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CÁTEDRA DE BIOQUÍMICA Y BIOFISICA

Determinación de Proteínas por Reacción Coloreada Específica.

Fundamento
Entre las reacciones coloreadas específicas para la determinación de proteínas en solución, destaca la
reacción de biuret. Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas pero no los aminoácidos
libres ya que es debida a la presencia de dos o más enlaces peptídicos CO-NH.
Para la reacción de biuret usaremos el reactivo de Benedict (sulfato de cobre, citrato de sodio y
carbonato de sodio) e hidróxido de sodio. El Cu 2+ en un medio fuertemente alcalino se coordina con
los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta cuya intensidad depende de la
concentración de proteínas.

Espe ctrofotome tría.


Se pue de definir la espectrofotometría de absorción como la medida de la atenuación que un material
a estudiar efectúa sobre la intensidad de un rayo de luz monocromática (de longitud de onda fija) que
incide sobre el mismo. En química clínica el material en estudio es generalmente una solución de la
sustancia absorbente y las medidas se hacen ordinariamente dentro del espectro de longitudes de onda
comprendido entre 220nm y 800nm.
El parámetro que mediremos nosotros en el laboratorio es la “Absorbancia” (A) de la solución.

Instrumento.
Los componentes básicos de los espect rofotómetros son: una fuente de radiación (lámpara), un
sistema para seleccionar la longitud de onda deseada (filtro o monocromador) , una cubeta destinada a
contener la muestra (solución absorbente) y un sistema para medir la intensidad de luz emergente y
traducirla en datos legibles.

Rayo Rayo
incidente emergent e

Té cnica
1) Colocar en un tubo de ensayo 3ml NaOH al 3%
2) Añadir 1ml de solución proteica
3) Añadir 0.5ml de solución de Benedict
4) Agitar para que se mezcle bien.
5) Observar los resultados
La intensidad del color obtenido será proporcional a la concentración proteica ( Ley de Lambert-
Beer: A =  .l. C donde A : absorbancia;coficiente de extinción molar; l : trayecto recorrido
por haz de luz en cm.; C : concentración de sustancia absorbente) y se puede medir por
espectrofotometría.
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Actividad de laboratorio pre viamente realizada por los docentes:

1) Pretratamiento de soluciones de albúmina: se agrega 15 ml de HCl 10M a 10


ml de solución de BSA y se incuba a 110ºC durante 24hs en recipiente sellado. Transcurrido el
tiempo se alcaliniza la solución resultante con NaOH.

2) Construcción de curva de calibración


Una curva de calibración relaciona la absorbancia (A) de diversas soluciones con la concentración
conocida de cada una de ella s. Su empleo se hace indispensable para trabajos cuantitativos en los que
se deba determinar la concentración de la sustancia absorbente en una solución de concentración
desconocida.
Para saber si dicha relación es lineal se necesita un mínimo de tres puntos y se recomienda para mayor
segurida d en los resultados obtenidos realizar cada punto por duplicado. Siempre que sea posible es
aconsejable la construcción de una curva de calibración que cubra el rango de concentraciones que se
van a encontrar en la práctica.
Para la elaboración de esta curva se usaron soluciones de albúmina sérica bovina (BSA) de distintas
concentraciones, se determinaron sus respectivas absorbancias en el espectrofotómetro y se graficaron
los resultados obtenidos trazándose la curva de mejor ajuste.
Las medidas se hicieron a 540 nm de longitud de onda contra una solución blanco (solución carente de
proteínas en la que se sustituye el volumen en ml de la solución de albúmina por agua destilada).

Datos para la elaboración de la curva de calibración


Absorbancia (A) Concentración BSA mg/ml
0.05 0.05
0.23 0.12
0,34 0.25
0,65 0.50
0,76 0.60
0,95 0.75
1,20 1.0
Curva de calibración

Actividad a se r desarrollada por los alumnos en el laboratorio.


Realizarán la reacción de Biuret a 3 soluciones de BSA de concentración desconocida: una sin
pretratamiento, una pretratada, y una a la cual le agregará el docente en el momento del práctico 50ul
de HCl 12M antes de la realización del ensayo de Biuret. También se ensayará el reactivo de Biuret a
una solución blanco y a una solución de un aminoácido (lisina). Deberán entonces preparar una
gradilla con 5 tubos de ensayo, nume rarlos y proceder como se describió anteriormente en “técnica”.
Luego de medir la absorbancia de los 5 tubos en el espectrofotómetro determinarán la concentración
proteica utilizando la curva de calibración.

Cátedra de Bioquímica y Biofísica - FO- UdelaR -


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Reactivos y Mate riales


- Soluciones de albúmina 0.1- 1% - Solución de BSA pretratada
- Solución de Benedict - Pipetas de 2-5 ml y de 100- 1000µl
- Solución de NaOH al 3 % - 5 T ubos de ensayo
- Solución de lisina al 2% -gradilla
- HCl 2M

Refe rencias Bibliográficas


R.J.Henry, D.C.Cannon, J.W.Winkelman Química Clínica. Bases y Técnicas. 2da. Ed. (1980)
José A. Cortés.Com. Recursos Didácticos para Biología. (consultado 8/03/10)

Cuestionario a responder en grupo por escrito una vez finalizado el


práctico

1)- ¿Que color se observa en cada uno de los 5 tubos al finalizar el ensayo?
2)- Si no obtuvieron igual coloración en todos expliquen a que puede deberse.
3) – Usando la curva de calibración determinen la concentración proteica en cada uno de ellos.
Considerando el pretratamiento de las soluciones de BSA realizado previamente por los docentes:
4) ¿Cual es la concentración de HCl antes del agregado de soda.?
5) ¿Cuál es el pH de la solución proteica antes y después del agregado de ácido?
6) ¿Por qué se corrige el pH?
7) Si comparan dicho pretratamiento con el agregado de ácido que realizaron a uno de los tubos
durante el práctico: ¿Qué procesos tienen lugar en cada uno de los dos casos?

No olviden incluir el nombr e de todos los participantes en el grupo.

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