Metabolite analysis by liquid chromatography-mass spectrometry

Serum metabolites were analyzed in deproteinized buffered extracts as previously reported

[Shu2016]. 100 µL of serum were thoroughly mixed with 200 µL of HPLC grade acetonitrile to
which 6.7 µM hydrochlorothiazide (DHCT) was added to be used as internal standard; the mixture
was centrifuged at 20,000 xg for 5 min, supernatants were diluted 1:1 (v/v) with 10 mM
ammonium acetate and kept at -80°C until further analysis. Just before injection, samples were
filtered (Millex-LCR, PTFE, Darmstadt, Germany) and kept on autosampler vials at 4°C. 20 µL of
sample were injected into an UltiMate 3000 RSLCnano HPLC system (Thermo Scientific, MA, USA)
configured for capillary flow with an Acclaim PepMapRSLC C18 column (2µm, 75 µm x 15 cm,
Thermo Scientific, MA, USA) kept at 45 °C and a constant flow of 5 µL/min of a mixture of 10 mM
ammonium acetate in water (Buffer A, from a Milli-Q system, Millipore, MA, USA) and HPLC grade
acetonitrile (Buffer B, Sigma-Aldrich, MO, USA). Chromatographic separations started at 12%B, at
minute 7, it changed from 12% to 50% in two minutes, and from minute 9 to minute 15, it
increased to 95%; it was held there for 2 min and returned to 12% in 1 minute for column re-
equilibration. Electrospray ionization of the eluted ions was performed with a CaptiveSpray source
(Bruker, MA, USA) and the mass spectra were acquired with an ion trap mass spectrometer
(amaZon speed ETD, Bruker, MA, USA). Negative ions were analyzed over an m/z range of 40-340,
ICC target 70000, 10 ms as maximum accumulation time using the maximum resolution mode with
a capillary voltage set at 3500V and nitrogen as nebulizer gas flowing at 4L/min and 200°C. Before
injections, calibration was performed with electrospray calibration solution (Fluka). MS/MS
fragmentation was limited to the 3 precursor ions with m/z values of 187 (pCS), 212 (IS) and 296
(DHCT) using a scheduled precursor list. The smart fragmentation option was active to
automatically find the optimum fragmentation amplitude for each precursor. Active exclusion was
off. Metabolite identity was confirmed by the presence of 107, 80 and 205 as MS/MS product ions
for pCS, IS and DHCT respectively [Shu2016]. pCS ammonium salt were synthesized on the Instituto
de Quimica (UNAM, Mexico) with a purity of XX% ; IS potassium salt and DHCT (>98%) were
purchased from Sigma-Aldrich (MO, USA). Data acquisition and analysis were made with the
trapControl 7.2.63.0 and DataAnalysis 4.2.383.1 software. Variability of analytical replicas was less
than 5%. Every sample contained 2.2µM DHCT as internal standard which was used for
quantification of pCS and IS. After every 10 injections, a quality control (QC) sample (pool of 20
different experimental samples) was injected to follow stability and performance of the system,
variability of the pCS, IS and DHCT concentrations among the QC injections was lower than 10%
during intra- and inter-day assays. A standard curve was constructed to determine linearity; to this
end, analytical standards were diluted in methanol and serial dilutions were prepared in 33%
acetonitrile and 5 mM ammonium acetate. For IS, a linear response (R 2=0.9998) was observed
from 5nM to 23 µM. For pCS, linearity (R2=0.996) was observed from 5nM to 260 µM.

Análisis de metabolitos por cromatografía líquida-espectrometría de masas.

Los metabolitos séricos se analizaron de los extractos tamponados desproteinizados como se

informó anteriormente [Shu2016]. 100 µL de suero se mezclaron completamente con 200 µL de
Acetonitrilo grado HPLC, a lo que se le adicionó Hidroclorotiazida 6.7 µM (DHCT) para usar como
estándar interno; La mezcla se centrifugó a 20 000 xg durante 5 minutos, los sobrenadantes se
diluyeron 1:1 (v/v) con Acetato de amonio 10 mM y se mantuvieron a -80°C hasta su posterior
análisis. Justo antes de la inyección, las muestras se filtraron (Millex-LCR, PTFE, Darmstadt,
Alemania) y se colocaron en viales de inyección a 4 °C. Se inyectaron 20 µl de muestra en un
sistema de HPLC UltiMate 3000 RSLCnano (Thermo Scientific, MA, EE. UU.) configurado para un
flujo capilar con una columna Acclaim PepMapRSLC C18 (2 µm, 75 µm x 15 cm, Thermo Scientific,
MA, EE. UU.) Se mantuvo a 45°C y un flujo constante de 5 µL/min de una mezcla de Acetato de
amonio 10 mM en agua (Solución amortiguadora A, de un sistema Milli-Q, Millipore, MA, EE. UU.)
y Acetonitrilo grado HPLC (Solución amortiguadora B, Sigma-Aldrich, MO, USA). Las separaciones
cromatográficas comenzaron con 12% de B en el minuto 7, cambió de 12% a 50% en dos minutos,
y del minuto 9 a minuto 15, aumentó a 95%; se mantuvo ahí durante 2 minutos y se regresó al 12%
en 1 minuto para reequilibrio de la columna. La ionización por electropulverización de los iones
eluidos se realizó con una fuente de CaptiveSpray (Bruker, MA, EE. UU.) y los espectros de masas se
adquirieron con un espectrómetro de masas con trampa iónica (amaZon speed ETD, Bruker, MA,
EE. UU.). Los iones negativos se analizaron en un intervalo m/z de 40-340, ICC target 70000, 10 ms
como tiempo de acumulación máximo utilizando el modo de resolución máxima con un voltaje
capilar establecido a 3500V y Nitrógeno como gas nebulizador que fluye a 4L/min y 200° C. Antes
de las inyecciones, la calibración se realizó con una solución de calibración de electropulverización
(Fluka). La fragmentación MS/MS se limitó a los 3 iones precursores con valores m/z 187 (pCS), 212
(IS) y 296 (DHCT) utilizando una lista de precursores programada. La opción de fragmentación
inteligente estaba activa para encontrar automáticamente la amplitud de fragmentación óptima
para cada precursor. La exclusión activa estaba desactivada. La identidad de metabolitos se
confirmó por la presencia de 107, 80 y 205 como iones de producto MS/MS para pCS, IS y DHCT
respectivamente [Shu2016]. La sal de amonio de pCS se sintetizó en el Instituto de Química
(UNAM, México) con una pureza del XX%; La sal de potasio IS y el DHCT (> 98%) se adquirieron de
Sigma-Aldrich (MO, EE. UU.). La adquisición y el análisis de los datos se realizaron con trapControl
7.2.63.0 y Software DataAnalysis 4.2.383.1. La variabilidad de las réplicas analíticas fue inferior al
5%. Cada muestra contenía 2.2 µM de DHCT como estándar interno que se usó para la
cuantificación de pCS e IS. Después de cada 10 inyecciones, se inyectó una muestra de control de
calidad (CC) (conjunto de 20 muestras experimentales diferentes) para seguir la estabilidad y el
rendimiento del sistema, la variabilidad de las concentraciones de pCS, IS y DHCT entre las
inyecciones de CC fue inferior al 10% durante las pruebas intra y entre días. Se construyó una curva
estándar para determinar la linealidad; con este fin, los estándares analíticos se diluyeron en
Metanol y las diluciones en serie se prepararon en Acetonitrilo al 33% y Acetato de amonio 5 mM.
Para IS, se observó una respuesta lineal (R 2 = 0.9998) de 5 nM a 23 µM. Para pCS, se observó una
linealidad (R2 = 0.996) de 5 nM a 260 µM.