Introducción

La oxidación lipídica en alimentos constituye una compleja cadena de reacciones que

primero cede a productos primarios (peróxidos), que una vez expuestos a condiciones de
oxidación prolongadas, da lugar a productos secundarios de oxidación, incluyendo
aldehídos, cetonas, epóxidos, compuestos hidroxi, oligómeros y polímeros. La mayoría de
estos productos secundarios de oxidación producen efectos sensoriales y biológicos
indeseables [1, 2]. Por lo tanto, su control es un problema fundamental.
Se han descrito diferentes vías para la oxidación de lípidos: el mecanismo radical o la
autooxidación, el mecanismo singlete de oxígeno mediado o fotooxidación y también la
oxidación enzimática, que es catalizada por las lipoxigenasas. Esta revisión se centra en las
rutas no enzimáticas, auto y fotooxidación, que dan lugar a peróxidos idénticos o
similares, que difieren solo en ocasiones en posición y estereoisomerismo. La
autooxidación requiere una energía de activación inicial para la eliminación de un átomo
de hidrógeno, por lo que se ve reforzada por las altas temperaturas y la presencia de
dobles enlaces. La fotooxidación se desencadena por especies de oxígeno singlete
altamente reactivas, que se forman por la excitación del oxígeno molecular triplete, bajo
la exposición a la luz y la presencia de fotosensibilizadores [3, 4].
Los primeros compuestos formados durante el proceso de oxidación son peróxidos,
especialmente hidroperóxidos; por lo tanto, se llaman productos de oxidación primaria. A
pesar de ser compuestos intermedios del proceso de oxidación de lípidos, son
relativamente estables (dependiendo de la estructura lipídica) y pueden usarse para
evaluar el estado de oxidación de lípidos en muestras de alimentos, siempre que la
muestra no se encuentre en un estado oxidativo avanzado. Debido a esta característica,
las condiciones de temperatura durante el análisis deben controlarse para evitar la
descomposición del hidroperóxido y a menudo se requiere la adición de un antioxidante.

Los hidroperóxidos generalmente sufren una oxidación adicional que los convierte en
productos secundarios de oxidación. Silvagni et al. [5] propusieron un modelo cinético
alternativo donde los aldehídos se generan no solo a través de la degradación directa de
hidroperóxidos sino también a partir de radicales peroxilo a través de una ruta
independiente. Este mecanismo implica una reacción bimolecular para formar tetraóxidos
intermedios, que son inestables a altas temperaturas y se descomponen para dar radicales
alcoxi.
La amplia variedad de productos de oxidación secundaria que produce la oxidación incluye
aldehídos, cetonas, epóxidos, compuestos hidroxi, oligómeros y polímeros. Entre ellos, se
pueden encontrar tanto compuestos volátiles como no volátiles, como hexanal o
malondialdehído (MDA) como principales representantes, respectivamente.
La evaluación del estado de oxidación de los lípidos es una tarea desafiante debido a una
serie de hechos, como los diferentes compuestos que se forman dependiendo del tiempo,
el grado de oxidación y el mecanismo involucrado. Por lo tanto, elegir un solo parámetro
para analizar el estado oxidativo es bastante difícil y con frecuencia es más conveniente
combinar diferentes métodos. Además, como lo expresan Eymard et al. [6], no solo la
naturaleza y composición de los lípidos como sustrato de la reacción tienen un impacto en
el proceso de oxidación de los lípidos, sino también el tipo y la concentración de
proteínas, antioxidantes y prooxidantes presentes en la matriz alimentaria, así como sus
características fisicoquímicas son parámetros que vale la pena tener en cuenta.
Dependiendo de la fuente de alimento, la oxidación de lípidos es diferente. Por ejemplo,
en muestras de carne, Richards y Dettmann [7] sugirieron que las tasas de oxidación de
lípidos pueden depender de la capacidad relativa de las hemoglobinas de diferentes
especies animales para promoverlo, y Chen et al. [8] propuso que las estructuras
coloidales formadas por fosfolípidos en aceites vegetales podrían tener un impacto en la
estabilidad oxidativa de los aceites alimentarios; también se observó que la oxidación de
lípidos se retrasó en las salchichas de pescado después de la adición de varios
antioxidantes [9], y en muestras de leche, el papel de las catequinas y el ácido ascórbico
se ha estudiado recientemente en la oxidación [10]. Además, cada método permite una
serie de condiciones experimentales diferentes, y junto con la falta de uniformidad entre
los laboratorios, conduce a resultados disímiles que son hoy en día inevitables.
Finalmente, la mayoría de los compuestos de oxidación son propensos a degradarse aún
más, lo que proporciona una fuente adicional de divergencia. En consecuencia, se debe
mantener un control preciso del procedimiento experimental.

En relación con la oxidación de lípidos en muestras de alimentos, también se pueden

realizar otras evaluaciones como la determinación de parámetros altamente indicativos
de deterioro de los lípidos y la subsiguiente susceptibilidad mejorada a la oxidación (como
la hidrólisis de triglicéridos). Además, medir el tiempo requerido por una muestra para
alcanzar un cierto nivel oxidativo mediante la promoción artificial de la oxidación es otro
procedimiento válido para evaluar la susceptibilidad de los lípidos a la oxidación (y / o
estabilidad a la oxidación). Sin embargo, esta revisión solo se enfoca en métodos que
determinan la oxidación lipídica actual y actual de una muestra, procedimientos de
descarte que evalúan el estado hidrolítico y aquellos que implican la inducción de la
degradación oxidativa, ya que no indican exactamente el estado de oxidación sino la
susceptibilidad y estabilidad oxidativa. respectivamente.
Esta revisión describe los métodos tradicionales para determinar los productos de
oxidación de lípidos primarios y secundarios en los alimentos, desde las técnicas
espectroscópicas hasta las técnicas cromatográficas. Se señalan sus características,
ventajas y limitaciones. Además de eso, las metodologías alternativas desarrolladas
durante las últimas décadas también se revisan con el fin de proporcionar una supervisión
completa de las posibles opciones. Las principales características de los métodos descritos
en esta revisión se informan en la Tabla 1.

Primary oxidation products

Peroxides

Las propiedades redox de los hidroperóxidos son la base de algunos de los métodos clave
aplicados en su determinación. Un número de reactivos puede ser oxidado por
hidroperóxidos, incluyendo iones inorgánicos simples, como yoduro o ión ferroso. Estos
métodos generalmente requieren una complejación posterior para mejorar la
sensibilidad.

Método volumétrico

Entre los diferentes métodos propuestos para el análisis de peróxidos, la yodometría ha

sido el método más convencional y extendido, principalmente debido a la simplicidad del
procedimiento experimental. Aunque el procedimiento requiere una extracción previa de
lípidos, se proporcionan resultados rápidos y claros.
En medio ácido, los hidroperóxidos y otros peróxidos reaccionan con el ion yoduro para
generar yodo, que se titula utilizando una solución de tiosulfato de sodio, en presencia de
almidón. La AOAC ofrece un método oficial desde 1965 [11]. De acuerdo con este método,
se considera que el valor de peróxido (PV) representa la cantidad de oxígeno activo (en
meq) contenido en 1 kg de lípido y que podría oxidar el yoduro de potasio.
Sin embargo, muestra algunos inconvenientes, derivados principalmente del yoduro, una
alta susceptibilidad a la oxidación en presencia de oxígeno molecular y acelerada por la
exposición a la luz. Además, puede ocurrir la formación espontánea de hidroperóxido, lo
que llevaría a una sobreestimación y absorción de yodo por parte de los ácidos grasos
insaturados, lo que llevaría a una subestimación [12]. Además, requiere sistemas anhidros
para evitar problemas de interferencia. Para este propósito, los lípidos deben ser
extraídos, y esta etapa del procedimiento aumenta el contacto con el oxígeno. Además, la
determinación del valor de peróxido no proporciona una medida real de la degradación
oxidativa, ya que los peróxidos generalmente se degradan más, por lo que la medición
simultánea de los productos secundarios es apropiada.

Métodos espectroscópicos VIS-UV

Además del método volumétrico, los espectroscópicos son bastante simples y son
moderadamente sensibles, confiables y reproducibles cuando se llevan a cabo en
condiciones estandarizadas. Por el contrario, son altamente empíricos en vista del hecho
de que miden mezclas complejas de moléculas oxidadas. Además, generalmente
requieren mucho trabajo y usan grandes cantidades de solventes y reactivos que pueden
ser peligrosos [13].

Método de oxidación ferrosa

El método de oxidación ferrosa para la determinación del contenido de peróxido es más
fácil de usar que la yodometría. La razón principal es la menor sensibilidad del ion ferroso
a la oxidación espontánea por el oxígeno presente en el aire, en comparación con la alta
susceptibilidad a la oxidación de las soluciones de yoduro. Consiste en la oxidación de Fe
(II) a Fe (III), mediada por la reducción de hidroperóxido en condiciones ácidas y en
presencia de tiocianato o naranja de xilenol (FOX). Estos dos compuestos proporcionan las
propiedades espectrofotométricas, ya que forman complejos con el ion férrico,
proporcionando máximos picos de absorbancia a 500 y 560 nm, respectivamente, que se
pueden medir con un espectrofotómetro UV-Vis [6, 14-18]. Sin embargo, ninguno de los
métodos está libre de complicaciones [19]. El método de tiocianato requiere grandes
cantidades de solvente, y como para el FOX, detecta un pequeño rango de
concentraciones de peróxidos y la absortividad molar del complejo de naranja de
ferrilxilenol varía dentro de los diferentes procedimientos de fabricación del tinte. Sin
embargo, Nuchi et al. [20] concluyeron que los resultados de FOX obtenidos de la
degradación de la grasa para usos de alimentación se correlacionaron mejor con otros
parámetros de oxidación que la yodometría tradicional.

Método de oxidación del yoduro También se ha establecido un método

espectrofotométrico dependiente del yoduro para determinar el contenido de
hidroperóxido. En esta metodología no tan común [21], la muestra de lípidos se coloca en
una solución ácida, que luego se fusiona con yoduro. El hidroperóxido de lípidos oxida
yoduro a yodo. Entonces, el yodo y el yoduro generados en exceso reaccionan para dar el
anión triyoduro, que se detecta espectrofotométricamente a 350 nm. Bloomfield [22] usó
Fe (II) como catalizador en esta reacción. Las condiciones de cierre evitan la interferencia
del oxígeno atmosférico, y el corto tiempo de reacción minimiza la interferencia de las
reacciones secundarias.

Cromatografía

Sin embargo, todas las metodologías descritas anteriormente son, en general, bastante
simples en cuanto a la base teórica, la implementación del procedimiento y la
interpretación ulterior de los datos, que presentan una sensibilidad y selectividad baja a
moderada. En este caso, las técnicas cromatográficas son mucho más precisas, sensibles y
específicas para el compuesto de interés, lo que permite una mejor identificación de los
productos individuales. En realidad, su implementación para la determinación de
hidroperóxidos en lugar de las mediciones volumétricas y espectroscópicas muestra una
tendencia creciente en los últimos años. Como consecuencia inevitable, los métodos
cromatográficos generalmente requieren un trabajo experimental largo o meticuloso, el
control preciso de las condiciones experimentales y el procesamiento de datos es
complejo.

Cromatografía líquida

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se está utilizando recientemente para

determinar hidroperóxidos. Este método es altamente sensible y bastante versátil
teniendo en cuenta tanto las propiedades de la columna como del detector, lo que
permite analizar compuestos con diferentes características de volatilidad, peso molecular
o polaridad. Sin embargo, la preparación de la muestra es frecuentemente tediosa y
generalmente requiere extracción de lípidos. Zeb y Murkovic [23] encontraron la HPLC-
ESI-MS isocrática como un método útil para la identificación y caracterización de especies
oxidadas de triacilgliceroles (TAG), es decir, mono- y bis-hidroperóxidos. Gotoh y col. [24]
desarrolló un método para medir el valor del peróxido en los lípidos coloreados sobre la
base de la reacción con trifenilfosfina, formando un compuesto que absorbe a 260 nm. Las
muestras luego se sometieron a separación por HPLC y detección UV. Los métodos de
oxidación ferrosa también se han adaptado a la separación por HPLC [25]. Los
hidroperóxidos específicos generados a partir de esteroles también se pueden evaluar por
cromatografía líquida. Saynajoki et al. [26] determinaron hidroperóxidos de estigmasterol
por medio de una columna de fase normal y dos tipos de detectores (UV y fluorescencia).

Cromatografía de gases
La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) también se puede
utilizar para el análisis de hidroperóxidos de lípidos, pero debido a su termolabilidad, se
necesita una reducción previa de los hidroperóxidos. Este hecho, junto con la extracción
previa de lípidos y el posterior paso de derivatización, lo convierte en un método
engorroso y lento [27].

Dienos / trienos conjugados

La formación de hidroperóxido a partir de ácidos grasos poliinsaturados es generalmente
(más del 90% de los casos) acompañada por la estabilización del estado radical a través de
la redisposición de doble enlace (deslocalización de electrones), lo que da como resultado
dienos y trienos conjugados. Estos compuestos relativamente estables absorben en el
rango UV (235 y 270 nm, respectivamente), y su absorción se puede medir mediante
técnicas espectrofotométricas para evaluar el nivel de oxidación [28, 29]. Esta técnica es
simple y rápida pero no tan extendida como la determinación de peróxidos,
probablemente porque puede conducir a una subestimación de la oxidación ya que los
hidroperóxidos de ácido oleico, que contienen menos de dos enlaces dobles, no pueden
ser detectados. Por otro lado, la sobreestimación es posible si los dobles enlaces
conjugados están presentes en el ácido graso original. Además, no es adecuado para
aceites que se han calentado en condiciones de hidroperóxidos en descomposición
porque puede producirse interferencia con la absorción de compuestos de carbonilo [30].
Aun así, una serie de estudios los han utilizado para el control de la oxidación de los
lípidos durante los tratamientos de calentamiento, especialmente en aceites vegetales
[31-33]. Se ha informado la correlación entre los valores de absorción de 235 nm y los
valores de peróxido [34].

Secondary oxidation products

Los productos de oxidación primaria de lípidos pueden generar, si están expuestos a otras
condiciones de oxidación, productos de oxidación secundarios, que incluyen aldehídos,
cetonas, epóxidos, compuestos hidroxi, oligómeros y polímeros. Estos compuestos
muestran una amplia variedad de propiedades fisicoquímicas, que difieren principalmente
en volatilidad, polaridad y peso molecular. Se comentarán los grupos más relevantes de
compuestos (aldehídos, compuestos volátiles y polímeros), así como una molécula
particular muy frecuentemente utilizada como marcador de oxidación (malondialdehído).

Malondialdehído
El malondialdehído (MDA) es uno de los aldehídos más abundantes que se generan
durante la oxidación secundaria de los lípidos y también es probablemente el más
utilizado como marcador de oxidación.

Espectroscopía UV-Vis

El método más ampliamente empleado para la determinación de MDA es la

determinación espectrofotométrica del complejo rojo fluorescente MDA-ácido
tiobarbitúrico (MDA-TBA).
La reacción se produce por ataque de la forma monoenólica de MDA a los grupos
metileno activos de TBA a pH bajo y temperatura alta, produciendo el cromo- gráfico
mencionado, que ofrece un máximo pico de absorbancia a 532 nm. La cinética de reacción
depende de la concentración de la solución de TBA, la temperatura y el pH [35]. Existen
varias variaciones del método MDA-TBA, con diferentes procedimientos actualmente
realizados en análisis de alimentos: calentamiento directo de la muestra, destilación de
muestra, extracción de lípidos con solventes orgánicos o extracción ácida acuosa, seguido
de reacción ácida con TBA. El procedimiento general generalmente consiste en la
homogeneización y la centrifugación en medio ácido (normalmente proporcionado por el
ácido tricloroacético) y la posterior reacción con TBA a altas temperaturas (alrededor de
90-100 ° C). Sin embargo, existe una gran variabilidad en las condiciones de reacción,
como el tiempo de exposición al tratamiento térmico; como Berasategi y otros, Peiretti y
otros, Jung et al. y Jongberg et al. [36-39] mostraron cuando dejaron la mezcla reaccionar
en el baño de agua hirviendo durante 15, 20, 30 y 40 minutos, respectivamente. Por otro
lado, también se ha informado que las concentraciones de la solución tricloroacética son
diferentes (de 3 a 15% p / v) entre los trabajos [9, 40].
La prueba tradicional espectrofotométrica TBA ha sido criticada por algunas razones,
como el hecho de que TBA no es selectivo para MDA, ya que también reacciona con
muchos otros compuestos, como otros aldehídos, carbohidratos, aminoácidos y ácidos
nucleicos [41], interfiriendo en la TBA ensayo y que resulta en sobreestimación
considerable, así como la variabilidad en los resultados. Es por eso que también se lo
conoce como método de sustancias reactivas TBA (TBARS). También existe el riesgo de
subestimar la respuesta dado que el malondialdehído puede, en condiciones in vivo,
formar bases de Schiff lineales o cíclicas, o incluso enlaces cruzados, con lisina y arginina
de proteínas. Por lo tanto, la pobre sensibilidad de cuantificación y la escasa especificidad
y especificidad molecular pueden atribuirse a este método. Además, las altas
temperaturas (95-100 ° C), los tiempos de incubación prolongados y las condiciones ácidas
fuertes comúnmente requeridas para la reacción de MDA con TBA pueden causar una
peroxidación de elementos de muestra de artefacto incluso en presencia de antioxidantes
añadidos. Obsérvese que el malondialdehído, que se forma principalmente a partir de la
oxidación del ácido linolénico, no se genera en otros lípidos oxidados (especialmente
cuando está presente solo un doble enlace, es decir, ácido oleico). En consecuencia, a
menudo es un producto secundario de oxidación secundaria, deteriorando su papel como
un marcador de oxidación de lípidos que generalmente se asume para este compuesto.
A pesar de las limitaciones mencionadas, se prefieren los métodos convencionales
espectrofotométricos MDA-TBA debido a su simplicidad. De hecho, se ha sugerido
recientemente como un parámetro más preciso y sensible en la evaluación del deterioro
oxidativo que la prueba de p-anisidina y la determinación de hexanal [20, 42].

Cromatografía

Para superar algunas de estas limitaciones, se han desarrollado determinaciones

cromatográficas más avanzadas. Estas técnicas proporcionan, como en el caso de la
medición cromatográfica de hidroperóxidos, más precisión, sensibilidad y especificidad
para MDA. Un trabajo experimental más duro y cierto nivel de complejidad en el
procesamiento de datos son los inconvenientes.
Algunos de ellos [43-48] implican la formación del complejo MDA-TBA, purificación por
cromatografía (GC o HPLC) y posterior detección por MS, UV-Vis o detector fluorométrico.
Y algunos otros usan la derivatización de MDA en lugar de la reacción con TBA, para
obtener un compuesto detectable. La reacción con 2,4-dinitro-fenilhidrazina (DNPH) o
pentafluorofenilhidrazina y la conversión en pirazol y derivados de hidrazona son los
procedimientos más utilizados con separación por HPLC y detección espectrofotométrica /
fluorométrica [48-50]. Por otro lado, la conversión en tetrametilacetal o metilpirazol es
más común con la separación de GC, con detector de ionización de llama (FID) o detector
específico de nitrógeno / fósforo [50]. Mendes et al. [48] y Marcincak [51] compararon
dos métodos de separación de HPLC para la determinación de MDA (aducto MDA-TBA y
MDA-DNPH) con la prueba tradicional espectrofotométrica MDA-TBA, en muestras de
pescado y cerdo refrigerados. Los métodos fueron rápidos, sencillos, sensibles y estables y
presentaron un mejor rendimiento general (basado en la precisión, especificidad y niveles
de recuperación) que la prueba espectrofotométrica tradicional MDA-TBA, aunque MDA-
DNPH mostró un límite de detección relativamente alto y una menor reproducibilidad en
menores contenidos de MDA en estándares y muestras.

Other secondary oxidation compounds

Espectroscopía UV-Vis

Varios otros aldehídos además de MDA se generan durante la oxidación secundaria de

lípidos. El método espectroscópico usó el valor de p-anisidina (PAV) para detectar su
presencia incluso cuando es uno de los métodos más antiguos para evaluar la oxidación
secundaria de los lípidos, especialmente en el análisis de grasas animales y aceites
vegetales. Proporciona información útil sobre compuestos de carbonilo, especialmente
aldehídos a insaturados no volátiles (como 2-alquenales y 2,4-dienales) porque se basa en
la reactividad del enlace aldehído-carbonilo en el grupo p-anisidina-amina, lo que lleva al
formación de una base de Schiff que absorbe a 350 nm. El valor de p-anisidina se define
como 100 veces la absorbancia de una solución que contiene 1 g de grasa en 100 ml de
disolvente. Se considera una metodología muy simple y rápida. PV y PAV permiten calcular
la oxidación total. La oxidación total combina la evidencia sobre la historia y el estado
actual de un aceite, lo que permite estimar el grado total de oxidación en los alimentos
[12].
El PAV ha sido recomendado como un buen parámetro de control para la oxidación
secundaria ya que se correlaciona bien con el contenido de peróxidos (FOX y PV), TBA y
análisis de aldehídos volátiles [20, 52]. En el campo de la investigación, se ha mantenido
un poco al revés, a favor de otras técnicas [53].
Es bien sabido que la respuesta colorimétrica con p-anisidina varía según el grado de
insaturación de aldehído. Por lo tanto, la respuesta es más intensa con di-insaturados que
con aldehídos mono-insaturados en concentraciones idénticas, que a su vez son más
sensibles que los aldehídos saturados. Además, la p-anisidina reacciona con todos los
aldehídos, independientemente de su origen. Este es especialmente el caso de algunos
compuestos de fenol del aceite de oliva virgen, como descarboxymethyloleuropeine
dialdehyde, que podrían interferir en la evaluación. Finalmente, los estudios sobre
correlaciones entre PAV y la calidad organoléptica destacaron la eficacia de esta prueba
para medir la oxidación en muchos lípidos diferentes. Por otro lado, estas correlaciones
pueden variar notablemente entre los lípidos y también de acuerdo con las condiciones de
oxidación predominantes. Por lo tanto, se requiere precaución al interpretar este índice
[28].

Cromatografía

Se generan varios otros compuestos además de carbonilos durante la oxidación

secundaria de lípidos.
Con respecto a los ácidos grasos, pueden sufrir oxidación como formas libres, dentro de
los triacilgliceroles o cuando se unen a los fosfolípidos. Sus productos secundarios de
oxidación pueden evaluarse mediante HPLC [54]. Por el contrario, aunque esta técnica
puede ser útil para obtener una huella digital del estado de oxidación de la muestra, solo
una minoría de las señales se puede atribuir inequívocamente a un compuesto específico
debido a la baja eficacia del proceso de separación. Se puede llevar a cabo un mejor
análisis cuantitativo por medio de GC-FID y GC-MS después de la derivatización en ésteres
metílicos [55]. El desarrollo de LDI-TOF-MS y ESI-MS [56-58] supuso un gran paso adelante
en este campo.
Aunque los productos de oxidación de esteroles (generalmente conocidos como SOP)
presentan bajos niveles en los alimentos, muestran una serie de efectos nocivos en el
organismo [59], por lo que un número significativo de estudios han centrado su atención
en su análisis. El procedimiento experimental implica la extracción de lípidos,
saponificación, purificación, derivatización y análisis cromatográfico. Esa determinación es
desafiante en muchos sentidos: generación de artefactos, concentraciones muy bajas,
efectos de matriz, identificación incompleta e informes, para señalar algunos [60, 61]. GC-
MS es el método de cuantificación más preciso y comúnmente aplicado para este tipo de
compuestos [62-66]. Clariana et al. [67] encontraron que esta técnica obtuvo mejores
resultados que GC-FID en un estudio realizado con carne de cerdo. Debido a la necesidad
de un proceso de derivatización y la imposibilidad de analizar moléculas termolábiles,
recientemente se han desarrollado algunos métodos de cromatografía líquida [68-70]. Sin
embargo, la cromatografía líquida muestra una resolución menor que la cromatografía de
gases, y la mejor manera de superar este problema es acoplándola a un detector de
espectrómetro de masas, que en este caso es bastante complejo y todavía no se ha
resuelto bien este problema. Recientemente, se ha desarrollado y aplicado un nuevo
método rápido GC-MS para el análisis de productos de oxidación del colesterol, que ofrece
resultados muy prometedores [71]. Una resolución satisfactoria, buena repetibilidad y
sensibilidad, junto con la consiguiente reducción del tiempo de análisis y los consumibles,
lo convierten en una alternativa válida a los GC-MS convencionales.

Volatiles

Bajo este grupo de productos de oxidación secundaria, se ha incluido una gran diversidad
de compuestos, presentando grupos funcionales muy diferentes: aldehídos, cetonas,
alcoholes, ácidos carboxílicos cortos e hidrocarburos. Todos comparten la propiedad de
dar olores de moderados a altos y están relacionados con la ranciedad en las pruebas
sensoriales. La medición de estos productos secundarios de oxidación es de gran
importancia, ya que su formación se relaciona estrechamente con el deterioro del sabor.
Algunos de estos compuestos volátiles son altamente específicos para la degradación
oxidativa de una familia particular de ácidos grasos poliinsaturados: el propanal es el
principal marcador de la oxidación de los ácidos grasos n-3, mientras que el hexanal y el
pentanal son marcadores de la oxidación de los ácidos grasos n-6. Tanto el propanal como
el hexanal se usan a menudo como indicadores de la oxidación de los lípidos en los
alimentos porque se pueden medir en el espacio de cabeza de la muestra y carecen de
dobles enlaces, lo que los hace más estables frente a la oxidación que los aldehídos
insaturados. Sin embargo, el hexanal se mide con mayor frecuencia ya que su formación
es más alta que la de la mayoría de los productos de oxidación secundaria, salvo algunas
excepciones. Sin embargo, la medición del grado de oxidación con solo uno o dos
marcadores es un enfoque bastante tosco, por lo que los métodos que implican la
evaluación de un gran conjunto de compuestos deben promoverse [28].
La cromatografía de gases es el método preferido para cuantificar las moléculas volátiles y
la detección por espectrometría de masas contribuye a identificarlas. Se pueden usar
diferentes métodos para recuperar compuestos de oxidación volátiles antes del análisis
cromatográfico, que incluyen: (a) extracción con solvente y (b) técnicas de espacio de
cabeza (HS).

(a) Aunque las extracciones líquido-líquidas no son muy adecuadas para recuperar el
contenido volátil porque son largas, laboriosas y requieren una etapa de evaporación del
solvente, lo que conduce a una degradación sustancial del compuesto volátil,
recientemente se han propuesto nuevas variantes para superar algunas de estas
limitaciones . Nótese especialmente la extracción por destilación simultánea (SDE) y la
extracción por destilación a vapor a presión reducida (RPDE). Ambos permiten obtener
compuestos con un punto de ebullición relativamente alto, pero con la evaporación de
RPDE se alcanza con temperaturas más bajas, evitando la posible formación de artefactos
[72]. SDE y RPDE muestran la ventaja de poder extraer grandes cantidades de compuestos
diana, ya que las fracciones volátiles generalmente tienen una alta solubilidad en
disolventes orgánicos [73, 74]. Por otra parte, Ferhat et al. [75] desarrolló un método de
extracción mediado por energía de microondas. Las extracciones líquido-líquido son los
métodos de recuperación preferidos siempre que las muestras requieran una etapa de
derivación previa al análisis cromatográfico (HPLC y GC). Los derivados de DNPH,
benciloxima y tiazolidina son los compuestos utilizados con más frecuencia para mejorar
la estabilidad y / o detección mediante espectrometría ultravioleta-visible, ionización de
llama, detección de nitrógeno-fósforo y espectrometría de masas [76].
(b) El análisis de HS se puede realizar mediante el espacio de cabeza estático (SHS), el
espacio de cabeza dinámico de purga y captura (DHS) o las técnicas de microextracción en
el espacio de cabeza-fase sólida (HS-SPME). Todos ellos son anteriores al análisis de
cromatografía de gases.

En el método SHS, la muestra se coloca en un vial hermético. La mayoría de los

compuestos que son volátiles a la temperatura de análisis se evaporan de la fracción
líquida o sólida y pasan al gas superior HS. En el equilibrio, una alícuota se cosecha e
inyecta en la columna GC. Este método es relativamente económico y fácil de usar, no
requiere extracción con disolventes y puede automatizarse. Sin embargo, a medida que se
establece el equilibrio entre los compuestos volátiles en el HS y los que permanecen en la
muestra, solo se recuperan cantidades bajas de compuestos, lo que limita la sensibilidad.
El aumento en la temperatura de extracción podría aumentar la volatilización de los
compuestos objetivo, un hecho que llevaría a un aumento en las cantidades recuperadas,
pero la temperatura debe mantenerse lo más baja posible para minimizar la generación
de nuevos productos de oxidación y / o Degradación térmica de los marcadores de
oxidación. Varios autores han aplicado este método en el análisis de muestras de
alimentos [77, 78].
Por el contrario, la técnica DHS no requiere el establecimiento del equilibrio: la muestra se
purga continuamente con gas inerte para extraer compuestos volátiles. Luego, el efluente
de gas pasa a través de una trampa de polímero poroso que recolecta analitos volátiles.
Entre todos los materiales de trampa disponibles, Tenax es el más comúnmente utilizado.
A medida que los volátiles contenidos en la muestra se liberan y atrapan constantemente,
se inyecta una alta concentración de compuestos en la columna de GC. A pesar de su alta
sensibilidad, la instrumentación es compleja y costosa, lo que aumenta las fuentes de
error (secado de trampa, transferencia de trampa, eficiencia de purga, etc.) y es más lenta
que SHS en términos generales. Sin embargo, varios estudios han destacado la eficacia de
DHS-GC en la evaluación del estado oxidativo de diferentes matrices de alimentos [79, 80].
En el análisis SPME, los compuestos volátiles establecen un primer equilibrio entre la
muestra y HS, seguido de un segundo entre HS y la fibra de contacto (que está recubierta
con una película polimérica altamente absorbente). Finalmente, la fibra se introduce en el
inyector de GC. Este método proporciona muchas ventajas sobre otras, incluyendo la fácil
manipulación y configuración experimental, tiempos de muestreo cortos, automatización
fácil y alta sensibilidad [81]. Varios autores han aplicado este método para
determinaciones de oxidación de lípidos en alimentos [80, 82]. Su principal inconveniente
es que la degradación y contaminación de la fibra se produce con bastante rapidez; por lo
tanto, el reemplazo se requiere periódicamente.
Recientes estudios comparativos realizados con todos estos métodos para la captura de
contenido volátil llevan a la conclusión de que cada uno presenta sus deficiencias y
ventajas [83, 84], pero que HS-SPME se está utilizando en mayor medida debido a sus
resultados más prometedores.

Oligómeros / polímeros

Durante la oxidación prolongada, un compuesto lipídico puede unirse entre sí con uno o
varios, dando lugar a dímeros, oligómeros o polímeros. El análisis simultáneo de formas
oxidadas de triacilgliceroles y sus oligo / polímeros es muy común para evaluar el progreso
de oxidación de lípidos. Los monómeros son muy reactivos y se correlacionan con la
precisión con el valor de peróxido, por lo que podrían dar información sobre el nivel de
oxidación primaria de una muestra. Por el contrario, los oligopolímeros de triacilgliceroles
son compuestos bastante estables, que se consideran como buenos indicadores del
estado de oxidación secundaria [85, 86].
La cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento (HPSEC) ha demostrado
proporcionar resultados satisfactorios en el análisis de este tipo de productos de
oxidación. Permite la separación y posterior identificación y cuantificación de moléculas
de acuerdo con su peso molecular. Por lo general, se realiza en compuestos polares, por lo
que requiere una purificación previa de la fracción de lípidos polares, que generalmente
se realiza mediante cromatografía en columna de gel de sílice. Algunos estudios [1, 87, 88]
han demostrado la utilidad de HPSEC en la determinación de los niveles de degradación
oxidativa en una variedad de muestras de alimentos, y particularmente en aceites
vegetales refinados, cuyo proceso tecnológico implica un deterioro de la calidad. Morales
et al. [33] lo aplicó para la determinación de la oxidación avanzada en aceites vegetales a
través de la detección de polímeros de ácidos grasos. La formación de oligómeros durante
la termooxidación de fitoesteroles también se ha informado [89-92] por medio del análisis
HPSEC.

Alternative methodologies

Las técnicas anteriores son demasiado empíricas o dependen mucho de varios factores
experimentales, como la habilidad técnica, la exposición a la luz y el oxígeno atmosférico,
aparte del hecho de que consumen mucho tiempo. Para evitar estas limitaciones, se han
propuesto diversas metodologías como buenas alternativas en el análisis de productos de
oxidación primarios y secundarios. Se basan en análisis espectroscópicos directos de
muestras, como resonancia magnética, fluorescencia y espectroscopia vibratoria, y en
propiedades quimioluminiscentes. Como buenas características generales, el tratamiento
preliminar es mínimo o innecesario, se requiere poca cantidad de muestra y se obtienen
resultados muy específicos.

Quimioluminiscencia
Ciertas reacciones químicas generan radiación electromagnética. Esta emisión de energía
se conoce como quimioluminiscencia (CL) y se puede aplicar para detectar y cuantificar
compuestos de interés. Sin embargo, la intensidad de la luz es muy baja (la LC ultrabaja se
acompaña durante la oxidación de hidrocarburos y lípidos [93]), por lo que se deben
introducir amplificadores de luz para aumentarla. Uno de los más utilizados es el luminol.
La quimioluminiscencia potenciada por luminol implica la oxidación de luminol en una
solución básica que genera un intermedio de radical libre que reacciona con el flujo de
agentes oxidantes (radicales libres activos) presentes en el sistema, por ejemplo,
hidroperóxidos de lípidos. Esto conduce a la formación de un producto derivado de
luminol en estado excitado, que finalmente vuelve al estado fundamental emitiendo una
luz azul fuerte a 430 nm [94]. Las diferentes versiones de este método difieren en el tipo
de radical libre activo producido y el modo de producción de radicales libres, así como en
los detalles del procedimiento. Robinson et al. [95] sugirió la adición de p-yodofenol para
proporcionar una emisión de luz más intensa, prolongada y estable en comparación con el
sistema de luminol tradicional. Más recientemente, se desarrolló un nuevo método de
quimioluminiscencia en medio CL no acuoso para detectar peróxidos lipídicos en aceites
vegetales [96], presentando una buena correlación con el análisis PV espectrofotométrico.
Baj et al. [97] descubrieron que la exclusión parcial de oxígeno del medio de reacción
influye fuertemente en la intensidad de la luz de la reacción de luminol y el efecto
depende del oxidante analizado, por lo que se sugirió un mecanismo alternativo para
algunas especies oxidantes. Además, declararon que la concentración de oxígeno siempre
afecta la reproducibilidad de los resultados, por lo que equilibrar las soluciones de trabajo
con oxígeno o aire siempre debería conducir a resultados más precisos.
Las características atractivas de los métodos CL son el menor consumo de tiempo
(tomando solo unos pocos minutos), la sensibilidad (se han evaluado los niveles de
picomol), bajos requerimientos de muestra, bajo costo y simplicidad en comparación con
otros métodos [98]. En cuanto a las deficiencias de este tipo de métodos, la teoría cinética
y el mecanismo para los procesos químicos que resultan en CL no se conocen en detalle y
esto puede ocasionar problemas en la interpretación de los datos. Además, este método
no es específico para los lípidos, ya que otros agentes oxidantes también dan señal, pero
esta oportunidad puede aprovecharse para estimar el estado total de oxidante total de la
muestra.
Bunting y Gray [99] desarrollaron un sistema de quimioluminiscencia por inyección de
flujo automático para medir las concentraciones de hidroperóxido lipídico en aceites e
informaron buena concordancia con un ensayo de titulación yodométrica tradicional, lo
que podría indicar la utilidad de los métodos CL para evaluar la oxidación primaria de los
lípidos; y también en aceites vegetales, Yang et al. [100] encontró una tendencia similar
para las mediciones de TBARS y CL durante la oxidación.

Espectroscopía de fluorescencia

Cuando un compuesto se irradia con una fuente de energía electromagnética, algunos de

sus electrones pasan de su estado fundamental a uno excitado, y posteriormente vuelven
a su estado original, reemitiendo la energía previamente absorbida. Sin embargo, ciertos
compuestos pueden perder parte de esa energía en forma de calor, lo que permite que
sus electrones vuelvan a un nivel más alto que el original, por lo que la luz emitida es en
este caso más baja que la absorbida. Este fenómeno se denomina fluorescencia y los
compuestos que presentan esta propiedad son fluorescentes. El rayo de luz es usualmente
del rango UV, y la energía emitida es típicamente, pero no necesariamente, desde el rango
visible. Se puede utilizar en química analítica para determinaciones tanto cualitativas
como cuantitativas, así como en equipos aislados y acoplados a cromatografía.
En cuanto al campo de los alimentos, su implementación se está volviendo muy popular
[101]. Los grupos amino libres de proteínas pueden reaccionar con aldehídos a partir de
peroxidación lipídica o azúcares reductores para dar bases de Schiff. Estos compuestos
presentan una intensidad de color alta (pardeamiento) y espectros de fluorescencia
característicos (longitudes de onda de excitación y emisión e intensidad de fluorescencia)
según el tipo de proteína y aducto. Aunque su sensibilidad es alta, los máximos de
longitud de onda de excitación y emisión varían dependiendo de la muestra de alimento y
el procedimiento seguido oscila entre 250 y 500 nm para la excitación y entre 280 y 600
nm para la emisión [53, 102-104]. Muchos autores han utilizado la capacidad de estas
bases de Schiff para emitir fluorescencia para controlar los procesos oxidativos térmicos,
especialmente en productos lácteos [105, 106], carne [107, 108], pescado [109, 110] y
aceites [111], pero fluorescencia las metodologías aún están poco documentadas en el
análisis de oxidación de lípidos en los alimentos. Tanto Gatellier et al. [104] y Nguyen et al.
[110] encontraron una alta correlación entre pigmentos fluorescentes y TBARS de carne y
productos de pescado, que demostraron que la interacción entre proteínas y productos
aldehídos de la oxidación de lípidos está principalmente involucrada en la producción de
pigmentos fluorescentes y estos son buenos marcadores de oxidación de lípidos.
Una implementación diferente de las propiedades fluorescentes fue desarrollada por
Andersen et al. [112] con una muestra de queso. Midieron la fluorescencia de los
fotosensibilizadores implicados en el mecanismo de oxidación lipídica del queso y
utilizaron los espectros para predecir con éxito el contenido de compuestos volátiles.

Espectroscopia infrarroja

La espectroscopía infrarroja (IR) también se conoce como una forma muy útil de estudiar
la degradación de los lípidos en condiciones de oxidación [113], particularmente porque
es una tecnología fácil, rápida, económica y no destructiva. Se basa en la determinación
de transiciones vibratorias fundamentales de un compuesto particular e implica la
absorción de niveles discretos de energía de la región IR. Estos niveles discretos de energía
son característicos de cada enlace átomo-átomo, por lo que estudiar el espectro IR puede
proporcionar suficiente información para descubrir la naturaleza del compuesto analizado.
Las herramientas matemáticas, como la transformada de Fourier (FT) o los métodos
quimiométricos, permiten el procesamiento de datos. El monitoreo del envejecimiento
continuo se puede llevar a cabo con esta metodología, aunque por el momento, la
mayoría de los trabajos se han evaluado de manera discontinua. Recientemente se han
realizado algunos avances gracias a los nuevos dispositivos tecnológicos [114].
IR se ha aplicado para medir el valor del peróxido en los lípidos oxidados [115], y se
observaron diferencias en los espectros IR de los aceites frescos y envejecidos [116, 117],
por lo que los espectros IR se pueden utilizar para caracterizar el envejecimiento de varios
comestibles aceites [118-122]. La investigación de los espectros FTIR de los aceites
tratados reveló que el calentamiento con microondas de aceites [123] causó cambios
significativos en la intensidad de sus bandas de absorción y no produjo cambios en la
posición de las bandas. Estos cambios se atribuyeron a la reducción en el contenido de
ácidos grasos 18: 2 y 18: 3 debido a la oxidación.
También se ha utilizado para el análisis de aceites comestibles [124], empanadas de jurel
[125] y jugo de tomate enlatado [126], en combinación con otros métodos analíticos que
conducen a conclusiones similares, proporcionando por lo tanto bandas marcadoras que
mejoran la comprensión de los cambios químicos que tienen lugar durante el
procesamiento y almacenamiento.

Espectroscopía Raman

Contrariamente a la espectroscopía infrarroja, la espectroscopía Raman detecta

transiciones vibratorias fundamentales no mediante absorción de energía directa sino a
través de una energía originada por un láser UV, visible o IR dispersando la promoción a
un estado vibratorio virtual y posterior relajación a un estado vibratorio fundamental
diferente del el original. Por lo tanto, la espectroscopía Raman y IR son técnicas
complementarias y proporcionan información estructural complementaria sobre las
moléculas. En realidad, solo algunas moléculas muestran propiedades de dispersión de
Raman, y la mayoría de ellas a una intensidad muy pequeña, por lo que se requieren
equipos de detección óptica bastante sofisticados y costosos. Esto reduce su uso práctico
a unos pocos casos. De hecho, todavía se utiliza muy poco en el campo de la alimentación,
a pesar de sus características interesantes, que incluyen productos químicos no
destructivos, rápidos y relativamente económicos, que no implican, que requieren muy
poca preparación de muestras, que son muy sensibles a insaturaciones y poco sensible al
agua [127, 128]. Se pueden emplear dos métodos instrumentales con espectroscopía
Raman: espectroscopía confocal Raman con un potente láser en rango visible y
espectroscopía Raman de transformada de Fourier. La mayoría de las aplicaciones en
aceites han sido realizadas por este último [129]. Sin embargo, recientemente se
desarrolló un espectrómetro Raman portátil [130], que, por otro lado, muestra una
resolución menor que los clásicos. Zhang et al. [130] informaron el primer estudio de
prueba de concepto de la detección Raman mejorada en la superficie de un aducto TBA-
MDA usando nanopartículas de plata como el sustrato SERS.
Los resultados de la espectroscopía Raman y los niveles de oxidación se relacionaron en
lípidos extraídos de varios productos de carne y pescado [128, 132]. A medida que los
valores de peróxido aumentan, los datos de los espectros de Raman mostraron un
aumento en bandas y regiones particulares de los espectros de los aceites extraídos que
podrían atribuirse a alteraciones en la estructura de los lípidos. Además, la espectroscopia
Raman podría ser una alternativa al análisis de ácidos grasos cromatográficos de gases, ya
que predijo con éxito la insaturación total y compuestos individuales en varios productos
cárnicos [133]. Los espectros de Salmon Raman [134] indicaron diferencias en la fracción
grasa así como en la fracción proteica en productos ahumados en frío. Con respecto a los
estudios de aceites vegetales, Muik et al. [135] detectó la formación de aldehídos y
sistemas de dobles enlaces conjugados, así como la isomerización de dobles enlaces cis a
trans. Los cambios de intensidad dependientes del tiempo en ciertas bandas de Raman se
compararon con los parámetros convencionales utilizados para determinar el grado de
oxidación en aceites, como el valor de anisidina y K270, y mostraron una buena
correlación. El-Abassy y otros [136] evaluó el contenido de ácidos grasos en el aceite de
oliva. Zhang et al. [131] desarrolló un método para determinar MDA en un sistema
modelo por medio de esta técnica. Descubrieron que era selectivo y específico para los
aductos MDA-TBA en términos de espectros diferenciales y aductos de alta respuesta
frente a aductos formados por TBA y otros TBARS diferentes de MDA. Además, lograron
una mejor sensibilidad que en trabajos que usan UV-Vis o detectores de fluorescencia. La
reducción del contenido de carotenoides medida por espectroscopía Raman a veces se ha
utilizado para controlar el proceso de oxidación de los lípidos [137].
El análisis simultáneo de la oxidación de aceites comestibles también se ha realizado
mediante técnicas infrarrojas y Raman [119]. Estas técnicas condujeron a una información
mejorada en comparación con el análisis aislado con respecto a la asignación de picos y,
por lo tanto, a compuestos formados durante la oxidación.

Magnetic resonance

Nuclear magnetic resonance

La base de la resonancia magnética nuclear (RMN) se basa en la propiedad de ciertos

átomos de energía absorbente y reemitente en presencia de un fuerte campo magnético
debido a la excitación de sus núcleos atómicos. Esta energía se emite a una frecuencia de
resonancia específica que depende de la intensidad del campo magnético y de las
propiedades magnéticas del isótopo particular del átomo en estudio. Las absorciones de
energía de los núcleos atómicos se ven afectadas por los núcleos de los átomos
circundantes, que provocan pequeñas modificaciones locales en el campo magnético
externo. Se obtienen resultados prometedores con esta metodología alternativa que
considera la fiabilidad y la especificidad de los datos, ya que proporcionan una huella
digital precisa de la muestra. No requiere una manipulación extensa de la muestra,
preservando así la integridad molecular y permitiendo la detección de todas las sustancias
presentes en la muestra al mismo tiempo. Este hecho, además de su alta sensibilidad
incluso en matrices complejas, destaca la necesidad de mejorar y difundir su uso. Sin
embargo, es una metodología muy costosa y requiere habilidades especiales para
interpretar los espectros. El uso de espectroscopía de RMN 1H y 13C en alimentos,
aplicada por diferentes grupos de investigación [138-146], ha demostrado ser muy útil
para evaluar el estado oxidativo de la fracción lipídica, así como para proporcionar
información sobre la naturaleza de la principal grupos funcionales y concentración de los
compuestos encontrados (es decir, hidroperóxidos, compuestos de carbonilo y dienos). Se
considera una herramienta valiosa para la cuantificación de la oxidación de los lípidos
alimentarios [147] y se ha informado de una buena correlación con el análisis
convencional, como el TBA [148].
Varias técnicas de RMN multidimensionales se han desarrollado en los últimos años como
la espectroscopía de correlación, la espectroscopía de efecto overhauser nuclear y la
espectroscopía de orden difuso. Aunque permiten una asignación mejor que los espectros
unidimensionales, lo que mejora la caracterización de las muestras de lípidos alimentarios
[143, 149], la aplicación de estas herramientas requiere un largo tiempo debido al proceso
de adquisición.

Resonancia paramagnética electrónica

La base de la resonancia paramagnética de electrones (EPR) es la misma que la de la RMN,

pero en este caso, la energía excita los giros de electrones individuales. Entonces, solo las
moléculas que presentan electrones individuales (es decir, radicales) tienen espectros
EPR. Se ha utilizado para detectar especies intermedias oxidantes en matrices de
alimentos [150, 151]. Sin embargo, estos radicales muestran una vida bastante corta a
menos que se garanticen temperaturas muy bajas [13, 151, 152]. En un intento de evitar
este problema, algunas metodologías desarrolladas recientemente se ocupan de la
detección de radicales libres inestables. Entre ellos, las técnicas de trampa de spin
permiten la detección indirecta de radicales derivados de lípidos mediante la formación de
aductos de spin estables que pueden acumularse en concentraciones detectables. De esta
forma, tanto la identificación como la cuantificación de estos intermedios son posibles.
Las trampas no son radicalmente específicas, sin embargo, las trampas particulares se
consideran más o menos útiles para atrapar radicales particulares. Compuestos tales
como PBN (a-fenil-terc-butilnitrona) y DMPO (5,5-dimetil-1-pirrolina-N-óxido) se usan con
frecuencia para este fin [150, 153].
La aplicación combinada de ambas metodologías (RMN y EPR) es de gran interés. En este
sentido, Silvagni et al. [5] los utilizaron en un estudio que investiga la cinética de la
peroxidación lipídica inducida térmicamente del aceite de maní. El uso de EPR les permitió
determinar los radicales alquilo primarios y proporcionó una estimación de la tasa de
generación de radicales; mientras que por medio de RMN, se realizó simultáneamente la
detección de productos de oxidación primarios y secundarios, permitiendo una
investigación cinética más detallada.

Conclusión

Se pueden usar diferentes tipos de compuestos como marcadores de oxidación de lípidos

en muestras de alimentos, entre los cuales los hidroperóxidos y una variedad de aldehídos
son los más comunes. Cada uno de ellos es indicativo de un estado particular de
oxidación, por lo que elegir un solo parámetro para analizar el estado oxidativo es
bastante difícil y con frecuencia es más conveniente combinar diferentes métodos. Por lo
tanto, los analistas deben elegir cuidadosamente el método más adecuado para su
propósito, tomando en consideración las moléculas más adecuadas y las condiciones
experimentales requeridas en cada caso. La primera decisión general es determinar si los
compuestos de oxidación primarios o secundarios son los que deben analizarse,
considerando principalmente el grado de oxidación. Luego, se debe considerar que la
precisión requerida y las características de la matriz alimentaria siguen una metodología u
otra. Se han desarrollado e implementado una variedad de metodologías convencionales y
alternativas. Considerando lo posterior, se ha demostrado que brindan resultados
interesantes y prometedores, por lo que se debe prestar atención a estas técnicas
alternativas en el área de la oxidación de los lípidos en los alimentos.