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Universidad de La Sabana

Facultad de Ingeniería
Laboratorio de Biotecnología
Profesora: Gina Pilar López Ramírez
Chía-Cundinamarca

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Diseño y preparación de medios de cultivo
Laura Catalina Marcelo García 0000043032
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Objetivo General: Evaluar efecto de macro y micronutrientes en crecimiento de microorganismos


filamentosos y no filamentosos.

Objetivos específicos:
 Adquirir destreza en la preparación de medios de cultivo
 Preparar medios de cultivo químicamente definidos.
 Evaluar cualitativamente crecimiento de microorganismos en diferentes medios de cultivo.
 Evaluar los microorganismos presentes en una muestra biológica.

Introducción sulfato de potasio promueven la formación de


pigmentos. La cetrimida actúa como un agente
Los sustratos nutritivos preparados en el inhibidor de flora acompañante al liberar
laboratorio se denominan medios de cultivos. nitrógeno y fósforo de. El pH final de este
En estos medios, microorganismos encuentran medio es de 7.2 ± 0.2 [2]
sustancias nutritivas como lo son
carbohidratos, aminoácidos, polialcoholes, Sabouraud Glucosado Agar: este medio se
vitaminas, minerales, así como condiciones utiliza principalmente para el aislamiento y
óptimas de pH que permiten el crecimiento y conservación de hongos patógenos y
desarrollo de microorganismos [1]. Ya que saprófitos, así como para el cultivo de
todos los microorganismos no requieren los levaduras. Entre los nutrientes de este cultivo
mismos nutrientes, existen diferentes tipos de se encuentran la peptona, la tripteína y la
medios de cultivo con características glucosa. Favorece el crecimiento de estos
específicas que permiten el crecimiento de microorganismos y debido a la presencia de
organismos en especial, los usados en este cloranfenicol y un pH ácido (5.6 ± 0.2)
laboratorio son químicamente definidos, lo inhibe el crecimiento de bacterias. [3]
que permite saber con exactitud los
componentes que cada medio de cultivo tiene, ISP2: este medio contiene dextrosa y
entre ellos se encuentra: extractos de levadura y malta que aportan
vitaminas, en especial vitamina B, factores de
Cultivo Cetrimide agar: es utilizado para crecimiento, carbohidratos y aminoácidos [4].
aislamiento selectivo de Pseudomonas Este medio es óptimo para el crecimiento de
aeruginosa y otras especies del género. En levaduras y actinomicetos, este medio se
este medio las peptonas contenidas aportan puede acidificar con ácido láctico, ácido
nutrientes para el desarrollo de los clorhídrico, ácido tartárico o ácido cítrico para
microorganismos. El cloruro de magnesio y el
incrementar la selectividad. Su pH está entre Es importante aprender a diseñar medios de
6.2 ± 0.2 cultivo ya que esto permitirá el desarrollo y
[5]. crecimiento de microorganismos haciendo
más fácil el estudio e identificación de los
Mac Conkey Agar: se utiliza para aislamientos mismos.
de bacilos Gram negativos o de la familia
Enterobacteriaceae ya que las peptonas con Metodología
las que cuenta aporta nutrientes para el  Preparación de medios de cultivo
crecimiento de estos microorganismos, el
carbohidrato lo aporta la lactosa y las sales
biliares y el cristal violeta inhiben el
crecimiento de microorganismos Gram
positivos. El pH que se maneja en este medio
es de (7.1 ± 0.2) [6].

Agar Bilis Rojo Violeta Glucosa (VRBG):


funciona para la detección de
Enterobacteriaceae ya que incluye bacterias
coliformes fermentadoras de lactosa. El
digerido enzimático provee nitrógeno,
carbono y aminoácidos, el extracto de
levadura suministra vitaminas, el carbohidrato
lo aporta la dextrosa y la inhibición de Gram
positivos se dan por los agentes selectivos
tales como las sales biliares y el cristal violeta
en un pH de (7.4 ± 0.2) [7].

E.M.B Agar: se utiliza para el aislamiento


selectivo de bacilos Gram negativos debido a
la combinación de fórmulas Holt-Harris y
Teague con la de Levine. Las peptonas
presentes favorecen el desarrollo microbiano y
los indicadores eosina y azul de metileno
permite diferenciar organismos que utilizan  Pruebas de pureza
lactosa (crecen con periferia rosada o azulada)
y /o sacarosa (incoloros) en un pH alrededor
de (7.2 ± 0.2). [8]

Si bien no se utilizó en laboratorio es


importante mencionar el cultivo Chromocul
como el recomendado para detección y
enumeración de bacterias coliformes basado
en la enzima b-D-galactosidasa presente en
este tipo de bacterias para separar el sustrato
Salmon-Gal produciendo una coloración rojo
asalmonado. [9]
En un principio las colonias utilizadas
fueron de Staphyloccocus aureus, una
bacteria que a simple vista se pudo
observar como puntos muy finos y de
una coloración entre amarilla y
 Preparación de suspensiones celulares naranja. Debido a que se trataba de
en solución salina al 0,85% una bacteria se realizó una prueba de
pureza con el objetivo de verificar que
se estuviera trabajando con ese tipo de
organismo, esta prueba constó de hacer
la tinción te Gram que al verla en
microscopio con un objetivo de 100X
(utilizando aceite de inmersión) se
pudo observar unas formas esféricas
de color azul oscuro o violeta, lo que
indica que es una bacteria Gram
positiva (tienen una pared gruesa de
peptidoglicano) como se había
determinado en la práctica pasada.

En cuanto a la levadura asignada se


tenía una colonia de Sacharomyces
cereviceae, esta levadura se observó
como puntos blancos de aspecto
cremoso y opaco de diferentes
tamaños. Para este caso se utilizó azul
de metileno para observarla al
 Siembra por técnica de aislamiento microscopio en un objetivo de 40X
pudiendo observar su forma ovalada y
aglomerada como se observa en la
Figura 1.

Resultados

Observaciones iniciales:
Figura 1. Sacharomyces cereviceae observada
al microscopio (40X).
Figura 3.
En cuanto a la muestra biológica se Colonia de
utilizó un durazno en descomposición
principalmente las partes que
contenían posibles hongos de una
apariencia mohosa y coloración blanca
y verde, así como partes donde la Streptomyces en medio ISP2
coloración de la fruta era café y tenía
una textura más blanda que el resto de Este medio de cultivo presenta una tonalidad
la fruta. La preparación de esta ámbar al secarse, en él se sembró
muestra se realizó como se describió Streptomyces ya que es ideal para el
anteriormente en la metodología crecimiento de actinomicetos, después de
haciendo uso de solución salina al encubar se pudo observar claramente el
0,85% como se observa en la Figura crecimiento de la colonia con aspecto de
2. pelusa blanca.

Figura 2. Preparación muestra de durazno en


descomposición en solución salina de 0,85% Figura 4. Siembra de solución de durazno en
descomposición de concentración 10-4 en
En cuanto a los medios de cultivo una vez medio ISP2
esterilizados se sirvieron en las cajas de Petri
debidamente rotuladas. Se utilizaron 6 medios En este medio después de la incubación no se
diferentes (ISP2, E.M.B, VRBG, Mac pudo observar registro alguno de
Conkey,Sabouraud y Cetrimide) donde se microorganismos procedentes del durazno en
hicieron uso de 3 cajas de cada uno para la descomposición.
siembra de una muestra de colonia
proporcionada, y de la solución de la muestra
biológica (en este caso durazno en
descomposición) en concentraciones de 10-4 y
10-5 cuyos resultados se muestran a
continuación:
Figura 5. Siembra de solución de durazno en
descomposición de concentración 10-5 en
medio ISP2
Figura 8.
Siembra de
En este medio después de la incubación no se solución de
durazno en
pudo observar registro alguno de
microorganismos procedentes del durazno en
descomposición.
descomposición de concentración 10-5 en
medio VRBG

En este medio después de la incubación no se


pudo observar registro alguno de
microorganismos procedentes del durazno en
descomposición.

En siguiente medio a evaluar fue el Mac


Figura 6. Colonia de Staphylococcus aureus Conkey, este medio tiene una coloración roja
en medio VRBG o rosada menos intensa que la del VDRG
El medio VRBG al secar conserva una debido también a la presencia de cristales
tonalidad magenta proporcionada por el cristal violeta en su composición. Como se puede
violeta presente en su composición. apreciar en la Figura 9, en este medio se
No se pudo apreciar desarrollo de algún pudieron observar unos puntos de color
microorganismo en este medio. rosado con el borde de un rosado más intenso
y bien definido. Sin embargo el crecimiento
de la bacteria Staphylococcus aureus no se dio
en gran cantidad.

Figura 7. Siembra de solución de durazno en


descomposición de concentración 10-4 en
medio VRBG Figura 9. Colonia de Staphylococcus aureus
en medio Mac Conkey
Figura 12. Colonia de
Staphylococcus aureus en medio
Cetrimide.

Este medio al solidificarse no conserva un


color tan específico como los mostrados
anteriormente, sin embargo presenta algunas
subtonalidades amarillas. En este medio
tampoco se presentó crecimiento de la
bacteria sembrada como se ve en la Figura 13.

Figura 10. Siembra de solución de durazno en


descomposición de concentración 10-5 en
medio Mac Conkey.
Figura 13. Siembra
de solución de
durazno en
descomposición de
concentración 10-4
en medio
Cetrimide

Figura 11. Siembra de solución de durazno en


descomposición de concentración 10-4 en
medio Mac Conkey.

Como se puede observan en las Figuras 10 y Figura 14. Siembra de solución de durazno en
11 no se pudo apreciar algún tipo de descomposición de concentración 10-5 en
medio Cetrimide
crecimiento de microorganismos en este
medio correspondientes a la muestra biológica Al igual que en los otros medios, en el agar
utilizada. Cetrimide no se presentó crecimiento ni
desarrollos de ningún microorganismo
proveniente del durazno en descomposición.
Figura
17.

Figura 15. Colonia de Sacharomyces


cereviceae en medio Sabouraud.
Siembra de solución de durazno en
En el medio Sabouraud se sembró una descomposición de concentración 10-4 en
levadura (Sacharomyces cereviceae), después medio Sabouraud.
de la incubación se pudo observar un gran A esta concentración se pudo observar que
crecimiento de esta colonia en forma de crecieron microorganismos en la parte inferior
puntos blancos de aspecto cremoso y opaco de la caja con el medio Sabouraud (según
característicos de una levadura (Figura 15). Figura 17), su aspecto es suave, de pequeños
Adicionalmente este medio se observó con hilos delgados que en conjunto se asemejan a
tonalidades ligeramente amarillas. un copo de nieve, tiene una coloración entre
blanca y gris.

Por último está el medio E.M.B el cual


Figura 16. presenta una coloración vino tinto. En este
Siembra de medio se sembró Staphylococcus aureus, pero
solución de no se presentó crecimiento ni desarrollo en
durazno en
ninguna de las tres cajas (Figuras 18,19 y 20)

descomposición de concentración 10-5 en


medio Sabouraud.

En esta concentración (Figura 16) no se pudo


observar crecimiento de algún
microorganismo.
Figura 18. Colonia de Sacharomyces
cereviceae en medio E.M.B
manejadas, lo que conlleva a pensar que el
durazno en descomposición utilizado no es
una fuente de buen crecimiento para bacterias
de tipo actinomicetos, esto puede deberse a
que el pH del durazno es de 3.2 ± 0.2 [11]
siendo este un pH más ácido en comparación
con el del medio y muy posible responsable
de que no haya presencia de Streptomices
considerando el pH óptimo en el que esta
especie se desarrolla.
Figura 19. Siembra de solución de durazno en
descomposición de concentración 10-4 en VRBG:
medio E.M.B En este medio no se presentó crecimiento ni
en la caja donde se sembró la muestra de la
colonia Staphylococcus aureus, ni en las cajas
con la solución de la muestra biológica. En
primera estancia se vio un patrón en todos los
medios donde se cultivó la muestra de la
colonia S. aureus ya que esta no creció en
ninguno de ellos aun cuando el tiempo de
incubación fue mayor a lo que tarda esta
bacteria en incubarse (1 a 6 horas) [12], lo que
puede indicar que puede que esta colonia no
fue sembrada de manera correcta y los
Figura 20. Siembra de solución de durazno en
descomposición de concentración 10-5 en
microorganismos pudieron morir en el
medio E.M.B proceso.
Por otra parte, este medio contiene sales
Análisis y discusión biliares y cristales violeta los cuales son
componentes que inhiben el crecimiento de
ISP2: bacterias Gram positivas como lo son los
El crecimiento que hubo en este medio por cocos utilizados [7] lo cual respalda que la
parte de la colonia Streptomyces fue bastante bacteria S. aureus no se haya desarrollado. En
bueno, y siendo esta bacteria un actino, se las cajas donde se sembró la solución
puede reafirmar que este es un buen medio de correspondiente a la muestra biológica
cultivo para cultivar actinomicetos debido a su tampoco hubo crecimiento, lo que permite
gran aporte de vitaminas y fuentes de afirmar que el durazno no es una buena fuente
carbohidratos proporcionados por el extracto para que crecimiento de organismos Gram-
de malta y levadura que se encuentra en su negativos que son aquellos para los que este
composición, adicionalmente se puede afirmar medio está diseñado.
que este tipo de bacterias se desarrollan en
medios ácidos ( pH óptimo de 6,5), aun Mac Conkey:
cuando se han encontrado especies que se Al igual que en el medio pasado el Mac
pueden desarrollar especies con pH más Conke contiene cristales violeta y sales
ácidos o más básicos hasta de 9 o más [10]. biliares los cuales inhiben el crecimiento de
En cuanto a los cultivos que respectan a la gran parte de la flora Gram positiva, sin
muestra biológica no se pudo identificar embargo, este medio se vio un pequeño
crecimiento de algún microorganismo en crecimiento de microorganismos esto se pudo
ninguna de las dos concentraciones deber a que la bacteria S. aureus es
fermentador de lactosa [13] y este tipo de negativos [8] y la bacteria utilizada es Gram-
microorganismos se pueden observar en el positiva, la cual se pudo ver inhibida por los
medio como halo de precipitación biliar [6]. indicadores eosina y azul de metileno. Al no
En el caso de las cajas con la solución de la crecer tampoco en los medios con la solución
muestra biológica al no haber crecimiento se del durazno se puede descartar la presencia de
reafirma que el durazno no es na buena fuente microorganismos Gram-negativos así como
para el crecimiento de microorganismos especies de la familia Enterobacteriaceae [8].
Gram-negativos y además de
microorganismos fermentadores de lactosa. Conclusiones
 Se aprendieron a diseñar medios de
Cetrimide: cultivo y se adquirió destreza en la
Al no observar algún tipo de crecimiento ni de elaboración de estos.
la colonia utilizada ni de la solución con la  El trabajar con medios de cultivo
muestra biológica se puede afirmar que la químicamente definidos facilita el
colonia no era de carácter Pseudomona ni que análisis de los microorganismos que
el durazno es buena fuente para el crecimiento crecen y se desarrollan en estos.
de estas, esto también se puede deber a que la  Se evaluó el crecimiento de
mayoría de Pseudomonas se desarrollan en un microorganismos en diferentes medios
pH mayor a 4,5 [14] y como se mencionó de cultivo.
antes el pH del durazno es mucho menor al de  Se analizó los posibles
crecimiento óptimo. Tampoco se pudo microrganismos presentes en una
observar ningún tipo de coloración por lo que muestra biológica de durazno en
se puede afirmar que no hubo crecimiento de proceso de descomposición mediante
organismos productores de piocianina, diluciones de la fruta en solución
pioverdina o piorrubina [2]. salina a 0,85%
 La presencia de cristal violeta, sales
Sabouraud: biliares, eosina y azul de metileno en
Con los resultados presentados se reafirma algunos medio impidieron el
que el medio Sabouraud es un medio óptimo crecimiento de organismos Gram-
para el crecimiento de levaduras en este caso positivos con los cuales se trabajó.
de la Sacharomyces cereviceae debido a la  El diseño de medios de cultivo permite
cantidad de peptona, glucosa y tripteína que la evaluar el crecimiento de
compone y que brinda los nutrientes para el microorganismos y su afinidad con los
desarrollo de la misma [3]. En cuanto al componentes del mismo.
crecimiento en las cajas con la solución de la Recomendaciones
muestra biológica el poco crecimiento se pudo
 Hacer buen uso del tiempo mientras
deber a que no se cumplió con el tiempo de
los medios se esterilizan en el
incubación recomendado para el crecimiento
autoclave.
de mohos y hongos que era el microorganismo
 Marcar las cajas previamente con el
que se esperaba encontrar en el durazno en
nombre del cultivo y la fecha para
descomposición que es de 5 a 20 días [3]
identificar los medios fácilmente y
mientras que los medios solo se dejaron
evitar confusiones. Si es posible
incubando durante 2 días.
marcarlos en la parte inferior de la caja
para poder observar bien los
E.M.B:
microorganismos en la parte superior.
El no crecimiento de la S. aureus en este
medio se puede justificar ya que este es un  Utilizar microorganismos afines a los
medio selectivo para microorganismos Gram- medios para evaluar el crecimiento en
ellos y evitar usar microorganismos
que pueden ser inhibidos por algún [6] LABORATORIOS BRITANIA S.A.
componente si no es lo que se desea. (2015). Mac Conkey Agar. REF B2311431.
 Realizar las siembras cerca del Consultado el 27 de Febrero de 2019
mechero para evitar algún tipo de https://www.britanialab.com/back/public/u
contaminación en el proceso de pload/productos/upl_5a2ed674cf661.pdf
siembra.
 En el caso de trabajar hongos tener en [7]Acumedia. (2015). NEOGEN
cuenta el tiempo de incubación que CORPORATION. Agar bilis rojo violeta
estos requieren es mayor. glucosa. (7425).
Referencias Consultado el 27 de Febrero de 2019 en :
https://foodsafety.neogen.com/pdf/acumedi
[1]Congreso internacional del colegio a_pi/7425_sp_pi.pdf
nacional de bacteriología. Beneficios de los
Medios de cultivo para Microbiología en [8] LABORATORIOS BRITANIA S.A.
MDM científica . Recuperado el 27 de (2015). E.M.B Agar (con eosina y Azul de
Febrero de 2019 en: Metileno). REF B0210105- B0210106.
https://mdmcientifica.com/beneficios-de- Consultado el 27 de Febrero de 2019 en :
los-medios-de-cultivo-para-microbiologia- http://www.britanialab.com/back/public/up
en-mdm-cientifica/ load/productos/upl_5a28240e1c004.pdf

[2]LABORATORIOS BRITANIA S.A. [9]Merck Millipore (2014). Chromocult Agar


(2015). Cetrimida Agar. REF B2311531. para coliformes. Consultado el 27 de Febrero
Consultado el 27 de Febrero de 2019 en: de 2019 en :
http://www.britanialab.com/back/public/up file:///C:/Users/dnb/Favorites/Downloads/D
load/productos/upl_5a2ed5a58f4ee.pdf S4485ES00_Chromocult%20Coliform
%20(6-25)%20(1).pdf
[3] LABORATORIOS BRITANIA S.A.
(2015).Sabouraud Glucosado Agar. REF [10] López, B. Streptomyces: características,
B0215005-B02215006. Consultado el 27 de taxonomía, morfología, cultivo. Lifeder.com.
Febrero de 2019 en: Recuperado el 5 de Marzo de 2019 de:
https://www.britanialab.com/back/public/u https://www.lifeder.com/streptomyces/
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[11]Food- info. (2017). ¿Cuál es el pH de los
[4]Núñez Reinoso, J.A, Sierra Arias, C.D. alimentos?Consultado el 5 de Marzo de 2019:
(2018). Identificación de microorganismos de http://www.food-info.net/es/qa/qa-fp65.htm
suelos de la provincia de pichincha, con
capacidad de producir antibióticos de amplio [12]Foodsafety. Staphylococcus. Consultado
espectro. Universidad politécnica salesiana el 5 de marzo de 2019 en:
sede Quito. Consultado el 27 de Febrero de https://espanol.foodsafety.gov/intoxicaci
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https://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456 occus/xmd/%C3%ADndice.html
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[13]Microbitos, G. (2011). Staphylococcus
[5] HIMEDIA. (20015)Technical Data. Yeast aureus, S. epidermis y S. saprophyticus.
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hylococcus-aureus-epidermidis- https://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803
saprophyticus/ /2521/LRM_TESIS.pdf

[14]Ruiz Martínez, L. (2007). Pseudomonas


aeruginosa: Aportación al conocimiento de su
estructura y al de los mecanismos que
contribuyen a su resistencia a los
antimicrobianos. Universidad de Barcelona.
Tesis Doctoral. Consultado el 7 de Marzo de
2019 en: