitted). Las placas MT no incluyen ningún tipo de
substrato y éstos se añaden en función de las necesidades particulares.
En ocasión de la campaña Malaspina, las placas Ocean permitirán el
ensayo de 8 fuentes de carbono adicionales que han sido elegidas por
su especial relevancia en los ecosistemas marinos y/o profundos:
bicarbonato, DMSP, D-asparagina, un pentapéptido de alanina,
almidón, celulosa, quitina, ATP.
Tanto en las placas GN2 como en las placas Ocean, a medida que las
bacterias de la muestra crecen en cada uno de los pocillos, éstas van
oxidando cada substrato y se va formando NADH. El producto reducido,
formazán insoluble, aparece en forma de color púrpura que puede
medirse fotométricamente. El patrón resultante es función de la
comunidad original inoculada en los pocillos.

6. Equipamiento necesario
El equipamiento necesario es un lector de placas de absorbancia y un
ordenador con el programa.

7. Reactivos u otro material fungible


1. Placas Biolog GN2 y MT
2 Pipeta multicanal
3. Receptáculos para el pipeteado
4. Reactivos para crear las placas Ocean
5. Puntas de pipeta

8. Calibración
En las placas Biolog, uno de los pocillos no contiene substrato, y sirve
como blanco con el comparar los valores de absorbancia de los
substratos.

9. Descripción de la Técnica
El primer paso consiste en la preparación de las placas Ocean: placas
Biolog-MT a las que añadiremos 30 ul de 8 diferentes substratos
(concentración final 10 mM): bicarbonato, DMSP, D-asparagina, un
pentapéptido de alanina, almidón, celulosa, quitina, ATP.
Las placas son inoculadas mediante la adición de un volumen de
muestra en cada pocillo de 120 ul en las Ocean, y 150 ul en las GN2.
Una vez inoculadas, las placas se incuban en la oscuridad a
temperatura cercana a la in situ y se mide la absorbancia regularmente

412
a 590 nm con el lector de placas. Tras substraer los datos de
absorbancia del blanco, los datos serán utilizados tanto para análisisis
multidimensionales para el estudio de la diversidad como para el
estudio detallado de utilización de cada uno de los substratos.

10. Cuadro sinóptico de la técnica


1. Adición de los substratos en las placas MT
2. Inoculación de las placas con la muestra
3. Incubación de las placas en la oscuridad y a temperatura cercana a
la in situ
4. Observación y lectura de la absorbancia de las placas en el lector.

11. Calculo de los resultados.


Los resultados se calculan sumando la absorbancia de cada uno de los
pocillos, después de haber restado el blanco, y calculando el % de
absorbancia de cada uno de los pocillos respecto al total. Los
porcentajes se usarán para el tratamiento de los datos mediante
técnicas estadísticas de análisis multidimensional.

12. Referencias

Eiler A, Langenheder S, Bertilsson S, Tranvik LJ (2003) Heterotrophic


bacterial growth efficiency and community structure at different natural
organic carbon concentrations. Appl. Environ. Microbiol. 69:3701-3709
Garland JL, Mills AL (1991) Classification and characterization of
heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of
community-level sole-carbon-source utilization. Appl. Environ. Microbiol.
57:2351-2359
Grover JP, Chrzanowski TH (2000) Seasonal patterns of substrate utilization
by bacterioplankton: case studies in four temperate lakes of different
latitudes. Aquat. Microb. Ecol. 23:41-54
Fernández-Gómez B, Sala MM, Pedrós-Alió C (submitted). Seasonal
changes in preferred substrates in the Arctic bacterioplankton
community
Hollibaugh JT (1994) Relationship between thymidine metabolism,
bacterioplankton community metabolic capabilities, and sources of
organic matter. Microb. Ecol. 28:117-131
Preston-Mafham J, Boddy L, Randerson PF (2002) Analysis of microbial
community functional diversity using sole-carbon-source utilisation
profiles - a critique. FEMS Microb. Ecol. 42:1-14
Sala MM, Arin L, Balagué V, Felipe J, Guadayol Ò, Vaqué D (2005a)
Functional diversity of bacterioplankton assemblages in western
Antarctic seawaters during late spring. Mar Ecol Prog Ser 292:13-21
Sala MM, Balagué V, Pedrós-Alió C, Massana R, Felipe J, Arin L, Illoul H,
Estrada M (2005b) Phylogenetic and functional diversity of

413
bacterioplankton during Alexandrium spp blooms. FEMS Microbiol. Ecol
54:257-267
Sala MM, Estrada M, Gasol JM (2006) Seasonal changes in the functional
diversity of bacterioplankton in contrasting coastal environments of the
NW Mediterranean. Aquat Microb Ecol 44:1-9
Sala MM, Terrado R, Lovejoy C, Unrein F, Pedros-Alio C (2008) Metabolic
diversity of heterotrophic bacterioplankton over winter and spring in the
coastal Arctic Ocean. Environ Microbiol 10:942-949
Sala MM, Arrieta JM, Boras JA, Duarte CM, Vaque D. (2011). The impact
of ice melting on bacterioplankton in the Arctic Ocean. En prensa en
Polar Biology

414
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestreo
2. Titulo de la técnica
Incorporación de bromodeoxiuridina en ADN microbiano para la
detección de filotipos activos
3. Autores del documento y filiación
Jesús M. Arrieta (IMEDEA)
4. Finalidad. Campo de aplicación
El objetivo de esta técnica es el marcaje de microorganismos en
crecimiento activo, es decir capaces de replicar su ADN. Para ello se
introduce un análogo de la timidina (Bromodeoxiuridina) que será
incorporado en lugar de esta durante la replicación del ADN. La
bromodeoxiuridina incorporada en el ADN puede ser detectada
posteriormente utilizando anticuerpos específicos, que a su vez pueden
ser unidos a un soporte paramagnético de forma que el ADN sintetizado
durante el experimento puede ser inmovilizado mediante el uso de un
imán. De esta manera se puede separar el material genético de los
microorganismos que replicaron su ADN durante el experimento de
marcaje y para su posterior identificación.
5. Conceptos generales
En este protocolo se define solamente el tratamiento de las muestras a
bordo del buque. Dado que la finalidad última es la detección de los
microorganismos activos en la muestra, el proceso de incubación ha de
comenzarse inmediatamente, manteniendo las muestras a una
temperatura lo más cercana a la original en todo momento. El proceso
es sencillo, consiste en añadir bromodeoxiuridina a las muestras en una
concentración final 40nM, incubar las muestras a la temperatura original
a la que se tomó la muestra y finalmente recolectar la biomasa
utilizando los mismos sistemas de filtración que se utilizaron para la
recolección de ADN o ARN.
La bromodeoxiuridina es un mutágeno potencial, como la mayoría las
sustancias que interactúan con el ADN. Las rutas de entrada en el
cuerpo son la respiración del producto en polvo y la ingestión.
Para prevenir la exposición accidental será suficiente con utilizar
guantes y bata y mantener las precauciones habituales a la hora de
trabajar en el laboratorio (no comer ni beber). También es importante
mantener el área de trabajo limpia, limpiando los derrames
accidentales con papel absorbente seguido de agua y jabón.
6. Equipamiento necesario
• Contenedor de plástico para mantener la muestra durante la
incubación (5L).

415
• Incubador(es), tantos como temperaturas diferentes se muestreen
a la vez.
• Bomba peristáltica con filtros en línea
• Contenedor para residuos
7. Reactivos u otro material fungible
• Filtros de policarbonato de 47 mm de diámetro.
ƒ 3.0µm de tamaño de poro
ƒ 0.22 µm de tamaño de poro
• Solución de bromodeoxiuridina (10mM). Almacenada a -20ºC a
largo plazo (meses) o a 4ºC a corto plazo (días).
• Guantes.
8. Calibración
No procede
9. Descripción de la Técnica
1. Preparación del material
Todo el material en contacto con la muestra se limpia primero con
agua destilada para eliminar restos de sal y después por inmersión
en una solución de lejía(10% de la solución comercial) durante al
menos 30 minutos.
Justo antes del muestreo se eliminan los restos lejía enjuagando
con un pequeño volumen de muestra.
2. Toma de muestras
La toma de muestras se hará directamente de la válvula de la
botella del CTD o utilizando un tubo de silicona previamente
tratado con lejía como se describe en el punto 1. Las muestras se
deben mantener en todo momento a la temperatura original
para evitar cambiar el ritmo de crecimiento de las poblaciones
microbianas.
3. Después de tomar la muestra, y tan rápido como sea posible, se
añadirá la bromodeoxiuridina a una concentración final de 40nM.
(4µL por litro de muestra). Las muestras se incuban a la
temperatura original durante 8-10 h en el caso de muestras de
superficie (hasta 100 m) y durante 24-30h en el caso de las
muestras de profundidad. No es necesario ser extremadamente
preciso con los tiempos, ya que no es una técnica cuantitativa,
pero en cualquier caso anotaremos el tiempo real de incubación
en el cuaderno de laboratorio.
4. Una vez transcurrido el tiempo de incubación se procederá a
filtrar las muestras utilizando el sistema de filtración secuencial
descrito para la toma de muestras de ADN.

416
5. Prepara el sistema de bombeo con una malla de 20µm en la
entrada el tubo, un filtro de policarbonato de 3µm de poro en el
portafiltros más cercano a la bomba peristáltica y otro de 2µm de
poro en el siguiente portafiltros.
6. Comenzar la filtración purgando el aire del sistema mediante los
tornillos de purga de ambos portafiltros.
7. Mantener la tasa de filtración a unos 50-100 ml min-1.
8. Cuando ta tasa de filtración se ralentice, cambiar el filtro de 3µm,
si no mejora, cambia también el de 0.22µm. Máximo 2 filtros de
cada por muestra (si se hubieran colmatado dos filtros de cada
tipo por muestra, se puede desechar el resto del agua). Si has
usado más de un filtro del mismo tamaño de poro guárdalos
juntos en el mismo criovial. Anotar el volumen filtrado.
9. -Guardar los filtros por separado (0.22µn y 3µm) en 2 crioviales de 2
mL convenientemente identificados, congelar por inmersión en
nitrógeno líquido y almacenar a -80ºC. Estos filtros se guardan en
las cajas de almacenamiento de color rosa para diferenciarlos del
resto.
10. Cuadro sinóptico de la técnica

417
11. Calculo de los resultados.

418
No procede
12. Control de calidad
No procede
13. Referencias
1. Urbach E, Vergin KL, Giovannoni SJ (1999) Immunochemical detection
and isolation of DNA from metabolically active bacteria. Appl Environ
Microbiol 65:1207-13.

2. Hamasaki K, Taniguchi A, Tada Y, Long RA, Azam F (2007) Actively


growing bacteria in the Inland Sea of Japan, identified by combined
bromodeoxyuridine immunocapture and denaturing gradient gel
electrophoresis. Appl Environ Microb 73:2787-2798.

419
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo para la Hibridación in situ Fluorescente (FISH):


a) plancton procariota (Bacteria y Archaea)
b) plancton picoeucariota

2. Titulo de la técnica
Muestreo para estudio de diversidad del plancton microbiano a partir
de sondas específicas y FISH

3. Autores del documento y filiación

Eva Teira
Universidad de Vigo
Marta Varela
Instituto Español de Oceanografía, Centro Oceanográfico de A Coruña
Ramon Massana
ICM

4. Conceptos generales

El plancton procariota es el principal mediador de los flujos


biogequímicos en el océano. Recientes evidencias sugieren que
aproximadamente un 30% de la remineralización oceánica tiene lugar
en el océano profundo. Además, de acuerdo con estimas actuales
existe una enorme diversidad microbiana en las aguas meso- y
batipelágicas del océano. Algunos trabajos, centrados
fundamentalmente en aguas profundas del océano (por debajo de 200
m), han encontrado que masas de agua diferentes albergan de hecho
comunidades procarióticas diferentes, probablemente relacionado con
la concentración y calidad de los nutrientes que transportan
(fundamentalmente orgánicos). Asimismo, los protistas más pequeños
(picoeucariotas: células de ≤3 µm) también juegan un papel crucial en
los sistemas marinos, contribuyendo significativamente a la producción
primaria (protistas forotróficos) o bien como depredadores de
procariotas (protistas heterotróficos). Éstos últimos juegan un papel
central en las redes tróficas microbianas y en la remineralización de
nutrientes, tanto en la capa fótica como en las aguas profundas.
El estudio de la diversidad del plancton microbiano puede abordarse
mediante el uso de técnicas moleculares basadas en el análisis de la
huella genética del ADN (por ejemplo T-RFLP o ARISA) que proporcionan
información fundamentalmente cualitativa, es decir, sobre la riqueza de
la muestra (número de unidades taxonómicas operativas, OTUs,
diferentes). Sin embargo, es importante determinar la abundancia
relativa de cada OTU, ya que dos muestras pueden presentar la misma
riqueza, pero diferente diversidad. Una técnica que permite

420
simultáneamente identificar y determinar la abundancia de grupos
taxonómicos de bacterias es la Hibridación In Situ Fluorescente (FISH).

5. Finalidad. Campo de aplicación

Metodología para obtener muestras de plancton procariota y


picoeucariota (≤3 µm) a distintas profundidades de cada estación de
muestreo para cuantificar la abundancia de los diferentes grupos
planctónicos.

6. Equipamiento necesario

Las muestras se toman directamente de las botellas oceanográficas


convencionales de 12L de capacidad montadas en una roseta
oceanográfica. Tras la fijación de las muestras, es necesario un equipo
de filtración múltiple (para filtros de 25 mm) equipado con embudos de
extensión para 100 ml de muestra y una bomba de vacío, con el fin de
conseguir un procesado rápido de las muestras.

Bomba de vacío Equipo de filtración múltiple Embudos de extensión

7. Descripción de la Técnica

Recogida y fijación de muestras de plancton procariota: Las muestras se


tomarán directamente de las botellas de la roseta en tubos estériles
desechables de 50 ml. Dependiendo de la profundidad se tomarán
entre 40 y 80 ml (2 réplicas) de muestra. En general, se recogerán 40 ml
en aguas mesopelágicas (200-1000 m) y 80 ml en aguas batipelágicas
(>1000 m). Se recomienda un chequeo rápido mediante microscopía
para asegurarse de que la densidad celular es adecuada. De forma
aproximada, para una densidad del orden de 106 células/ml son
adecuados 10 ml de muestra. A continuación, fijar las muestras
añadiendo formaldehido al 37% libre de partículas (utilizando una
jeringuilla y un filtro de 0.2 micras desechable) hasta una concentración
final del 2-4%. Mantener la muestra en oscuridad a 4 ºC (en nevera)
entre 1-24 h antes de proceder al filtrado.

421
Recogida y fijación de muestras de picoplancton eucariota: Las
muestras se tomarán directamente de las botellas de la roseta en
botellas de 2 L (que se podrán lavar entre muestreo y muestreo). Para
las muestras superficiales (hasta 200 m) se fijarán dos muestras de 95 ml
con 5 ml de formaldehido al 37% libre de partículas (antes del muestreo
se puede filtrar 1 litro por filtros de 0.2 µm de acetato de celulosa de 47
mm). Para las muestras profundas (más de 200 m) se fijarán dos muestras
de 475 ml con 25 ml de formaldehido al 37% libre de partículas.
Mantener la muestra en oscuridad a 4 ºC (en nevera) entre 1-24 h antes
de proceder al filtrado. Las muestras fijadas se filtrarán sobre un filtro de
policarbonato de 25 mm de ø y 0.6 µm de tamaño de poro (dos réplicas
de 100 ml para muestras superficiales; 2 réplicas de 500 ml para muestras
profundas).

Filtrado de las muestras de plancton procariota: Poner unas gotas de


agua Milli-Q el las posiciones del sistema de filtración si estuviera seco.
Colocar filtros de nitrocelulosa de 0.45 μm en las posiciones del sistema
de filtración. A continuación, se colocan encima los filtros de
policarbonato de 0.2 μm con la cara brillante hacia arriba. Una vez
filtradas las muestras, lavar los filtros dos veces con 10 ml de agua Milli-Q.
Dejar secar los filtros colocándolos con cuidado sobre papel absorbente
(manteniendo siempre la cara brillante hacia arriba). Una vez secos, se
introduce el filtro con cuidado en tubos debidamente etiquetados de
1.5-2 ml (asegurándose que la cara brillante, aquella que contiene las
células está hacia dentro) y se almacenan los tubos en las cajas de
congelación debidamente etiquetadas a -20 ºC.

Filtrado de las muestras de picoplancton eucariota (FISH): Poner unas


gotas de agua Milli-Q en las posiciones del sistema de filtración si
estuviera seco. A continuación, colocar filtros de acetato de celulosa
de 0.8 μm en las posiciones del sistema de filtración. Colocar encima los
filtros de policarbonato de 0.6 μm con la cara brillante hacia arriba.
Filtrar 2 alícuotas de 100 mL (superficie) o 500 ml (profundidad) es decir,
2 filtros por cada muestra. Una vez filtradas las muestras, lavar los filtros
dos veces con 10 ml de agua Milli-Q. Dejar secar los filtros colocándolos
con cuidado sobre papel absorbente (manteniendo siempre la cara
brillante hacia arriba). Una vez secos, se introduce el filtro con cuidado
en tubos debidamente etiquetados de 1.5-2 ml (asegurándose que la
cara brillante, aquella que contiene las células está hacia dentro) y se
almacenan los tubos en las cajas de congelación debidamente
etiquetadas a -20 ºC.

422
8. Cuadro sinóptico de la técnica
Formol al 37%

9. Reactivos u otro material fungible

Conservantes: Formaldehído al 37 %.

Tubos Falcon de 50ml estériles.


Jeringuillas desechables de 20 y 50 ml.
Filtros estériles desechables de 0.2 μm (para prefiltrado del formol).
Filtros de nitrocelulosa de 0.45 μm y de 25 mm de diámetro.
Filtros de acetato de celulosa de 0.8 μm y 25 mm de diámetro.
Filtros de policarbonato blancos de 0.2 y de 0.6 μm y de 25 mm de
diámetro.
Viales para centrífuga de 1.5-2 ml.
Cajas de congelación de cartón para viales de 1.5-2 ml.

10. Control de calidad

Se tratará de hacer chequeos mediante microscopía (montar el filtro


utilizando la mezcla de DAPI y observar la muestra en un microscopio de
epifluorescencia) para cerciorarse de que los volúmenes de muestra son
adecuados. La densidad óptima de células recogidas sobre los filtros
para el procesado posterior de los filtros en el caso del plancton
procariota es de entre 100-300 células en un área de 104 μm2.

423
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento _

“Fijación y Procesado de muestras”

2. Titulo de la técnica

Determinación de abundancia y actividad individual


bacteriana por citometría de flujo.

3. Autores del documento y filiación

Josep M Gasol, ICM-CSIC pepgasol@icm.csic.es


Xelu A. G. Morán, IEO-Gijón xelu.moran@gi.ieo.es

4. Finalidad. Campo de aplicación

Se trata de determinar la abundancia y actividad individual de


bacterias por medio de citometría de flujo. El protocolo tiene dos partes:
- recogida de muestras, fijación y mantenimiento
- análisis por citometría.

El análisis puede efectuarse en el barco o en el laboratorio.

5. Conceptos generales

El protocolo que seguimos está muy bién desarrollado en las


publicaciones siguientes:
• GASOL, J.M., J. FELIPE. 1999. How to count algae and bacteria with
the FACScalibur flow cytometer. 2nd edition. Dirección web:
ftp.icm.csic.es/pub/gasol/Manuals/FACS/Citometry.html
• GASOL, J.M. & P.A. DEL GIORGIO. 2000. Using flow cytometry for
counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of
planktonic bacterial communities. Scientia Marina 64: 197-224

6. Equipamiento necesario

424
• Citómetro de Flujo FACSCalibur de Becton & Dickinson
• Vórtex
• Pipetas para dispensado de muestras
• Bidón de nitrógeno líquido.
• Sonicador

7. Reactivos u otro material fungible

• Fijador: Solución de Paraformaldehido con glutaraldehido (1% + 0.05%


final): Solución de P+G.
Preparación de P+G (1 Litro):
- Pesa 100 g. de PFA (Sigma P6148).
- Coloca en 880 ml dH2O en un recipiente, cubierto con Parafilm, y con una
mosca magnética. El agua debe star muy caliente, casi hirviendo.
- Deja > 24 h en una campana de gases en un calentador (90°) con mezclado
magnético
- Desués de la disolución (it make take days), añade 100 ml PBS (phosphate-
buffered saline solution). El PBS se prepara con una pastilla de Sigma P4417 (1
en 200 ml)
- Añade 20 ml Glutaraldehyde 25%
- Filtra con filtro de policarbonato de 0.2 µm en la campana con un sistema de
filtración que se use sólo para eso.
- Distribuye en tubos de 5, 20 ml y 50 ml.
- Congélalos a -70°C.
- Guarda los tubos a -20°.
- Una vez descongelado, un tubo se usa en una semana o se tira.

• Crioviales de 2 mL
• Tubos de citómetro
• Tinción SybrGreen I (Molecular Probes), diluída 10x con DMSO (Sigma)
• Nitrógeno líquido
• Solución de bolas de látex amarillas de 1 µm a ca. 108 ml-1
(Polysciences).

9. Descripción de la Técnica

9.1- Recogida de muestra


- Se toman 1.2 ml de la muestra y se depositan en un criovial. Se fija con
120 µl de la solución de P+G.
- Aguardar 10 min en oscuridad
- Guardar en nitrógeno líquido.

9.2- Análisis en el barco


- Se dejan descongelar las muestras.

425
- Poner en marcha el citómetro. 10 min después, poner en marcha el
ordenador.
- Poner agua MilliQ en el recipiente de la izquierda (Sheath Fluid). Cargar
la presión. Vaciar el recipiente de “Waste”
- Limpiar el filtro salino de aire.
- “Prime” el sistema (botón de la derecha). Cambiar el tubo, con MilliQ.
- Conectar el programa CellQuest. Buscar la hoja Template Bacteria.
Ponerla en marcha.
- En el menú ACQUIRE, abrie “Connect to cytometer”.
- En el menú CYTOMETER, abrir “Instrument settings”. Buscar el de
Bacterias. Darle a “Set” y luego a “Done”.
- Poner agua MilliQ en un tubo, ponerlo en posición y darle a “Run”. El
botón debe estar en verde. Escoger la velocidad “LOW”. Asegurarse
que sólo pasan < 20 partículas por segundo.
- Standard settings son: FSC: E02, SSC: 400; FL1: 511, FL2: 400, FL3: 590
(threshold a FL1: 72). Acquisition en Log.
- Standard process: 0.4 ml de muestra, a la velocidad LO (~19 µl min-1) y
con 10 µl de una solución a 106 de beads ml-1. Acabar con 10.000
particles o, más o menos, 1-2 minutes.
- Observación con una gráfica de SSC vs. FL1 y otro de FL1 vs. FL3.
- No olvideis de escribir en la libreta el volumen de muestra y de beads
usado, y los tiempos de empezar y terminar.

Proceso:

a) Pon 0.4 ml de muestra en el tubo.


b) Añade 2 µl de tinción. Vortex. Espera 10 minutos con el tubo a
oscuras.
c) Añade las bolas de látex.
d) vortex el tubo.
e) Pon la máquina en “Standby”.
f) Pon el tubo.
g) Pon la máquina en “Run”.
h) En la ventana: Acquisition Control, pon “Pause”, luego “Abort”,
luego asegúrate que “Setup” está marcado, y luego pulsa “Acquire”.
i) Deja la máquina correr unos segundos. Si está correcto, prepara la
máquina para guardar los datos.
i) Ve al menu Acquire, y selecciona “Parameter description”. Nombra
la muestra y selecciona en qué carpeta debe ir.
j) En la ventana de Acquisition Control, pulsa “Pause”, luego “Abort”.
Pulsa “Setup” para quitar la selección, y luego pulsa “Acquire”.

426
** Controla la velocidad de paso de muestra. Si está por arriba de 800
particles s-1, debereis diluir la muestra con MilliQ.

10. Cuadro sinóptico de la técnica

11. Calculo de los resultados.


- Con CellQuest o Paint-A-Gate se procesa la muestra para marcar la
población adecuada y contar cuantas partículas hay en ella.
- El num de partículas se convuerte en concentración a partir del tiempo
de paso de muestra, y la velocidad.
- La velocidad se determina con las bolas de látex, o bién midiendo el
volumen antes o después del paso de muestra con una pipeta de 1 ml.

12. Control de calidad


- Las muestras tienen que tener la apariencia parecida a este gráfico.
Las concentraciones deben estar entre 1 x 105 y 5 x 106 ml-1.

427
13. Referencias
Allman, R., A.C. Hann, R. Manchee and D. Lloyd. 1992. – Characterization
of bacteria by multiparameter flow cytometry. J. Appl. Bacteriol., 73:
438-444.
Button D.K. and B.R. Robertson. 1993. – Use of high-resolution flow
cytometry to determine the activity and distribution of aquatic bacteria.
In: Kemp, P.F., B.F. Sherr, E.B. Sherr and J.J. Cole, (eds.). Handbook of
methods in aquatic microbial ecology. pp. 163-173, Lewis Pub., Boca
Raton.
Button, D.K., B.R. Robertson and F. Jüttner. 1996. Microflora of a subalpine
lake: bacterial populations, size and DNA distributions, and their
dependence on phosphate. FEMS Microb. Ecol., 21: 87-101.
Davey, H.M. and D.B. Kell. 1996. – Flow cytometry and cell sorting of
heterogeneous microbial populations: the importance of single-cell
analyses. Microbiological Rev., 60: 641- 696.
del Giorgio, P.A., D.F. Bird, Y.T. Prairie and D. Planas. 1996. – Flow
cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton
with the green nucleid acid stain SYTO 13. Limnol. Oceanogr.,41:
783-789.
Gasol, J.M., J. Felipe. 1999. How to count algae and bacteria with the
FACScalibur flow cytometer. 2nd edition. Dirección web:
ftp.icm.csic.es/pub/gasol/Manuals/FACS/Citometry.html
Gasol, J.M. and X.A.G. Morán. 1999. – Effects of filtration on bacterial
activity and picoplankton community structure as assessed by flow
cytometry. Aquatic Microbial Ecology, 16: 251-264.
Gasol, J.M. & PA. del Giorgio. 2000. Using flow cytometry for counting
natural planktonic bacteria and understanding the structure of
planktonic bacterial communities. Scientia Marina 64: 197-224
Gasol, J.M., U.L. Zweifel, F. Peters, J.A. Fuhrman and Å. Hagström. 1999. –
Significance of Size and Nucleic Acid content Heterogeneity as
measured by Flow Cytometry in Natural Planktonic Bacteria . Appl.
Environ. Microbiol., 65: 4475-4483
Guindulain, T., J. Comas and J. Vives-Rego. 1997. – Use of nucleic acid
dyes SYTO-13, TOTO-1, and YOYO-1 in the study of Escherichia coli and
marine prokaryotic populations by flow cytometry. Appl. Environ.
Microbiol., 63: 4608-4611.
Haugland, R.P. 1999. – Handbook of fluorescent probes and research
chemicals. Seventh Ed. Molecular Probes Inc.
Jellett, J.F., W.K.W. Li, P.M. Dickie, A. Boraie and P.E. Kepkay. 1996. –
Metabolic activity of bacterioplankton communities assessed by flow
cytometry and single carbon substrate utilization. Mar. Ecol. Prog. Ser.,
136: 213-225.

428
Lebaron, P., N. Parthuisot and P. Catala. 1998. – Comparison of blue
nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in
aquatic systems. Appl. Environ. Microbiol., 64: 1725-1730.
Lebaron, P., P. Servais, M. Troussellier, C. Courties, J. Vives-Rego, G.
Muyzer, L. Bernard, T. Guindulain, H. Schäfer & E. Stackebrandt. 1999.
Changes in bacterial community structure in seawater mesocosms
differing in their nutrient status. Aquat. Microb. Ecol., 19: 255-267.
Li, W.K.W., J.F. Jellett and P.M. Dickie, P M. 1995. – DNA distributions in
planktonic bacteria stained with TOTO or TO-PRO. Limnol. Oceanogr.,
40: 1485-1495.
Li, W.K.W., P.M. Dickie, B.D. Irwin and A.M. Wood. 1992. – Biomass of
bacteria, cyanobacteria, prochlorophytes and photosynthetic
eukaryotes in the Sargasso Sea. Deep-Sea Res., 39: 501-519.
Marie, D., F. Partensky and D. Vaulot. 1996. – Application of the novel
DNA dyes YOYO-1, YOPRO-1 and Picogreen for flow cytometric
analysis of marine prokaryotes. Appl. Environ. Microbiol., 62: 1649-1655.
Robertson B.R. and D.K. Button. 1989. – Characterizing aquatic bacteria
according to population, cell size and apparent DNA content by flow
cytometry. Cytometry, 10: 70-76.
Shapiro, H.M. 1995. Practical flow cytometry. Third Edition. Wiley-Liss
Steen, H.B. 1990. –Flow cytometric studies of microorganisms. In: Melamed,
M.R., T. Lindmo and M.L. Mendelsohn (eds.). Flow cytometry and sorting.
2nd. pp. 605-622. Ed. Wiley-Liss Inc., NY
Troussellier M., C. Courties, P. Lebaron and P. Servais. 1999. – Flow cytometric
discrimination of bacterial populations in seawater based on SYTO 13
staining of nucleic acids. FEMS Microbiol. Ecol., 29: 319-330.
Troussellier, M., C. Courties and S. Zettelmaier. 1995. – Flow cytometric
analysis of coastal lagoon bacterioplankton and picophytoplankton :
Fixation and storage effects. Est. Coast. Shelf Sci., 40: 621-633.
Vazquez-Dominguez, E., F. Peters, J.M. Gasol and D. Vaqué. 1999. –
Measuring the grazing losses of picoplankton: Methodological
improvements to the use of fluorescently labeled tracers combined to
flow cytometry. Aquat. Microb. Ecol., 20: 119-128.
Vives-Rego, J., T. Guindulain, E. Vazquez-Dominguez, J.M. Gasol, R.
López-Amorós, D. Vaqué and J. Comas. 1999. – Assessment of the
effects of nutrients and pollutants on coastal bacterioplankton by flow
cytometry and SYTO-13 staining. Microbios, 98: 71-85.

429
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Fijación de muestras; análisis por citometría de flujo en el ICM

2. Titulo de la técnica

Muestreo para recuentos de flagelados heterotróficos por citometría de


flujo.

3. Autores del documento y filiación

Ramon Massana
ICM

4. Finalidad. Campo de aplicación

La citometría de flujo es una técnica inestimable para cuantificar la


abundancia de distintos grupos microbianos (bacterias, cianobacterias,
protistas fototróficos) y se utiliza ámpliamente en oceanografía. Sin
embargo, todavía no se aplica de forma rutinaria para cuantificar los
protistas (flagelados) heterotróficos. Para este fin existen dos protocols
descritos. El primero está basado en una tinción vital con Lysotracker
que tiñe las vacuolas digestivas (de pH ácido) de los protistas
heterotróficos antes de procesar la muestra en el citómetro (Rose et al.
2004). El segundo protocolo está basado en teñir el DNA de los
flagelados heterotróficos (con SYBRGreen) y distinguirlos en el citómetro
de flujo por su contenido de DNA superior al de las bacterias (Zubkov et
al. 2007). En esta campaña utilizaremos el segundo protocolo, ya que
parece más robusto y se puede aplicar en muestras fijadas. Además
podremos comparar los valores obtenidos por citometría de flujo con los
recuentos de epifluorescencia.

5. Conceptos generales

Los microorganismos son muy importantes para los sistemas marinos a


distintos niveles, y son un componente central del proyecto Malaspina.
Los flagelados heterotróficos juegan un papel central en el concepto
del bucle microbiano, tanto como canalizadores de materia orgánica
disuelta a niveles tróficos superiores, como remineralizadores de
nutrientes inorgánicos. Óbviamente, su importancia está principalmente
ligada a su biomasa, y la aplicación de citometría de flujo en las
muestras de Malaspina permitirá una visión general de su distribución y
abundancia en los distintos gradientes muestreados (vertical en la
columna de agua, distintos Océanos, masas de agua etc…).

430
6. Equipamiento necesario

Las muestras se toman directamente de las botellas oceanográficas


convencionales de 12L de capacidad montadas en una roseta
oceanográfica. Tras la fijación de las muestras, los crioviales se sumergen
en nitrógeno líquido y luego se guardan a -80°C.
7. Reactivos u otro material fungible

Glutaraldehido al 10%, frío


Se diluye el glutaraldehido comercial (25%) con agua milliQ (450 ml de
agua milliQ + 300 ml de glutaraldehido 25%), se filtra por 0.2 µm y se
guarda a 4°C

8. Calibración

La calibración de la citometría de flujo se efectuará mediante medición


del volumen procesado (pesado del criovial antes y después del
análisis)

9. Descripción de la Técnica

a) Fijar la muestra
- Fijar con 10% glutaraldehido frío (1% concentración final): 4.5 ml
de muestra con 0.5 ml de fijador
- “Flash freeze” los crioviales en nitrógeno líquido
- Guardar los crioviales a -80°C hasta su procesado en el ICM

b) Almacenaje de las muestras a bordo


- Colocar los crioviales en cajas a -80°C.

c) Análisis de citometría de fljujo


Se utilizará el protocolo detallado para los recuentos de bacterias
con la única excepción que se incrementará el flujo de muestra
durante su procesado (hasta 400 µl por minuto) y se realizará un
proceso de “gating” distinto para localizar la población de HF (ver
ejemplo a continuación)

431
10. Calculo de los resultados.

Se utilizará el protocolo detallado para los recuentos de bacterias por


citometría de flujo

11. Control de calidad

Se utilizará el protocolo detallado para los recuentos de bacterias por


citometría de flujo

12. Referencias

Rose, J.M., D.A. Caron, M.E. Sieracki & N. Poulton. 2004. Counting heterotrophic
nanoplanktonic protists in cultures and aquatic communities by flow cytometry. Aquat.
Microb. Ecol. 34:263-277
Zubkov, M.V., P.H. Burkill & J.N. Topping. 2007. Flow cytometric enumeration of DNA-
stained oceanic planktonic protists. J. Plankton Res. 29:79-86

432
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Incubaciones con 14C-Bicarbonato para el estudio de la fijación de


carbono inorgánico disuelto (CID) por los procariotas (bacterias y
arqueas)

2. Titulo de la técnica
Estudio de la cuantificación de CID por el plancton procariota
mesopélágico.

3. Autores del documento y filiación

Marta Varela
Instituto Español de Oceanografía, Centro Oceanográfico de A Coruña
Eva Teira
Universidad de Vigo

En colaboración con:

Gerhard Herndl
Universidad de Viena

4. Conceptos generales

Las fuentes de carbono y energía de los procariotas son tema de


debate actual. Algunas investigaciones indican que Crenarchaeota son
heterotróficas, y consumen activamente aminoácidos. Sin embargo el
cultivo y aislamiento de Nitrosopumilus maritimus también mostró que
algunas Crenarchaeota son capaces de oxidar amonio como fuente
de energía, y fijar carbono inorgánico (metabolismo autotrófico). En
este sentido, el análisis genómico de Crenarchaeota indicó que el gen
que codifica para la oxidación de amonio (amoA) es 10 veces más
abundante en Crenarchaea que en Bacteria. Sin embargo, mediante la
técnica de hibridación in situ fluorescente combinada con
microautorafiografía (MICRO-CARD-FISH) se descubrió que la fijación de
carbono inorgánico está muy extendida tanto en Bacteria como en
Crenarchaeota. Actualmente se desconoce cuanto carbono
inorgánico es fijado por Bacteria vs. Archeea y que grupos Bacterianos
están implicados en dicha fijación de CID.

5. Finalidad. Campo de aplicación

Cuantificación de la fijación de CID por el plancton procariota


mesopelágico, Archaea vs. Bacteria, en una estación de muestreo
determinada.

433
6. Equipamiento necesario

Las muestras se toman directamente de las botellas oceanográficas


convencionales de 12L de capacidad montadas en una roseta
oceanográfica. Tras la incubación con substancias radioactivo (14C) y la
posterior fijación de las muestras, es necesario un equipo de filtración
múltiple equipado con embudos de extensión para 100 ml de muestra y
una bomba de vacío. Se utilizará unsistema completo (bomba más
colector múltiple):

Bomba de vacío Equipo de filtración múltiple Embudos de extensión

7. Descripción de la Técnica

Toma de muestras y fijación de las mismas: Las muestras se recogerán


directamente de las botellas de la roseta en tubos de vidrio de 50 ml. Se
tomarán 40 ml (tres réplicas) de muestra y 40 ml para los controles
(también tres réplicas) en aguas mesopelágicas (200-1000 m). Se
tomaran dos sets de estas muestras, añadiendo a uno de ellos
Eritromicina (un inhibidor de Bacteria) con el objetivo de cuantificar la
fijación de CID por Archaea. Al otro set de muestras no se añadirá
Eritromicina y se cuantificará la fijación de CID por toda la comunidad
procariota (Bacteria + Archaea). A continuación se añade
formaldehido al 37% libre de partículas (utilizando una jeringuilla y un
filtro de 0.2 micras desechable) hasta una concentración final del 2-4%
a los controles. Tras 15 minutos se inoculan el substrato marcados
radiactivamente según se indica a continuación.

-Bicarbonato sódico marcado con 14C (actividad específica


aproximada de 50 mCi/mmol): añadir 50 μCi por cada 40 ml de
muestra.

A continuación incubar las muestras manteniéndolas a la temperatura


in situ 72 h. Para finalizar la incubación se fijan las muestras añadiendo

434
formaldehido al 37% libre de partículas (utilizando una jeringuilla y un
filtro de 0.2 micras desechable) hasta una concentración final del 2-4%.

Filtrado de las muestras: La filtración se llevará a cabo en una instalación


radioactiva. Antes de la misma se añadirán unas gotas de agua Milli-Q
en las posiciones del sistema de filtración si estuviera seco. Colocar filtros
de policarbonato de 0.2 μm en el colector de filtración. Una vez filtradas
las muestras, lavar los filtros dos veces con 10 ml de agua de mar
filtrada. A continuación se introduce el filtro con cuidado en viales de
centelleo debidamente etiquetados. Los filtros se exponen a vapores de
HCl concentrado durante 12 h. Finalmente, la radioactividad retenida
en cada filtro se mide utilizando un contador de centelleo líquido.

8. Cuadro sinóptico de la técnica

Formol al 37%

Incubación
Temperatura in situ

14
C-Bicarbonato

9. Reactivos u otro material fungible

Tubos vidrio de 50ml.


Conservantes: Formaldehído al 37 %.
Jeringuillas desechables de 20 y 50 ml.
Filtros estériles desechables de 0.2 μm (para la prefiltración del formol).
Filtros de policarbonato blancos de 0.2 y de 25 mm de diámetro.

10. Control de calidad

Se harán chequeos continuos de los contajes de la radioactividad


(expresados en DPM, desintegraciones por minuto) en cada unos de los
legs, asegurándonos de que hay una baja variabilidad entre las 3
replicas de cada muestra y que las DPM de los controles son inferiores a
las DPM de la muestra.

435
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Técnica analítica

2. Titulo de la técnica

Actividad enzimática de los procariotas planctónicos.

3. Autores del documento y filiación

Iriberri J., Unanue M., Ayo B.


Dpto. Inmunología, Microbiología y Parasitología, Universidad del País
Vasco

4. Finalidad. Campo de aplicación

Metodología para determinar el nivel y características de la actividad


enzimática de los procariotas heterótrofos planctónicos. Se describe la
técnica basada en la hidrólisis enzimática de substratos fluorogénicos
modelo (1). Estos substratos consisten en una molécula fluorescente
artificial unida a otro compuesto (por ejemplo, glucosa, fosfato, amino
ácido, etc.) mediante un enlace específico (enlace éster, enlace
peptídico, etc.). Estas moléculas son hidrolizadas por los enzimas de
modo similar a los sustratos naturales oligoméricos o poliméricos, y
cuando esto ocurre, la molécula de fluorocromo liberada genera
fluorescencia. La cantidad de fluorescencia liberada (incremento de
fluorescencia), determinada mediante fluorimetría, indica el nivel de
actividad enzimática en la muestra de agua.
Las características generales de la técnica propuesta son las siguientes:
• Los substratos fluorogénicos modelo no son tóxicos para la
comunidad procariota natural.
• Los substratos fluorogénicos modelo son artificiales: diferentes en
tamaño, estructura y complejidad espacial a los substratos
naturales. Además, son hidrolizados principalmente por los
exoenzimas, en tanto que los compuestos naturales son atacados
tanto por exoenzimas como por endoenzimas. Debemos por tanto
asumir, al utilizar esta técnica, que las velocidades de hidrólisis de
estos substratos son asimilables a las velocidades de hidrólisis de
los substratos naturales.
• Las concentraciones in situ de los substratos naturales son
habitualmente desconocidas, pero como estos substratos son
competitivos frente a los substratos naturales, los estudios se
realizan habitualmente bajo concentraciones saturantes, de
modo que los resultados obtenidos representan velocidades
potenciales de hidrólisis.

436
• La utilización de concentraciones diferentes de substrato permite
determinar características cinéticas de los enzimas estudiados,
representadas por los parámetros cinéticos Km y Vmax.
• La técnica implica la utilización de períodos de incubación
variables, a fin de obtener incrementos significativos en el nivel de
fluorescencia de la muestra.

5. Conceptos generales

Una gran parte de la materia orgánica disuelta del océano está


compuesta por moléculas poliméricas tales como proteínas, hidratos de
carbono, grasas, etc. (2,3), y los procariotas heterótrofos son los
principales responsables de su degradación (4). Los procariotas
heterótrofos no pueden utilizar como alimento estos materiales
directamente porque les resultan demasiado grandes, pero en cambio
sí que pueden romper estas macromoléculas mediante enzimas y
consumir ávidamente las pequeñas moléculas resultantes, tales como
aminoácidos, pequeños azúcares, etc. Evidentemente, esta rotura debe
ser realizada fuera de las células, y para ello, los procariotas son
capaces de sintetizar y expulsar del citoplasma celular dos tipos de
enzimas hidrolíticos. Los enzimas que se quedan en el periplasma o
adheridos a las envolturas celulares se denominan ectoenzimas,
mientras que los que son liberados al exterior se denominan enzimas
extracelulares. Una vez rotas las macromoléculas mediante la actividad
ectoenzimática y/o extracelular los procariotas consumen las pequeñas
moléculas liberadas, crecen y se reproducen. Esta hidrólisis enzimática
es un proceso clave porque los procariotas heterótrofos son los
principales organismos no autótrofos del océano capaces de
transformar alimento en forma disuelta en alimento en forma
particulada, es decir, en nuevos procariotas. Una vez formados los
procariotas, estos podrán ser consumidos por otros organismos cada vez
más grandes, flagelados, ciliados, zooplancton, peces y mamíferos, a lo
largo de la cadena trófica del océano.
En este proyecto vamos a medir cuatro actividades enzimáticas
(ectoenzimas y enzimas extracelulares):
• la actividad aminopeptidasa, que nos indicará como rompen
estos procariotas las proteínas. La actividad aminopeptidasa se
analizará con el análogo L-leucine-4-methyl-coumarinyl-7 amide
(MCA-L). Este análogo es hidrolizado por varios enzimas, no solo
por las leucina-aminopeptidasas. Se puede considerar como un
sustrato modelo para la hidrólisis de una gran variedad de
péptidos (5).
• la actividad fosfatasa alcalina, capaz de hidrolizar los grupos
fosfato de moléculas orgánicas. La actividad de estos enzimas se
analizará con el análogo 4-methyl-umbelliferyl phosphate (MUF-P),
que presenta velocidades de hidrólisis similares a los sustratos
naturales (6,7).

437
• la actividad β-glucosidasa, que rompe carbohidratos con enlaces
tipo β entre los azúcares, como por ejemplola celulosa. La
actividad de estos enzimas se analizará con el análogo 4-methyl-
umbelliferyl –β-D-glucopyranoside (MUF-G).
• la quitinasa, que hidroliza los enlaces de la quitina, un
polisacárido estructural producido por muchos organismos
marinos. La actividad de estos enzimas se analizará con un
análogo fluorogénico de la quitina, el 4-methyl-umbelliferyl –N-
acetyl-β-D-Glucosamine (MUF-C).

Esta información permitirá conocer la importancia de los procariotas en


el flujo de materia y energía en el Océano Global y, principalmente, en
el océano profundo.

6. Equipamiento necesario

• Lector de microplacas multidetector Synergy 2 (Biotek). Equipado


con sonda superior de lectura de fluorescencia, con rango de
excitación de 300-650 nm de longitud de onda y rango de emisión
de 300-700 nm de longitud de onda. Permite agitación de la placa
durante periodo y velocidad variables. Utiliza microplacas de 96
celdas, con un volumen de muestra de 250 μl.
• Ordenador portátil equipado con software de análisis de datos Gen
5. Controla el lector de microplacas, y permite el análisis de datos.
• Congelador a -20ºC. Almacenamiento de substratos fluorogénicos.
• Frigorífico a 4ºC. Almacenamiento de substratos fluorogénicos.
• Incubadores a varias temperaturas. Incubación de las muestras de
agua a temperatura in situ.

• Vortex. Homogeneización de soluciones.

7. Reactivos u otro material fungible

1. Material fungible
o Botellas de muestreo de policarbonato de 500 ml de
capacidad, con tapón.
o Contenedores de policarbonato de 125 ml de capacidad, con
tapa.
o Reservorios para pipeteado multicanal, con tapa.
o Microplacas de 96 pocillos negras con tapa, estériles
o Pipeta automática multicanal de 12 canales de 20-300 μl.
o Pipeta automática multicanal de 12 canales de 5-20 μl.
o Pipetas automáticas en el rango 10-5000 μl.
o Puntas de pipeta estériles.
o Jeringas estériles de 20 ml.
o Filtros de jeringa de baja adsorción proteica, de 0,1 μm de
tamaño de poro, estériles.

438
o Crioviales de 2 y 5ml de capacidad, de rosca externa, estériles.
o Gradillas para crioviales
o Cajas de congelación para crioviales.
o Guantes sin polvo

2. Reactivos
o Agua destilada de calidad MilliQ
o L-leucine-7-amide-4-methyl-coumarin hydrochloride (MCA-L)
o 4-methylumbelliferyl-phosphate (MUF-P)
o 4-methylumbelliferyl-β-D- glucopyranoside (MUF-G)
o 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D- glucosaminide (MUF-C)
o 7-amino-4-methylcoumarinyl (MCA)
o 4-methylumbelliferone (MUF)
o Metanol absoluto
o HCl 35%

3. Preparación de soluciones Standing Stock (SS) de los substratos y de


los productos:
o Solución MCA-L SS: Solución 50 mM de MCA-Leu en Metanol
40%.
ƒ Preparación: disolver la cantidad correspondiente del
sustrato en metanol 40%. Agitar hasta su completa
disolución. Alicuotar en crioviales y congelar a -20ºC
hasta su uso.

o Solución MUF-P SS: Solución 10 mM de MUF-P en Metanol 40%.


ƒ Preparación: disolver la cantidad correspondiente del
sustrato en metanol 40%. Agitar hasta su completa
disolución. Alicuotar en crioviales y congelar a -20ºC
hasta su uso.

o Solución MUF-G SS: Solución 10 mM de MUF-G en Metanol 40%


ƒ Preparación: disolver la cantidad correspondiente del
sustrato en el volumen de agua MiilliQ correspondiente.
Agitar hasta su completa disolución. Añadir la cantidad
de metanol absoluto necesaria. Alicuotar en crioviales y
congelar a -20ºC hasta su uso.

o Solución MUF-CSS: Solución 10 mM de MUF-C en Metanol 40%.


ƒ Preparación: disolver la cantidad correspondiente del
sustrato en metanol 40%. Agitar hasta su completa
disolución. Alicuotar en crioviales y congelar a -20ºC
hasta su uso.

o Solución MCA SSx1000: Solución 4,8 mM de MCA en Metanol


40%.

439
ƒ Preparación: disolver la cantidad correspondiente del
producto en el volumen de metanol absoluto
correspondiente. Agitar hasta su completa disolución.
Añadir la cantidad de agua MilliQ necesaria. Alicuotar
en crioviales y congelar a -20ºC hasta su uso.

o Solución MUF-P SSx1000: Solución 2,4 mM de MUF en Metanol.


ƒ Preparación: disolver la cantidad correspondiente del
producto en el volumen de metanol absoluto
correspondiente. Agitar hasta su completa disolución.
Añadir la cantidad de agua MilliQ necesaria. Alicuotar
en crioviales y congelar a -20ºC hasta su uso.

4. Preparación de soluciones de trabajo “Working solutions” (WS) de los


substratos y de los productos:
o Las soluciones de trabajo (WS) se preparan diluyendo las
soluciones “Standing Stock” con agua MilliQ hasta conseguir
una concentración tal que al añadir 10 μl de la WS a un
volumen de 240 μl de muestra, se alcanza la concentración
deseada en ésta última.

o La concentración en muestra de los sustratos varía en función


del análisis a analizar: actividad potencial, en la que se utilizan
concentraciones saturantes, o estudio cinético, en la que se
utiliza un rango de 12 concentraciones.

o En la siguiente tabla se muestra la preparación de las


soluciones de trabajo (WS) que permiten obtener
concentraciones saturantes para realizar estudios de actividad
potencial:

MCA‐L MUF‐P
Preparation Preparation
Final conc  Final conc 
Conc WS  Stock 50  MilliQ w      Conc WS  Stock 10  MilliQ w     
in sample     Name WS in sample     Name WS
(uM) mM  (ul) (ul) (uM) mM  (ul) (ul)
(uM) (uM)
1000 HC‐Leu 25000 400 400 200 HC‐P 5000 400 400
250 LC‐Leu 6250 100 700 10 LC‐P 250 20 780

MUF‐G MUF‐C
Preparation Preparation
Final conc  Final conc 
Conc WS  Stock 10  MilliQ w      Conc WS  Stock 10  MilliQ w     
in sample     Name WS in sample     Name WS
(uM) mM  (ul) (ul) (uM) mM  (ul) (ul)
(uM) (uM)
200 HC‐G 5000 400 400 200 HC‐C 5000 400 400
10 LC‐G 250 20 780 10 LC‐C 250 20 780

o En la siguiente tabla se muestra la preparación de las


soluciones de trabajo (WS) que permiten obtener la
concentración más elevada para realizar estudios cinéticos:

440
MCA‐L MUF‐P
Preparation Preparation
Final conc  Final conc 
Conc WS  Stock 50  MilliQ w      Conc WS  Stock 10  MilliQ w     
in sample    Name WS in sample     Name WS
(uM) mM  (ul) (ul) (uM) mM  (ul) (ul)
(uM) (uM)
500 C1‐L 12500 300 900 100 C1‐P 5000 300 900

MUF‐G MUF‐C
Preparation Preparation
Final conc  Final conc 
Conc WS  Stock 10  MilliQ w      Conc WS  Stock 10  MilliQ w     
in sample    Name WS in sample     Name WS
(uM) mM  (ul) (ul) (uM) mM  (ul) (ul)
(uM) (uM)
100 C1‐G 5000 300 900 100 C1‐C 5000 300 900

o En la siguiente tabla se muestra la preparación de las


soluciones de trabajo de los productos:

MCA MUF
Preparation Preparation
Final conc  Final conc 
Stock 4.8  MilliQ w      Conc WS  Stock 2.4  MilliQ w     
in sample     Name WS Conc WS (uM) in sample     Name WS
uM  (ul) (ul) (uM) uM  (ul) (ul)
(nM) (nM)
96 MCA‐C1 2.4 400 400 48 MUF‐C1 1.2 400 400
24 MCA‐C2 0.6 100 700 12 MUF‐C2 0.3 100 700
6 MCA‐C3 0.15 25 775 3 MUF‐C3 0.075 25 775
o 0 MCA‐C4 0 0 800 0 MUF‐C4 0 0 800

8. Calibración
Para cada muestra de agua analizada, se calibrará la relación entre las
Unidades de fluorescencia y la concentración de los dos productos que
pueden ser generados, en función del sustrato utilizado. Estos dos
productos son MCA y MUF.
Cada calibración generada se aplicará a los resultados específicos de
esa muestra.
Las concentraciones de los dos productos que se utilizarán para las
calibraciones son:
• MCA: 96nM, 24nM, 6nM y 0 nM.
• MUF: 48nM, 12nM, 3nM, 0nM.

9. Descripción de la Técnica

9.1. Muestreo.
Las muestras de agua se recogerán de las botellas Niskin en botellas de
policarbonato lavadas con ácido (HCl 3,5% 24 horas, aclaradas 3 veces
con agua destilada y dos veces con agua MilliQ), de 500 ml de
capacidad. Las botellas estarán previamente identificadas como
“TOTAL SAMPLE”, con el número de estación y profundidad.
Un volumen adecuado de la muestra será filtrado a través de 0,1 μm, a
fin de eliminar todo el material particulado de la misma. El filtrado se
recogerá en una botella identificada como “FILTERED SAMPLE”, con el
número de estación y profundidad.

441
9.2. Preparación de sustratos y productos.
Las soluciones Standing Stock (SS) de los sustratos y productos deben ser
descongeladas a temperatura ambiente. A partir de estas soluciones SS,
se obtendrán volúmenes adecuados de las soluciones de trabajo (WS)
mediante dilución en agua MilliQ. Las soluciones de trabajo se
distribuirán en pocillos de una microplaca denominada “master plate”,
que será mantenida a 4ºC hasta su uso.

9.3. Mezcla de soluciones de trabajo con la muestra.


El análisis de la actividad enzimática de una muestra de agua se
realizará en una o más microplacas, que serán denominadas teniendo
en cuenta el número de estación, la profundidad, el tipo de estudio a
realizar, la presencia de muestra Total y/o Filtrada, el tipo de actividad
analizado y, por último, la temperatura a la que debe ser incubada la
placa.
A cada uno de los pocillos de estas microplacas se añadirán:
• 10 μl de WS, procedentes de la “master-microplate”
• 240 μl de muestra, Total o Filtrada.

442
9.4. Medida de la fluorescencia de la muestra.
Una vez preparada la placa, se realizará la primera medida de
fluorescencia en los pocillos mediante el lector de microplacas Synergy
2. Una vez realizada la medida, las placas se incubarán a la
temperatura adecuada hasta las siguientes medidas de fluorescencia,
que se realizarán al cabo de 12h, 24h y 48 h.

Para realizar una medida de fluorescencia de los pocillos de la placa, se


debe generar un “experimento” basado en un protocolo específico
para el tipo de medida que se desee realizar:
• Abrir el programa Gen 5
• Abrir “crear un experimento”
• Escoger un protocolo específico del tipo de medida que
queramos realizar. Por ejemplo, el protocolo “PsT” se refiere a los
perfiles de profundidad en los que se mide actividad potencial.

443
• Salvar el experimento con el mismo nombre que la microplaca a
analizar. Salvarlo en la carpeta designada para esa estación.
• En la pantalla aparecerá:

a. Clicar el icono Plate 1 (Æ 1) Aparece en la pantalla un


esquema de la placa
b. Clicar el icono “READ” (Æ 3). Escriba cualquier observación
que desee en el diálogo que aparece
c. Clicar “READ”. Se abre la portilla del lector.
d. Colocar la microplaca. Quitar la tapa.
e. Clicar OK
f. Las medidas finalizan cuando la portilla se abre de nuevo.
g. Retirar la microplaca, y colocar su tapa. Cierre la portilla
pulsando el “carrier eject button” dellector.
h. Salvar el experimento (Æ 5)
A lo largo de la incubación, se realizarán lecturas al cabo de:
• 12 horas: realizar la lectura en la Plate 2
• 24 horas: realizar la lectura en la Plate 3
• 48 horas: realizar la lectura en la Plate 4

Al término de las lecturas, clicar Power Export (Æ 4), y salvar el archivo


Excel resultante con el mismo nombre que el experimento, y en la misma
carpeta.

444
10. Cuadro sinóptico de la técnica

11. Calculo de los resultados.


El proceso de cálculo se esquematiza a continuación:
• Analizar replicados para la detección y supresión de “outliers”.
• Calcular el incremento de fluorescencia en cada pocillo a lo
largo de las 48 horas de incubación
• Establecer la linealidad de las medidas
• Calcular el incremento de fluorescencia en cada pocillo por hora
• Calcular los valores medios de incremento de fluorescencia por
hora para cada análisis
• Calibrar la determinación de unidades de fluorescencia frente a
la concentración de los productos
• Convertir las unidades de fluorescencia en concentración de
producto generado

12. Control de calidad


El Control de Calidad de la técnica presenta dos vertientes: la
Cualificación del lector, y el Control de Calidad de sustratos y
productos.
Cualificación del lector
1. Encender el lector de placas y el ordenador portátil
2. La lámpara del lector debe estar en funcionamiento al menos
media hora antes de realizar cualquier acción
3. Abrir (doble click) el programa Gen 5

445
4. Seleccionar “System Test”. El aparato realiza un autochequeo del
motor, lámpara y varios subsistemas. Tarda unos 3 minutos.
5. Al término del test, aparece en la pantalla un cuadro de diálogo,
requiriendo información adicional. Introducir el nombre del usuario
y cualquier dato que se considere relevante
6. El informe aparece en la pantalla. Dirigirse hacia el final del
informe, donde aparecerá:
a. “System Test Pass”. En test es correcto.
b. “System Test Error: xx error detected”. En este caso,
i. Buscar el tipo de error indicado en el Manual, e
intentar solucionarlo
ii. Repetir el System Test
iii. Si se mantiene el error, contactar conel servicio de
asistencia técnica de Biotek (teléfono 802 655 4740, e-
mail: TAC@biotek.com)
7. Salir de Gen 5.

Control de Calidad de Sustratos y Productos


1. Encender el lector de placas y el ordenador portátil
2. Preparar una microplaca, denominada Quality Control (QC) que
contenga 10 μl de las soluciones de trabajo indicadas distribuidas
según el esquema siguiente:

QC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A LC-L LC-L LC-L LC-L MCA-C1 MCA-C1 MUF-C1 MUF-C1
B LC-P LC-P LC-P LC-P MCA-C2 MCA-C2 MUF-C2 MUF-C2
C LC-G LC-G LC-G LC-G MCA-C3 MCA-C3 MUF-C3 MUF-C3
D LC-C LC-C LC-C LC-C MCA-C4 MCA-C4 MUF-C4 MUF-C4
E

3. Añadir 240 μl de agua (puede utilizarse agua de mar sobrante de


experiencias previas) en los pocillos.
4. Realizar una medida de fluorescencia de los pocillos de la placa,
utilizando el protocolo definido como QC:
a. Abrir el programa Gen 5
b. Abrir “crear un experimento”
c. Escoger el protocolo “QC”
d. Salvar el experimento como “QC-fecha”. Salvarlo en la
carpeta designada para los QC.
e. En la pantalla aparecerá:

446
f. Clicar el icono Plate 1 (Æ 1) Aparece en la pantalla un
esquema de la placa
g. Clicar el icono “READ” (Æ 3). Escriba cualquier observación
que desee en el diálogo que aparece
h. Clicar “READ”. Se abre la portilla del lector.
i. Colocar la microplaca. Quitar la tapa.
j. Clicar OK
k. Las medidas finalizan cuando la portilla se abre de nuevo.
l. Retirar la microplaca, y colocar su tapa. Cierre la portilla
pulsando el “carrier eject button” dellector.
m. Salvar el experimento (Æ 5)
n. Clicar Power Export (Æ 4), y salvar el archivo Excel resultante
con el mismo nombre que el experimento, y en la misma
carpeta.
En el Excel aparecerá el resultado de tres Tests:
• Test de preparación de sustratos: chequea la correcta
concentración de los mismos. Color verde: OK. Color rojo:
preparación incorrecta, deberían ser preparados de nuevo.
• Test de manipulación de muestras: chequea la correcta
manipulación de las alícuotas. Color verde: OK. Color rojo:
manipulación incorrecta, revisar pipetas, puntas, etc…
• Test de productos: chequea la correcta preparación de los m
ismos. Color verde: OK. Color rojo: preparación incorrecta,
deberían ser preparados de nuevo.

13. Referencias

1- Hoppe H-G .1983. Mar. Ecol. Prog. Ser. 11: 299-308.


2- Benner R, Pakulski JD, McCarthy M, Hedges I, Hatcher PG. 1992.
Science 255: 1561-1564.
3- Chrost RJ. 1993. In: Trends in Microbial Ecology, SEM pp401-106.
4- Hoppe et al. 1988. Appl. Environ. Microbiol. 54: 784-790.
5- Flint KP, Hopton JW. 1977. Eur. J. Appl. Microbiol. 4: 195-204
6- Berman T. 1988. J. Plankton Res. 10: 1239-1249
7- Hoppe H-G.1993. In: Handbook of methods in aquatic microbial
ecology (Kemp et al. Eds.) Lewis.

447
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de preparación de muestras para recuentos por


epifluorescencia de microorganismo, categorizados en los siguientes
grupos:
a) plancton procariota heterotrófico
b) plancton procariota fototrófico (picocianobacterias)
c) plancton picoeucariota heterotrófico
d) plancton picoeucariota fototrófico

2. Titulo de la técnica

Muestreo para recuentos de microorganismos por epifluorescencia.

3. Autores del documento y filiación

Ramon Massana
ICM

4. Finalidad. Campo de aplicación

Los filtros preparados se inspeccionarán en microscopía de


epifluorescencia para observar, categorizar y cuantificar distintos grupos
microorganismos planctónicos que no son observables por microscopía
óptica con luz transmitida, ya que son demasiado pequeños. Los
microorganismos se agruparán en 4 grandes grupos, plancton
procariota heterotrófico y fototrófico (picocianobacterias), y plancton
picoeucariota heterotrófico y fototrófico. Para cada grupos se harán
distintas clases de tamaño y se anotarán las principales características
morfológicas (tamaño, forma y número de cloroplastos etc...). Algunos
de estos grupos también son cuantificables por citometría de flujo,
técnica que es mucho más rápida pero menos informativa a nivel
cualitativo. Ambas técnicas son claramente complementarias y se
compararán en todo momento, de manera que se podrá optimizar el
nivel de esfuerzo en los recuentos de epifluorescencia. Además, los
flagelados heterotróficos son difícilmente cuantificables por citometría
de flujo, y los protocolos propuestos (Rose et al. 2004; Zubkov & Tarran
2008) todavía no son de uso general, por lo cual deben ser comparados
por recuentos directos por epifluorescencia.

5. Conceptos generales

Los microorganismos son muy importantes para los sistemas marinos a


distintos niveles, y son un componente central del proyecto Malaspina.
Obviamente, su importancia está inicialmente canalizada por su
abundancia y biomasa, parámetros que, especialmente para los

448
picoeucariontes heterotróficos, sólo pueden obtenerse fielmente por
microscopía de epifluorescencia. Ésta es una técnica clásica en
ecología microbiana (Porter & Feig, 1980; Sherr & Sherr 1993) y es
ampliamente utilizada por la mayoría de laboratorios que trabajan en
microbiología marina.

6. Equipamiento necesario

Las muestras se toman directamente de las botellas oceanográficas


convencionales de 12L de capacidad montadas en una roseta
oceanográfica. Tras la fijación de las muestras, es necesario un equipo
de filtración múltiple (para filtros de 25 mm) equipado con embudos de
extensión para 100 ml de muestra y una bomba de vacío, con el fin de
conseguir un procesado rápido de las muestras.

Bomba de vacío Equipo de filtración múltiple

7. Reactivos u otro material fungible

Glutaraldehido al 10%, frío


Se diluye el glutaraldehido comercial (25%) con agua milliQ (450 ml de
agua milliQ + 300 ml de glutaraldehido 25%), se filtra por 0.2 µm y se
guarda a 4°C

DAPI (0.5 mg ml-1)


Añadir 1 ml de agua milliQ a 10 mg de DAPI (dentro de la botella
comercial).
Mezclar, transferir a un tubo de Falcon de 50 ml. Añadir 1 ml más a la
botella comercial. Repetir el proceso hasta diluir los 10 mg en 20 ml.
Filtrar por 0.2 µm, alicuotar en 0.5 ml en tubos, y guardar a -20°C en
oscuridad. Evitar congelar y descongelar muchas veces

8. Calibración

Los recuentos dependen del área observada del microscopio, que se


deberá calibrar con un porta-micrómetro.

449
9. Descripción de la Técnica

a) Fijar la muestra
- Fijar con 10% glutaraldehido frío (1% concentración final). En
superficie, 27 ml de muestra y 3 ml de fijador; en mar profundo 180
ml con 20 ml
- Guardar las muestras fijadas a 4°C en oscuridad entre 1-24 horas
antes de preparar los filtros

b) Preparación de filtros para procariotas


- Colocar un filtro de acetato de celulosa de 0.8 µm (25 mm
diámetro) en el sistema de filtración y añadir unas gotas de agua
milliQ
- Colocar un filtro de policarbonato de 0.2 µm encima del filtro de
acetato de celulosa
- Añadir la muestra (5 ml en superficie; 20 ml en profundidad).
Filtrar hasta reducir el volumen a 5 ml en todas las torres de
filtración. Añadir 50 µl de DAPI (0.5 mg ml-1). Dejar 3 minutos en
oscuridad y filtrar
- Colocar el filtro en un porta, añadir una gota de aceite de
inmersión no fluorescente, y cubrir con un cubreobjectos
- Marcar el porta con el nombre y volumen de la muestra

c) Preparación de filtros para picoeucariotas


- Colocar un filtros de acetato de celulosa de 0.8 µm (25 mm
diámetro) en el sistema de filtración y añadir unas gotas de agua
milliQ
- Colocar un filtro de policarbonato de 0.6 µm encima del filtro de
acetato de celulosa
- Añadir la muestra (30 ml en superficie; 200 ml en profundidad).
Filtrar hasta reducir el volumen a 5 ml en todas las torres de
filtración. Añadir 50 µl de DAPI (0.5 mg ml-1). Dejar 3 minutos en
oscuridad y filtrar
- Colocar el filtro en un porta, añadir una gota de aceite de
inmersión no fluorescente, y cubrir con un cubreobjectos.
- Marcar porta con el nombre y volumen de la muestra

D) Almacenaje de las muestras a bordo


- Colocar los portas en caja de preparación de filtros a -20°C.

10. Cuadro sinóptico de la técnica

450
11. Calculo de los resultados.

La concentración de cada grupo se calculará multiplicando el número


de organismos observados por el factor de microscopio (relación entre
área filtrada y el área observada), y dividiendo por el volumen filtrado y
el factor de dilución de la fijación (10/9)
12. Control de calidad

Los recuentos de epifluorescencia dan valores robustos que en general


tienen que estar dentro del rango de valores esperados. El error típico
de los recuentos es alrededor del 10%

13. Referencias

Porter, K. G. & Y. S. Feig. 1980. The use of DAPI for identifying and counting aquatic
microflora. Limnol. Oceanogr. 25:943-948.
Rose, J.M., D.A. Caron, M.E. Sieracki & N. Poulton. 2004. Counting heterotrophic
nanoplanktonic protists in cultures and aquatic communities by flow cytometry. Aquat.
Microb. Ecol. 34:263-277
Sherr, E.B. & B.F. Sherr. 1993. Preservation and storage of samples for enumeration of
heterotrophic protists. In: P.F. Kemp, B.F. Sherr, E.B. Sherr & J.J. Cole (eds.), Handbook of
Methods in Aquatic Microbial Ecology, Lewis Publishers, Boca Raton, pp. 207-212
Zubkov, M.V. & G.A. Tarran. 2008. High bacterivory by the smallest phytoplankton in the
North Atlantic Ocean. Nature 455:224-227

451
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento _

“Fijación y Procesado de muestras”

2. Titulo de la técnica

Determinación de la actividad bacteriana mediante la


incorporación de leucina radioactiva

3. Autores del documento y filiación

Josep M Gasol, ICM-CSIC pepgasol@icm.csic.es


Xelu A. G. Morán, IEO-Gijón xelu.moran@gi.ieo.es

4. Finalidad. Campo de aplicación

Se trata de determinar la actividad heterotrófica global de bacterias y


arqueas por medio de la incorporación de leucina radioactiva. El
protocolo tiene dos partes:
- recogida de muestras, incubación y mantenimiento
- análisis.

El análisis puede efectuarse en el barco o en el laboratorio.

5. Conceptos generales

El protocolo que seguimos está muy bién desarrollado en las


publicaciones siguientes:

• Kirchman, D.L. 1993. Leucine incorporation as a measure of biomass


production by heterotrophic bacteria. Pp 509-512, in: P.Kemp, B.F. Sherr,
E.B. Sherr & J.J. Cole (eds). Handbook of Methods in Aquatic Microbial
Ecology. Lewis Publ.
• GASOL, J.M. 1999. How to measure bacterial activity and production
with the uptake of radiolabeled leucine. Dirección web:
ftp.icm.csic.es/pub/gasol/Manuals/ProdBact/Leucine.htm

452
6. Equipamiento necesario

• Centrífuga refrigerada para tubos eppendorf


• Vórtex
• Pipetas para dispensado de muestras
• Dispensadores de cócktail y TCA
• Sistema de aspiración de líquidos
• Contador de centelleo

7. Reactivos u otro material fungible

• Eppendorfs de 1.2 mL
• Solución de TCA 50% (sigma)
• Solución de leucina radioactiva, a 120-150 mCi mmol-1, llevada a 1 µM
con MilliQ. Esta solución puede diluirse al 10% con MilliQ para ahorrar.
• Tips estériles
• Cajas para material potencialmente radioactivo
• Racks para los eppendorfs
• Solución de TCA al 5%
• Cocktail de centelleo Optisafe HiSafe (Wallac-PerkinElmer)
• Bandejas, bolsas de plástico, etc necesario para trabajar con
radioactividad y guardar los residuos sólidos.

8. Descripción de la Técnica

453
9.1- Recogida de muestra e incubación
- Se toman 6 veces 1.2 ml de la muestra y se depositan en 6 eppendorfs,
marcados con un num, y las letras de la a a la f. Se fijan las réplicas e y f
con 120 µl de la solución de TCA50%.
- Se ponen en cada eppendorf 24 µl de Leucina 1 µM (conc. Final, 20
nM). La solución puede ser “caliente” (sin diluir en MilliQ) o “tibia” diluída
p.ej. 10% en MilliQ.
- Se cierran las muestras y se vortexan.
- Se incuban entre 1 h y 10 horas a la tempreatura in situ. Anotar tiempo
de comienzo de la incubacion y temperatura escogida.
- Terminada la incubación, se pone 120 µl de TCA 50% en las muestras a
a d.
- las muestra se guardan congeladas.

9.2- Análisis en el barco


- Se dejan descongelar las muestras.
- Se centrifugan las muestras 10’ a 10.000 rpm. Se aspira el
sobrenadande., se le añade 1 ml de TCA 5% y se vortexan de nuevo.
- Se centrifugan otra vez, se aspira el sobrenadante, y se pone 1 ml de
cóctail de centelleo.
- Se vortexan de nuevo, y se ponen a reposar 24 h. Se reanalizan al día
siguiente en el contador de centelleo.

9. Cuadro sinóptico de la técnica

454
Smith & Azam's Leucine method
1 Put 1.2 ml of sample in 6 eppendorfs (labelled a through f)
Add 120 μl TCA 50% to controls (e & f)
Add 40 nM *leucine to all of them (48 μl of 1μM solution)
(add leucine concentration depending on saturation curve)
Vortex
Incubate (1 to 4 h) initial time

Write
{ incubation temp.
amount of leucine added
leucine batch name
sample volume

2 Add 120 μL TCA 50% to samples a through d


Vortex
Spin 10 min. 12000 g
Aspirate water. Make sure no water is left on cap

3 Add 1 mL TCA 5%
Vortex
Spin 10 min. 12000 g
Aspirate

4 Add 1 mL of cocktail
Vortex
Place in 22 mL vial and put to count (Program #3)

10. Calculo de los resultados.

- Con el tiempo y el volumen se calculan los “incorporation rates”

mmols Leu L-1 h-1 = (4.5 10-13) * (dpm sample - dpm blank) * (SA)-1 * (T)-1 *
(V)-1

- factor 4.5 10-13 es el num de curies por dpm (una constante)


- SA: Actividad específica de la solución en curies por mmol.
- T: Tiempo de incubación en horas
- V: Volúmen de incubación en Litros.

- Cálculo de la producción con los valores de la literatura:

mgC L-1 h-1 = Leu (mmols Leu L-1 h-1) * 131.2 * (%Leu)-1 * (C:Protein) * ID

- 131.2 peso molecular de la leucina

455
- %Leu proporción de leucina en la proteïna total, se asume que es
0.073 (Simon & Azam 1989).
- C:Prot relación de C a proteína. Se asume que es 0.86 (Simon & Azam
1989).
- ID: Dilución del isótopo. Se asume que es 1 en aguas oligotróficas, y 2
en aguas mesotróficas.

11. Control de calidad


- La gráfica presenta los valores medidso en la literatura en el oceano
profundo:

(de Arístegui et al. 2009). Dividir producción por 12 para tenerlo en mols
C.

12. Referencias
Allman, R., A.C. Hann, R. Manchee and D. Lloyd. 1992. – Characterization
of bacteria by multiparameter flow cytometry. J. Appl. Bacteriol., 73:
438-444.
Bjørnsen, P K, Kuparinen, J. 1991. Determination of bacterioplankton
biomass, net production and growth efficiency in the Southern
Ocean. Mar. Ecol. Prog. Ser. 71: 185-194 .
Ducklow, H W, Carlson, C A. 1992. Oceanic bacterial production. Adv.
Microb. Ecol. 12: 113-181.
Ducklow, H W, Kirchman, D L, Quinby, H L. 1992. Bacterioplankton cell
growth and macromolecular synthesis in seawater cultures during the

456
North Atlantic spring phytoplankton bloom, May, 1989. Microbial
Ecology. 24: 125-144.
Hollibaugh, J.T. and P.S. Wong. 1992. Ethanol-extractable substrate pools
and the incorporation of thymidine, L-leucine, and other substrates by
bacterioplankton. Can. J. Microbiol. 38: 605-613
Jeffrey, W H, R von Haven, M P Hoch and R B Coffin. 1996.
Bacterioplankton RNA, DNA, protein content and relationships to rates
of thymidine and leucine incorporation. Aquat. microb. Ecol. 10: 87-95.
Jørgensen, N O G. 1992. Incorporation of [3H] leucine and [3H] valine into
protein of freshwater bacteria: field applications. Appl. Environ.
Microbiol. 58: 3647-3653.
Kirchman 1993. Leucine incorporation as a measure of biomass
production by heterotrophic bacteria. pp. 509-512 In: Kemp, PF, Sherr,
BF, Sherr, EB and Cole, JJ. Handbook of methods in Aquatic Microbial
Ecology. Lewis Pub.
Kirchman, D L, Hoch, M P. 1988. Bacterial production in the Delaware Bay
estuary estimated from thymidine and leucine incorporation rates.
Appl. Environ. Microbiol. 45: 169-178.
Kirchman, D L, Newell, S Y, Hodson, R E. 1986. Incorporation versus
biosynthesis of leucine: implications for measuring rates of protein
synthesis and biomass production by bacteria in marine systems. Mar.
Ecol. Prog. Ser. 32: 47-59.
Kirchman, D L. 1990. Limitation of bacterial growth by dissolved organic
matter in the subarctic Pacific. Mar. Ecol. Prog. Ser. 62: 47-54
Kirchman, D L. 1992. Incorporation of thymidine and leucine in the
subarctic Pacific: application to estimating bacterial production. Mar.
Ecol. Prog. Ser. 82: 301-309.
Kirchman, D L., R E Murray, R E Hodson. 1986. Rates of protein synthesis by
heterotrophic bacteria in aquatic environments: A comparison
between the thymidine and leucine approaches. Proc. IV ISME 631-
637.
Kirchman, D, K'nees, E, Hodson, R. 1985. Leucine incorporation and its
potential as a measure of protein synthesis by bacteria in natural
aquatic systems. Appl. Environ. Microbiol. 49: 599-607.
Kirchman, D, Soto, Y, Van Wambeck, F, Bianchi, M. 1989. Bacterial
production in the Rhône River plume: effect of mixing on relationships
among microbial assemblages. Mar. Ecol. Prog. Ser. 53: 67-275.
Kirchman, D.L. & H.W. Ducklow. 1993. Estimating conversion factors for
the thymidine and leucine methods for measuring bacterial
production. pp. 513-517 In: Kemp, PF, Sherr, BF, Sherr, EB and Cole, JJ.
Handbook of methods in Aquatic Microbial Ecology. Lewis Pub.
Kirschner, A.K.T. and B. Velimirov. 1999. Modification of the 3H-leucine
centrifugation method for determining bacterial protein synthesis in
freshwater samples. Aquat. Microb. Ecol. (in press).

457
Riemann, B, Azam, F. 1992. Measurements of bacterial protein synthesis in
aquatic environments by means of leucine incorporation. Mar.
Microb. Food Webs. 6: 91-105
Riemann, B, Bell, R T, Jørgensen, N O G. 1990. Incorporation of thymidine,
adenine and leucine into natural bacterial assemblages. Mar. Ecol.
Prog. Ser. 65: 87-94.
Simon, M and Azam, F.1989. Protein content and protein synthesis rates
of planktonic marine bacteria. Mar. Ecol. Prog. Ser. 51: 201-213.
Simon, M, Welschmeyer, N A, Kirchman, D L. 1992. Bacterial production
and the sinking flux of particulate organic matter in the subarctic
Pacific. Deep-Sea Res. 39: 1997-2008
Simon, M. 1990. Improved assessment of bacterial production: combined
measurements of protein synthesis via leucine and cell multiplication
via thymidine incorporation. Arch. Hydrobiol. Beih. Ergebn. Limnol. 34:
151-155
Smith, D.C. & F. Azam. 1992. A simple, economical method for measuring
bacterial protein synthesis rates in seawater using 3H-leucine. Mar.
Microb. Food Webs 6: 107-114.
Snyder, R.A., R.D. Robarts, D.E. Caldwell. 1994. (methyl-3H)thymidine and
(3H)leucine incorporation in Vibrio spp. grown in nutrient limited
continuous cultures. Can. J. Microbiol. 40: 375-381
van Looij, A, Riemann, B. 1993. Measurements of bacterial production in
coastal marine environments using leucine: application of a kinetic
Approach to correct for isotope dilution. Mar. Ecol. Prog. Ser. 102: 97-
104.
Wicks, R J, Robarts, R D. 1988. Ethanol extraction requirement for
purification of protein labeled with [3H]Leucine in aquatic bacterial
production studies. Appl. Environ. Microbiol. 54: 3191-3193.

458
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Metodología de muestro
2. Titulo de la técnica
Respiración mediante cambios in vitro de la concentración de O2
3. Autores del documento y filiación
Ignacio P. Mazuecos e Isabel Reche. Departamento de Ecología
Facultad de ciencias, Universidad de Granada.
Javier Arístegui. Instituto de Oceanografía y Cambio Global, Universidad
de Las Palmas de Gran Canarias.
Evaristo Vázquez-Domínguez* y Josep M. Gasol. Departamento de
Biología Marina y Oceanografía, Instituto de Ciencias Marinas – Centro
Mediterráneo de Investigaciones Marinas y Ambientales (ICM-CMIMA),
CSIC.
Eva Ortega-Retuerta Laboratoire d’Oceanographie Microbienne,
Banyuls/mer (France).

* Dirección actual: Instituto Español de Oceanografía. Centro


Oceanográfico de Gijón.

4. Conceptos generales

El oxígeno es un elemento directamente relacionado al


metabolismo aeróbico de los organismos vivos. Este elemento es
metabolizado en reacciones anabólicas tales como la fotosíntesis y en
reacciones catabólicas como la respiración. Por tanto, la
determinación de su concentración en medio acuático proporciona
información muy valiosa sobre los procesos biológicos que allí ocurren.

Fotosíntesis ->
6CO2 + 6H20 <-> [C6H12O6] + 6O2
<- Respiración

459
5. Finalidad. Campo de aplicación
Aunque la determinación de oxígeno disuelto en muestras de
agua fue descrita por primera vez en el siglo XIX (Winkler 1888), las
medidas de metabolismo planctónico basadas en cambios en la
concentración de oxígeno no fueron introducidas hasta el inicio del siglo
XX por Gardner & Gran (1927). Esta técnica está basada en que las
muestras de agua son cuidadosamente introducidas en botellas DBO
(Demanda Biológica de Oxígeno). Varias de estas botellas son usadas
para establecer la concentración inicial de oxígeno (Botellas Iniciales;
Bi), mientras que otra serie de botellas son incubadas bajo condiciones
in situ durante aproximadamente 24 - 72 h (Botellas Oscuras: Bo). En los
experimentos de respiración, las botellas son incubadas en oscuridad y
las medidas de respiración son obtenidas, bien mediante la diferencia
en la concentración de oxígeno entre el tiempo inicial y final del
experimento, o mejor como la pendiente de la recta de regresión de la
disminución de oxígeno a lo largo del tiempo. Para evitar problemas de
interacción entre la fase acuosa y la atmósfera es muy importante que
las botellas estén completamente sumergidas en agua (por encima del
tapón) durante la incubación. Si no, podría haber intercambio de gases
entre el aire y el agua de la botellas (por diferencias en la presión
parcial de los gases), creándose burbujas de aire que alterarían la
concentración de oxígeno, o el volumen real de líquido a analizar.
La concentración de oxígeno disuelto en agua marina es definida
como el número de micromoles de di-oxígeno (O2) por kg de agua
marina (µmol kg-1).

6. Equipamiento necesario
Desde que Winkler (1988) describiese un método químico para la
determinación de oxígeno disuelto, este método ha sido uno de los más
usados, no solo por su simplicidad y bajo coste sino también debido a su
precisión. Durante la campaña Malaspina se utilizará para el análisis de
oxígeno disuelto un sistema micro-Winkler comercial (DOA Sis),

460
automatizado, con detección colorimétrica del punto final, basado en
el sistema descrito por Williams & Jenkinson (1982), y las
recomendaciones ofrecidas por Carpenter (1965) y Carrit & Carpenter
(1966). El método Winkler está basado en que el oxígeno de las
muestras de agua marina oxida el ion yoduro a yodo y la cantidad de
yodo generado es determinado mediante titración con una solución
estándar de tiosulfato sódico. El punto final de la titración se determina
mediante el método colorimétrico, y la cantidad de oxígeno disuelto es
calculada a partir del volumen de tiosulfato añadido durante la titración
hasta alcanzar el punto final.

Sistema DOA de análisis de


oxígeno disuelto.

1.- Diodo para estimar la


concentración de iodo y
absorbancia de las botellas

2.- Fotomultiplicador

3.- Controlador

461
7. Descripción de la Técnica
Las reacciones que tienen lugar para la determinación de la concentración
de oxígeno disuelto son las siguientes:
Una vez añadidos el reactivo 1 -sulfato de manganeso o cloruro de
manganeso (MnSO4 o MnCl2)- y el reactivo 2 -solución alcalina de yoduro sódico
(NaOH + NaI), las botellas son cerradas cuidadosamente (evitando aparición de
burbujas) y vigorosamente agitadas (para facilitar la reacción). El oxigeno disuelto
químicamente reacciona con Mn(OH)2 en un fuerte medio alcalino resultando en
un precipitado marrón de Mn(OH)3. Después de la fijación y precipitación
completa del oxígeno, las botellas permanecen en reposo (bajo el agua) unas
horas antes de su análisis. Previamente al análisis, la muestra son acidificada a pH
2.5 – 1.0. Esto hace que los hidróxidos precipitados sean disueltos, liberando Mn+3.
Los iones Mn+3 oxidan el yoduro (I-) a yodo (I2). El yodo forma un complejo con el
exceso de los iones yoduro. Entonces el yodo es determinado mediante titulación
con tiosulfato (S2O3-2). Donde el yodo es reducido a yoduro (cambiando de color
de amarillo a transparente) y el tiosulfato es oxidado a tetrationato (S4O6-2).

1) Mn+2 + 2 OH- Mn(OH)2


2) 2Mn(OH)2 + ½ O2 + H2O 2Mn(OH)3
3) 2Mn(OH)3 + 2 I- + 6 H+ 2Mn+2 + I2 + 6 H2O
4) I2 + I- I3-
5) I3- + 2S2O3-2 3I- + S4O6-2

La fijación de oxígeno es una reacción muy rápida debido a la


inestabilidad del Mn+2 en medio alcalino.
El método está descrito con detalle en Strickland & Parsons (A Practical
Handbook of Seawater Analysis, Bull. Fish. Res. Bd Canada, 1968, no 167, 2nd ed.)

462
8. Calibración del volumen de las botellas DOB
Para determinar el volumen exacto de las botellas de borosilicato DBO, se
deben pesar vacías y llenas de agua milli-Q (controlando la temperatura del
agua) en una balanza de alta precisión (300 ± 0.0001g). El volumen se determina
a partir de la diferencia de ambos pesos, corrigiendo para el coeficiente de
expansión de borosilicato, obtenido a partir de la densidad del agua (Kell, 1975).
La calibración del volumen de las botellas DBO debe ser realizado de forma muy
precisa, ya que la precisión del método depende de ello.

9. Recogida y fijación de O2 en las muestras de agua marina

Llenar las botellas DBO


homogéneamente a través de un tubo de
silicona que actúa como sifón. Fijar el oxígeno
disuelto en el agua de las botellas mediante la
adición de 1 ml de sulfato de manganeso
(MnSO4) y 1 ml de solución alcalina de yoduro
sódico (NaOH + NaI). Se genera un precipitado
de hidróxido de manganeso. Las botellas son
agitadas hasta que el precipitado de hidróxido
de manganeso es dispersado uniformemente
(figura adjunta). Las botellas deben de reposar unas horas antes de ser valorado
el O2 disuelto. La concentración de O2 de las Bi es fijada a 0 h y en las Bo el
oxígeno es fijado a cada tiempo de muestreo.

10. Estandarización del tiosulfato

El tiosulfato puede cambiar su composición y, como consecuencia, es


necesario estandarizarlo antes de cada análisis. Para este propósito se utiliza una
solución estándar de yodato potásico (KIO3). Bajo condiciones ácidas el yodato
reacciona con los iones yoduro hacia yodo, el cual es titrado con tiosulfato.

463
IO3- + 8I- +6H+ 3I3- + 3H2O
I3- + 2S2O3-2 3I- + S4O6-2
Cada vez que se preparan reactivos nuevos, el tiosulfato también se debe
estandarizar con yodato potásico. Para la estandarización se añaden los
reactivos en orden inverso: primero añadir H2SO4, seguido por la solución alcalina
de yoduro potásico (reactivo 2) y por último se añade el sulfato de manganeso
en agua milli-Q o agua marina (reactivo 1). Después se añade la solución
estándar de yodato potásico. El yodo es valorado con la solución de tiosulfato
apropiada y la molaridad es calculada como sigue:

Mt = (Vi x Mi x 6) / Vt
Donde Mt: molaridad del tiosulfato (M), Vt: volumen de tiosulfato añadido
(nl), Vi: volumen de estándar de iodato potásico añadido (ml) y Mi: molaridad del
estándar del iodato (M).
11. Blancos
Para probar que los reactivos están en buenas condiciones, se debe valorar
algún blanco alternando con las muestras. Para los blancos, los reactivos son
añadidos de forma inversa, similar a la anterior excepto el estándar de yodato
potásico. Los resultados de la titulación deberían ser ~ 0, de lo contrario su valor
debe ser restado al valor de las muestras.

12. Titración de las muestras y calculo de resultados


Antes de la titulación, añadir H2SO4 y agitar homogéneamente. Los
precipitados de hidróxido de manganeso son dispersados y la solución de yodo es
titulada con tiosulfato sódico usando un microprocesador controlado por el
detector fotométrico Winkler (Williams & Jenkinson 1982). La bureta dispensa 0.2 µl
de reactivo (tiosulfato) durante los pasos finales de la detección del punto final.
Entonces, la media y los errores estándar de las botellas oscuras Bo y las
botellas iniciales Bi son obtenidos y los valores de respiración calculados como
sigue:
R = Bi – Bo
Donde R = Respiración en µM, µmoles O2 L-1.

464
Referencias
- Carrit, D.E. & Carpenter J.H. Comparison and evaluation of currently employed modification of the
winkler method for determining dissolved oxygen in sea-water. J. Mar. Res. 24: 286-318 (1966).
- Carpenter, J.H. The Chesapeake Bay Institute. Technique for the winkler oxygen method. Limnology
& Oceanography. 10: 141-143 (1965).
- Grasshoff K., Ehrhardt M. & Kremling K. Methods of Seawater Analysis. Grasshoff K., Ehrhardt M. &
Kremling K. eds Verlag Chemie GmbH. 419 pp.
- Kell G.S. Density, Thermal Expansivity, and Compressibility of Liquid Water from 0" to 150°C:
Correlations and Tables for Atmospheric Pressure and Saturation Reviewed and Expressed on 1968
Temperature Scale. Journal of Chemical and Engineering Data 21: 91-105 (1975).
- Strickland J.D.H. & Parsons T.R. Determination of dissolved oxygen in A Practical Handbook of
Seawater Analysis. Fisheries Research Board of Canada, Bulletin, 167: 71-75 (1968).
- Weast R.C. 1973. Handbook of chemistry and physics, 59th Edition 1978-1979. CRC Press.
- Williams P.J.leB. & Jenkinson N.W. A transportable microprocessor-controlled precise Winkler titration
suitable for field station and siphboard use. Limnology & Oceanography, 27 (3): 2843-2855 (1982).

Winkler L.W. Die Bestimmung des in Wasser gelösten Sauerstoffen. Berichte der Deutschen
Chemischen Gesellschaft. 21: 2843 – 2855 (1888).

465
1. Tipo de técnica, análisis o tratamiento

Técnicas analíticas

2. Titulo de la Técnica

Medida de Partículas exopoliméricas transparentes (TEP) en agua marina

3. Autores del documento y filiación

Eva Ortega-Retuerta, Laboratoire d’Oceanographie Microbienne,


Banyuls/mer, France.

Ignacio Pérez Mazuecos, Departamento de Ecología, Universidad de


Granada.

Isabel Reche Cañabate, Departamento de Ecología, Universidad de


Granada.

4. Finalidad. Campo de aplicación.

Protocolo de recogida de muestras de agua marina para el análisis de


TEPs y experimentos de generación de TEP. Las concentraciones de TEPS van a
ser analizadas usando el método colorímétrico propuesto por Passow &
Alldredge 1995. Los TEPs serán analizados a partir de muestras naturales,
aunque tambíen pueden ser analizadas a partir de muestras fijadas con
formalina (~ 1 %).
La importancia de la dinámica de los TEPS ha recibido considerable
atención en los últimos años ya que ellos son un componente importante del
flujo hacia los sedimentos en ecosistemas marinos (Passow 2002 b)

5. Conceptos generales

Dentro de las substancias exopoliméricas (EPS), las partículas


exopoliméricas transparentes (TEP) son partículas de naturaleza adhesiva, y
susceptibles de ser teñidas con azul alcián (Alldredge et al. 1993). Estas
partículas se forman predominantemente por la polimerización abiótica de
precursores disueltos, principalmente mono- y polisacáridos de naturaleza
acídica. Las TEPs son excretadas por microorganismos, tradicionalmente

466
asociados a afloramientos de fitoplancton (Passow & Alldredge 1994; Passow
2000). Sin embrago, el papel de procariotas (bacterias) parece más complejo,
ya que estos son a la vez productores y consumidores tanto de TEPs como de
sus precursores.
De este modo, las TEPs contribuyen de forma significativa en el flujo
descendente de materia orgánica en sistemas marinos, ya que debido a su
alta adherencia actúan como una matriz intersticial generando agregados
macroscópicos, formados por compuestos orgánicos e inorgánicos que son
conocidos como “nieve marina”. La formación y sedimentación de nieve
marina es una ruta principal de retirada de carbono de la superficie del
océano hacia aguas profundas (Alldredge et al. 1993, Passow et al. 2001;
Passow 2002).

6. Equipamiento necesario

- Tubo de silicona.
- Botellas Nalgene 2L (de polipropileno).
- Bomba de vacío.
- Rampa de filtración.
- Kitasato de seguridad (de polipropileno) con tapón perforado para
conectar a la bomba.
- Filtros de policarbonato de 0.4 μm de tamaño de poro (Ø 25 mm).
- Pinzas para filtros.
- Pipetas de 1 y 5 ml.
- Botes de vidrio de 20 ml o algo similar para la extracción.
- Espectrofotómetro.
- Cubetas desechables de 1 cm.
- Botes de polipropileno para preparar disoluciones de trabajo y stock
de azul alcián.
- Balanza muy precisa para la calibración (precisión de 0.0001 mg).
- Ionizador.
- Vasos de precipitado 500 ml.

467
- Probeta de 500 ml.
- Filtros de jeringa de 0.2 μm de tamaño de poro.
- Jeringas 10 y 20 ml.
- Frasco lavador para el agua milli-Q.
- Guantes.
- Crioviales de 2 ml para introducir los filtros.
- Cajas de plástico para almacenar los crioviales en el congelador.
- Estadillo de recogida de muestras.
- Libreta de incidencias.
- Material de librería (rotuladores, bolígrafos, lápices,…).
- Bandeja.
- Triturador de tejidos para preparar soluciones patron.

7. Reactivos u otro material fungible

Reactivos:
i. Solución de azul alcián para la tinción de TEPs:
a. Azul alcián
b. Ácido acético
ii. Ácido sulfúrico (80 %) para extracción de azul alcián
iii. Goma de xanyán y ácido algínico para preparación de
curvas de calibración.

Preparación de reactivos

Preparación de la solución stock de Azul alcián: en botes de polipropileno


(PET) de 250 ml donde se habrá pesado anteriormente 0,5 g de azul alcián, se
les añade 48.5 ml de agua milli-Q + 1.5 ml de ácido acético, el resto se
completa con agua milli-Q.

Preparación de la Solución de trabajo (a partir de la anterior): se diluye la


solución anterior 1 : 50. Ejemplo: 20 ml de stock + 980 ml de agua milli-Q. Se

468
filtrará la solución de trabajo por filtros de 0.2 µm desechables (el volumen
aproximado que se necesite para cada día).

8. Calibración

Curva de calibración de goma de xantán (y ácido algínico): Para


calibrar la solución de azul alcián con la cual se teñirán las partículas
exopolimericas de nuestras muestras, se preparará una solución de goma de
xantán (y ácido algínico). Con esta solución se calculará la concentración
exacta de goma de xantán (o ácido algínico) filtrando volúmenes conocidos
(e.g. 1, 2, 4, y 8 ml) a través de filtros de policarbonato de 0.4 µm de tamaño
de poro, que se pesarán antes y después (al menos 3 veces) de la filtración.
Además, se filtrarán volúmenes semejantes (e.g. 1, 2, 4, y 8 ml) y los filtros se
teñirán con azul alcián. Por tanto, se relacionará la absorbancia a 787 nm que
corresponderá a cada cantidad conocida de goma de xantán.

9. Descripción de la técnica

Los TEPs son teñidos con azul alcián. Alcián blue es un grupo de
colorantes básicos polivalentes derivados de la ftalociania que son solubles en
agua. El color azul es debido a la presencia de cobre en la molecula. En una
solución con ácido acético 3 % (PH 2.5), el azul alcián tiñe a los grupos
carboxilados y ester-sulfato de los mucopolisacáridos ácidos. Para los cuales es
uno de los colorantes catiónicos más ampliamente usados. Las partes teñidas
son de color azulado y se crre que forman enlaces salinos con los grupos
ácidos.
Los TEPs son retenidos en filtros de policarbonato de 0.4 µm de tamaño
de poro y entonces son teñidos con una solución de trabajo de azul alcián.
Seguidamente, la concentración de TEP es determinado colorimétricamente
con el espectrofotómetro. Pasos a seguir:

a. Preparación de solución de trabajo de azul alcián.

469
b. Recoger el agua (de la botella Niskin) en botellas de 2 L para cada
profundidad.
c. Filtrar 200-300 ml de muestra (según saturación del filtro) a través de
filtros de policarbonato de 0.4 µm de tamaño de poro. Tres filtros
(réplicas) por profundidad (600-900 ml). Recomendable usar presión
no muy alta (~ 150 mm de Hg) con ritmo constante.
d. Tinción: Teñir el filtro con 0.5 - 1 ml de solución de trabajo de azul
alcián (que cubra completamente). Dejar unos 5 segundos. Volver a
filtrar. Enjuagar con agua milli-Q filtrada por 0.2 µm.
Nota: en este paso los filtros se pueden congelar a – 20 ºC.
e. Por último, los TEPs se analizarán espectrofotométricamente. A los
filtros teñidos con azul alcián se añadirá 5 ml de H2SO4 al 80 % y
después de 2- 3 h se extraerá la absorbancia a 787 nm.

10. Esquema y cuadro sinóptico de la técnica

Filtración y tinción de TEPs

Filtrar 200-300 ml de muestra


3 filtros por profundidad Filtros de policarbonato de 0.4 µm de
tamaño de poro y 25 mm Ø

Añadir 0.5 – 1 ml de
solución de trabajo de
azul alcián

Añadir 5 ml H2SO4 80 %

Después de 2-3 h extraer


la absorbancia a 787 nm

470
11. Calculo de los resultados.

Una vez obtenida la curva de calibración. Esto nos permite


calcular el factor de calibración (que es la pendiente de la curva). Con
este factor de calibración junto con el volumen (L) filtrado de muestra y
los datos de absorbancia (a 787 nm) obtenidos anteriormente podremos
calcular la concentración de partículas exopoliméricas trasnaprentes
(CTEP) expresadas como μg de equivalentes de goma de xantán por litro
(μg XG eq L-1):

CTEP = (Amuestra – Ablanco) V-1 F

Donde Amuestra es la absorbancia de la muestra, Ablanco es la


absorbancia del blanco, V el volumen filtrado de muestra y F es el factor
de calibración. El factor de calibración F es calculado de la siguiente
forma:

F = W x [(A787 – C787) x V-1] -1

Donde F es el factor de calibración, W es la concentración de la


solución de goma de xantán en µg L-1, A787 es la absorbancia del
extracto a 787 nm, C787 es la absorbancia del blanco y V es el volumen
filtrado en L.

12. Control de calidad

Al inicio de cada set de muestras hacer tres blancos (tiñendo filtros


vacíos) o bien solo añadir agua milli-Q o sin añadir nada antes del azul alcián.
El valor de absorbancia (787 nm) de los blancos será sustraido al valor total de
la absorbacnica de las muestras, para eliminar la capacidad del alcian blue
de teñir el filtro vacío.

471
El límite de detección del método es de 2.2 µg de equivalentes de
goma de xantán por litro y el coeficiente de variación es del 13 %.

13. Referencias

1. Alldredge A.L., Passow U. & Logan B.E. The abundance and


significance of a class of a large, transparent organic particles in
the ocean. Deep-Sea Research Part I- Oceanographic Research
papers. 40: 1131 – 1140 (1993).
2. Passow U. & Alldredge A.L. A dye-binding assay for the
spectrophotometric measurement of transparent exopolymer
particles (TEP). Limnology & Oceanography. 40 (7): 1326 – 1335
(1995).
3. Passow U. & Alldredge A.L. Distribution, size and bacterial
colonization of transparent exopolymer particles (TEP) in the
ocean. Marine Ecology-Progress Series. 113: 185 – 198 (1994).
4. Passow U. Formation of transparent exopolymer particles, TEP, from
dissolved precursor material. Marine Ecology-Progress Series. 192: 1
– 11 (2000).
5. Passow U. Production of transparent exopolymer particles (TEP) by
phyto- and bacterioplankton. Marine Ecology-Progress Series. 236:
1 – 12 (2002a).
6. Passow U. Transparent exopolymer particles (TEP)in aquatic
environments. Progress in Oceanography. 55: 287-333 (2002b).
7. Passow U., Shipe R.F., Murray A., Pak D.K., Brzezinski M.A. &
Alldredge A.L. The origin of transparent exopolymer particles (TEP)
and their role in the sedimentation of particulate matter.
Continental Shelf Research. 21: 327 -346 (2001).

472
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Fijación y Procesado de muestras

2. Titulo de la técnica
Determinación de abundancia de virus por citometria de flujo

3. Autores del documento y filiación


Dolors Vaqué, Julia Boras Elena Lara, Elisabet-laia Sa Lago, ICM-CSIC
dolors@icm.csic

4. Finalidad. Campo de aplicación

Se trata de determinar la abundancia de virus por medio de citometría de flujo. El


protocolo tiene dos partes:

•recogida de muestras, fijación y mantenimiento


• análisis por citometría en el laboratorio del ICM de Barcelona.

El análisis puede efectuarse en el barco o en el laboratorio.

5. Conceptos generales

El protocolo que seguimos está muy bién desarrollado en las publicaciones


siguientes:
• Boras JA, Sala MM, Vázquez-Domínguez E, Weinbauer MG, Vaqué D (2009)
Annual changes of bacterial mortality due to viruses and protists in an oligotrophic
coastal environment (NW Mediterranean). Environ Microbiol 11:1181–1193

• Boras JA, Sala MM, Arrieta JM, Sa EL, Felipe J, Agustí S, Duarte CM, Vaqué
D (2010). Effect of ice melting on bacterial carbon fluxes channelled by viruses
and protists in the Arctic Ocean. Polar Biol DOI 10.1007/s00300-010-0798-8.

• Boras JA, Sala MM, Baltar F, Arístegui J, Duarte CM, Vaqué D (2010). Effect
of viruses and protists on bacteria in eddies of the Canary Current region
(subtropical Northeast Atlantic). Limnol Oceanogr 55:885–898.

• Brussaard CPD (2004). Optimisation of procedures for counting viruses by


flow cytometry. Appl Environ Microbiol 70:1506–1513.

6. Equipamiento necesario

473
• Citómetro de Flujo FACSCalibur de Becton & Dickinson
• Vórtex
• Pipetas para dispensado de muestras
• Bidón de nitrógeno líquido.
• Sonicador
• Baños termostatizados (37ºC y 80ºC)

7. Reactivos u otro material fungible

• Fijador: glutaraldehido al 25% (0.5% concentración final)


• Crioviales de 2 mL
• Tubos de citómetro
• Tinción SybrGreen I (Molecular Probes), diluída 10x con agua (Sigma)
• Nitrógeno líquido
• Solución de bolas de látex amarillas de 1 µm a ca. 108 ml-1 (Polysciences).
•Tampón TE

9. Descripción de la Técnica

9.1- Recogida de muestra


- Se toman 1.2 ml de la muestra y se depositan en un criovial. Se fija con 40 µl de
glutaraldehido al 25%
- Aguardar 10 min en oscuridad
- Guardar en nitrógeno líquido.

9.2- Análisis en el laboratorio


—Soluciones a preparar con anterioridad
•Agua Milli-Q recientemente hecha
•SYBR Green I solución de trabajo en alícuotas y guardada a –20ºC (200x diluida
la solución comercial):
a) Dejar la solución comercial a la oscuridad y a la temperatura ambiente.
b) Trabajar a luz difusa. El SYBR Green I es muy sensible a la luz
c) Diluir la solución comercial 200 veces en microtubos esteriles: 5 µl de la
solución stock+ 995µl
d) agua Milli-Q prefiltrada y esteril.
e) Guaradar a -20 ºC.
f) Siempre usar guantes al manipular SYBR Green I.

•TE buffer (10:1 mM Tris:EDTA):


a) primero preparar una solución de 0.5 M EDTA
18,6 g EDTA + 100 ml MQ.

474
Mientras se mezcla con una barra magnetica, ajustar a pH=8, añadiendo
lentamente by NaOH

• Preparar 10x TE Tris:EDTA (100 mM Tris; 10 mM EDTA), 100 ml de volumen final


1,21 g de TRIS + 2 ml de 0,5 M EDTA
añadir MQ hasta 100 ml.
Mientras se mezcla con la barrita magnética, ajustar a pH=8 añadiendo
lentamente HCl (37%).

• Preparar 1x TE buffer Tris:EDTA 10:1 mM:


10 ml of 10x TE y 90 ml de agua MQ recien preparada y esteril.
Mientras se mezcla con la barrita magnética, comprobar el pH=8, si es
necesario, ajustar lentamente añadiendo HCl (37%) or NaOH.

AUTOCLAVAR. Tener cuidado de marcar todo. Si se ha perdido volumene


ajustar con MQ el volumen perdido.

Filtrar el tampon TE por 0.2 µm el dia antes de usarlo

—Como proceder con el FCM

•Encender el FCM. Esperar ca.15 minutos y entonces encender el PC


Encender los baños de 80 ºC y 37 ºC
Sacar la solución stock de SYBR Green I del congelador de-20 ºC y ponerla
en la oscuridad a la temperatura ambiente. Centrifugar la de de a 2
minutos

•Comprobar que los contenedores de fluidos del FC estan correctos.


Vaciar el contenedor de aguas residuales y llenar el de trabajo con agua
Milli-Q.
Llenar el tubo con agua MilliQ esteril y ponerlo place bajo el tubo de
succión de la muestra. Presurizar el flujo del contenedor y poner el FC en
RUN.
Hacer un PRIME tres veces para eliminar burbujas en la cámara. Después
de esto cambiar el tubo

•Limpiar el FC – Poner el tubo con legia y hacerlo correr unos minutos. Cambiar
por un tubo con MilliQ y dejarlo correr otros pocos minutos
Comprobar con MilliQ si el FCM esta limpio: poner un tubo con Milli-Q, y
correr a velocidad MED.

•Abrir el programa “Cell-Quest”:


Conectar el PC con el FC (“Acquire”: “conctar con el citometro”) .

475
Abrir un “modelo” documento para virus y todas las ventanas (“Cytometro”:
“Detectores”,
“umbrales”, “Status”; “Acquire”: “descripción de parámetros”, “contadores”;
“Settings del Instrumento”, escoger los setting para virus, que para nuestro
FCM son:
SSC=625, FL1=530).
En “Acquisition & parameters” seleccionar el tiempo (60) y incrementar el
número de eventos a100 000 para evitar que los recuentos paren antes que
el tiempo escogido/ fijado.
Nombrar el Directorio y el fichero. Si es posible marcar las muestras en orden
continuo.

•Comprobar si el TE utilizado para diluir las muestras esta limpio: poner en un tubo
0,5 ml de TE, y RUN a velocidad MED. “Los eventos por segundo”
normalmente estaran entre 0-15.

•Comprobar la tasa de flujo del FC.


a) Llenar un tubo con 2-3 ml de TE
b) Pesar la muestra (X0)
c) Seleccionar una tasa de flujo media
d) Eliminar el tubo exteriot del sistema de inyeccion (cubrir la aguja). Guardar
la mas fina
y poner de nuevo la rosca gris
e) Esperar hasta que caiga la gota.
f) Poner en marcha el temporizador.
g) Antes que se forme la nueva gota, poner el tubo con muestra cerca del
tubito de aspiración en la posición de “running”. Simultáneamente conectar el
cronómetro.
h) Correr la muestra durante 10-15 minutos a velocidad MED.
i) Cuando el tiempo se termina sacra el tubo y simultáneamente parar el
cronómetro.
j) Pesar el volumen que queda (X1)
k) Calcular la tasa de flujo (FR) utilizando la siguiente formula:

FR= (X1 – X0) / t

donde: t = tiempo (min)

Después de medir la tasa de flujo poner de nuevo la cubierta del manguito


del sistema de inyección, cuidadosamente.

•Preparar vuestro directorio en la ventana BROWSER y la forma impresa donde se


registraran los valores de las muestras que se pasan.

476
•Filtrar la solución autoclavada de TE-buffer por filtros de 0.2 μm antes de usar.

— Preparación del Control


•Preparar el control (blanco que se restará de las muestras):
0.5 ml de TE filtrado + 5 ul of SYBR Green I, incubar 10 min a 80ºC en el baño
termostatizado, y 5 min a temperatura ambiente y a la oscuridad.
•Correr el control a velocidad MED por 1 min.
•Anotar el número de eventos contados en la region de virus del citograma.
Deberian ser de 0-45 ev/seg. El valor del control se restará de los recuentos de la
muestra.

-Procesamiento de Muestras
• Coger 8 muestra del congelador. Las muestras se temperaran en las manos o en
un baño a ~ 37ºC. • El proceso de atemperar la muestra ha de ser rápido, 1-2
minutes para crioviales de 2 ml.
• La muestra no deberia sobrecalentarse.
• Después de atemperar la muestra la medida de la abundancia de virus ha de
ser rápida (la concentración de virus disminuye rápidamente después de
descongelarse).
•Escribir el código de los tubos en una hoja de papel (número del tubo-código de
la muestra).
•Marcar los tubos de trabajo.
•Diluir las muestras en TE. Generalmente las diluciones utilizadas para el recuento
de virus son: 50-100x pero depende del tipo de muestras que se tenga
(frecuentemente puede ser 5-10x).
•Preparar las diluciones de 50x y100x en los siguientes pasos:
a) Dilution I: 450 μl of TE + 50 μl de muestra (10x)
b) Dilution II: 400 μl of TE + 100 μl de “Dilucion I” (50x)
c) Dilution III: 450 μl of TE + 50 μl de “Dilution I” (100x)
• Añadir 5 μl deSYBR Green I a cada tubo. agitar.
• Incubar los tubos 10 min en el baño a 80ºC. Dejarlo 5 min in en la oscuridad a
temperatura ambiente y dejarlo enfriar
• Mezclar la muestra en el tubo e instalarla en el FCM (evitar las gotas del sistema
de inyección).
• Esperar hasta que el voltaje sea estable (en Status window) mas o menos 10
segundos y solamente ENTONCES apretar ACQUIRE. La muestra correrá por 60
seg a la velocidad MED. La media de eventos por segundo debería ser alrededor
de 300-600. Nunca debería ser <75 y >800. Si no es posible alcanzar estos valores,
deberemos cambiar la dilución de la muestra.
• Anotar en la forma impresa después de cada muestra: la velocidad utilizada, el
promedio de eventos por seg, el número total de eventos y los setting utilizados.

477
10. Cuadro sinóptico de la técnica

11. Calculo de los resultados.


-— Análisis de Muestras
•Todos los datos adquiridos en el BROWSER se guardan como archivos de Cell
Quest. A partir de aquí haremos el GATING:
a) Abrir un “Plot Model” para virus.
b) Abrir el “Inspector” (“Windows”: “Show inspector”). Seleccionar“Analisis” en la
ventana “Plot type”. En la ventana “Inspector”, ir a “File” para importar el primer
archivo Cell Quest que se quiera analizar.
c) En los citogramas, cambiar o preparar regiones nuevas alrededor de las
poblaciones que se quieran contar
d) En la “Region” window, marcar cada región con un nombre en “Gates” y
escoger un color. (NOTA: para que se puedan ver los colores se ha de
seleccionara la caja, “multicolor gates” en la ventana “Inspector”).
e) Si aún no se tiene la”statistics region” in el documento, ir a “Statistic” en el
“Menu” y abrir una. f) Allí, se pueden editar los estadisticos que se quieran
guardar
g) Una vez seleccionadas las regiones, ir a “Acquire”: “Acquisition and Storage” y
a “Batch”: “Setup” (seleccionar 60 seg, a un archivo para exportar los estadisticos
statistics, incremento del archivo = 1).
h) Ir a “Batch” y apretar “Run”.
i) Cuando la nueva muestra esta en la pantalla, comprobar si las regiones
concuerdan bien y modificar si es necesario. Cuando se termina, seguir con la
muestra siguiente
j) Transformar este archivo “Batch” en uno de Excel. Abrir el programa EXCEL y
desde allí abrir los archivos y salvarlos como archivos EXCEL.

—Final
•Apagado del citómetro:
a) En“Acquire”: “desconectar desde el citometro”
b)“File”: “Quit”,“Do not save”
c) Poner un tubo con agua MilliQ en el FC, apretar “STANDBY” y TURN OFF la
presión del contenedor de fluido. NUNCA dejar el tubo en Standby con la presión
ON.

12. Control de calidad


La media de eventos por segundo debería ser alrededor de 300-600. Nunca
debería ser <75 y>800. Si no es posible alcanzar estos valores, deberemos cambiar
la dilución de la muestra.

478
13. Referencias
Boras JA, Sala MM, Vázquez-Domínguez E, Weinbauer MG, Vaqué D (2009) Annual
changes of bacterial mortality due to viruses and protists in an oligotrophic coastal
environment (NW Mediterranean). Environ Microbiol 11:1181–1193

Boras JA, Sala MM, Arrieta JM, Sa EL, Felipe J, Agustí S, Duarte CM, Vaqué D
(2010). Effect of ice melting on bacterial carbon fluxes channelled by viruses and
protists in the Arctic Ocean. Polar Biol DOI 10.1007/s00300-010-0798-8.

Boras JA, Sala MM, Baltar F, Arístegui J, Duarte CM, Vaqué D (2010). Effect of
viruses and protists on bacteria in eddies of the Canary Current region (subtropical
Northeast Atlantic). Limnol Oceanogr 55:885–898.

Brussaard CPD (2004). Optimisation of procedures for counting viruses by


flow cytometry. Appl Environ Microbiol 70:1506–1513.

479
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Analítico-experimental, tratamiento mediante inoculación de análogos
bacterianos

2. Titulo de la técnica
Determinación de la depredación bacteriana debida a protistas, mediante la
desaparición en el tiempo de bacterias marcadas con un compuesto
fluorescente (FLB)

3. Autores del documento y filiación


Dolors Vaqué, Julia A Boras, Elena Lara Elisabet-Laia Sá,
Institut de Ciències del Mar (CSIC). Passeig Marítim de la Barceloneta 37-49, 08003
Barcelona.
dolors@icm.csic.es

4. Finalidad. Campo de aplicación


El objetivo de este experimento es medir las pérdidas de bacterias debido a su
ingestión por parte de protistas. Dichos experimentos se harán coincidir con los de
Producción Vírica, con el fin de obtener datos comparativos sobre los dos tipos de
mortalidad de bacterias (depredación vs. lisis).

5. Conceptos generales
-El bucle microbiano
En los sistemas marinos oligotroficos las comunidades de procariotas están
constituidas principalmente por bacterias heterótrofas y autótrofas
(Synechococcus y Prochlorococcus) y algunas Arqueas. Las bacterias
heterótrofas representan un elevado porcentaje de la biomasa respecto a otros
organismos planctónicos (fitoplancton, protozoos, zooplancton, Gasol et al. 1997)
y juegan un papel muy importante en el reciclaje de la materia orgánica disuelta
en el mar. Así, captan el carbono orgánico disuelto excretado por el fitoplancton
y lo convierten en particulado entrando a formar parte de la dieta básica de
protozoos, constituyendo el bucle microbiano. En cambio las bacterias autótrofas
utilizan CO2 y nutrientes inorgánicos disueltos en el agua necesarios para la
fotosintesis y su crecimiento. Estos microorganismos también forman parte del flujo
de carbono que pasa a niveles tróficos superiores, principalmente protozoos
(nanoflagelados heterótrofos). El papel que juegan los protozoos como
reguladores de la biomasa de procariotas empieza a ser reconocido en la
década de los 80's. El continuo avance en el desarrollo de técnicas que se utilizan
para determinar: (i) abundancia de procariotas y protozoos por microscopia de
epifluorescencia (Porter and Feig 1980) y citometria de flujo (Gasol y del Giorgio.
2000); (ii) producción de procariotas: uso de isotopos radiactivos (Kirchman 1993);
(iii) tasas de depredación de protozoos sobre procariotas, mediante técnicas de
dilución (Landry et al. 1984), fraccionamiento (Kuuppo-Leinikki y Kuosa, 1990), uso
de trazadores fluorescentes (Sherr et al. 1987, Pace et al. 1990, Vaqué et al. 1994,
Vazquez-Dominguez et al. 1999. Todo ello ha contribuido y contribuye a mejorar el
conocimiento y función microorganismos integrantes de las redes tróficas

480
microbianas y a cuantificar los flujos de carbono que se establecen entre los
distintos microorganismos en los sistemas marinos.

6. Equipamiento necesario
•Sistema de filtración para filtros de 25 mm
•Bomba de vacío y trampa

7. Reactivos u otro material fungible


•Glutaraldehido para fijación de muestras
• Solución de Dapi
•Pipetas
•Puntas de pipeta
•tubos de plástico para el sistema de filtración
•Portas y cubres
•Lapiz para marcar los portas
•guantes
•cajas para guardar las preparaciones
•Botes de plástico
•Botellas para incubaciones
•Solución de trabajo de bacterias marcadas con un compuesto fluorescente
(FLB)

8. Calibración
En los experimentos se calibran mediante un control, que consiste en una muestra
de agua a la que no continen detyredadores (previamente filtrada por 0.8 µm)
depredadores.

9. Descripción de la Técnica

a) Diseño del experimento


•Preparación de FLBs: se encuentra descrito en Vázquez-Domínguez et al. (1999).
Se partirá de una solución de trabajo de ~2 · 108 ml-1 FLBs. Sonicar antes de
añadirlo a la muestra. La concentración final de FLBs en la muestra debe ser
alrededor de 1·105 cels ml-1.
•Tomar 2L de muestra natural. De éstos, filtrar sólo medio litro por 0.6µm.
•Marcar 4 botellas limpias como Control y 3 réplicas.
•Dispensar 0,5L de la muestra natural en cada réplica, y el medio litro de la
muestra filtrada por 0,6µm en el control.
•Descongelar 2 ml de la solución de trabajo de FLBs y sonicarlos 15 minutos en el
baño de ultrasonidos.
•Añadir las FLBs a un tubo con 6 ml de agua filtrada por 0,2µm. Sonicar de nuevo
15 minutos.
•Añadir a cada botella, réplicas y control, 2ml de esta solución de FLBs.

481
•Rotar cuidadosamente las botellas (unas 20 veces) para homogeneizar bien las
muestras con las FLBs.

b) Muestreo del experimento en T0 y T48


•El experimento se incubará durante 48h en oscuridad a la temperatura in situ.
•En el T0 se tomarán muestras para recuento de ciliados, bacterias
heterotróficas/FLBs y nanoflagelados.
•En el T48 sólo para bacterias heterotróficas/FLBs. Además, en el T48 se tomará
una muestra para Producción Bacteriana.

c) Determinación de abundancias
•Abundancia de ciliados
-Dispensar 100ml de cada triplicado en botellas de vidrio. Fijar con 2ml de lugol
acético (2% concentración final). Conservar en un lugar fresco y oscuro hasta su
llegada al centro de investigación, donde se observarán en un microscopio
invertido.
•Abundancia de bacterias heterotróficas/FLBs y nanoflagelados
- Preparar glutaraldehído 10% (600ml de MQ y 400ml de glutaraldehído 25%).
- Conservar a 4°C.
- Dispensar 50ml de réplicas y control en 4 botellas de tapón estrella.
- Fijar con 5ml de glutaraldehido al 10% (concentración final 1%).
- Mantener a 4ºC al menos 1 hora, o hasta que se proceda al protocolo de DAPI.

c1)Filtración de muestras con DAPI


•Para cada muestra fijada, filtrar lo siguiente para recuentos DAPI:
-T0)10-15ml para bacterias heterotróficas/FLBs (filtro de 0.2µm)
25-40ml para nanoflagelados (filtro de 0.6µm)
-T48)10-15ml para bacterias heterotróficas/FLBs (filtro de 0.2µm). El volumen de
filtración dependerá de la riqueza de cada área de muestreo.

•DAPI de bacterias heterotróficas/FLBs


-Preparar la solución de trabajo de DAPI (0.5 mg/ml), acorde al protocolo descrito
por el grupo de eucariotas.
-Montar la rampa para filtraciones tóxicas. Colocar un filtro de 0.8 µm de acetato
de celulosa como base, y humedecerlo con algunas gotas de MQ. Sobre él,
colocar el filtro negro de 0.2 µm de policarbonato.
-Colocar la torre de filtración y añadir la muestra fijada de 5 en 5 mililitros.
-Filtrar hasta que queden los últimos 5ml, entonces añadir 50ul de DAPI (0.5
mg/ml).
-Esperar 5 minutos en oscuridad antes de filtrar los 5ml restantes.
-Montar la preparación poniendo una gota de aceite de inmersión en el porta,
encima el filtro, sobre él otra gota de aceite de inmersión y por último el cubre.
Guardar las preparaciones a -20ºC y anotar los datos en el estadillo.

482
•DAPI de nanoflagelados

-Proceder de la misma forma que para bacterias heterotróficas pero con un filtro
negro de 0.6 µm de policarbonato. El volumen filtrado será en este caso de entre
25 y 40ml.

d) Producción bacteriana

-Tomar 10ml de cada triplicado en un tubo.


-Preparar 5 microtubos (4 réplicas y 1 control) por cada triplicado.
-Dispensar en cada tubo 1.5ml de la muestra correspondiente.
-Añadir 50ul de TCA al 50% al microtubo Control.
-Añadir 48µl de Leucina a los 5 microtubos.
-Incubar los microtubos en oscuridad a la temperatura in situ, durante 2-4 horas,
dependiendo del área muestreada.
-Continuar el protocolo de Producción Bacteriana descrito en el protocolo
correspondiente.

10. Cuadro sinóptico de la técnica


1. Adición de FLBs
2. incubación de la muestra durante 48 h en oscuridad y a la temperatura in situ
3. Recuento de protistas a tiempo cero y de bacterias/FLBs a tiempos 0 y 48 h

11. Calculo de los resultados.


La tasa de desaparición de FLB’s que nos daran las tasas de depredación se
calculan mediante el modelo matemático descrito en Salat y Marrasé 2004 y
utilizado en varios trabajos de Vaqué et al. 2001, 2002, Boras et al, 2009, 2010ª,
2010b)

12. Referencias

Boras JA, Sala MM, Vázquez-Domínguez E, Weinbauer MG, Vaqué D (2009) Annual
changes of bacterial mortality due to viruses and protists in an oligotrophic coastal
environment (NW Mediterranean). Environ Microbiol 11:1181–1193

Boras JA, Sala MM, Arrieta JM, Sa EL, Felipe J, Agustí S, Duarte CM, Vaqué D (2010).
Effect of ice melting on bacterial carbon fluxes channelled by viruses and protists
in the Arctic Ocean. Polar Biol DOI 10.1007/s00300-010-0798-8.

Boras JA, Sala MM, Baltar F, Arístegui J, Duarte CM, Vaqué D (2010). Effect of
viruses and protists on bacteria in eddies of the Canary Current region (subtropical
Northeast Atlantic). Limnol Oceanogr 55:885–898.

Gasol JM, del Giorgio PA, Duarte CM.(1997) Biomass distribution in marine
planktonic communities. Limnology and Oceanography 42: 1353-1363.

483
Gasoil JM, del Giorgio PA (2000) Using flow cytometry for counting natural
planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial
communities. Scientia Marina 64: 197-224.

Kirchman DL (1993) Leucine incorporation as a measure of


biomass production by heterotrophic bacteria. In: Kemp
PF, Sherr BF, Sherr EB, Cole JJ (eds) Handbook of methods
of aquatic microbial ecology. Lewis Publishers, Boca
Raton, p 509–512

Kuuppo-Leinikki P, y Kuosa H (1990). Estimation of flagellate grazing on bacteria by


size fractionation inthe Northern Baltic Sea Arch, Hidrobiol Beih Ergebn Limnol
34:283-290

Landry MR, Haas LW, Fagerness VL (1984) Dynamics of


microbial plankton communities: experiments in Kaneohe
Bay, Hawaii. Mar Ecol Prog Ser 16:127–133

Pace ML, McManus GB, Findlay SEG (1990) Planktonic


community structure determines the fate of bacterial production
in a temperate lake. Limnol Oceanogr 35: 795–808

Porter KG, Feig YS (1980) The use of DAPI for identifying and counting aquatic
microflora Limnol Oceanogr. 25:943-948

Salat J, Marrasé C (1994) Exponential and linear estimations


of grazing on bacteria: effects on changes in the proportion
of marked cells. Mar Ecol Prog Ser 104:205–209

Sherr BF, Sherr EB, Fallon RD (1987) Use of monodispersed, fluorescently labeled
bacteria to estimate in situ protozoan bacterivory. Appl Environ Microbiol 53: 958–
965.

Vaqué D, Gasol JM, Marrasé C (1994) Grazing rates on bacteria:


the significance of methodology and ecological factors.
Mar Ecol Prog Ser 109:263–274

Vaqué D, Casamayor E.O, Gasol JM (2001) Dynamics of whole community


bacterial production and grazing losses in seawater incubations as related to the
changes in the proportions of bacteria with different DNA-content. Aquatic
Microbial Ecology 25: 163-177.

Vázquez-Domínguez E, Gasol JM, Peters F, Vaqué D (1999). Measuring the grazing


losses of picoplankton: methodological improvements to the use of fluorescently
labeled tracers combined with flow cytometry. Aquat Microb Ecol 20: 110–128.

484
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Analítico-experimental, reconstrucción y reconstrucción de las muestras

2. Titulo de la técnica
Determinación de la producción de virus debida a la lisis bacteriana

3. Autores del documento y filiación


Dolors Vaqué, Julia A Boras, Elena Lara Elisabet-Laia Sá,
Institut de Ciències del Mar (CSIC). Passeig Marítim de la Barceloneta 37-49, 08003
Barcelona.
dolors@icm.csic.es

4. Finalidad. Campo de aplicación


La determinación de Producción Vírica se harán coincidir con los experimentos de
depredación bacteriana, con el fin de obtener datos comparativos sobre la
mortalidad de bacterias debida a virus frente a la mortalidad causada por
depredación.

5. Conceptos generales
-Virus, su papel en el bucle microbiano
En el mar los virus presentan abundancias entre 106-108 cels ml-1 (suttle 2007), de
20 a 200 nm de longitud, constituidas por material genético (DNA ó RNA de
cadena sencilla o doble), rodeados por una cubierta de proteinas y algunos
poseen lípidos. No tienen metabolismo propio y funcionan como parásitos
utilizando la maquinaria celular de la célula hospedadora. Los virus son "las
particulas vivas" mas abundantes del plancton marino. Su supervivencia y
reproducción se basan en la infección tanto de microorganismos procariotas
(bacterias) como eucariotas (fitoplancton). Hay básicamente tres tipos de
reproducción vírica: (1) Infección lítica, el virus entra en contacto con la célula
hospedadora y le inyecta su ácido nucleico, el cual determina la producción de
una numerosa progenie de virus. En un momento dado, la célula hospedadora
explota, los virus salen al exterior y el ciclo empieza de nuevo. (2) Infección
crónica, cuando la progenie de virus liberados no es letal y la célula hospedadora
excreta los virus por extrusión, o se desarrollan dentro de la misma durante varias
generaciones. (3) Lisogenia, el ácido nucleico del genoma del virus pasa a formar
parte del genoma de la célula hospedadora y se reproduce como material
genético de la misma (profago). En el caso que las células hospedadoras se
encuentren en condiciones de estrés la infección puede convertirse en lítica. La
lisogenia parece ser la forma infectiva mas frecuente en sistemas oligotróficos,
debido a la menor abundancia bacteriana de estos sistemas, lo que disminuye la
probabilidad de encuentro entre virus y célula hospedadora, comparado con los
eutróficos. Es una manera hábil de mantenerse amparado por la célula
hospedadora hasta el momento propicio (estrés, incremento de la abundancia
bacteriana) en que se convierten en líticos y salen al exterior a infectar nuevas
células). Por tanto, la infección virica del procariotas se ha de tener en cuenta en
el funcionamiento del bucle microbiano. Los virus pueden catalizar la
transformación de materia orgánica particulada (e.g. bacterias) en materia

485
orgánica disuelta que proviene del contenido de los organismos hospedadores
durante la lisis celular. La actuación de los virus favorecerá las cadenas tróficas
dominadas por pequeños organismos con poca exportación y retención de mas
nutrientes en la zona fótica. Paradogicamente, la presencia de virus a la vez que
incrementará las tasas de mortalidad bacteriana, también favorecerá su
producción y respiración, debido a los nuevos aportes de materia orgánica

6. Equipamiento necesario
• Bomba peristática
•Portafiltros de 47 mm

7. Reactivos u otro material fungible


•Agua MQ
•NaOH 0.5 N
•Lejia
•Etanol 5%
•Mitomicina C
•Pipetas
•Puntas de pipeta
•tubos de plástico para el sistema de filtración
•Falcons, 50 ml
•guantes
•Crioviales

8. Calibración

9. Descripción de la Técnica

El método utilizado para los experimentos es el descrito por Weinbauer et al.


(2002), conocido como método de reducción-dilución. En él se va a determinar la
producción vírica debida a la lisis bacteriana de células infectadas con virus
líticos, así como a la lisis inducida por Mitomicina C de bacterias infectadas con
virus lisogénicos. La lisis inducida en las muestras tratadas con Mitomicina C nos da
la producción total de virus (líticos más lisogénicos). A partir de aquí se puede
calcular cuál es la concentración de virus lisogénicos: producción total de virus
menos producción por lisis

Protocolo del experimento de producción vírica

a) Diseño experimental
•Preparación de la Mitomicina C: disolver el contenido de un vial de 2mg de
Mitomicina C con 1 ml de MQ filtrada por 0.2um. Añadir este volumen a 19ml de
MQ igualmente filtrada. Alicuotar y conservar a -20ºC.
•Obtener 200ml de agua de mar libre de virus (=ultrafiltrado), mediante filtración
tangencial con una membrana de 30KDa (Ver protocolo correspondiente).

486
•Concentración de bacterias: filtrar 1L de agua de mar por 0,8μm y
seguidamente reducirlo a 100ml de concentrado de bacterias, mediante
filtración tangencial con una membrana de 0.2µm (Ver protocolo
correspondiente).
•Mezclar los 100ml de concentrado de bacterias con 200ml de agua de mar libre
de virus. La idea es tener la misma concentración inicial de bacterias que en la
muestra natural, pero habiendo eliminado la mayor parte de los virus.
•Tomar 6 tubos y repartir a cada uno 50ml de la mezcla preparada previamente.
En tres de ellos añadir 0.5 ml de la solución de trabajo de Mitomicina C
(concentración final 1 µg ml-1), para obtener la producción de virus total
(infección lítica y lisogénica).
•Al finalizar se procedera al lavado de los Cartuchos de 0.2 µm y 30 Kda, tal y
como está descrito en el protocolo de ultrafiltración tangencial

b) Muestreo las alicuotas


•Incubar los 6 tubos en oscuridad a la temperatura in situ. Tomar muestras, por
duplicado, para abundancia de virus y bacterias por citometría, cada 4 horas (0,
4, 8 y 12h). (Ver protocolo de Abundancia de Virus por Citometría).

10. Cuadro sinóptico de la técnica


1. Concentrado de bacterias
2. Agua libre de virus
3. Mezclar ambas fracciones
4. Muestrear cada 4 horas el incremento de la producción de virus en muestras
con y sin mitomicina

Bombas peristalticas con cartuchos de VIVAFLOW de 0.2µm y 30 Kda

487
11. Calculo de los resultados.
Las tasas de producción de virus que a partir de ellas podremos estimar las tasas
de lisis bacteriana se calcularan según está descrito en Boras et al. (2009, 2010 a,
2010b)

12. Referencias

Boras JA, Sala MM, Vázquez-Domínguez E, Weinbauer MG, Vaqué D (2009) Annual
changes of bacterial mortality due to viruses and protists in an oligotrophic coastal
environment (NW Mediterranean). Environ Microbiol 11:1181–1193

Boras JA, Sala MM, Arrieta JM, Sa EL, Felipe J, Agustí S, Duarte CM, Vaqué D (2010).
Effect of ice melting on bacterial carbon fluxes channelled by viruses and protists
in the Arctic Ocean. Polar Biol DOI 10.1007/s00300-010-0798-8.

Boras JA, Sala MM, Baltar F, Arístegui J, Duarte CM, Vaqué D (2010). Effect of
viruses and protists on bacteria in eddies of the Canary Current region (subtropical
Northeast Atlantic). Limnol Oceanogr 55:885–898.

Weinbauer MG, Winter C, Höfle MG (2002). Reconsidering transmission electron


microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion
factors derived from natural communities. Aquat Microb Ecol 27:103–110.

Winget DM, Williamson KE, Helton RR, Wommack KE (2005). Tangential flow
diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production.
Aquat Microb Ecol 41: 221–232.

488
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento
Recogida de muestras para ADN vírico

2. Titulo de la técnica
Determinación de la composición de la comunidad vírica

3. Autores del documento y filiación


Dolors Vaqué, Julia A. Boras, Elena Lara, Elisabet-Laia Sá, Silvia Gonzalez-Acinas
Institut de Ciències del Mar (CSIC). Passeig Marítim de la Barceloneta 37-49, 08003
Barcelona.
dolors@icm.csic.es

4. Finalidad. Campo de aplicación


Estimar los cambios de en la composición de las comunidades de virus mediante
la técnica de finger-printing RAPD-PCR con la que conseguiremos descifrar
fragmentos de secuencias víricas, gracias a una amplificación en la que se usan
cebadores de secuencia corta y aleatoria que se unirán a diversos puntos del
genoma vírico (Winget y Wommack 2008).

5. Conceptos generales
Los virus son los entes mas abundantes en los sistemas acuáticos, y una gran
mayoria tienen a las bacterias como hospedadores (Furhman 1999). Aunque en la
actualidad se están realizando grandes avances en estudios que versan sobre la
diversidad de los virus, como es el uso de técnicas como la implementación de la
metagenómiica (Paul and Sullivan 2005). Aúnque esta es la técnica ideal y ya se
utilizará en la campaña Malaspina en profundidades discretas. Nosotros vamos a
realizar de forma sistemática en muchas estaciones y profundidades la
determinación de la composición de la comunidad de virus mediante la técnica
de Fingerprint RAPD-PCR (Weinbauer et al. 2009)

6. Equipamiento necesario
•Bomba persitáltica Watson-Marlow

7. Reactivos u otro material fungible


•Agua MQ
•Cebadores y patrones
•Portafiltros y Filtros de 50 µm, 0.8 µm y 0.2 µm
•Membrana (o cartucho, VIVAFLOW) de 30Kda: retendrá los virus dejando pasar
a través suyo el agua libre de virus.
•Tubos de silicona
•Jarras de plastico, provetas,
•pipetas
•puntas de pipeta
•nevera potátil
•hielo
•NaOH, 0.5 N

489
•Lejia
•Etanol 5%

8. Calibración
Se realizará mediante la utilización de distintos cebadores sobre distintas muestras.
Los resultados en los geles se compararan con los de los patrones

9. Descripción de la Técnica

Para poder llevar a cabo estas técnicas en el laboratorio, durante la campaña


debemos concentrar en unos pocos mililitros los virus presentes en varios litros de
agua. Lo haremos mediante un protocolo de filtración tangencial utilizando
membranas de polietersulfona de 30Kda donde las partículas víricas serán
retenidas y posteriormente recuperadas (Winget et al., 2005).

-Recogida de Muestras
Cada tres días, se recogeran muestras de un perfil completo de profundidades.
Para muestras profundas se filtrarán entre 10 y 20 litros, mientras que para muestras
superficiales serán suficientes 2 litros de agua prefiltrada por 0.8 y 0.2 µm. A partir
de aquí los virus se concentararn mediante filtración tangencial sobre cartuchos
(VIVAFLOW)de 30 Kda . Además, una vez por semana, coincidiendo con las
estaciones consideradas para realizar experimentos se concentrarán dos
muestras de superficie y una de máxima profundidad.

- Esquema general del sistema de filtración tangencial


•Bomba persitáltica Watson-Marlow
•Membrana (o cartucho, VIVAFLOW) de 30Kda: retendrá los virus dejando pasar
a través suyo el agua libre de virus.
•Tubos de silicona: la membrana está conectada a 3 tubos (figura 1):
•Tubo #1: es el tubo de entrada. Pasa por el cabezal de la bomba y aspira
la muestra en dirección a la membrana.
•Tubo #2: es el de recirculación. Lleva adherido un émbolo. Su función es
recircular el agua que acaba de pasar por la membrana, de modo que
vamos obteniendo una muestra cada vez más concentrada de partículas
víricas.
•Tubo #3: es el de salida. Más delgado que los otros dos. Saca del sistema
el agua libre de virus (= ultrafiltrado) procedente de la membrana (ya que
éstos no han podido atravesarla).

-Protocolo de concentración de virus mediante filtración tangencial


•Recoger en un bidón limpio los litros de agua de mar prefiltrados por 0,2 μm
cuyos virus se desea concentrar.
•Montar del sistema en el MODO LIMPIEZA (ver figuras anexas).
•Pasar 500 ml de MQ para eliminar el etanol del interior de la membrana.
•Limpiar el vaso de plástico de 5L donde irá la muestra, primero con MQ y
después con la misma muestra.

490
•Poner la muestra en el vaso de 5L limpio. (Si vamos a filtrar más de 4L, iremos
añadiendo muestra medida que se vacíe el vaso).
•Poner el sistema en MODO FILTRACIÓN.
•Filtrar la muestra (= agua de mar prefiltrada por 0,2μm). Durante el proceso de
filtrado, deben guardarse a parte 500 ml de ultrafiltrado, que se usarán más tarde.
•Fase final de la filtración: cuando queden tan sólo 100ml de muestra en el
recipiente original, parar la bomba y trasvasarlos a un falcon estéril, junto con los
tubos 1 y 2.
•Utilizaremos 200ml del ultrafiltrado recogido previamente para lavar 3 veces el
vaso que contenía la muestra, con el fin de arrastrar los virus enganchados a las
paredes del vaso.
•A medida que se absorbe la muestra del falcon, le vamos añadiendo el volumen
de dichos lavados.
•Parar la bomba cuando queden <5ml de muestra en el falcon, y en todo caso,
ANTES de que el tubo aspire aire.
•Poner el sistema en MODO REVERSO. Es importante cerrar el paso del tubo 3.
•En el mismo falcon recogeremos 20ml del concentrado de virus que expulsa el
tubo #1. Rotular bien, asegurar el tapón con parafilm y guardar a 4ºC.

- Protocolo de limpieza de la membrana


•Poner el sistema en MODO LIMPIEZA
•Pasar 200 ml de MQ
•Preparar la solución de limpieza: 250ml de NaOH 0,5M + 2ml de lejía.
•Pasar 50 de los 250 ml de solución limpieza.
•Poner el sistema en MODO RECIRCULACIÓN
•Recircular los 200ml que quedan de solución limpieza durante 30-40 minutos.
•Poner el sistema en MODO LIMPIEZA
•Pasar 100 ml de MQ
•Poner el sistema en MODO RECIRCULACIÓN
•Recircular 500 ml de MQ durante 5-10 minutos.
•Poner el sistema en MODO LIMPIEZA
•Pasar los 500 ml de MQ.
•Preparar un falcon con 50 ml de EtOH al 10% y pasarlos por la membrana.
•Parar la bomba ANTES de que entre aire en la membrana.
•Desconectar los 3 tubos y cerrar las salidas de la membrana, de modo que ésta
quede llena de etanol y sin burbujas de aire.
•Limpiar externamente los tubos con papel impregnado en etanol. Tapar los
extremos de los tubos con papel de aluminio para evitar que entre suciedad.
•Apuntar en la membrana los litros de muestra pasados.
•Conservar los tubos y la membrana a 4ºC.

491
10. Cuadro sinóptico de la técnica

MODO FILTRACIÓN
TUBO 3

TUBO 2

Membrana
30KDa
TUBO 1

BOMBA
PERISTÁLTICA

ULTRA- 255 RPM


FILTRADO
O

MUESTRA

BOMBA: 255 RPM EN EL SENTIDO DE LAS AGUJAS DEL RELOJ.


TUBO 1: absorbe la muestra hacia la membrana, pasando a través del cabezal de la bomba.
TUBO 2: devuelve la muestra con virus al vaso, de modo que ésta se va concentrando.
TUBO 3 : expulsa fuera del sistema la fracción libre de virus o ultrafiltrado.

492
MODO
RECIRCULACIÓN
TUBO 3

TUBO 2

Membrana
30KDa
TUBO 1

BOMBA
PERSITÁLTICA
255 RPM

MQ o
Sol. limpieza

BOMBA: 255 RPM EN EL SENTIDO DE LAS AGUJAS DEL RELOJ.


TUBO 1: pasa por el cabezal de la bomba y absorbe agua MQ o sol. limpieza hacia la membrana.
TUBO 2: vuelve al vaso de limpieza, permitiendo la recirculación.
TUBO 3 : vuelve al vaso de limpieza, permitiendo la recirculación.

493
MODO REVERSO
TUBO 3

X TUBO 2

Membrana
30KDa
TUBO 1

BOMBA
PERISTÁLTICA
155 RPM

ULTRA-
CONCENTRADO FILTRADO
DE VIRUS

BOMBA: 155 RPM EN SENTIDO CONTRARIO A LAS AGUJAS DEL RELOJ.


TUBO 1: pasa a través del cabezal de la bomba expulsando la muestra concentrada.
TUBO 2: absorve ultrafiltrado para empujar la muestra concentrada en dirección al falcon.
TUBO 3 : debe permanecer cerrado.

494
MODO LIMPIEZA

TUBO 3
TUBO 2

Membrana
30KDa
TUBO 1

BOMBA
PERISTÁLTICA
Residuo
s 255 RPM

MQ o sol.
limpieza

BOMBA: 255 RPM EN SENTIDO DE LAS AGUJAS DEL RELOJ.


TUBO 1: pasa a través del cabezal de la bomba en dirección a la membrana.
TUBO 2: lleva el émbolo. Sale de la membrane en dirección al recipiente de residuos.
TUBO 3 : es el más fino. Sale de la membrana y se dirige al recipiente de residuos.

495
11. Obtención de resultados.

Una vez tenemos los concentrados, en el laboratorio del ICM se va a proceder a:


•ultraconcentrar los virus mediante ultracentrifugación a 100000g durante 2h.
•A partir de aquí se prepararan los insertos que se pueden almacenar a 4ºC el
tiempo que sea necesario hasta que se corra la electroforesis.
•Los insertos se trataran con distintos cebadores y se escogeran los que den una
mejor separación de banadas en el gel de azarosa.
Para ello seguiremos la técnica descrira en Weinbauer et al. (2009)

12. Referencias

Fuhrman JA (1999). Marine viruses and their biogeochemical


and ecological effects. Nature 399: 541–548, doi:10.1038/ 21119

Paul JH, Sullivan MB (2005). Marine phage genomics: what have we learned?
Environmental biotechnology. 16:299–307

Weinbauer MG, Arrieta JM, Griebler C, Herndl GJ (2009). Enhanced viral


production and infection of bacterioplankton during an iron-induced
phytoplankton bloom in the Southern Ocean. Limnol Oceanog 54: 774–784.

Winget DM, Williamson KE, Helton RR, Wommack KE (2005). Tangential flow
diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production.
Aquat Microb Ecol 41: 221–232.

Winget DM, Wommack KE (2008). Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD)-


PCR as a tool for assessment of marine viral richness. Appl Environ Microbiol
74:2612–1618.

496
BLOQUE 7

DISTRIBUCIÓN Y FUNCIÓN DEL ZOOPLANCTON EN EL


OCEÁNO GLOBAL

MÉTODOS, TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS

497
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Titulo de la técnica

Muestreo de microzooplancton profundo (> 2000 m)

3. Autores del documento y filiación

González-Gordillo, J.I.
Sánchez García, R.
CACYTMAR, Universidad de Cádiz.

4. Conceptos generales

El microzooplancton (20 – 200 µm) corresponde a un importante y numeroso grupo


de organismos que incluyen tanto a protistas heterótrofos (principalmente ciliados
y dinoflagelados) como a pequeños metazoos (generalmente larvas de
invertebrados). La importancia ecológica de este grupo radica en que son
importantes consumidores de bacterias y protistas autótrofos, constituyendo uno
de los eslabones tróficos entre el bucle microbiano y la clásica red trófica de los
metazoos. Así, para el estudio de los procesos de los que forman parte son
necesarias estimas fiables de su abundancia y biomasa.

5. Finalidad. Campo de aplicación

Metodología para obtener muestras microzooplancton (20 – 200 µm) profundo en


una estación de muestreo determinada, para estudios cualitativos o cuantitativos.
Aunque el microzooplancton es muy abundante en aguas poco profundas de
casi cualquier zona geográfica (ver Gifford y Caron, 2000) y no se necesita filtrar
grandes volúmenes de agua para obtener una muestra representativa, no es así
en aguas profundas (> 1000 m), donde probablemente poco litros de agua
pueden no ser suficientes para conseguir buenas estimas.

6. Equipamiento necesario

Botella oceanográfica de 12l de capacidad en la que se dispone interiormente


una red de plancton de 20 µm de luz de malla. El conjunto va montado en una
roseta oceanográfica. Los mismos disparadores remotos que se utilizan para
cerrar las botellas de agua se utilizan para cerrar este sistema a una profundidad
determinada. Un esquema del diseño del equipo se observa en la figura siguiente:

498
7. Descripción de la Técnica

Las muestras se tomarán gracias al acoplamiento de una pequeña red de


plancton de 20 μm de luz de malla en el interior de una botella de la roseta
oceanográfica. El sistema actúa durante la subida de la roseta, desde la
profundidad máxima alcanzada por ésta hasta una profundidad deseada
(transecto vertical), obteniéndose una muestra de ese intervalo de profundidad.
El cierre de la botella a la profundidad elegida evitará la contaminación de la
muestra por otros organismos de estratos superiores.
Un esquema del funcionamiento de muestreador se indica a continuación:

Toma de muestras:
Se tomará una sola muestra por cada perfil de roseta. En aquellos puntos de
muestreos terminados en 0 o 5 (10, 15, 20, etc.) la muestra será utilizada

499
íntegramente para genómica; en el resto de los puntos las muestras se usarán
para taxonomía. Las muestras se tomarán desde la máxima profundidad a la que
baje la roseta hasta los 2000 m. No obstante, la columna de agua muestreada
debería ser siempre mayor de 1000m, pues menos distancia no daría,
seguramente, una muestra representativa. Por tanto, en sondas menores a los
3000 m no se tomarían muestras.

Conservación de muestras:
Muestra para genómica:
Para la recogida de la muestra se extrae el tapón del colector y el contenido se
vierte directamente en un vaso de filtración provisto de un filtro GF/F colocados
en un kitasato. Tras una filtración muy suave (para no romper los organismos y
perder su ADN) se extrae el filtro y se coloca enrollado en un tubo de plástico de
5ml al que se le añade etanol absoluto con una jeringa. Durante todo el proceso
debe tenerse especial cuidado de no contaminar la muestra con ADN extraño
(restos de organismos, etc.)

Muestras para Taxonomía:


Verter el contenido del colector en una jarra graduada de 1 l, añadiéndose
agua de mar filtrada (10 µm) hasta enrasar a 100 ml. No se debe pulverizar la red
ni el colector para evitar rotura de ciliados. Mediante el uso de una segunda jarra
graduada de 1 l se mezcla suavemente la muestra y se divide en dos mitades
iguales de 50 ml. Una mitad se pasa a un frasco de 50 ml de tapón de estrella y se
le añaden 5 ml de Formaldehído al 40% saturado con Bórax y filtrado, para llegar
a la proporción del 4% de conservante. Un sistema rápido y seguro para medir
este volumen es utilizar una jeringuilla de boca ancha de unos 30 ml con un filtro
desechable o un dispensador. La segunda mitad de la muestra se vierte en un
frasco topacio de 60 ml y se le añaden 12 ml de Lugol (20% de conservante).
IMPORTANTE: primero echar el Lugol y después la muestra.

La limpieza final del muestreador se realiza aplicando un chorro suave de agua


dulce desde la boca del equipo, de forma que todo el material pegado a la red
salga a través del colector inferior.

Etiquetado: No escribir directamente sobre el frasco o sobre, se borra con los


conservantes o por el propio manejo. Etiquetar siempre con etiquetas impresas
mediante la aplicación informática MalaspinaLabel (ver protocolo de creación
de etiquetas), para evitar errores de interpretación de los datos. Cada etiqueta
debe ser cubierta por cinta de precinto
transparente suficientemente ancha como
para cubrir sobradamente la etiqueta. Verificar
los datos de la etiqueta con los datos del
muestreo.
Las etiquetas seguirán el siguiente modelo:

500
Estadillo de datos:

Muestreador: BOTTLE-NET
Prof. Inicio Hora inicio
Vol. Bottle-Net Hora inicio roseta Prof max Perfil
Filtrado filtrado (UTC)

Prof. Fin filtrado Hora fin filtrado (UTC) Hora fin roseta

Prof DCM Prof DSL Prof. Max. O2 Temperatura Salinidad

Observaciones del muestreo

Volumen
Código digital muestras asoc Observaciones
alícuota

8. Cuadro sinóptico de la técnica

Puntos Aprox. 3 ml
terminados etanol absoluto
en 0 y 5

5 ml formol
al 40%
tamponado

50 ml
12 ml Lugol

50 ml
100 ml

501
9. Reactivos y material de laboratorio

Conservantes:
Formaldehído al 40 % tamponado con Bórax.
Lugol Acético

Otro material:
Frascos para muestras de 120 ml de vidrio y color topacio (especialmente cuando
se usa Lugol). El vidrio del frasco aporta sílice a la muestra y ayuda a la
conservación de las diatomeas.
Jeringuilla de 50 ml
Filtros desechables para jeringuilla
Jarras graduadas 1 l
Material de etiquetado
Estadillo de datos

10. Calibración

Debe evitarse que sucedan casos de colmatación de la red o de retroceso del


agua a filtrar, debidos a una elevada abundancia de organismos filtrados o una
rápida velocidad de izado de la botella oceanográfica. Ambas circunstancias
podrían evitarse realizando muestreos preliminares. Durante el muestreo la roseta
no debe pararse pues podrían salirse los organismos capturados, el muestreo
debe ser sin pausas.

11. Calculo de los resultados.

El cálculo del volumen filtrado se obtendría simplemente multiplicando el área de


la boca de la botella por los metros de columna de agua filtrados, es decir:

Vol filtrado = π r 2 ∗ Prof final − Prof inicial

12. Control de calidad

Aunque organismos superiores a 200 µm pueden ser recogidos mediante esta


técnica, estos no deberían usarse para estudios cuantitativos, pues su número
podría estar subestimado debido al pequeño diámetro de boca de entrada del
muestreador y a la alta capacidad de evasión de los organismos superiores a este
tamaño.

13. Otras técnicas similares

Los métodos actuales de recogida de microzooplancton, esto es, botellas


oceanográficas montadas en rosetas, no permiten obtener grandes volúmenes
de agua de los que obtener muestras concentradas. El método que aquí se
describe permite obtener muestras concentradas de microplancton de forma

502
simultanea a la realización de perfiles de CTD con rosetas oceanográficas, sin
necesidad de usar redes de plancton convencionales largadas hasta miles de
metros o de efectuar numerosas recogidas de agua con rosetas oceanográficas,
metodologías que de cualquier forma siempre implican un consumo de tiempo
importante en cualquier campaña oceanográfica.

14. Referencias

Gifford, D.J. and Caron, D.A. 2000. Sampling, preservation, enumeration and
biomass of marine protozooplankton, Cap. 5: 193-221. In: Harris, R.P.; Wiebe, P.H.;
Lenz, J.; Skjoldal, H.R.; Huntley, M. (Eds). ICES Zooplankton Methodology Manual.
Academic Press, 684 pp.

503
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Titulo de la técnica

Muestreo de microplancton superficial

3. Autores del documento y filiación

González-Gordillo, J.I.
Sánchez García, R.
CACYTMAR, Universidad de Cádiz.

4. Conceptos generales

El microplancton agrupa a una alta diversidad de organismos marinos de


naturaleza muy heterogénea, encontrándose entre ellos a diatomeas,
dinoflagelados, protozoos, nauplios de copépodos, etc. En aguas superficiales
constituyen una importante fuente de carbono orgánico.

5. Finalidad. Campo de aplicación

Metodología para obtener muestras de microplancton superficial (3-5 m) durante


la travesía entre puntos de muestreo, con la idea de advertir cambios en la
distribución, composición taxonómica, biomasa, etc. El rango de tamaño
muestreado será de 20 a 200 μm, y se aprovechará la bomba continua del
termosalinómetro instalado en el barco.

6. Equipamiento necesario

Termosalinómetro trabajando en continuo con caudal constante.


Juego de colectores de 20 y 200 µm
Cubo aforado para calibración

7. Descripción de la Técnica

Recogida de muestras: Las muestras se tomarán a partir del grifo de salida del
termosalinómetro continuo instalado en el barco. El grifo se mantendrá abierto
siempre y en la misma posición, con la idea de mantener un caudal constante
durante el muestreo. Este caudal se calibrará antes y después de cada muestra
mediante el llenado de un cubo aforado. El agua saliente del grifo se hará pasar
por un juego de tamices de 200 y 20 µm colocados uno encima del otro. La
muestra que se recogerá será la retenida en el tamiz de 20 µm.
Se tomarán 2 muestras diarias, una en cada fase del día (día y noche), y cada
una de ellas durante 1 hora. Las muestras se tomarán intentándolas hacerlas
coincidir con la mitad del día (12:00) y mitad de la noche (23:00),

504
respectivamente. Debido a la logística general de la Campaña, la muestra diurna
corresponderá al punto de muestreo en el que se esté realizando el
correspondiente perfil de CTD, mientras que la muestra nocturna corresponderá al
transecto navegado entre dos puntos de muestreo.

Conservación de muestras: Las muestras deberán fijarse rápidamente para evitar


la degradación de los organismos.
El material colectado en el tamiz de 200 µm se desecha pues estará subestimado.
Los organismos del tamiz de 20 µm se vierten suavemente en una jarra graduada
de 1 l, sin aplicar ningún pulverizador para evitar rotura de los organismos frágiles
ciliados. Se añade agua de mar filtrada (10 µm) hasta enrasar a 200ml. Mediante
el uso de una segunda jarra graduada se mezcla suavemente la muestra y se
divide en dos mitades iguales de 100 ml. Una mitad se pasa a un frasco de 125ml
de topacio y se le añaden 10 ml de Formaldehído filtrado al 40% saturado con
Bórax, para llegar a la proporción del 4% de conservante. Un sistema rápido y
seguro para medir este volumen es utilizar una jeringuilla de boca ancha de unos
30 ml con un filtro desechable o un dispensador. La segunda mitad de la muestra
se vierte también en un frasco topacio de 125 ml y se le añade 25 ml Lugol,
quedando este al 20%.
IMPORTANTE: primero echar el Lugol y después la muestra.

Etiquetado: No escribir directamente sobre el frasco o sobre, se borra con los


conservantes o por el propio manejo. Etiquetar siempre con etiquetas impresas
mediante la aplicación informática MalaspinaLabel (ver protocolo de creación
de etiquetas), para evitar errores de interpretación de los datos. Cada etiqueta
debe ser cubierta por cinta de precinto transparente suficientemente ancha
como para cubrir sobradamente la etiqueta. Verificar los datos de la etiqueta con
los datos del muestreo.
Las etiquetas seguirán el siguiente modelo:

505
Estadillo de datos:

Muestreador: BOMBA DEL CONTINUO


Variable: MICROPLANCTON

Fase del Día

Calibración Caudal (l/min)

Hora inicio (UTC)

Latitud inicio

Longitud inicio

Estado cielo

Hora fin (UTC)

Latitud final

Longitud final

Tiempo filtrado (min)

Vol. Filtrado (m3)

Observaciones
Volumen
Código digital muestras asoc Observaciones
alícuota

8. Cuadro sinóptico de la técnica

9. Reactivos y material de laboratorio

Conservantes:
Formaldehído al 4 % tamponado con Bórax.

506
Lugol acético

Material laboratorio:
Frascos para muestras de 125 ml de vidrio y color topacio. El vidrio del frasco
aporta sílice a la muestra y ayuda a la conservación de las diatomeas.
Jeringuilla de 50 ml
Filtros desechables para jeringuilla
Jarras graduadas 1 l
Material de etiquetado

10. Calibración

El caudal del continuo debe ser calibrado antes y después de cada muestra
mediante el llenado de un cubo aforado. El dato se obtiene midiendo el tiempo
que tarda en llenarse el recipiente aforado. Realizar varias réplicas para obtener
una mejor estima. Pasar los datos a L/min y anotar en el estadillo.

12. Control de calidad

Es importante asegurarse que no existe ningún tipo de filtro en los conductos del
termosalinómetro que puedan impedir la entrada del plancton.
Deberá controlarse el funcionamiento del sistema mientras que las primeras
muestras se estén tomando, ajustando la apertura del grifo a la cantidad de
plancton que se recoge con la idea de que no se colmaten los tamices.
Este tipo de muestreo no debería utilizarse para el estudio cuantitativo de
organismos mayores de 200 micras pues los valores de abundancia estarían
subestimados.

13. Otras técnicas similares

Otro método de recogida de microplancton implica el uso de botellas


oceanográficas montadas en rosetas, pero esta técnica requiere que el barco
este parado y que se reserve una botella para estas muestras. Mediante esta
técnica no es necesario reservar botellas sólo para este fin y el barco puede
seguir navegando.

507
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Titulo de la técnica

Procesado de las muestras de meso y macroplancton tomadas con Multinet.

3. Autores del documento y filiación

Martín Mikelarena, Inma. AZTI-Tecnalia


González-Gordillo, J.I. CACYTMAR, Universidad de Cádiz
Sánchez García, R. CACYTMAR, Universidad de Cádiz

4. Finalidad. Campo de aplicación

Obtención de muestras de zooplancton gelatinoso, meso y macrozooplancton a


distintas profundidades con el muestreador de plancton MULTINET. Dichas
muestras serán fraccionadas y conservadas siguiendo diferentes protocolos
dependiendo del objeto de estudio: taxonomía, genética, acción enzimática e
isótopos estables de C/N.

5. Conceptos generales

El colector de plancton MAXI-MULTINET (apertura de boca 0.5m2; 0,7 x 0,7m) es


una red que puede operarse tanto en arrastre oblicuo como vertical. Dispone de
9 redes con dispositivo de apertura y cierre controlado, obteniéndose, de este
modo, muestras estratificadas. Dispone de un CTD. Para su utilización consultar el
protocolo correspondiente.

6. Equipamiento necesario

Maquinilla para maniobra de Red y pórtico (barco)


Red MULTINET
Cable electromecánico (opcional)

7. Reactivos u otro material fungible

• Tanques isotérmicos con agua de mar


• Enfriadores en tableta para los tanques
• Filtro de cartucho para filtrar agua de mar
• Jarras-tamices de 0 (cerradas), 40, 200 y 5000 µm
• Frascos lavadores
• Probetas
• Jeringas o dispensadores de diferentes volúmenes: 5-10-20-50ml
• Filtros desechables para jeringas
• Botes de 50 y 250ml

508
• Columna de tamices de distintos tamaños para Actividad Enzimática y
para Isótopos Estables de C/N
• Rampa de filtración
• Filtros de fibra de vidrio Whatman
• Placas de Petri
• Envases herméticos de plástico
• Silica-gel
• Botella con Nitrógeno líquido
• Formaldehído al 40% tamponado con Borax
• Etanol absoluto
• Redes de repuesto

8. Calibración

Sólo es necesaria la calibración de la CTD y flujómetros.

9. Descripción de la Técnica

Profundidades de muestreo:
Se realizará un lance de MULTINET diario alcanzando una profundidad máxima de
1000m, en los que obtendremos muestras de los rangos de profundidad:
1000-900, 900-800, 800-700, 700-600, 600-500, 500-400, 400-300, 300-200, 200-0.
Puntualmente (muestreos tipo C), se realizarán lances profundos hasta una
profundidad máxima de 4000m, recogiéndose muestras de los rangos de
profundidad: 4000-3500, 3500-3000, 3000-2500, 2500-2000, 2000-1500, 1500-1000,
1000-500, 500-200, 200-0.

Preparaciones previas al lance:


Hay que tener preparados 2 tanques isotérmicos con agua de
mar a una temperatura similar a la registrada a los 1000 m de
profundidad para evitar en la medida de los posible la
degradación de los organismos por choque térmico. Para ello
se utilizarán enfriadores re-utilizables tipo pastilla, que se
mantendrán congelados hasta su utilización. Dichos tanques
disponen de una gradilla para colocar las jarras-tamiz según la
figura de la derecha:

Tanque 1 (zooplancton): 9 conjuntos de jarras-tamiz numeradas del 1 al 9,


compuestos cada uno de ellos por una jarra cerrada y otra con fondo perforado
de 5000 µm.

Tanque 2 (gelatinoso): 9 jarras cerradas numeradas del 1 al 9. Estas jarras deberán


estar colocadas en la gradilla y llenas de agua de mar filtrada (10µm).

Atención: la numeración de las jarras será siempre la misma e idéntica en cada


tanque, asignando el nº 1 a la jarra que vaya a contener la muestra del colector

509
nº 1ª, el nº 2 al 2ª colector, y así sucesivamente. Hay que tener cuidado con la
cantidad de agua que se pone en el tanque pues al meter las jarras puede
rebosar y entrar agua en éstas.

Todos los frascos deberán estar convenientemente etiquetados antes de su


utilización

Las etiquetas seguirás el siguiente modelo:

Tratamiento inmediato de las muestras:


Para evitar que los organismos colectados, principalmente los de mayor
profundidad, no sufran un excesivo choque térmico, las redes no se lavarán tras
ser sacadas del agua sino que los colectores se sacarán y su contenido se pasará
rápidamente a las jarras del baño isotérmico. Sólo la red de superficie (200-0m)
podría ser lavada si fuera necesario, siempre con agua de mar.
Todos los colectores se verterán en las jarras-tamiz antes de continuar con el
procesado, intentando minimizar el deterioro de los organismos. Los colectores se
van sacando con sumo cuidado tras comprobar que el nivel agua+plancton no
rebasa el tope del colector, y se verterá su contenido en el correspondiente
conjunto jarra-tamiz del Tanque 1 (verificar en todo momento que llevamos el
número de colector “x” a su conjunto correspondiente). Lavar cuidadosamente el
colector con la ayuda de un pulverizador.

Procesado muestras macroplancton:


Una vez que se tienen todas las muestras en el baño isotérmico 1 se van
inspeccionando ordenadamente las jarras de 5000 µm. IMPORTANTE: El
procesado de las muestras tendrá lugar de la siguiente forma: primero se procesa
la más profunda, muestra 1, después la más superficial, muestra 9, y a
continuación se procesarán todas las demás siguiendo el orden 8, 7, 6, 5, 4, 3 y 2.
Excepción: es probable que los organismos gelatinosos puedan predar a los de
menor tamaño, por lo que la separación de estos debería priorizarse. Así, si hay
algún organismo muy voluminoso procesar en primer lugar esta muestra.

510
El procesado de macroplancton comienza sacando la jarra de 5000 µm,
asegurándose que los organismos menores de 5000 micras han pasado por el
tamiz y se quedan en la jarra cerrada. Lavar cuidadosamente el tamiz con la
ayuda de un pulverizador.
El contenido de esta jarra-tamiz se verterá en una bandeja con un poco de agua
filtrada (10 µm), separando con una pinza los organismos no gelatinosos e
introduciéndolos en un frasco de 50ml tapón de estrella. La muestra se etiquetará
para taxonomía y se conservará en formol al 4%, excepto aquellas de los puntos
de muestreo terminados en 0 o 5, cuyas muestras se etiquetarán para genética y
se conservarán en etanol absoluto. Si aparece material gelatinoso se volverán a
colocar en la jarra-tamiz de 5000 µm y se re-colocará en el lugar correspondiente
del Tanque 2. Los organismos gelatinosos permanecerán en este tanque durante 1
hora para que se depuren. El posterior tratamiento de estas muestras se
específica en procedimiento aparte (ver procedimiento para el procesado de
muestras de gelatinoso).
Tras el pre-procesado de las muestras de plancton realizado anteriormente
tendremos 9 muestras en el tanque 1 y de 0 a 9 muestras en el tanque 2,
dependiendo si hay zoo gelatinoso.

Procesado muestras mesoplancton:


A cada muestra recogida en la jarra cerrada se le añade agua de mar filtrada
(10 µm) hasta enrasar a 1000 ml y se va fraccionando en 4 partes iguales
(alícuotas) de 250ml cada una. Para conseguir esto se mezclará cuidadosamente
la muestra, utilizándose otra jarra graduada de 1 l cerrada y vertiendo el
contenido de una en la otra varias veces.
Posteriormente, se obtendrán cada una de las alícuotas de 250 ml:

- Muestras para Actividad Enzimática:


o Tener los crioviales ordenados y rotulados, con rotulador indeleble,
con el número de código digital obtenido mediante el programa de
etiquetado y el rango de profundidad muestreado, p.e.
A1001NM012ATF (500-1000). La letra debe ser muy clara, sin
tachaduras.
o Se vierten los 250ml sobre una columna de pequeños tamices de
1000, 500 y 200 µm. IMPORTANTE: asegurarse que están en este
orden.
o El contenido del tamiz de 1000 µm se vierte con la ayuda de un
pulverizador sobre una malla de forma cuadrada de 200 µm
dispuesta en un embudo a forma de “filtro de café”.
o Con un pulverizador se concentran los organismos en el centro de la
malla.
o Se abre la malla y se coloca sobre un papel secante, de tal forma
que se retira el máximo de agua de la muestra.
o Con una espátula se recogen los organismos y se pasan a un criovial
(eppendorf). Este debe tener un pequeño orificio en la tapa hecho
con un punzón para dejar pasar el aire y evitar que estalle tras la
congelación.

511
o Repetir el proceso para los tamices de 500 y 200 µm.
o Se introducen los crioviales en una media y a continuación en
Nitrógeno líquido para congelación inmediata. La media se queda
dentro de la lechera de N2.
o Cuando están todas las muestras procesadas se recuperan los
crioviales y se colocan dentro de la caja de congelación de cartón.
Después se llevan a la cámara congeladora de -80ºC para
almacenaje definitivo.
o
- Muestras para Genética:
o Se vierten 250ml sobre un tamiz de 200µm
o Se concentra la muestra con un pulverizador de agua de mar filtrada
(10 µm).
o Se lleva la muestra a un frasco de 50ml (tapón estrella) arrastrándola
con Etanol absoluto y la ayuda de un embudo pequeño.

- Taxonomía:
o Se vierten los 250ml de la alícuota directamente al frasco de 250 ml
(tapón estrella).
o Se añaden 25ml de formaldehído al 40% tamponado con Bórax con
la ayuda de una jeringa provista de un filtro desechable.

- Isótopos Estables (sólo para la muestra de 0-200m)


o Ver procedimiento correspondiente

- Otros estudios (excepto muestra superficial):


o Se vierten los 250ml de la alícuota directamente al frasco de 250 ml
(tapón estrella).
o Se añaden 25ml de formaldehído al 40% tamponado con Bórax con
la ayuda de una jeringa provista de un filtro desechable.

Recogida de material:
Lavar bien todas la redes con agua dulce después de cada uso. Inspeccionarlas
por si existe alguna rotura. Cubrir las redes con una loneta o plástico para
protegerlas de suciedad o posibles quemaduras.
Al final de cada etapa las redes deberían limpiarse en profundidad
introduciéndolas una noche en un tanque con agua dulce y un poco de lejía. En
caso de estar muy estropeadas cambiarlas por una nueva.

512
Estadillo de datos:

Muestreador: MULTINET
Prof. de Hora inicio Hora fin Vol. Filtrado
Observaciones
muestreo (UTC) (UTC) (m3)

Variable: MESOPLANCTON
Volumen Peso seco
Código digital muestras asoc Observaciones
alícuota filtro

Variable: MACROPLANCTON
Volumen
Código digital muestras asoc Observaciones
alícuota

Variable: ZOOPLANCTON GELATINOSO


Prof. Peso fresco Peso fresco Nº Total
Observaciones
muestreo total muestra residuos Organismos

Peso
Nº de Código Observacio
Código digital muestras asoc Taxón fresco
organis. foto nes
(sólo CNH)

513
10. Cuadro sinóptico de la técnica

Verter tamiz de 5000µm ¿Organismos NO


en bandeja gelatinosos?
5000µm + cerradas

Verter la muestra ¿El punto de


al conjunto SI muestreo termina
“jarra-tamiz” y al (4 0%) en 0 ó 5?
TANQUE 1
o

MACROZOO
TAXON Comenzar por estas muestras, para NO SI
evitar perder organismos apresados
por gelatinosos

OMÍA

Añadir 5ml de
Formaldehido y
5000µm enrasar con Agua
GELATINOSOS BOTE 50ml
Arrastrar con
Etanol a
BOTE 50ml
DEPURAR 1
HORA
5000µm
cerrada Protocolo
TANQUE 1:
9 CONJUNTOS
Organismos
TANQUE 2:
DE J ARRAS: 9 Gelatinosos
CONJUNT OS
DE J ARRAS:
CERRADA S
Enrasar a 1000ml

ISOTOPOS
q
¿M anga 200 -0 m? AÑADIR 25ml
cerrada Filt rar FORMALDEHIDO
n
cada
(4 0%)
ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA FRACCIONAR LA MUESTRA EN 4 SI
PARTES IGUALES (250ml x 4)
Col umna d e t amices
- 1000 µm BOTE
- 500 µm AÑADIR 2 5ml
FORMALDEHIDO BOTE 50ml Guardar 5 0ml 250ml
- 200 µm
y añadir 5 ml
fo rmol
BOTE 50ml
Pasar el resto
CONCENTRAR LA (200ml) por
MUESTRA (arrastrando columna de
con H2O FILTRADA) tamices
GENÉTICA
BOTE 250ml

Concentrar cada fracción


en malla de 200 µm
NO

tamiz a volu men


Recoger con con ocido
espátula
ARRASTRAR

tamaño
Enrasar cad a

CONGELAR
p CON
ETANOL
IN MEDIATAM ENTE EN
NIT RÓGEN O LÍQUIDO
Guardar filtro en placa petri
correspondiente. Secar a 50-
60ºC. Almacenar en caja
514
hermética con silica-gel
ALMA CENAR
CONG ELADO A -80 ºC
11. Calculo de los resultados.

No hay cálculos que realizar. Los volúmenes filtrados para cada pesca se
obtienen directamente del software de control de la multinet.

12. Control de calidad

Dado que se va a trabajar con 9 muestras diferentes y de estas resultarán multitud


de sub-muestras, es de vital importancia tener todos los recipientes a usar
correctamente rotulados, indicándose claramente el número de red al que hace
referencia.

Así mismo, cada tipo de muestra se va a conservar de distinto modo por lo que
resulta imprescindible identificar correctamente el reactivo o líquido contenido o
utilizado con los diferentes envases: botes, frascos lavadores, tamices, etc.

Se debe tener especial cuidado a la hora de arrastrar las muestras para llevarlas a
otro bote o tamiz. UNICAMENTE se utilizará líquido diferente al agua de mar
filtrada en el caso de las muestras destinadas a estudios de genética, puesto que
si la arrastrásemos con agua la concentración de conservante (etanol) disminuiría
pudiendo perjudicar la fijación de la muestra. El tamiz utilizado con etanol, estará
debidamente diferenciado del resto, marcado con una cinta de color verde.

Después de procesar las muestras, TODO EL MATERIAL debe ser lavado y


enjuagado con agua dulce.

515
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Recogida y procesado de muestras de plancton a bordo

2. Titulo de la técnica

Procesado de muestras para el análisis de isótopos estables en plancton

3. Autores del documento y filiación

A. Bode; A. Fernández Lamas - IEO, Centro Oceanográfico de A Coruña

4. Finalidad. Campo de aplicación

Obtener una distribución del contenido en isótopos estables de C y N, según


clases de tamaño, especies o grupos taxonómicos característicos del plancton.

5. Conceptos generales

La medida de la abundancia natural de isótopos estables permite hacer


inferencias sobre el origen de la materia orgánica y nutrientes inorgánicos en los
organismos y redes tróficas (Lajtha y Michener 1994). El proceso por el cual los
isótopos más ligeros reaccionan de forma preferente en las reacciones químicas
(fraccionamiento isotópico) causa que los productos de la reacción contengan
una mayor proporción de isótopos ligeros (enriquecimiento isotópico) a la vez que
las sustancias que reaccionan incrementan su proporción de isótopos pesados. El
conocimiento de los valores de abundancia natural de isótopos en las distintas
fuentes de materia orgánica y nutrientes (terrestres, marinas, antropogénicas,
etc.) en las que han ocurrido procesos diferentes de transformación es clave para
distinguir la contribución de nutrientes de cada fuente a un tipo de organismo.
Además, el fraccionamiento isotópico también causa que exista un
enriquecimiento en los isótopos pesados entre las presas y sus consumidores,
especialmente en el caso del nitrógeno (Vander Zanden y Rassmusen 2001). Esta
característica facilita la cuantificación de los niveles tróficos y los estudios de
estructura en las redes tróficas en el plancton (ej. Bode y Alvarez-Ossorio 2004,
Bode et al. 2007).

6. Equipamiento necesario

Estufa de secado (mejor con aire forzado, regulable a 60 ºC)


Sistema de filtración a vacío (bomba, rampa multipuesto, soportes y embudos
para filtros de 47 mm de diámetro, kitasato (2) o depósito para el agua)

7. Reactivos u otro material fungible

Reactivos:
• Agua de mar filtrada (al menos por 40 µm)

516
• Agua desionizada ultrapura Milli-Q o similar (DDW)
• Ácido clorhídrico (para preparar diluciones con DDW al 5%)
• Gel de sílice con indicador (Silicagel)

Material:
• Tamices plásticos (jarras) de malla de 40, 200, 500, 1000 y 2000 µm
• Embudos de plástico de boca ancha (capacidad 500-1000 ml)
• Nevera de plástico (para llenar de agua de mar filtrada y lavar los tamices)
• Jarra plástico de 2 l graduada
• Pulverizador (tipo matabi)
• Probetas de plástico (250, 1000 ml)
• Pinzas para filtros
• Frascos lavadores
• Filtros de fibra de vidrio (GF; ej. Whatman GFC). Cada filtro estará prepesado y
guardado en cajas de Petri de plástico con el peso anotado en la tapa de
cada placa.
• Placas Petri de plástico (con los filtros)
• Recipientes de plástico herméticos (tipo Tupperware)
• Papel de filtro de laboratorio (para hacer bolsitas en las que se mete Silicagel)
• Botes de plástico de 60 ml tapón de estrella
• Guantes de látex o vinilo (sin talco)
• Cinta adhesiva (para cerrar las placas)
• Material de etiquetado
• Estadillo

8. Calibración

Para el muestreo no hace falta ninguna referencia ni calibración. Para el análisis


posterior por espectrometría de masas se emplea como referencia la
composición isotópica del N2 atmosférico (Lajtha y Michener 1994). Para
interpretación de los resultados hace falta una referencia del ecosistema
estudiado (idealmente el fitoplancton o en su defecto la materia orgánica
particulada). En la expedición Malaspina el análisis de abundancia natural de C y
N en la materia orgánica particulada está previsto en el Bloque 3.

9. Descripción de la Técnica

Las muestras a procesar procederán de las pescas realizadas con la red de 40


micras y de las pescas superficiales (0-200 m) realizadas por la multinet.

Procesado de muestras de la red de 40 µm (microplancton):

Hacer una pesca vertical entre la superficie y por debajo del máximo de clorofila
(150-200 m en aguas oceánicas). No lavar la red con ninguna manguera de agua
marina mientras está en el cable con el colector. Desmontar y llevar al interior del
laboratorio con cuidado que no se vuelque el colector.

517
El contenido del colector se dividirá en dos partes iguales, una parte será para el
grupo de fitoplancton y la otra para el de zooplancton.

La muestra para zooplancton (1/2 muestra total) se vierte a una probeta de 500
ml, se enrasa a 250ml (foto 1), se homogeneiza por volteo tapando la parte
superior con la mano enguantada (fotos 2,3).

Si la muestra es >250ml se pasa por el tamiz más pequeño (40µm) y de ahí a una
jarra medidora de 2 L para reconcentrarla en 250ml (Foto 4). Se volvería a repetir
la homogeneización en la probeta (fotos 2,3).

De la muestra de 250ml, se guardan 50ml en un frasco de tapón de estrella (a


efectos de cálculos posteriores es 1/10 muestra total), al que se le añaden 5 ml de
formol al 40% tamponado con Bórax (foto 4).
El resto (200ml) se pasa por un tamiz de 200 µm superpuesto a otro de 40 µm y se
lava por inmersión en la nevera (cubo) llena de agua de mar filtrada (desechar la
fracción > 200 µm) (foto 5).

Pasar el contenido del tamiz de 40 µm a una jarra medidora de 2 L y enrasar a 250


ml (foto 4). Si es posible, filtrar todo el contenido de la muestra 250ml (2/5 de la
muestra total) por un filtro GF de 47 mm prepesado (foto 7).

Guardar el filtro en la caja Petri (foto 8). Anotar los datos correspondientes al
número de filtro (correlativo), peso seco del filtro y etiqueta de la placa en el
estadillo y el volumen filtrado si se filtran menos de los 250 ml.

Secar el filtro en su placa (abierta) en estufa (60 ºC, 24-48 h) (foto 9) y después
guardar la placa cerrada con cinta adhesiva en caja hermética (tipo
tupperware) con bolsitas de papel de filtro con Silicagel (foto 10).
Nota: Estas bolsitas de Silicagel hay que meterlas a la estufa cada 3-4 días para
que recuperen su efecto desecador.

Red de 200 µm (meso- y macrozooplancton):

Las muestras a procesar procederán de las pescas realizadas con la Multinet en el


intervalo 0-200 m de profundidad y representarán ¼ de la muestra total.
Pasar el contenido del colector a una probeta de 500 ml y enrasar con agua de
mar filtrada a 250 ml (aunque ya deberían estar los 250ml procedentes de la
Multinet) (foto 1). Homogeneizar bien la muestra por volteo (fotos 2,3).

Pasar una alícuota de 50 ml a un bote de plástico de tapón de estrella (ésta


representará 1/20 de la muestra total) (foto 4). Pasar el resto de la muestra 200ml
(1/5 de la muestra total) por la columna de tamices de 2000, 1000, 500 y 200 µm y
lavar bien cada fracción por inmersión de la columna de tamices en la nevera
con agua de mar filtrada (foto 6).

518
Pasar el contenido de cada tamiz a jarra medidora de 2L con la ayuda de un
pulverizador y enrasar a 250 ml (foto 4). Si es posible, filtrar todo el contenido de la
muestra por un filtro GF de 47 mm prepesado (foto 7). Si hay mucho plancton ir
filtrando alícuotas de 100 ml (medir con las marcas de la copa de filtración
cortando el vacio) hasta que el filtro esté completamente tupido y la velocidad
de filtración sea lenta (Nota: agitar bien la jarra antes de echar las alícuotas).

Guardar el filtro en la caja Petri (foto 8). Anotar los datos correspondientes al
número de filtro, peso seco del filtro, la fracción de tamaño correspondiente y
etiqueta de la placa en el estadillo, así como el volumen filtrado si se filtran menos
de los 250 ml enrasados. Secar el filtro en su placa (abierta) en estufa (60 ºC, 24-48
h) y después guarda la placa cerrada con cinta adhesiva en caja hermética con
bolsitas de papel de filtro con Silicagel (fotos 9,10).
Al retirar los filtros con su placa de la estufa, empaquetar juntas todas las placas
de cada estación/día (incluyendo la de la red de 40 µm).

Etiquetado: Además de etiquetar siempre con etiquetas impresas mediante la


aplicación informática MalaspinaLabel (ver protocolo de creación de etiquetas),
para evitar errores de interpretación de los datos, rotular cada placa con número
correlativo del filtro mediante rotulador indeleble. Cada etiqueta debe ser
cubierta por cinta de precinto transparente suficientemente ancha como para
cubrir sobradamente la etiqueta. Verificar los datos de la etiqueta con los datos
del muestreo.

Las etiquetas seguirás el siguiente modelo:

519
520
Estadillo de datos:

Muestreador: RED DE 40 µm
Hora Columna
Latitud Longitud Hora inicio
fin muestreada

Observaciones

Variable: MICROPLANCTON

Muestra formol
Volumen
Código digital muestras asoc Observaciones
alícuota

1/10 Formol frasco 50 ml

Muestra isótopos
Volumen
Código digital muestras asoc nº filtro peso filtro Observaciones
alícuota

2/5

Muestreador: MULTINET
Prof. de Hora inicio Hora fin Vol. Filtrado
Observaciones
muestreo (UTC) (UTC) (m3)

Variable: MESOPLANCTON
Código digital muestras fracción Volumen nº filtro peso filtro Observaciones
asoc alicuota

2000 1/5

1000 1/5

500 1/5

200 1/5

521
10. Cuadro sinóptico de la técnica

522
523
11. Calculo de los resultados

No son necesarios cálculos durante la Campaña. No obstante, debe prestarse


especial atención al volumen de cada alícuota filtrada respecto al volumen de la
muestra total y del valor del pre-pesado del filtro para poder realizar
posteriormente los cálculos de densidad.

12. Control de calidad

No hay controles de calidad específicos para este muestreo. Mantener una


limpieza escrupulosa de las redes en su uso y almacenamiento. Usar guantes al
manipular las muestras y trabajar en un lugar limpio. Lavar todo el material
(tamices, copas de filtración, embudos) con agua acidulada (agua destilada
Milli-Q con HCl al 5%, aproximadamente) al finalizar las operaciones diarias.

13. Otras técnicas similares

El muestreo de plancton puede hacer por varios otros métodos: bombas de


succión, redes de otros tipos, botellas oceanográficas, etc (ej. Harris et al. 2000).
La alternativa al secado de plancton, paso previo necesario para después aplicar
la espectrometría de masas, es la liofilización que se suele aplicar a organismos de
mayor tamaño (ej. Bode et al. 2007).

14. Referencias

Bode A, Alvarez-Ossorio MT (2004) Taxonomic versus trophic structure of


mesozooplankton: a seasonal study of species succession and stable carbon
and nitrogen isotopes in a coastal upwelling ecosystem. ICES J Mar Sci 61:563-
571
Bode A, Alvarez-Ossorio MT, Cunha ME, Garrido S, Peleteiro JB, Porteiro C, Valdés L,
Varela M (2007) Stable nitrogen isotope studies of the pelagic food web on the
Atlantic shelf of the Iberian Peninsula. Prog Oceanogr 74:115-131
Harris RP, Wiebe P, Lenz J, Skojdal HR, Huntley M (2000) ICES zooplankton
methodology manual, Academic Press, San Diego
Lajtha K, Michener RH (1994) Stable isotopes in ecology and environmental
science., Vol. Blackwell Scientific Publications, Oxford
Vander Zanden MJ, Rasmussen JB (2001) Variation in d15N and d13C trophic
fractionation: Implications for aquatic food web studies. Limnol Oceanogr
46:2061-2

524
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Procesado de muestras de zooplancton gelatinoso para taxonomía, barcoding y


análisis del contenido en carbono

2. Titulo de la técnica

Muestreo de zooplancton gelatinoso

3. Autores del documento y filiación

J.L. Acuña F. y A. Molina – Ramírez -Universidad de Oviedo-

4. Finalidad. Campo de aplicación

Tratamiento de muestras de zooplancton gelatinoso destinadas a análisis


filogenéticos de código de barras de ADN, fotografía digital para identificación
taxonómica, peso fresco y contenido de carbono.

5. Conceptos generales

Excepto en el caso de especialistas que tienen un interés particular en el estudio


del plancton gelatinoso, éste tipo de organismos raramente se muestrea en el
mar. En general, son animales frágiles y que, cuando aparecen, lo hacen en
densos enjambres que obturan las redes de pesca. Esto suele ser interpretado
como un problema más que como una oportunidad, y en no pocas ocasiones el
material gelatinoso es despreciado. Esta práctica, aunque humanamente
comprensible, no se compadece con la importancia ecológica y
socioeconómica de éstos organismos, que median importantes flujos de materia y
energía, obturan redes de pesca, cierran playas turísticas (Richardson et al; 2009),
compiten con los peces (Purcell y Strudevant, 2001), etc.

Es de suponer que, durante la campaña MALASPINA 2010, se muestrearán una


gran diversidad de ambientes, por lo que es grande la probabilidad de
encontrarse con zooplancton gelatinoso, contemplándose la posibilidad de que
muchos de esos organismos sean nuevos para la ciencia. Es preciso disponer de
un protocolo adaptativo para responder a esas situaciones, permitiendo el
muestreo de una serie de parámetros básicos sobre la biodiversidad y ecología
de éstos organismos. Al mismo tiempo, ese protocolo debe ser sencillo y aplicable
por no especialistas.

Esta ficha contiene un guión simple, adaptativo y orientado a cubrir los siguientes
aspectos:

1) La identificación taxonómica a partir de ejemplares fijados.


2) La obtención de una marca genética (barcoding) que permita registrar la
biodiversidad incluso en el caso de que no se disponga de una identificación

525
taxonómica.
3) La medición del contenido en carbono y del peso fresco, con el objeto de
poder hacer estimas de actividad fisiológica, y para reconstruir el origen
filogenético de la estrategia gelatinosa.

El tratamiento y la preservación de las muestras para cada uno de estos objetivos


son mutuamente incompatibles: una muestra que se seca y quema para la
medición del contenido en carbono queda inutilizada para la identificación
taxonómica o el barcoding. Por lo tanto, cada tipo de análisis consume una
cantidad de muestra, pudiendo no haber suficiente para los tres tipos de análisis.
Por lo tanto, se ha priorizado el análisis de acuerdo con la lista anterior, de modo
que, si hay suficiente material, se recogerán los tres tipos de muestras. Sin
embargo, si hay poco material, se muestreará sólo para barcoding y taxonomía, y
si hay muy poco se muestreará sólo taxonomía. Existe la posibilidad de errores en
la identificación de los animales que se usan para barcoding y contenido en
carbono. Para que estos problemas puedan ser detectados y corregidos, se
realizarán fotografías de alta calidad que permitan una identificación de esos
animales a posteriori.

6. Equipamiento necesario

Redes de plancton
Congelador -80ºC
Balanza de 0.1gms de precisión
Estufa a 60ªC
Cámara DSLR (canon Mark III)
Objetivo macro 100mm
Mesa de reprografía Kaiser Re PRO con columna
Juego de Flashes de Estudio de 600W
Brazos articulados para flashes
Placa-stand de policarbonato
Ordenador Macintosh IMAC 21,5 pulgadas (para el control remoto de la cámara)
Disco RAID 4TB
Software de manejo remoto de la cámara y de administración de archivos
fotográficos
Software de respaldo automático de información
Cables USB
Cables firewire 800
Cable Syncro
Supresor de picos de energía eléctrica

7. Reactivos u otro material fungible

Reactivos:
Agua de mar filtrada

526
Silicagel para muestras secas de CNH
Etanol Absoluto 96%
Formol al 4%
Cristales de mentol
Nitrógeno líquido

Material:
Baño para mantener muestras frescas
Jarra de filtración con tamiz de 5mm
Placas petri de vidrio (con escala de tamaño en el fondo)
Frascos lavadores
Lámpara de alcohol o mechero bunsen
Pinzas
Coladores de distintos tamaños
Red de NYTAL
Bandejas de aluminio de diferentes tamaños
Botes plásticos de precintado (volúmenes: 180,280, 500, 800 ml.)
Dispensador de volumen fijo para formol
Dispensador de volumen fijo para etanol absoluto
Papel para etiquetas de muestras de sistemática
Marcadores indelebles
Tubos de centrifuga de polipropileno de 15 ml (para muestras de barcode)
Pesos de referencia para calibración
Balanza con precisión 0.2mg

8. Calibración

En el proceso de determinación de peso húmedo se requiere utilizar pesas de


referencia para calibrar la balanza. En el proceso de obtención de imágenes
digitales se requiere calibrar el tipo de iluminación en función de un patrón
general de los diferentes grupos de zooplancton gelatinoso. Este proceso previo
permite que la obtención de imágenes implique que la interacción del operario
con la muestra se limite al encendido y apagado del equipo y al enfoque del
organismo teniendo como referencia un cuadro de los caracteres taxonómicos
relevantes para diferentes grupos de zooplancton gelatinoso (ver técnica de
fotografía de zooplancton gelatinoso sección 7 y cuadro de caracteres) .

9. Descripción de la Técnica

A continuación presentamos una serie de apartados que contiene el flujo de


operaciones requeridas durante el muestreo, que incluye decisiones, saltos entre
secciones y repeticiones de procesos o bucles. Las secciones son presentadas
con la estructura de código de programación y dependiendo de la situación se

527
vuelve o se dirige a puntos específicos del proceso. Se describen también los
procesos de etiquetado y preparación del equipo fotográfico .

PROTOCOLO MUESTREO ZOOPLANCTON GELATINOSO

p1. A LA LLEGADA DE LA PESCA

p1. 1. Comprobar si hay zooplancton gelatinoso (ZG) en la pesca. Se deben


revisar las jarras-tamices de la fracción > 5000 micras colocados en el tanque
isotérmico de recepción de las muestras de la Multinet y de la red de neuston.

p1. 2. Si lo hay, y hay otros organismos no gelatinosos en esta fracción, verter el


contenido de la jarra de 5000 µm en una bandeja con un poco de agua,
separando los organismos gelatinosos y no gelatinosos. Los organismos no
gelatinosos de la fracción > de 5000 µm, se fijan en formol 4%, excepto los
colectados en los puntos de muestreo terminados en 0 y 5 que se fijan en
etanol absoluto para análisis genético. Ambos tipos de muestras van
colocados en un frasco de tapón de estrella de 50 ml. Los organismos
gelatinosos se volverán a colocar en la jarra-tamiz de 5000 µm y ésta se re-
colocará en la gradilla del tanque isotérmico 2 preparado para la depuración
de material gelatinoso.

p1. 3. Verificar si aún hay material de ZG en los colectores. Si queda ZG ir a p1.2

p1.4. Dejar a los organismos en el agua filtrada del baño isotérmico durante 1 h
para que defequen.

p 1.5. Hacer una pesada de todo el material gelatinoso contenido en cada una
de las jarras. Retirar el agua excedente utilizando una malla de NYTAL y pesar
el material en una bandeja de aluminio de tamaño proporcional a la
cantidad de material gelatinoso recolectado. Anotar en estadillo.

p1.6. Trillar la muestra de una de las jarras utilizando pinzas, garcilla, o coladores
de acuario, poniendo cada individuo en un bote con agua filtrada. Los botes
estarán previamente numerados y los individuos recolectados en cada jarra
deberán irse adicionando a los botes ordenados por taxones, considerando
cuantos individuos de cada taxón han sido recolectados de acuerdo al
siguiente orden de prioridades:
1 Individuo –Muestra para sistemática
2 Individuos-Muestra para sistemática y para DNA barcode
3 ≥ individuos – Muestra sistemática, DNA barcode y el resto para biomasa y
CHN

p1.7. Anotar el número de cada uno de los botes en los cuales se fueron
guardando los organismos recolectados

528
p 1.8. Hacer una pesada de el material gelatinoso residual o restante que no ha
logrado separarse (por ejemplo organismos incompletos y material gelatinoso
que no se logre distinguir claramente). Anotar en estadillo.

p1.9.Colocar los botes de cada individuo recolectado en la caja de transporte y


pasar a la sección de fotografía P2.

529
p2. FOTOGRAFÍA DE ZOOPLANCTON GELATINOSO

p2.1. Encender el enchufe general (alimenta las cámaras, la mesa de reprografía,


el sistema de iluminación y el disco duro externo).

p2.2.Los organismos se fotografiaran en el orden en el que fueron ordenados


individualmente en cada frasco.

p2.3. Coger el individuo a fotografiar con pinza, garcilla o coladores de acuario y


ponerlo sobre una placa de petri con agua de mar filtrada con mentol junto a
una escala espacial del tamaño adecuado. Si es una medusa, orientar los
tentáculos hacia arriba (posición ventral de la medusa).

P2.4. Disponer la bandeja en el centro de la mesa de reprografía, justo debajo del


objetivo de la cámara. Mover el cabezal de la columna utilizando el control
del motor hasta que el organismo a fotografiar cubra más de ¾ y menos de
95% del campo de la imagen.

P2.5.Utilizando la función de enfoque del software de control enfocar el


organismo, verificar que este enfocado todo el organismo especialmente los
caracteres necesarios para su correcta determinación. Estos caracteres son:
●En medusas (Ver esquema de caracteres diagnósticos)
●En salpas (Ver esquema de caracteres diagnósticos)
●Para otros grupos de zooplancton gelatinoso (Ver esquema de
caracteres diagnósticos)

p2.6 La cámara debe estar en el perfil de usuario C1 y modo M (f32, S60).

P2.7 Hacer un disparo de prueba, usando la opción de disparo de prueba del


software de control de la cámara (“EOS Utility”) de para verificar que el
organismo se encuentra enfocado.

P2.8 Disparar tres fotografías por individuo

P2.9 Apuntar el código de las fotografías en el estadillo (Ver sección p8 para


códigos del estadillo)

P2.10 Colocar los organismos en la caja de transporte e Ir a p3. para continuar


con el muestreo de sistemática.

530
p3. MUESTREO PARA SISTEMÁTICA.

P3.1 Seleccionar el primer individuo de cada taxón de la serie de frascos


numerados.

p3.2. De los botes de sistemática disponibles, seleccionar uno en el que el animal


esté holgado (p.e. que ocupe un 10% a lo más del volumen interior del bote).

P3.3. Rellenar con las cantidades adecuadas de formol al 40% tamponado con
bórax y agua de mar filtrada para obtener una concentración final de formol
al 4%, utilizando las jeringuillas destinadas a este fin.

P3.4. Etiquetar de acuerdo con la sección p8.

P3.5. Sellar bote con sistema de precintado y almacenar en la correspondiente


caja de almacenaje de muestras en formol de gelatinosos.

P3.6. ¿Quedan mas organismos del mismo taxón? Ir a P.4 para muestreo de DNA
Barcode.

P3.7.¿Quedan organismos de otros taxones ir p3.1.


Si quedan organismos en otras jarras correspondientes a otro colector ir a p1.8. Si
no quedan mas organismos apagar de acuerdo a la sección P.8

531
P4. MUESTREO PARA DNA BARCODE.

P4.1 Para esta finalidad se requieren dos ejemplares, sin embargo si solo se
dispone de uno además del ejemplar de sistemática el segundo se utilizara para
barcoding

p4.2. Si el animal entra en el bote de barcoding (criovial de 15ml) y deja 90% del
volumen interior libre ir a 3.5. Si el animal no entra en el bote o no deja 90% de
su interior libre, pasar a p3.4.

p4.3. Cuando el animal no entra en el bote de barcoding se deberá tomar un


pedazo de tejido preferentemente de los brazos o del margen de la
campana. Es necesario utilizar pinzas estériles o que previamente hayan sido
pasadas por un mechero bunsen o una lámpara de alcohol, el fragmento de
tejido se almacena en un bote de barcoding. Los restos del organismo se
guardan en un frasco separado con etiquetado para taxonomía (atención,
no para genética) pero indicando que es la replica 2, pues ya existen un
frasco con la misma codificación proveniente del punto p2. Anotar en
Observaciones de la muestra obtenida para genética que “los restos del
organismos están en el frasco de código “indicar código digital”

p4.4. Introducir el fragmento o el individuo en un bote de barcoding meterlo en el


bote usando pinzas, rellenar el bote con etanol absoluto usando un frasco
lavador.

P4.5. Etiquetar de acuerdo con las instrucciones de la sección p7. Como el


procesado implica la utilización de dos frascos con ejemplares del mismo
taxón y mismos muestreos, etc., se etiquetarán considerándolos replicados.

p3.6. Pasar el bote de barcoding por nitrógeno líquido usando una media y
almacenar en el congelador a -80ºC. Guardar en el contenedor designado
para las muestras de DNA Barcoding en el congelador.

p3.8 Si queda alguna otro frasco con otro taxón (uno o varios individuos), volver a
empezar en la sección P3. Si no quedan más taxones, el muestreo ha
finalizado. Apagar el equipo según sección P.8.
Si quedan mas organismos en los botes pasar a la sección de biomasa y CHN. Si
quedan organismos en otras jarras correspondientes a otro colector ir a p1.8. Si no
quedan mas individuos apagar de acuerdo a la sección P.8.

532
P5. MUESTREO PARA CONTENIDO EN CARBONO.

P5.1. Seleccionar una bandeja de aluminio que se adapte al tamaño del


individuo más grande que quede del trillado. En la base de todas las bandejas
está escrito su peso, anotarlo en el estadillo. Coger el individuo más grande
que quede.

P5.2. Se retira el exceso de agua a los organismos con papel secante y una tela
de NYTAL. Esta operación se realiza utilizando los diferentes tipos de coladores
y la tela de NYTAL.

P5.3. Poner la bandeja de pesada en la balanza (0.2mg de precisión), (no debe


tararse pues está pre-pesada) añadir el organismo y pesarlo, ir agregando los
organismos que resten de la misma especie, registrar el peso por organismo y
el peso de todos los organismos de la misma especie, hasta acumular 10g.
Hacer 5 pesadas, se debe registrar el peso de cada organismo y el peso total
de todos los organismos en la bandeja.

P5.5 Registrar los datos de las cinco pesadas correspondientes a cada individuo y
el peso total en el estadillo. Calcular la media y desviación típica de las
medidas y anotar estos valores en la celda correspondiente del estadillo. en
sección p8.

Quedan mas organismos de la misma especie. Ir a p4.1. tantas veces como se


requiera para completar bandejas de 10g

P5.6. Poner a secar la bandeja de acuerdo a con la sección p6.

p4.7.¿ Quedan organismos en los frascos numerados?


Si aún quedan individuos de ese taxón en los frascos numerados, ir al punto p4.2.,
teniendo en cuenta para el etiquetado que los frascos que se origen a partir
de ahora serán réplicas de este primero. Si no hay más ejemplares, el
muestreo de este taxón ha acabado. Si queda algún frasco con otro taxón
(uno o varios individuos), ir a empezar en la sección p3 y procesar cada
individuo en el orden que fueron fotografiados. Si quedan organismos en otras
jarras correspondientes a otro colector ir a p1.8. Si no quedan más taxones, el
muestreo ha finalizado. Apagar el equipo según sección p9.

533
p.6 SECADO DE ZOOPLANCTON GELATINOSO

p6.1 Verificar que la temperatura de la estufa este a 60ºC.

p6.2 Cerciorarse de que la bandeja de aluminio tenga registrado su código digital


en el estadillo y adherir la etiqueta correspondiente a cada bandeja (ver
sección 8)

p6.3 Secar en la estufa a 60ºC. durante 48 hrs.

P6.4 Pasado el tiempo de secado y evaporación en la estufa sacar las bandejas


con las muestras de la estufa, cortarlas y doblarlas en forma de sobre. Cada
bandeja se introducirá en una bolsa tipo zip que tendrá pegada en su exterior
una etiqueta idéntica a la de la bandeja. Dentro de cada bolsa se
introducirá silicagel para evitar la humedad.

P6.5 Almacenar en el sitio designado para muestras de CNH.

534
P7. ETIQUETADO DE MUESTRAS DE SISTEMÁTICA Y BARCODING

Crear cada etiqueta por separado, una vez que se tiene el frasco con el
organismo, con el programa de generación de etiquetas Malaspina Label,
teniendo en cuenta que todos frascos generados a partir de una sola muestra y
para la misma finalidad (taxonomía, genética o CNH) serán considerados
replicados entre sí. Si la muestra es para taxonomía meter una etiqueta de papel
vegetal en el bote con el código digital del frasco. Colocar la etiqueta en el
frasco o bandeja protegida por cinta adhesiva transparente.
En el caso del frasco de 15 ml (criovial), no etiquetar pues irá a N2, rotular el
correspondiente código digital.

p8.2. Registrar en el estadillo los siguientes datos de cada bote:


Código digital de cada frasco
Taxón: Si se determinó o en su defecto marcar como Zooplancton
gelatinoso
Nº de organismos incluidos en cada frasco
Códigos fotos: MK 134-137. Esto indica que para este individuo, se han
hecho las fotos 134 a 137 con la cámara Mark III de la mesa de
reprografía.
Peso de la bandeja
Peso fresco total muestra + bandeja
Observaciones: las que procedan

Volver a p3.5.. si es sistemática


Volver a p3.6 si es DNA barcoding

P9. APAGADO DEL EQUIPO.


Para terminar la parte fotográfica seguir esta secuencia

p9.1 Apagar y desconectar fuentes de iluminación (flashes)

p9.2 Apagar el motor de la columna

p9.3 Hacer backup usando software de respaldo “Time machine”

p9.4 Cerrar software

p9.5 Desconectar cámara del ordenador (conector USB)

p9.6 Apagar cámara

p9.7 Revisar y llenar estadillo correspondiente al material obtenido durante el


día

p9.8 Apagar ordenador

535
10. Cuadro sinóptico de la técnica

Ver esquema al final de la ficha

11. Calculo de los resultados.

No hay cálculos

12. Control de calidad

Por motivos relacionados al movimiento del barco existe cierta variación en los
resultados del peso húmedo. Por lo que se realizan 5 pesajes y se considera el
valor de la media. Se contempla el uso de pesas de referencia para calibrar
constantemente la balanza.

13. Otras técnicas similares

No hay una técnica específica que englobe el tratamiento de muestras de


zooplancton gelatinoso en un solo flujo de trabajo que comprenda la obtención
de imágenes digitales, la obtención de muestras para análisis molecular y el
procesamiento de material para análisis de CNH. Si existen protocolos o técnicas
para el fotografiado de plancton gelatinoso (Svoboda, 1992), para el muestreo
de barcoding (Dawson et al 1998), para el análisis de CHN en zooplancton, (Postel
et al 2000; Larson, 1986). Este protocolo integra los diferentes enfoques de
procesado de muestras de zooplancton gelatinoso en un solo flujo de trabajo.

14. Referencias

Dawson M.N, K.A. Raskoff, & D.K. Jacobs. 1998. Preservation of marine invertebrate
tissues for DNA analyses. Molecular Marine Biology and Biotechnology 7: 145-
152

Larson RJ 1986 Water content, organic content, and carbon and nitrogen
composition of medusae from the northern pacific. Journal of Experimental
Marine Biology and Ecology 99:107–120

Postel L., H. Fock and W. Hagen 2000 Biomass and Anbundance. In R. P. Harris, P. H.
Wiebe, J. Lenz, H. R. Skjoldal, and M. Huntley, editors. Zooplankton
Methodology Manual. Academic Press, San Diego, California 83-174pp.

Purcell J.E. & Strudevant M.V. 2001 Prey selection and dietary overlap among
zooplanktivoros jellyfish and juvenile fishes in Prince William Sound, Alaska.
Marine Ecology Progress Series 210: 67-83

536
Richardson A, Bakun A, Hays G, Gibbons M. 2009. The jellyfish joyride: causes,
consequences and management responses to a more gelatinous future.
Trends in Ecology and Evolution 24:312-322

Svoboda, A. 1992 Close-up photography of marine life on board research vessels.


Scientia Marina 56 (2) 239-244

537
Esquema de caracteres diagnósticos de los principales taxones de zooplancton
gelatinoso.

538
p1.1.  ¿Hay  ZG  en  alguno  de  los  colectores  de  la  red  mulCnet  o  red  de   X  9  
SECCIÓN  p1:  TRATAMIENTO  INICIAL  
neuston  de  la  pesca  en  el  baño  de  agua  de  mar  fría  y  filtrada?  

no  
si  
FIN  DEL  MUESTREO  

p1.2.  Pasar  el  contenido  de  un  colector  con  ZG  por  una  copa  o  jarra  
de  filtración  con  malla  de  5  mm    
Luz  de  malla5mm  

p1.3.  Colocar  la  malla  dentro  del  baño  frio  para  ZG     si  

Colectores  con  ZG  


p1.4.  ¿Queda  ZG  en  alguno  de  los  colectores  de  la  red  mulCnet  o  red  
de  neuston  de  la  pesca  en  el  baño  de  agua  de  mar  fría  y  filtrada?    
1  hr  

no  

p1.  5.  Dejar  a  los  organismos  en  el  agua  filtrada  durante  1  h  para  que  
defequen.  

p1.  6.  Cuando  se  vaya  a  comenzar  el  procesado,  encender  el  enchufe  
general  (alimenta  la  cámara,  la  mesa  de  reprogra[a,  el  sistema  de  
iluminación  y  el  disco  duro  externo).  

p1.7.  Trillar    un  colector,  poniendo  todos  los  individuos  


pertenecientes  una  misma  especie  en  una  bandeja  de  aluminio  del  
tamaño  adecuado,  mediante  pinzas,  o  garcilla,  o  coladores  de  
acuario,  con  agua  de  mar  filtrada.  

p1.8.  Seleccionar  una  de  las  bandejas  para  su  procesado.  

p2.1.  Seleccionar  un  individuo  


SECCIÓN  p2:  MUESTRA  DE  SISTEMÁTICA  

p2.5.Fotografiar  el  espécimen  de  acuerdo  con  DIAGRAMA  DE  


FOTOGRAFIADO  DE  ESPéCIMEN  (SECCIÓN  6)  
Botes  de  sistemáCca  

p2.3.  De  los  botes  de  sistemáCca  disponibles,  seleccionar  uno  en  el  
que  el  animal  esté  holgado  (p.e.  que  ocupe  un  10%  a  lo  más  del  
volumen  interior  del  bote).,  y  poner  el  espécimen  en  su  interior.  

p2.4.    Rellenar  con  las  canCdades  adecuadas  de  formol  puro  (4%)  y   (4%)  CH2O  +    (96%)  H2O  filtrada  
agua  de  mar  filtrada  (96%),  uClizando  los  dispensadores.  

p2.5.  EKquetar  de  acuerdo  con  la  sección  8.  Poner  eCqueta  con  
papel  en  el  interior  de  la  muestra  y  por  fuera  del  bote  

p2.6.  Sellar  bote  con  sistema  de  precintado  y  almacenar  en  el  
contenedor  dispuesto  para  las  muestras  de  sistemáCca  almacenadas  
en  formol  

p2.7.  ¿Queda  algún  individuo  en  la  bandeja  de  trillado?  

no  

p2.8.  ¿Queda  alguna  bandeja  de  trillado  correspondiente  a  ese  


colector?   si   Vuelve  a    p1.8  

no  
si  
p2.9.  ¿Queda  algún  colector  con  ZG?   si   Vuelve  a  p1.7  

no  

FIN  DEL  MUESTREO  

SIGUE  EN  PÁGINA  SIGUIENTE  


VIENE  DE  PÁGINA  ANTERIOR  

p3.1.  Seleccionar  un  individuo  de  la  bandeja  


Etanol  absoluto  90%  vol.  del  bote  
SECCIÓN  p3:  MUESTRA  DE  DNA  BARCODE  

p3.2.  Fotografiar  el  espécimen  de  acuerdo  con  DIAGRAMA  DE  


FOTOGRAFIADO  DE  ESPÉCIMEN  (SECCIÓN  5)  

p3.3.    El  espécimen  ¿entra  en  el  tubo  de  barcoding  y  deja  más  de  un  
90%  de  espacio  libre  en  su  interior?  

no  

SI   p3.4.  Tomar  un  pedazo  de  tejido  preferentemente  de  los  brazos  o  de  
el  margen  de  la  campana.  Es  necesario  uClizar  pinzas  esterilizadas  en  
una  lámpara  de  alcohol.  
Pinzas  estériles  

p3.5.  Introducir  el  fragmento  o  el  individuo  un  bote  de  barcoding.  
Rellenar  con  etanol  puro  usando  un  frasco  lavador.  

p3.6.  EKquetar  de  acuerdo  con  SECCIÓN    8.  Pasar  la  muestra  por  el  
nitrógeno  líquido  usando  una  media  y  almacenar  en  el  congelador  a  
-­‐80.     Puntos  adecuados  para  cortar  tejido    

p3.7.  Pasar  la  muestra  por  el  nitrógeno  líquido  usando  una  media  y  
almacenar  en  el  congelador  a  -­‐80.    

p3.7.  ¿Queda  algún  individuo  en  la  bandeja  de  trillado?  

no  

p3.8.  ¿Queda  alguna  bandeja  correspondiente  a  ese  colector?   si   Vuelve  a  p1.8  

no   -­‐  80  ºC  


p3.9.  ¿Queda  algún  colector  con  ZG?   si   Vuelve  a  p1.7   2  
si  
no  
FIN  DEL  MUESTREO  
SECCIÓN  p4:  PESADO  PARA  BIOMASA  Y  CNH  

p4.1.  Seleccionar  una  bandeja  de  aluminio  tarada    que  se  adapte  al  
tamaño  del  individuo  más  grande  que  quede  del  trillado.  En  la  base  de  
todas  las  charolas  está  escrito  su  peso.    

Bandeja  de  Al  pesada  previamente  


p4.2.  Seleccionar  un  espécimen  y  fotografiar  el  espécimen  de  
acuerdo  con  DIAGRAMA  DE  FOTOGRAFIADO  DE  ESPÉCIMEN  
(SECCIÓN  6).  

p4.3.  Se  reCra  el  exceso  de  agua  a  los  organismos  con  papel  secante  y  
una  tela  de  NYTAL.  Esta  operación  se  realiza  uClizando  los  diferentes  
Cpos  de  coladores  y  la  tela  de  NYTAL  

p4.4.  Añadir  el  espécimen  a  la  bandeja  de  aluminio  tarada  y  pesarla  
en  la  balanza  con  precisión  de  0,1  g.   si  

p4.5.  Apuntar  datos  especimen  en  el  estadillo  ECquetar  de  acuerdo   si   Se  reCra  el  exceso  de  agua  con  la  red  de  NYTAL  y  colador  plano  
con  DIAGR.  DE  ETIQUETADO(SECCIÓN    7).    

p4.6.  ¿Pesa  la  bandeja  de  pesada  más  de  10  g?  

no  

si   p4.7.  ¿  Quedan  espécimenes  en  la  bandeja  de  trillado?  

no  

p4.8.  EKquetar  la  bandeja  de  pesada  de  acuerdo  con  DIAGR.  DE  
ETIQUETADO(SECCIÓN    8.    

p4.9.  Poner  la  bandeja  a  secar  de  acuerdo  con  la  sección  5  
Se  tara  en  la  balanza  bandeja  de  Al  

p4.10.  ¿  Quedan  espécimenes  en  la  bandeja  de  trillado?  

no  

p4.11.  ¿Queda  alguna  bandeja  correspondiente  a  ese  colector?   si   Vuelve  a  p1.8  

no  

p4.12.  ¿Queda  algún  colector  con  ZG?   si   Vuelve  a  p1.7  


Se  pesa  material  gelaCnoso  X5  se  considera  la  media  
no  
FIN  DEL  MUESTREO  
SECCIÓN  p5:  SECADO  PARA  DETERMINACIÓN  DE  CNH  
VIENE  DE  PÁGINA  ANTERIOR  

60o  C  
p5.1  Verificar  que  la  temperatura  de  la  estufa  este  a  60ºC  

p5.2  Cerciorarse  de  que  la  bandeja  de  aluminio  tenga  registrado  su  
numero  de  registro  en  el  estadillo      

                           p5.3  Secar  en  la  estufa  a  60ºC.  durante  48  hrs  

Tiempo  de  secado   48  hrs.  

p5.4  Pasado  el  Cempo  de  secado  y  evaporación  en  la  estufa  sacar  las  
bandejas  con  las  muestras  de  la  estufa  cortarlas  y  doblarlas  en  forma  de  
sobre     1)  

Doblado  de  bandejas  


 con  material  seco     2)  
p5.5  Cada  bandeja  debe  tener  registrado  el  numero  que  corresponde  
al  estadillo  
3)  

p5.6  Almacenar  en  el  siCo  designado  para  muestras  de  CNH  
Bandeja  lista  para  
almacenarse    
FIN  DEL  MUESTREO  
VIENE  DE  SECCIONES  p2,  p3,  y  p4  

SECCIÓN  p6:  PREPARACIÓN  MESA  DE  REPROGRAFÍA   Conexión  ordenador  -­‐cámara  

p6.1.  Asegurarse  de  que  el  cable  conector  de  la  cámara  al  ordenador  
está  conectado    

p6.2.  Encender  la  cámara  de  la  mesa  de  reprogra[a  (la  Canon  EOS  Mark   Encendido  cámara  y  mesa  de  rperogra[a  
III).    

p6.3.  Debe  acCvarse  el  programa  de  control  de  la  cámara  ("EOS  UClity")  y  el  
programa  de  administración  de  archivos  fotográficos  ("Digital  photo  
professional").    

p6.4  Si  el  sorware  de  control  de  la  camara  no  se  acCva.  Seguir  la  siguiente  
secuencia:  
1)  Ir  a  el  buscador  de  archivos  o  finder  y  abrir  la  carpeta  aplicaciones   Sorware    de  administración  de  archivos  
fotográficos  “Digital  photo  professional”    
2)  Abrir  la  carpeta  canon  uCliCes    
3)  Hacer  doble  click  en    la  en  el  icono  EOS  uClity  y  Digital  Photo  Professional    
4)  Si  no  se  hay  comunicación.  Verificar  los  cables.  Apagar  y  enecender  la  
camara    

p6.5.  Encender  el  sistema  de  iluminación/flash.    

p6.6    Asegurarse  de  la  cámara  está  en  modo  AV  y  en  modo  C1    

Sorware    de  control  de  la  cámara    “Eos  UClity”    en  modo  AV  y  C1  
p6.7  Asegurarse  de  que  la  posición  del  flash  es  correcta    

p6.7  Fin  preparación  mesa  reprogra[a.  Seguir  en  7.1    Para    tomar  
fotografias    

Interruptor  encendido  /apagado  Flash  (botón  rojo)  

Posición  adecuada  del  Flash  

p7.1.  Coger    el  individuo  que  esté  en  mejor  estado,  ponerlo  sobre  una  
placa  de  petri  que  contenga  una  escala  espacial  del  tamaño  adecuado;      
con  agua  de  mar  filtrada  con  mentol  que  se  saca  de  frasco  rociador  .  Si  
es  una  medusa,  orientar  los  tentáculos  hacia  arriba.  
SECCIÓN  p7:  FOTOGRAFÍA    ZG  

Solución  de  mentol  y  agua  mar  filtrada  -­‐    Agregar  10  


gotas      
p7.2.  Disponer  la  bandeja  en  el  centro  de  la  mesa  de  reprogra[a,  
debajo  del  objeCvo  de  la  cámara.  Mover  el  cabezal  de  la  columna  
uClizando  el  control  del  motor;  el  organismo  fotografiar  debe  cubra  
mas  de  ¾  y  menos  de  95%  del  campo  de  la  imgen.    

p7.3.UClizando  la  función  de  enfoque  del  sorware  de  control,  enfocar  
el  organismo,  verificar  que  este  enfocado  todo  el  organismo  
especialmente  los  caracteres  necesarios  para  su  correcta  
determinación.    (VER  ESQUEMA  DE  CARACTERES)  

Proporciones    adecuadas  de  iluminación  y  enfoque  


p7.4  La  camara  debe  estar  configuara  en  el  perfil  C1  y  modo  AV  

p7.  5  Hacer  un  disparo  de  prueba  para  verificar  que  el  organismo  se  
encuentra  enfocado    

p7.6  Disparar  tres  fotografias  por  individuo    

p7.7.  Apuntar  el  código  de  foto  en  estadillo  (Ver  sección  .8  para  
codigos  del  estadillo)    
Si  es  sistemaCca  ir  a  p2.2.  

p7.8  Fin  de  la  fotogra[a  de  animales  con  la  mesa  de  reprogra[a.   Si  es  barcoding  ir  a  p3.3.  
Volver  al  origen.    

Si  es  CNH  ir  a  p4.3     Cámara  enfocada  adecuadamente  desde  el  sorware  
y  disparo  de  prueba  
SECCIÓN  p8:  DIAGRAMA  DE  ETIQUETADO    

SistemáCca:  ECqueta  dentro  de  la  muestra  y  en  la  pared  del  
bote  de  sistemáCca  

Barcode:  ECqueta  solo  en  la  pared  del  bote  

Marcar  sobre  la  base  de  la  bandeja  de  aluminio  


Caracteres diagnósticos de algunos grupos de zooplancton gelatinoso

A)
Medusas B)
C)
Salpas

D)

F) G) H)
Apendicularias Sifonoforos
E)
Referencias de fotos y esquemas: A) M N Dawson, http://scyphozoan.ucmercedlibrary.info/wiki/Methods
B, D, E, G, H) http://www.jellieszone.com/photography.htm, C)Bone Q. I. Editor. The biology of pelagic tunicates. Oxford University Press P.13,
Fig. 1.14. ; F) Guide of the marine zooplankton of the SE Australia: http://www.tafi.org.au/zooplankton/imagekey/appendicularia/index.html#image
1. Tipo de Técnica, análisis o tratamiento

Metodología de muestreo

2. Titulo de la técnica

Muestreo del neuston (> 200 µm)

3. Autores del documento y filiación

González-Gordillo, J.I. CACYTMAR, Universidad de Cádiz.


Sánchez, R. CACYTMAR, Universidad de Cádiz.

4. Conceptos generales

Se conoce como neuston a la comunidad de organismos planctónicos que vive


en la escueta capa de agua que se extiende desde la superficie hasta unos
pocos centímetros inmediatamente por debajo de ella. En esta capa,
directamente sometida a las condiciones meteorológicas, se producen
importantes intercambios atmósfera-océano, además de presentar una
composición taxonómica generalmente diferente a la encontrada algunos
decímetros más abajo.

5. Finalidad. Campo de aplicación

Metodología para obtener muestras de neuston de la fracción mayor de 200 µm,


válida tanto para estudios cualitativos como cuantitativos.

6. Equipamiento necesario. Características técnicas

Red planctónica para neuston. Este equipo básicamente consiste en una red de
plancton montada sobre un armazón rígido, al que se le acoplan unos flotadores
que hacen que el conjunto navegue por la superficie del mar sin hundirse.

545
La boca de la red debe ser rectangular para delimitar mejor el estrato que se
pretende muestrear. La red deberá estar provista de un flujómetro para
cuantificar el volumen muestreado. Este debe colocarse por debajo de la boca
de la red y unos 20 cm separado de ésta, para que su funcionamiento no se vea
perjudicado por las turbulencias del armazón de la red. Otros equipos, como un
pequeño CTD, podrían ser acoplados a la estructura para obtener datos
hidrológicos del transecto muestreado.

7. Descripción de la Técnica

Preliminares: Verificación de grilletes, colectores y estado de la red.


Cumplimentación del estadillo de datos. Elaboración de etiquetas. Puesta en
marcha de equipos accesorios (CTD, etc.)

Largado del equipo: Las muestras se toman realizando transectos horizontales


superficiales. La red debe ser largada por una de las bandas del barco y nunca
por la popa, pues la turbulencia de las hélices altera la distribución natural de los
organismos que se pretenden muestrear. Por tal razón, la red debería “navegar”
por una zona no perturbada por el barco.
Antes de iniciar la maniobra de arriado, el barco debe ponerse a navegar según
el rumbo preestablecido y a una velocidad constante de 2 nudos. Es conveniente
que el timón esté metido 5º hacía el costado por el que se va a bajar la red, esto
hará que el barco mantenga su popa separada de la red y se eviten incidentes.
A continuación se baja la red suavemente por el costado del barco, separada un
par de metros del casco y ayudándose de un pequeño cabito que iría preso en
una de las cogidas de los tirantes de arrastre. Con este cabito es más fácil orientar
la red para que se pose en el agua de forma correcta. Una vez posada en el
agua, se larga cable hasta que la red esté casi a la altura de la popa.
Dependiendo del estado de la mar puede ser conveniente largar más cable para
estabilizar la red, pues ésta siempre debe trabajar totalmente asentada sobre la
superficie del agua.
El diseño de la red debe permitir que la parte superior de la boca de entrada
quede siempre fuera del agua, de forma que se evite que los organismos
distribuidos superficialmente pasen por encima de la boca de la red y no sean
muestreados.

546
El tiempo de muestreo será de unos 15 min, aumentándose este tiempo si la
cantidad de organismos colectados es pequeña. Debe tenerse en cuenta que la
muestra será dividida en tres, una para taxonomía, otra para isótopos y otra para
genética.

Recogida de muestras:
La limpieza de la red se realiza fácilmente con ésta colgada desde el chigre y
una manguera a presión de agua de mar (generalmente se usa la manguera
contra-incendios del barco), quedando todo el material filtrado concentrado en
el colector final.

Conservación de muestras:
Todo el material colectado se pasa a un conjunto de jarra-tamiz, compuesto por
una jarra de fondo cerrado y otra con fondo malla de 5000 µm, con la ayuda de
un pulverizador con agua de mar filtrada para separar organismos grandes del
resto, especialmente los gelatinosos. Antes de pasar a conservar el material es
importante comprobar si existe material gelatinoso. Organismos como los
ctenóforos se deshacen al contacto con el formol y hacen que la muestra se muy
difícil de analizar.

Fracción > 5000 µm:


El contenido de la jarra de 5000 µm se vierte en una bandeja con un poco de
agua filtrada, separando los organismos gelatinosos y no gelatinosos. Los
organismos no gelatinosos de la fracción > de 5000 µm, se fijan en formol 4%,
excepto los colectados en los puntos de muestreo terminados en 0 y 5 que se fijan
en etanol absoluto para análisis genético. Ambos tipos de muestras van
colocados en un frasco de tapón de estrella de 50 ml. Los organismos gelatinosos
se volverán a colocar en la jarra-tamiz de 5000 µm y ésta se introducirá en la
gradilla de uno de los tanques isotérmicos usados para las muestras de la Multinet.
Los organismos gelatinosos permanecerán en este tanque durante 1 hora para
que se depuren. El posterior tratamiento de estas muestras se específica en
procedimiento aparte (ver procedimiento para el procesado de muestras de
gelatinoso).

Fracción < 5000 µm:


Al contenido de la jarra < 5000 µm se le añade agua de mar filtrada con otra jarra
hasta enrasar a 600 ml. Se mezcla bien la muestra y se divide en tres partes iguales
de 200 ml con la ayuda de un vaso de precipitados de 500ml.
Muestra para taxonomía: se pasa a un frasco de 250 ml de tapón de estrella y se
le añaden 25 ml de Formaldehído filtrado al 40% saturado con Borax. Añadir agua
de mar hasta aforar a 250 ml (muestra+conservante) para llegar a la proporción
del 4% de conservante. Un sistema rápido y seguro para medir el volumen de
conservante es utilizar una jeringuilla de boca ancha de unos 50 ml con un filtro
desechable.
Muestra para genética: la segunda parte de la muestra se concentra en un tamiz
de 200 µm, pasándose seguidamente a un frasco de 50 ml con la ayuda de un
frasco lavador relleno de etanol absoluto y un embudo.

547
Muestra para isótopos: se utilizan filtros Whatman GF/F de 47 mm pre-pesados
(peso seco). La muestra se filtra mediante una bomba de vacío + kitasatos.
Anotar peso filtro seco en estadillo. Tras la filtración llevar el filtro+muestra a la
estufa (60 ºC, 24 h). Una vez seco, pesarlo, anotar peso en estadillo, doblarlo
cuidadosamente por la mitad e introducirlo de nuevo en su sobre. El sobre se
almacenará en una caja plástica hermética junto con todos los de la misma
etapa.

Etiquetado: No escribir directamente sobre el frasco o sobre, se borra con los


conservantes o por el propio manejo. Etiquetar siempre con etiquetas impresas
mediante la aplicación informática MalaspinaLabel (ver protocolo de creación
de etiquetas), para evitar errores de interpretación de los datos. Cada etiqueta
debe ser cubierta por cinta de precinto transparente suficientemente ancha
como para cubrir sobradamente la etiqueta. Verificar los datos de la etiqueta con
los datos del muestreo.

Las etiquetas seguirás el siguiente modelo:

Recogida de material:
Lavar bien la red y colectores con agua dulce después de cada uso.
Inspeccionarlas por si existe alguna rotura. Cubrir la red con una loneta o plástico
para protegerla de suciedad o posibles quemaduras.
Al final de cada etapa la red debería limpiarse en profundidad introduciéndola
una noche en un tanque con agua dulce y un poco de lejía. En caso de estar
muy estropeada cambiarla por una nueva.

548
Estadillo de datos:

Muestreador: RED DE NEUSTON


Hora inicio
Latitud inicio Longitud inicio Fluj. Inicio Ref Fluj. Estado Mar
(UTC)

Hora fin (UTC) Latitud final Longitud final Fluj. Fin Vel viento (Kn) Estado del cielo

Observaciones

Variable: MESOPLANCTON
Volumen Peso seco Peso seco
Código digital muestras asoc Observaciones
alícuota filtro filtro + muestra

Variable: MACROPLANCTON
Volumen
Código digital muestras asoc Observaciones
alícuota

Variable: ZOOPLANCTON GELATINOSO


Peso fresco Nº Total
Peso fresco total
residuos Organismos

Peso
Nº de Código Observacio
Código digital muestras asoc Taxón fresco
organis. foto nes
(sólo CNH)

549
8. Cuadro sinóptico de la técnica
Protocolo gelatinosos

Puntos
terminados
5000 en 0 y 5 Taxonomía
mm 5ml Formol

Resto
Puntos Genética
Etanol

600 ml

Secado (60 ºC; 24h)


Taxonomía 20 ml formol al
40% tamponado
200 ml
200 ml Isótopos
200 ml Etanol
Genética

9. Reactivos u otro material de laboratorio

Conservantes: Formaldehído al 40 % tamponado con Borax. Para muestras a


tratar con fines moleculares utilizar Etanol absoluto.

Pulverizador para limpieza del colector de la red


Frascos para muestras. Utilizarlos preferiblemente de polietileno, pero no de
poliestireno, se agrietan con el tiempo.
Jeringuilla de 50 ml
Cronómetro
Jarras para submuestreo y fraccionamiento
Filtros Whatman GF/F
Pinzas filtros
Quitasatos y embudo de filtración
Bomba de vacío
Balanza
Estufa
Material de etiquetado
Estadillo de datos

10. Calibración

Debe evitarse que sucedan casos de colmatación de la red o de retroceso del


agua a filtrar, debidos a una elevada abundancia de organismos filtrados o una

550
rápida velocidad de muestreo. Ambas circunstancias podrían evitarse realizando
muestreos preliminares.

11. Calculo de los resultados.

El cálculo del volumen filtrado se obtendría según la siguiente expresión:

Vol filtrado = A ∗ (Dig 2 − Dig 1 ) ∗ C

siendo, A el área de la boca de la red; Dig2, la lectura final del flujómetro; Dig1, la
lectura inicial del flujómetro; C, constante suministrada por el fabricante referente
al valor (longitud) a que equivale un revolución del flujómetro. No obstante debe
tenerse en cuenta que no toda la boca de la red queda sumergida por lo que
debería restarse en los cálculos el área de la boca que se estima que queda
fuera del agua

12. Control de calidad

Aunque organismos superiores al centímetro pueden ser recogidos mediante esta


técnica, debería cuestionarse su uso para estudios cuantitativos, pues su número
podría estar subestimado debido a la pequeña área de boca de entrada del
muestreador y a la alta capacidad de evasión de los organismos superiores a este
tamaño.

13. Otras técnicas similares

Pueden obtenerse muestras de neuston de fracciones más pequeñas del


plancton (micro, nano o picoplancton) mediante el uso de botellas horizontales o
recogida directa mediante frascos tomamuestras.

551

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