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I. EL PROBLEMA.
Separar los pigmentos de una muestra vegetal, por medio de técnicas cromatográficas.
Cuantificar la cantidad de etanol presente en una muestra de licor , usando HPLC
La historia de la cromatografía moderna se remonta a los estudios del botánico ruso Mikhail Tswett, quien
utilizó una columna rellena de carbonato de calcio (fase estacionaria) para separar pigmentos coloreados de
extractos vegetales. La muestra se colocaba en la parte superior de la columna y se hacia pasar a través del
carbonato de calcio usando éter de petróleo (fase móvil). A medida que el solvente se desplazaba, los
pigmentos se empezaban a separar en bandas coloreadas, luego se sacaba de la columna el carbonato, se
cortaba y cada pigmento se extraía por separado. Tswett denominó esta técnica cromatografía, por la
combinación de las palabras griegas que significaban “color” y “escribir”. Después de 1931 esta técnica
analítica tomo interés para las separaciones bioquímicas gracias a los trabajos de Martín y Synge (1941), y
por los cuales fueron merecedores del premio Nobel de Química en 1952.
En resumen, la cromatografía es una técnica en la que se separan solutos debido a la distribución diferencial
de estos, entre la fase móvil y la estacionaria.
La fase móvil suele ser un líquido o un gas (cromatografía líquida o cromatografía de gases) y la fase
estacionaria es un sólido o una película líquida que reviste una superficie sólida. Para poner en contacto la
fase móvil y la estacionaria se usan dos métodos, la cromatografía de columna (CC) donde la fase estacionaria
se empaca en una columna estrecha por la cual pasa la fase móvil, por efecto de la gravedad o de una presión
aplicada. La cromatografía de capa delgada (CCD), la fase sólida cubre una lámina plana de vidrio, metal o
plástico, que se coloca en contacto con la fase móvil y esta se desplaza por capilaridad.
El mecanismo por el que los solutos se separan se pueden catalogar en cromatografía de adsorción y
cromatografía de reparto; en la primera los solutos se separan según la capacidad para adsorberse sobre una
fase estacionaria sólida, y en la segunda, la separación se debe a la diferencia del equilibrio de reparto
(solubilidades) entre la fase móvil líquida y la fase estacionaria (película líquida). También la separación se
puede deber a las interacciones electrostáticas entre la fase estacionaria y los solutos (cromatografía de
intercambio iónico); por la interacción entre los solutos con las cavidades porosas de un gel (cromatografía de
exclusión por tamaño), y por la formación de enlaces específicos entre la fase estacionaria y los solutos
(cromatografía de afinidad).
III. MATERIALES Y REACTIVOS.
Las muestras vegetales que se pueden utilizar son: Remolacha, mora, achiote.
Seco en la estufa de aire durante la noche a 50oC
IV. PROCEDIMIENTO
Pique el material vegetal seco en pequeños trozos y pese aproximadamente 10g de este, coloque la
muestra en el mortero, adicione 10,0 mL de etanol al 96% y haga la extracción. Filtre sobre gasa y recoja
el filtrado en un erlenmeyer de 50 mL, devuelva el residuo al mortero y repita la extracción dos veces
más. Concentre el extracto etanólico en una plancha de calentamiento a temperatura moderada y en
la campana de extracción hasta un volumen aproximado de 5 mL, tape con parafilm y guarde para la
cromatografía. No deje secar el extracto. (Cuidado con calcinar el extracto).
El residuo sólido obtenido del punto anterior colóquelo nuevamente en el mortero seco y adicione 10,0
mL de n-hexano o de éter de petróleo y haga la extracción. Filtre sobre gasa y recoja el filtrado en un
erlenemyer de 50,0 mL. realice la extracción dos veces más. Concentre el extracto orgánico en la
plancha de calentamiento al baño maría, en la campana de extracción. Concentre hasta un volumen
aproximado de 5 mL, tape y guarde para la cromatografía.
Coloque en forma adecuada la pipeta Pasteur en una pinza para refrigerante, introduzca una pequeña
porción de lana de vidrio al interior para hacer un tapón no muy compacto ni muy alto al fondo de la
pipeta. Adicione lentamente la suspensión de la fase estacionaria en el solvente de estudio con un
gotero de vidrio y cuide que no se formen burbujas al interior de la columna; recoja en solvente que
sale de la columna en un vaso de precipitados, parcialmente tapado con papel alumnio. Llene la
columna con la fase estacionaria HASTA 0,5cm por debajo del nivel superior. No deje que la columna
se seque, manténgala húmeda con el solvente que usará como fase móvil.
Coloque 2 a 5 gotas del extracto con el solvente orgánico en un vidrio de reloj y déjelo secar al medio
ambiente o en baño maría, luego adicione 5 gotas de la fase móvil, disuelva los pigmentos y coloque
las cinco gotas en la parte superior de la columna sobre la fase estacionaria previamente despejada de
fase móvil. Deje que los pigmentos se introduzcan en la columna y luego elúyalos adicionando más fase
móvil a la columna hasta que se observe separación o un pigmento coloreados llegue al final de la fase
estacionaria. No deje que los pigmentos se salgan de la columna, tapando la parte superior e inferior
con Parafilm. Observe.
Trace una línea con lápiz, a 1 cm de altura, en la lámina con la fase estacionaria adecuada; divida la
línea en dos y en la primera porción adicione con un capilar dos gotas del extracto correspondiente
(ver tabla 1) y en la segunda porción 6 gotas del extracto, deje secar al aire. Coloque la placa en la
cámara de revelado en donde está la fase móvil, y debe sumergirse por debajo del punto de siembra
del extracto; la mezcla de solventes correrá sobre la lámina por capilaridad y se retirará la placa cuando
la fase móvil esté a 1cm de llegar al nivel superior. Deje secar a la atmósfera y con un lápiz indique la
posición de los pigmentos sobre la placa. Observe.
Tabla No 1.
V. TABLA DE DATOS
En la tabla de datos debe tener en cuenta el sistema de solventes que utilizó para cada una de las
cromatografías y la descripción de la separación de los pigmentos, si esta se llevó o no acabo.
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
5. CROMATOGRAFIA HPLC
Atienda las explicaciones del monitor encargado del cuidado de equipo. El método utilizado es una
separación por HPC en un equipo Hitachi.,el solvente es ( H2SO4 5Mm) que varía en composisicón desde 0%
hasta 100% de mezcla de 0 a 28 minutos, el con flujo del solvente es de 0.5mL/min. La detección de los
compuestos alcohólicos se realiza a 270 nm con un detector LaChrom L- 7400 de Merk- Hitachi
Cantidad de muestra para el análisis son 60 µL.
La curva de calibración está preparada entre 0 y 6% de etanol, tome los datos de altura de pico, para hacer
los cálculos.
La muestra problema puede ser una bebida alcohólica, prepare por dilución un 1 mL de muestra que contenga
aproximadamente entre 2 y 4 % de alcohol.
Si la bebida seleccionada tiene entre 2 y 4% de etanol no es necesaria la dilución
Inyecte la muestra y espere 28 minutos hasta obtener el cromatograma. (Para este método el tiempo de
retención del etanol esta entre 25.6 y 25.75 min)
Columna de intercambio ioníco Aminex HPX87H. tamaño de poro 300mm X 7.8mm
Registre el número de señales de muestra, los tiempos de retención, compare con la curva de calibración y
determine la concentración del etanol presente en la muestra.
VI. BIBLIOGRAFÍA.
- Harvey, D. Química analítica moderna. 2002. McGraw Hill, primera edición, España.
- Ramírez, I.B; Gaviria, L.E; Young, S.T y Morales, A.L. Química analítica instrumental. 1989. Editorial
Hispanoamericana, Universidad abierta y a distancia, UNISUR. Bogotá.
PREINFORME E INFORME
1. Extracción de la muestra
Hipótesis
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Diagrama de flujo
4. Cromatografía HPLC
Hiptesis:_________________________________________________________________-
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