Microbios Lab

Campus Sur
INFORME GUÍAS
LABORATORIO
Versión: 00
ÁREA:
Carrera de Ingeniería Ambiental
MICROBIOLOGÍA
Responsable: José Luis Ballesteros L Codigo:
R001
#1
1. TEMA: NORMAS DE BIOSEGURIDAD
2. Objetivo general: Concientizar al alumno sobre la importancia de la

Bioseguridad en el Laboratorio.
3. Objetivos específicos:
 Conocer los equipos y materiales que se utilizan en el Laboratorio de
Microbiología.
 Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar
contaminaciones.
 Aprender el procedimiento para empacar diversos materiales de uso en
microbiología así como el procedimiento de la esterilización por calor seco y calor
húmedo.
 Organizar el material para su fácil manejo e identificación.
4. Introducción: El estudio de las bacterias, virus, parásitos, hongos y otros agentes

infecciosos que pueden ser patógenos para el hombre, los animales u otras formas
de vida conforman riesgos que varían según el agente infeccioso y los
procedimientos utilizados. Las normas de Seguridad Biológica pretenden reducir
a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulación de material peligroso y
son muy rigurosas para los agentes más peligrosos y menos exigentes para los que
causan problemas de menor entidad. En un laboratorio existen variadas
disposiciones que es necesario observar y muchas de estas reglas derivan del
sentido común que no necesitan ser memorizadas; pero que deben ser
consideradas en el trabajo diario.
5. Fundamento: “La bioseguridad es la aplicación de conocimientos, técnicas y

equipamientos para prevenir a personas, laboratorios, áreas hospitalarias y medio
ambiente de la exposición a agentes potencialmente infecciosos o considerados
de riesgo biológico. La bioseguridad en un laboratorio, a través de medidas
científicas organizativas, define las condiciones de contención bajo las cuales los
agentes infecciosos deben ser manipulados con el objetivo de confinar el riesgo
biológico y reducir la exposición potencial de:
 personal de laboratorio y/o áreas hospitalarias críticas.
 personal de áreas no críticas
 pacientes y público general, y material de desecho
 medio ambiente de potenciales agentes infecciosos.
6. Materiales:
1
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MICROBIOLOGÍA
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Material Cantidad
Guantes de latex 1
Mascarilla 1
Cofia 1
Gafas de protección 1
Bolsas rojas 1
Papel absorbente 1
7. Reactivos:
Reactivo Cantidad
Reactivo con etiqueta de clasificación de 1
riesgos
Hipoclorito de sodio 3% 200ml
Alcohol antiseptico 200 ml
Jabon glicerinado 200ml
8. Equipos:
Equipo Cantidad
Camara de flujo laminar 1
Autoclave 1
9. Notas:
10. Procedimiento experimental:

1. DECONTAMINACION DEL AREA DE TRABAJO:
- Regar hipoclorito de sodio sobre el área de trabajo.
- Dejar actuar durante 5 minutos.
- Limpiar con toallas de papel, del centro hacia la periferia y descartar el papel en
la caneca correspondiente.
2. MANEJO DE ELEMENTOS DE PROTECCION:

El profesor indicará la manera adecuada de colocar, usar y retirar todos y cada
uno de los elementos de protección (mandil, gafas, mascarilla, cofia, guantes, etc.)
a utilizar en el laboratorio.
3. LAVADO DE MANOS
- Abrir la llave del agua con una toalla desechable o un trozo de papel.
2
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MICROBIOLOGÍA
R001
- Descartar ese papel en la caneca.

- Humedecer las manos con agua de chorro y frotar.
- Aplicar jabón antiséptico y frotar vigorosamente las manos, poner especial
cuidado en dedos y limpiar uñas.
- Colocar las manos debajo del chorro y dejar que corra el agua, hasta eliminar
completamente el jabón.
- Cerrar la llave del agua con un trozo de papel o toalla desechable.
- Secar perfectamente las manos con toallas desechables.
4. USO Y CUIDADO DEL MECHERO DE ALCOHOL

Antes de iniciar la práctica, llenar cuidadosamente el mechero con alcohol,
asegurándose de no derramarlo.
- Impregnar la mecha con alcohol. El largo de la mecha debe ser el adecuado para
proporcionar una llama eficiente
- Revisar que el exterior del mechero y el área de trabajo estén completamente
secas, libres de alcohol.
- Revisar que sus manos y vestimenta estén libres de alcohol.
- Evitar prender el mechero con guantes de cualquier material (látex, nitrilo y
vinilo).
- Encender exclusivamente con fósforos. NUNCA con mecheros vecinos, ni con
otro tipo de encendedor.
- Evitar mover o trasladar el mechero del lugar de trabajo cuando este se encuentre
encendido.
11. Cuestionarios y problemas :

1. Defina el término de riesgo biológico.
2. Cómo se clasifican los microorganismo según el riesgo de peligrosidad?
Escriba 3 ejemplos de cada uno.
3. Defina el concepto de Limpieza, contaminación, desinfección,
descontaminación y esterilización
4. De ejemplos de reactivos o sustancias utilizadas para cada uno de los anteriores
propósitos.
12. Bibliografía:
 Manual de bioseguridad en el laboratorio. Organización mundial de la
salud. Tercera edición. 2005
 Fundamentos de Microbiología. Miryam Escobar de Rico. Pontificia
Universidad Javeriana. 1998
 Bioseguridad en laboratorios de microbiología y biomédica. Cuarta
edición. Washington D.C, Estados Unidos. Centro para el control y
prevención de enfermedades. 1999.
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3
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
#2
13. TEMA: Esterilización y Preparación de Medios de Cultivo
14. Objetivo general: Concientizar al alumno sobre la importancia de la

esterilización y correcta preparación de medios de cultivo.

1. Explicar el concepto de esterilización y su aplicación en microbiología.
2. Preparar correctamente el material que se someterá a esterilización.
3. Aplicar algunas metodologías para esterilizar material y medios de cultivo.
4. Comprobar la efectividad del proceso de esterilización.
5. Explicar el concepto de medio de cultivo en microbiología.
6. Preparar medios de cultivo con diferente estado físico y explicar la
diferencia en el procedimiento de preparación.
7. Eliminar adecuadamente los desechos biológicos.
16. Introducción: Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar

entre otras cosas con material y medios de cultivo estériles. En Microbiología la
esterilización se define como “el proceso mediante el cual se eliminan todos los
microorganismos (incluyendo formas de resistencia) de un objeto, medio o
superficie” y su aplicación garantiza la ausencia de microorganismos en el
material y medios de cultivo a ser empleados. Existen diversos métodos de
esterilización, entre ellos: calor (seco o húmedo), filtración (para sustancias
termolábiles y aire), radiaciones y aplicación de gas de oxido de etileno (para
jeringas y cajas de plástico).
Un medio de cultivo está constituido por una mezcla de agua y sustancias
orgánicas e inorgánicas, los que en conjunto proporcionan los requerimientos
nutricionales para el desarrollo de los microorganismos. La composición de los
medios de cultivo varía en función de: a) grupo microbiano que se pretende
estudiar, b) complejidad química, c) estado físico, y d) aplicación.
17. Fundamento:
MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el
desarrollo de microorganismos. Entre los requerimientos más importantes para su
desarrollo están el carbono, el oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono e
hidrógeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores
de crecimiento específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre
otros.
Clasificación de los medios de cultivo

A. Según su origen:
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a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen

animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición
química no se conoce exactamente.
b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química
definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados
reproducibles.
c) SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factores de
crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo
extracto de levadura.
B. Según su consistencia
a) LÍQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solución
acuosa.
b) SÓLIDOS: se preparan añadiendo un agar a un medio. El agar es una sustancia
inerte polisacárida (hidrato de carbono) que se extrae de las algas. Como esta
sustancia no es digerida por las bacterias no constituye ningún elemento nutritivo.
Este conjunto convenientemente esterilizado puede ser vertido en placas de Petri
o en tubos de ensayo y presentan la posibilidad de aislar y diferenciar bacterias,
"procesos que antes no eran posibles en medio líquido".
c) SEMISÓLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para
determinar la motilidad de las especies en estudio.
C. Según su composición:
A causa de los requerimientos químicos del mundo microbiano, a veces es
necesario agregar o eliminar componentes químicos del medio.
a) COMUNES O UNIVERSALES: su finalidad es el crecimiento de la mayor
parte de los microorganismos poco existentes. Es el medio más frecuentemente
utilizado para mantener colonias microbianas. Por ejemplo: agar común o caldo
común.
b) ENRIQUECIDOS: están compuestos de un medio base como apoyo del
crecimiento al cual se le puede agregar un gran exceso de nutrientes como
suplementos nutritivos, por ejemplo: sangre, suero, líquido ascítico, etc. Se utiliza
para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales.
c) SELECTIVOS: son sólidos en los que la selectividad se consigue alterando las
condiciones físicas del medio o añadiendo o suprimiendo componentes químicos
específicos con el fin de inhibir el crecimiento de especies químicas cuyo
crecimiento no interesa. Este tipo de medio sólo permite el crecimiento de un
grupo de microorganismos e inhibiendo el de otros. Se utiliza para seleccionar y
aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas. Por ejemplo Agar salado-
manitol o Chapman (permite el crecimiento de ciertos estafilococos).
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R001
d) DIFERENCIALES: son medios de cultivos que nos permiten distinguir entre

varios géneros y especies de microorganismos. Por ejemplo si al medio se le ha
añadido un carbohidrato y un indicador y la bacteria que se cultiva es capaz de
fermentar dicho carbohidrato, se produce una acidificación del medio con el
consiguiente viraje de color del indicador por el cambio de pH.
e) DE ENRIQUECIMIENTO: El enriquecimiento es una técnica que utiliza un
medio selectivo líquido para permitir el desarrollo de un microorganismo a partir
de una muestra que contiene una gran variedad de microorganismos. Así, aquellos
microorganismos para los que el ambiente sea más favorable crecerán más que los
otros y finalmente serán predominantes
f) DE TRANSPORTE: son utilizados para asegurar la viabilidad de la bacteria sin
multiplicación significativa de los microorganismos desde el momento de su
extracción hasta su posterior estudio. Se utilizan generalmente cuando las
muestras deben ser enviadas de un laboratorio a otro.
ESTERILIZACIÓN
AGENTES FÍSICOS ANTIMICROBIANOS.
A) CALOR HÚMEDO.- La temperatura elevada, combinada con una humedad
elevada, es uno de los métodos más efectivos para matar microorganismos. El
calor húmedo mata a los microorganismos coagulando sus proteínas. Es mucho
más rápido y efectivo que el calor seco. El vapor a presión proporciona
temperaturas por encima de las que se pueden obtener al hervir. Tiene la ventaja
de un calentamiento rápido, así como penetración rápida y abundante humedad.
El aparato a esterilizar que utiliza vapor de agua a presión regulada se denomina
autoclave. Consta de una cámara de doble pared que se llena de vapor saturado
libre de aire y se mantiene a la temperatura indicada y a la presión establecida
durante un periodo de tiempo determinado. Generalmente el autoclave funciona a
una presión de 15 libras/ pulgada cuadrada a 121°C. El tiempo de funcionamiento
para lograr la esterilidad depende de la naturaleza del material que se va a
esterilizar, del tipo de envase y del volumen del material. Una temperatura de
l00·C es la suficiente para matar a todas las formas bacterianas en 2 o 3 minutos,
excepto a las esporas, para matar a estas se requiere una temperatura de 121°C
durante 15 minutos y a una presión de 15 libras.
Este método es adecuado para esterilizar aparatos que tienen hule, jeringas que
contienen metal, para medios de cultivo que contienen un azúcar especial
dextrosa. El autoclave se puede sustituir por la olla de presión.
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B) CALOR SECO.- En este tipo de esterilización existe una destrucción de los

microorganismos oxidando sus constituyentes químicos, desnaturalizando las
proteínas y los ácidos nucleicos de las células así como fragmentando las
membranas celulares. Para materiales que deben permanecer secos como ciertos
instrumentos de vidrio de laboratorio tales como: cajas de petri, pipetas, así como
aceites, polvos (por ser impermeables al vapor), los materiales que no se pueden
esterilizar por calor seco son: Material textil (algodón, sedas, lino, etc.), Gomas y
Materiales sintéticos. Todo material que se altere a la temperatura de trabajo se
dispone de hornos eléctricos por los que circula aire caliente, en vista de que el
calor es menos eficaz en materiales secos, se acostumbra a aplicar una temperatura
de 160·C a 170·C durante una hora o más. Para materiales de vidrio de laboratorio
es suficiente una exposición de dos horas de duración a 160·C (320 ·F) para que
quede esterilizado. Otras formas útiles de calor seco incluyen incineración para
objetos que deben ser destruidos y flameados por pasaje de agujas o pequeños
instrumentos a través de la llama de un mechero bunsen.
18. Materiales:
Material Cantidad
Balanzas digital 1
Potenciómetro 1
Espátulas 1
Matraz Erlenmeyer de 50 mL 1
Matraz Erlenmeyer de 250 o 300mL 1
Probeta de 100 o 250 mL 1
Varilla de vidrio 1
Gradilla 1
Pipeta de 10 mL 1
Pipetas de 1.0 mL 1
Tubos de ensayo de 16x150 1
Tubos de ensayo de 22x175 1
Hisopos 1
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R001
19. Reactivos:
Reactivo Cantidad
Agua destilada 1L
Caldo nutritivo o caldo tripticasa soya (medio de 1L
cultivo líquido deshidratado)
Gelosa nutritiva o tripticasa soya agar (medio de 1L
cultivo sólido deshidratado)
Agar-Agar 1L
Solución de NaOH 1.0 N, 500 ml
Solución de HCl al 10% 500 ml
20. Equipos:
Equipo Cantidad
Plancha magnética 1
Autoclave 1
Microondas 1
Mechero 1
21. Notas:

EMPACADO DEL MATERIAL
1.- Antes de iniciar un empaque del material que se desea esterilizar, limpiar el
área de trabajo con alguna sustancia desinfectante y encender el mechero.
2- El material a empacar debe estar limpio, seco y sin residuos. Empacar
correctamente con papel, de acuerdo a las instrucciones dadas por el instructor.
ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

1.- El material a esterilizar se deberá cargar con el esterilizador frío, teniendo en
cuenta las siguientes recomendaciones: Los materiales no deberán estar en
contacto con las paredes, piso y techo del esterilizador. La carga del esterilizador
será homogénea y no deberá superar el 80% de la capacidad total de la cámara.
2.- Encender el equipo y Verificar que los instrumentos de control de ciclo, tiempo
(1 hora) y temperatura (170·C) se encuentren en la posición correcta y el tiempo
de aplicación será de una hora o más.
3.- La descarga del Esterilizador se efectuará una vez que el material se haya
enfriado. Durante el ciclo de Esterilización no deberá abrirse la puerta del
Esterilizador porque ello implicaría abortar el ciclo.
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R001
ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO

1.- Prepara material limpio y secado en estufa o en forma manual con papel
absorbente y empácalo. Tenlo listo para su esterilización.
2.- Coloca el agua necesaria en la autoclave u olla de presión hasta la marca e
introduce unas gradillas metálicas que servirán de base al material a esterilizar.
3.- Coloca el material a esterilizar dentro de la autoclave u olla de presión,
evitando que el material toque las paredes.
4.- Cierra la autoclave u olla de presión. Sigue las instrucciones del fabricante para
iniciar su trabajo.
5.-Deja enfriar hasta que el manómetro marque cero. Abre la válvula de salida de
vapor, para expulsar el vapor restante.
6.- Esperar unos minutos a que se enfríe perfectamente y abra la autoclave, y retire
el material.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

1- Antes de preparar cualquier medio leer cuidadosamente el rótulo del envase y
fijarse la fecha de vencimiento.
2- Calcular la cantidad de polvo, de acuerdo a las instrucciones del rótulo del
envase y el volumen total que se desee preparar.
3- Pesar sobre papel de aluminio la cantidad de medio a preparar y se vuelca en el
recipiente en el que será preparada.
4- Medir el volumen de líquido en otro recipiente auxiliar limpio y graduado, y
verter sobre el recipiente con el medio pesado.
5- Agita vigorosamente hasta obtener una suspensión o solución (si es caldo)
homogénea. Los caldos suelen dar soluciones transparentes que no necesitan
calentamiento ni ninguna otra manipulación antes de ser llevados al autoclave.
Las soluciones con agar sin embargo, requieren calentamiento casi hasta
ebullición con agitación constante y a fuego suave (o a Baño María o microondas)
para lograr su solubilización completa.
6- Observar la solución durante el calentamiento ya que una vez que aparecieron
las primeras burbujas tiende a desbordar por ebullición.
7- Dosificar los medios preparados teniendo en cuenta el uso que se les dará.
Los caldo se dosifican en los tubos, colocando 9ml en cada uno de ellos y, 90 mL
en los frascos con tapa esmerilada.
8- Los medios sólidos se esterilizan en el mismo envase que se los preparó.

1. Calcule cuántos gramos de agar-nutritivo se necesitan para preparar 125 ml de
medio de cultivo sólido. ¿Qué porcentaje P/V se utilizó?
2. ¿Por qué el medio Mc Conkey puede ser considerado un medio selectivo y
diferencial? ¿Para el aislamiento de qué tipo de bacterias se lo emplea?. Anote la
composición y diga qué función cumple el rojo neutro.
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
3. ¿En qué momento se esteriliza un medio de cultivo y por qué?

4. Antes del agar-agar se utilizó otro componente para solidificar los medios de
cultivo, ¿de qué componente se trata y qué inconvenientes presentaba su uso?.
5. Consulte y describa, otros métodos físico-químicos para esterilización.
24. Bibliografía:
 Barry, A. y S. Gibson. 2002. Control de calidad en microbiología, en Dharan, M.
Control de Calidad en los Laboratorios Clínicos. Ed. Reverté. Sevilla, España.
 Collins C.H. y Lyne Patricia M. 1989. Métodos Microbiológicos. ACRIBIA. 524
pp
 Díaz, R., G. Gamazo e I. López Goñi.1995. Manual Práctico de Microbiología. 1ª
edición. MASSON, S. A. España
 Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock. Biología de los
microorganismos. 10ª edición. Prentice Hall Iberia. España.
 Ramírez-Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García,
A. Mejía Chávez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernández Gómez, I. Müggenburg, A.
Camacho Cruz y M del C. Urzúa Hernández. 2006. Manual de Prácticas de
Microbiología General. 5ª edición. Facultad de Química, UNAM. México.
 Riveros, S. Historia de los Indicadores Biológicos.
http://www.enfermeraspabellonyesterilizacion.cl/trabajos/biologicos.pdf
Consultado en enero de 2010.
 Stanier,R. Y., J. L Ingraham, M. L Wheelis y P. R Painter, 1996. Microbiología.
2ª edición. Reverté, S. A. España
 Tortora Gerard J., Fonke Beidell R. y Case Christine L. 1995. Microbiology an
Introduction. 5a. ed. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 801 pp
 Zinsser. Microbiología. 1994. Ed. Panamericana. 1699 pp
______________________________________________________________________
#3
1. TEMA: Técnicas de siembra microbiológicas
2. Objetivo general: Desarrollar destrezas para realizar diferentes tipos de siembra para
cultivos microbiológicos.
1. Llevar a cabo la técnica de transferencia aséptica de microorganismos para un

subcultivo.
2. Esterilizar correctamente los instrumentos de inoculación en la flama del
mechero.
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R001
3. Realizar los procedimientos de rayado de placas (siembra por estrías)

4. Realizar la siembra en un medio de cultivo líquido
4. Introducción:
La siembra es el proceso de colocar microorganismos en medios de cultivo estériles. Los
microorganismos pueden ser obtenidos de una muestra biológica, de muestras de
alimentos, de muestras ambientales o simplemente de un cultivo puro. La técnica de
transferencia de microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de cultivarlos
es una de las técnicas más utilizadas en el laboratorio de microbiología, dado que para
identificar y caracterizar organismos microscópicos se debe obtener cultivos puros
(axénicos).
Existen diferentes técnicas de siembra que se pueden aplicar dependiendo de las

características de los microorganismos y del objetivo del estudio. Los elementos
importantes que se utilizan para realizar la siembra son: mechero (de alcohol o Bunsen),
asa bacteriológica, espátula, cámara de flujo laminar o el espacio adecuado en
condiciones asépticas y medios de cultivo preparados y autoclavados.
5. Fundamento:
Se pueden utilizar una gran variedad de técnicas de siembra, dependiendo del medio de
cultivo y del objetivo del trabajo, entre las técnicas más utilizadas tenemos:
Siembra en cajas Petri por la técnica de agotamiento, aislamiento o de estría

cruzada: Es una técnica utilizada para obtener colonias aisladas, es decir obtener
colonias separadas a partir de un inóculo. Para realizar la siembra por este método se
debe tomar el inóculo de un cultivo después de haber esterilizado el asa directamente
en la llama del mechero. El inóculo debe ser transferido a la caja Petri con
movimientos en forma de estrías (como se muestra en la Figura 1). Después de cada
estría se debe esterilizar el asa con el objetivo de reducir la carga microbiana, y cada
nueva estría empieza con el arrastre de microorganismos desde la anterior estría.
Después de terminar la siembre en asa debe ser flameada directamente en la llama
para esterilizarla.
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R001
Figura 1. Pasos para la siembra de bacterias por la técnica de agotamiento
Siembra en cajas Petri por la técnica de siembra en cuadrantes: Esta técnica permite
disminuir la carga microbiana a medida que se realizan las estrías en cada cuadrante
del agar. Para realizar la siembra se divide la caja Petri en cuatro cuadrantes
(imaginariamente o con un marcador en la base de la caja). Una vez que se toma el
inóculo se inicia en rayado en cada cuadrante sin esterilizar en asa después de cada
estría (Figura 2). Después de terminar la siembre en asa debe ser flameada
directamente en la llama para esterilizarla.
Figura 2. Técnica de siembra en cuadrantes
Siembra en tubo en medio líquido: Para transferir material a partir de un medio líquido
o sólido a otro líquido, puede usarse el asa bacteriológica, o en algunos casos pipetas
estériles o hisopos. Cuando se utiliza el asa bacteriológica, se inocula el
microorganismo en el medio líquido haciéndola rotar del mango.
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MICROBIOLOGÍA
R001
Figura 3. Siembra con asa bacteriológica en medio líquido.
6. Materiales:
En la tabla se detallan los materiales para un grupo de 5 estudiantes
Material Cantidad
Caja Petri con agar nutriente 10
Tubos con caldo nutritivo 5
Asa bacteriológica 2
Cultivo de bacterias 1
Parafilm 1
Gradilla 1
Marcador para vidrio 1
7. Equipos: En la tabla se detallan los materiales para un grupo de 5 estudiantes
Equipos Cantidad
Mechero Bunsen 1
Incubadora 1
1. Utilizando un marcador para vidrio, identifique todos los tubos de medios estériles
indicando siempre:
a. Nombre del microorganismo,
b. Nombre del medio,
c. Dilución de la muestra (si la hay),
d. Nombre del grupo
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e. Fecha
2. Siguiendo el procedimiento descrito e ilustrado previamente, realice las siguientes
transferencias:
a. Siembra en caja Petri por la técnica de agotamiento
b. Siembra en caja Petri por la técnica de cuadrantes
c. Siembra en tubo en medio líquido
d. Incubar las cajas y tubos a 37⁰ C durante 48 horas.
9. Cuestionarios y problemas
 ¿Cuál es la finalidad de la siembra por agotamiento?
 ¿Por qué el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias?
 ¿Cómo se identifica el crecimiento de microorganismos en los tubos con medio
líquido?
10. Bibliografía:
Aquiahuatl Ramos, M. d., & Pérez Chabela, M. d. (2004). Manual de prácticas de

laboratorio de microbiología general. Iztapalapa, México: Universidad
Autónoma Metropolitana. Obtenido de
http://www.uamenlinea.uam.mx/materiales/licenciatura/diversos/AQUIAHUAT
L_RAMOS_MARIA_DE_LOS_ANGELES_Manual_de_practicas_de.pdf
Rojas-Triviño, A. (2011). Conceptos y práctica de microbiología general. Palmira,
Colombia. Obtenido de
http://www.bdigital.unal.edu.co/4999/1/albertorojastrivino.2011.pdf
______________________________________________________________________
#4
25. TEMA: Cuantificación de bacterias por el método de dilución
26. Objetivo general: Cuantificar las bacterias utilizando el método de diluciones

continuas.
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R001
 Entender el concepto de Unidad Formadora de Colonia (UFC)

 Desarrollar destrezas en la preparación de diluciones seriadas.
28. Introducción:
Existen diferentes técnicas para determinar el número de microorganismos o el peso seco
(biomasa) de las células microbianas presentes en un cultivo. Los métodos de conteo
microbiológico se agrupan en directos e indirectos.
Métodos directos: Requieren de preparaciones puras, sin ningún tipo de partículas que
puedan ocasionar errores, y se refieren básicamente a la medida de la masa celular o
directamente del número de individuos presentes en una muestra, tres estos mpetodos
destacan: determinación del peso seco, determinación del peso húmedo,
determinación del nitrógeno total y recuento en cámara de Petroff – Hausser.
Métodos indirectos: Buscan realizar una estimación de la población bacteriana en

base a un parámetro en particular, entre estos métodos tenemos: consumo de
nutrientes/tiempo, turbidimetría, recuento de microorganismos viables, siendo este
último uno de los más utilizados.
29. Fundamento:
La forma de cuantificar células viables más utilizada en Microbiología, es la de hacer
diluciones y cuenta en placa con medios de cultivo específicos para la población de
interés. Esta técnica se basa en la suposición de que cada bacteria incluida en un medio
agar o en su superficie se multiplicará y producirá una colonia visible, en consecuencia
el número de colonias que se observarán a simple vista será igual al número de bacterias
viables o unidades formadoras de colonias (UFC) inoculadas en el agar multiplicadas por
el factor de dilución respectivo. (Aquiahuatl Ramos & Pérez Chabela, 2004)
30. Materiales:
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MICROBIOLOGÍA
R001
Material Cantidad
Caja Petri con agar nutriente 5
Pipetas de 1 – 2 ml estériles 5
Matraz Erlenmeyer 1
Cultivo de bacterias 1
Asa Digralsky 2
Gradilla 1
Marcador para vidrio 1
Tubos de ensayo pequeños estériles 5
Parafilm 1
Marcador de vidrio
31. Reactivos:
Material Cantidad
Agua autoclavada 120 ml
Equipos Cantidad
Mechero Bunsen 1
Incubadora 1

1. Utilizando un marcador para vidrio, identifique todas las cajas Petri con la siguiente
información:
a. Nombre del medio
b. Nombre del grupo
c. Fecha
2. Hacer diluciones decimales del cultivo de 10-3 hasta 10-7
3. Colocar 0.1ml de las soluciones con las tres últimas diluciones del medio de cultivo
4. Distribuir cuidadosamente el inóculo en una caja con ayuda del asa digralsky
5. Dejar absorber el líquido durante diez minutos.
6. Incubar las cajas en posición invertida a 35°C durante 24-48 horas.
7. Contar las colonias de las placas seleccionando la dilución donde el número de
colonias sea entre 30 y 300.
8. Reportar los resultados multiplicando el número de colonias encontradas por el
inverso del factor de dilución y por 10.
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
Fig. 1. Esquema de la preparación de las diluciones y la siembra en las Cajas Petri.

 Reporte los resultados obtenidos en la siguiente tabla
Nombre del estudiante Conteo de UFC/ml
 En base a los resultados obtenidos por los diferentes miembros del grupo explique
cuáles son las limitaciones y las posibles fuentes de error al utilizar la técnica de
dilución para el conteo bacteriano.
 Algunos autores sugieren la medición de actividad biológica y la determinación
de constituyentes celulares para la cuantificación de la población bacteriana.
Explique dos de estos métodos.
35. Bibliografía:

laboratorio de microbiología general. Iztapalapa, México: Universidad Autónoma
Metropolitana. Obtenido de
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001

______________________________________________________________________
#5
1. TEMA: Curva de crecimiento bacteriano
2. Objetivo general: Determinar el crecimiento microbiano mediante conteo de

células y turbidimetría para obtener la curva de crecimiento.
3. Introducción: Los métodos directos de cuantificación de microorganismos

permiten establecer la población total de microorganismos existentes, tienen la
ventaja de ser rápidos aunque no es posible diferenciar a las células vivas de las
muertas. Entre estos métodos tenemos la turbidimetría y el conteo de células.
4. Fundamento:
Turbidimetría
En una suspensión microbiana, la cantidad de microorganismos está directamente
relacionada con la turbiedad o densidad óptica. La metodología es útil con
suspensiones de densidad microbiana baja y con cultivos en donde los
microorganismos son unicelulares y con un tamaño de unos cuantos micrómetros,
características que les permiten mantenerse suspendidos y homogéneamente
distribuidos en tanto que con microorganismos de mayor tamaño y con aquellos
productores de polisacáridos esta metodología no es adecuada.
Recuento microscópico
Un volumen conocido de muestra es depositado en un portaobjetos especial para
cuenta (hemacitómetros, cámaras de Petroff-Hauser, Neubauer o de Helber; estas
consisten de portaobjetos excavados y cuadriculados que facilitan el recuento por
unidad de superficie y de volumen).
Con la cuantificación de microorganismos a través del tiempo es posible el
representar gráficamente el crecimiento microbiano. La curva presenta distintas
fases: Fase de latencia ó lag: período de adaptación de un microorganismo a un
nuevo medio de cultivo. Fase exponencial o logarítmica: aumento regular de la
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MICROBIOLOGÍA
R001
población que se duplica a intervalos regulares de tiempo (td). Fase estacionaria:

cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes, por acumulación de productos
tóxicos, etc. Fase de declinación o muerte: el número de células que mueren es
mayor que el número de células que se dividen.
Las propiedades de un microorganismo dependerán de la fase de la curva en que
se encuentren (por ejemplo la producción de antibióticos se lleva a cabo en la fase
estacionaria).
5. Materiales:
Material (por grupo) Cantidad

Tubos de ensayo tapa rosca 15
Gradilla 1
Pipetas 1ml 5
Pipetas 10ml 5
Gaza 1
Probeta 100ml 1
Algodon 1
Papel de estraza 1
Celdas para espectrofotometro 15
Portaobjetos 15
Cubreobjetos 15
Tubo T de vidrio 1
Matraz Erlenmeyer 125ml 1
6. Reactivos:
Reactivo Cantidad
Agua destilada 1L
Caldo nutritivo (medio de cultivo líquido 1L
deshidratado)
7. Equipos:
Equipo Cantidad
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R001
Plancha magnética 1
Balanza analitica 1
Espectrofotometro 1
Microscopio 1
Camara de Neubauer 1
Mechero 2
Autoclave 1
8. Notas: Se necesita la cepa de Escherichia coli
1.- Se preparará 250 ml de caldo nutritivo por equipo, se disolverá por
calentamiento y se distribuirá de la siguiente manera: 10 ml de medio en tubo con
tapón de rosca (15 tubos por equipo) 50 ml en un matraz erlenmeyer de 125 ml
con tapón de algodón
2.- Esterilizar las pipetas en un cilindro, los tubos y el matraz erlenmeyer con
medio de cultivo en el autoclave a 15 lb/plg2, durante 15 minutos.
3.- Inocular con Escherichia coli el matraz erlenmeyer el día anterior a la sesión
práctica e incubar a 37ºC (tabla 1).
4.-Al día siguiente medir densidad óptica del cultivo del matraz erlenmeyer
utilizando como blanco medio estéril para calibrar el espectrofotómetro.
5.- Inocular con el cultivo del matraz 4 tubos con caldo nutritivo (serie 1) e incubar
a 37ºC tres horas antes de que dé inicio la sesión práctica.
6.- Inocular con el cultivo del matraz 8 tubos con caldo nutritivo (serie 2) e incubar
a 37ºC
7.- Realizar el muestreo de acuerdo a la tabla 1, determinando la densidad óptica
de acuerdo al paso 4 y contando células siguiendo el procedimiento que se explica
a continuación.
Tabla 1. Horario de inoculación de E. coli a tubos con medio de cultivo y muestreo

para cuantificar microorganismos.
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MICROBIOLOGÍA
R001
CONTEO DE CÉLULAS
1. Hacer frotis y tinción de Gram a la muestra a cultivar.
2. Bajo condiciones de asepsia colocar en el área hundida de la cámara de
Neubauer una gota de los cultivos (muestras series 1 y 2) y extenderla
rápidamente. Evitar escurrimientos.
3. Colocar el cubreobjetos y observar con los objetivos de 40X y 100X
4. Contar las células en cuadros individuales. Para evitar el conteo de las mismas
células dos veces, omitir aquellas ubicados en las líneas de la parte superior e
izquierda de cada cuadro. Los microorganismos omitidos son considerados en los
cuadros superior y derecho adyacentes: ejemplo:
5. Contar cuando menos 10 campos

6. Calcular el número de microorganismos por mililitro o gramo de la muestra
original.
RESULTADOS
* Graficar la curva de crecimiento (número de células y densidad óptica)
* Determinar la tasa específica de crecimiento (μ) en la gráfica y con la ecuación
de la curva de crecimiento
* Determinar el tiempo de duplicación.

1. Explica en qué consisten los métodos directos e indirectos de cuantificación de
microorganismos
2. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de los métodos de cuantificación de
microorganismos empleados en la práctica?
3. Explica en qué consiste la curva de crecimiento y que pasa en cada etapa
11. Bibliografía:
 Barry, A. y S. Gibson. 2002. Control de calidad en microbiología, en Dharan, M.
Control de Calidad en los Laboratorios Clínicos. Ed. Reverté. Sevilla, España.
 Collins C.H. y Lyne Patricia M. 1989. Métodos Microbiológicos. ACRIBIA. 524
pp
 Díaz, R., G. Gamazo e I. López Goñi.1995. Manual Práctico de Microbiología. 1ª
edición. MASSON, S. A. España
 Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock. Biología de los
microorganismos. 10ª edición. Prentice Hall Iberia. España.
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
 Ramírez-Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García,

A. Mejía Chávez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernández Gómez, I. Müggenburg, A.
Camacho Cruz y M del C. Urzúa Hernández. 2006. Manual de Prácticas de
Microbiología General. 5ª edición. Facultad de Química, UNAM. México.
 Riveros, S. Historia de los Indicadores Biológicos.
http://www.enfermeraspabellonyesterilizacion.cl/trabajos/biologicos.pdf
Consultado en enero de 2010.
 Stanier,R. Y., J. L Ingraham, M. L Wheelis y P. R Painter, 1996. Microbiología.
2ª edición. Reverté, S. A. España
 Tortora Gerard J., Fonke Beidell R. y Case Christine L. 1995. Microbiology an
Introduction. 5a. ed. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 801 pp
 Zinsser. Microbiología. 1994. Ed. Panamericana. 1699 pp
_____________________________________________________________________________
#6
1. TEMA: Metabolismo bacteriano
2. Objetivo general:
Demostrar la diversidad de reacciones metabólicas que pueden utilizar las bacterias.
Objetivos específicos:
 Conocer las principales reacciones bioquímicas que ocurren en los diferentes
géneros de bacterias.
 Entender los mecanismos que permiten identificar las reacciones bioquímicas
dentro de las bacterias.
 Utilizar diversos medios selectivos y diferenciales.
3. Introducción:
Las bacterias son los organismos más pequeños que tienen la maquinaria requerida
para el crecimiento y la replicación. Están compuestas, como las células eucariotas,
por proteínas, polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos, entre otros. Estas macro-
moléculas pueden formar parte de estructuras celulares más complejas, como la pared
celular y la membrana plasmática. El crecimiento bacteriano se define como el
aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de la célula. Es un proceso
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
complejo que supone la replicación de todas las estructuras y componentes celulares

a partir de nutrientes exógenos. El conocimiento de la fisiología y del metabolismo
bacteriano tiene algunas aplicaciones prácticas. En principio permite conocer el modo
de vida y el hábitat de diferentes especies bacterianas. El ser humano actuando como
huésped, ofrece una variedad de nichos ecológicos que se diferencian entre sí por
aspectos físicos y químicos (temperatura, concentración de oxígeno, pH, presión
osmótica, etc.), en los cuales pueden crecer y multiplicarse distintas especies
bacterianas según sus requerimientos nutricionales, ambientales y atmosféricos.
Además, permite formular medios de cultivo para el aislamiento e identificación de
los patógenos participantes. Desde un enfoque terapéutico, nos permite conocer y
entender el modo de acción de algunos antibióticos que bloquean una vía metabólica
o la síntesis de alguna macromolécula esencial para la bacteria.
El término metabolismo se refiere al conjunto de reacciones químicas que se producen

en la célula y tiene tres funciones específicas. La primera es obtener energía química
del entorno y almacenarla, para luego usarla en diferentes funciones celulares. La
segunda es convertir los nutrientes exógenos en unidades precursoras de los
componentes macromoleculares de la célula bacteriana. Y la tercera función es formar
y degradar moléculas necesarias para cumplir funciones celulares específicas, por
ejemplo: movilidad y captación de nutrientes.
4. Fundamento:
En el laboratorio se pueden utilizar pruebas in vitro para determinar las características
metabólicas de los microorganismos, estas pruebas se basan en suministrar un
determinado sustrato a las bacterias y a medida que estas crecen lo pueden modificar
o no. Para la realización de tales pruebas se requiere un cultivo fresco (entre 12 y 24
horas de incubación).
A continuación, se describe brevemente el fundamento de las pruebas que se

realizarán durante esta práctica de laboratorio:
Prueba de la catalasa: la catalasa en una enzima que descompone el peróxido de

hidrógeno en agua y oxígeno (burbujas de gas), la mayoría de las bacterias aerobias y
anaerobias facultativas poseen actividad catalasa, con excepción de los estreptococos.
Fermentación de glucosa: La determinación de la capacidad de fermentación de la

glucosa es importante durante las primeras etapas de identificación de los
microorganismos. La realización de esta prueba se basa en cultivar las bacterias en
Caldo de Glucosa y agregar una campana Durham invertida. Posteriormente se
procede a incubar las bacterias a 35°C durante 48 horas. Aquellas bacterias
fermentadoras de glucosa producen un viraje en el indicador a color amarillo, y
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R001
adicionalmente puede observarse la presencia de burbujas de H2 en la campana, el

cual es un producto residual insoluble del proceso fermentativo. Por su parte las
bacterias no fermentadoras, no producen viraje, con lo cual el medio toma una
coloración de violeta a púrpura.
Producción de indol: el indol es uno de los productos de la degradación metabólica

del triptófano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de
hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y
amoníaco. La prueba se basa en cultivar los microorganismos en un medio rico en
triptófano (caldo triptófano, agua de peptona, etc), y dejar en incubación durante 24
horas, después de lo cual se deben agregar cinco gotas de reactivo de Kovac´s, la
prueba será positiva si se forma un anillo color rojo cereza en la superficie del caldo
a los pocos segundos de colocado el reactivo.
Prueba de Citrato de Simmons: La utilización de citrato como única fuente de carbono

es útil en la identificación de enterobacterias. Se debe inocular las bacterias en el
medio correspondiente y cultivarlas por un período de 24 hasta 72 horas, la prueba es
positiva cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría acompañado o no de un
viraje de color azul.
5. Materiales:
Material Cantidad
Portaobjetos 4
Asas bacteriológicas 5
Gradilla 1
Campanas Durham 5
Marcador
Parafilm
6. Reactivos:
En la tabla se detallan los reactivos para un grupo de 5 estudiantes
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R001
Reactivos Cantidad
Peróxido de hidrógeno 1
Cultivo en placa fresco (24 horas) 1
Caldo glucosa rojo de fenol 5
Tubos con agua de peptona 5
Reactivo de Kovac´s
Tubos con Agar Citrato de Simmons 5
inclinado
Equipos Cantidad
Mechero Bunsen 1
Incubadora 1
Prueba de Catalasa.
1. Colocar una gota de peróxido de hidrógeno al 3% en el centro de un portaobjetos
limpio.
2. Transferir una alícuota de microorganismos frescos al sitio donde se encuentra el
peróxido de hidrógeno.
3. La rápida aparición sostenida de burbujas de gas indica una prueba positiva.
Prueba de la fermentación de glucosa

1. Colocar las campanas Durham en posición invertida dentro de los tubos que
contienen el caldo glucosa rojo de fenol.
2. Inocular los tubos con microorganismos frescos.
3. Incubar a 35°C durante 48 horas.
Prueba de producción de indol:

1. Inocular microorganismos frescos en los tubos con agua de peptona.
2. Incubar durante 24 horas.
3. Agregar cinco gotas de reactivo de Kovac´s dejando que este resbale por las
paredes del tubo.
4. Registrar sus resultados.
Prueba de Citrato Simmons
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R001
1. Inocular los microorganismos en los tubos con el citrato Simmons.

2. Incubar durante 24 horas.
3. Registrar sus resultados.
Nombre del Prueba de Fermentación Producción de Prueba de
estudiante catalasa de glucosa indol Citrato de
Simmons
*Debe incorporar las fotografías de los resultados obtenidos.
 ¿Qué otras enzimas pueden provocar un falso positivo en la prueba de la catalasa?

 Además de la fermentación de la glucosa, la prueba de fermentación de azúcares
en agar TSI es de uso frecuente. Explique el fundamento de esta prueba.
 ¿Por qué se forma el anillo rojo en la prueba positiva de producción de indol?
Explique
10. Bibliografía:

laboratorio de microbiología general. Iztapalapa, México: Universidad Autónoma
Metropolitana. Obtenido de
_____________________________________________________________________________
#7
36. TEMA: TÉCNICAS DE MUESTREO
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R001
37. Objetivo general: Conocer las diferentes técnicas de muestreo utilizadas para el
análisis microbiológico de agua y aire necesario para determinar la calidad
microbiológica de interés sanitario.
 Describir el procedimiento para la toma de muestra de agua.

 Describir el procedimiento para la toma de muestra de aire.
 Describir el procedimiento para la toma de muestra en superficies.
39. Introducción:
En el sentido estricto, una muestra colectada en un tiempo determinado y lugar en
particular, representa la composición de esa fuente en ese preciso instante y lugar.
Por ello, el muestreo debe realizarse considerando los máximos cuidados. Por otra
parte de una buena toma de muestra, depende la representatividad de los
resultados analíticos que se obtendrán en el laboratorio. La toma de muestra no
solo involucra el proceso de obtener físicamente la muestra representativa del
cuerpo de agua para el análisis, sino también el de caracterizar el ambiente del
cual la muestra fue tomada y el manejo de la misma para cumplir con los objetivos
propuestos.
Normalmente, el muestreo está representado por la obtención de una parte de la
porción de agua a ser evaluada, realizándose a nivel de campo las determinaciones
de los parámetros susceptibles de sufrir algún tipo de variación como
consecuencia del tiempo transcurrido entre el muestreo y su análisis en el
laboratorio; mientras que la porción restante, considerada como más estable en el
tiempo, es pre tratada, envasada, preservada y embalada convenientemente para
su transporte hasta el laboratorio en donde se realizaran los análisis respectivos.
Una vez obtenida la muestra, el inspector debe rotular el envase que contiene la
muestra, realizar las mediciones de campo, como temperatura y cloro residual, y
anotar en la hoja de muestreo antes de abandonar el lugar de toma de muestra.
Finalmente, si la muestra que llega al laboratorio no reúne las condiciones de
muestreo como son: tipo de envase, preservación, transporte e identificación, la
muestra debe ser rechazada en su totalidad. Adicionalmente, durante el muestreo
se deben tomar todas las medidas de seguridad adecuadas para evitar accidentes
del personal encargado del muestreo y se debe usar distinta muestra para los
análisis fisicoquímicos, metales, plaguicidas y bacteriológicos porque los
métodos de recolección y manipulación son diferentes.
40. Fundamento:
Toma de muestras de agua:
La muestra debe ser colectada en frascos de vidrio, o de polipropileno
autoclavable, de boca ancha, estériles. No debe llenarse el frasco por completo,
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R001
dejando una cámara de aire para poder homogeneizar la muestra antes de

procesarla.
La muestra debe conservarse a 4ºC hasta ser analizada. El período máximo de
conservación de la muestra en frío es de 6 - 8 horas. Para aguas que fueron
cloradas el frasco debe contener Na2S203 en una concentración de 100 mg/L de
muestra para neutralizar el cloro residual, sin producir efectos importantes sobre
los coliformes de la muestra. En un frasco de muestreo de 120 mL, 0.1 mL de
solución de Na2S203 al 10%, es suficiente para neutralizar 15 mg/L de cloro
residual.
Cuando la muestra posee una alta cantidad de metales pesados, el frasco de
muestreo debe contener EDTA a pH 6.5 como agente quelante en una
concentración de 372 mg/L, para disminiur la toxicidad de los mismos.
Cuando la muestra es de agua de ríos, arroyos, lagos o reservorio, recolectar la
muestra por lo menos 15 cm debajo de la superficie y si es posible, contra
corriente.
Toma de muestras de aire:

Los microorganismos pueden ser transportados rápidamente, en forma de
bioaerosoles, a través de grandes distancias con el movimiento del aire que
representa el mejor camino de dispersión.
Toma de muestras de superficie:

 Método del hisopo: Se utiliza para superficies inertes regulares e
irregulares, tales como mesas de trabajo, utensilios, pisos, paredes y otros.
 Método de la esponja: El método de la esponja se utiliza preferentemente
para muestrear superficies de mayor área.
 Método del enjuague: Se utiliza para superficies vivas (manos) y para
objetos pequeños o para el muestreo de superficies interiores de envases,
botellas, bolsas de plástico, etc.
41. Materiales:
CANTIDAD
42. MATERIAL
(por grupo)
Hisopos de algodón u otro
material equivalente, de largo 4
aproximado de 12 cm.
Tubos de ensayo 4
Cajas petri 4
Frascos de vidrio ambar (500
2
mL)
Hielera 1
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Parafilm 1
43. Reactivos:
CANTIDAD UNIDAD
REACTIVO
(por grupo)
Peptona 1 (por curso) g
Agua destilada 1000 mL
44. Equipos:
CANTIDAD
45. EQUIPOS
(por grupo)
Incubadora 1

Procedimiento para la toma de muestras de aguas superficiales:
1) Utilizar frascos de vidrio o plástico con tapa, limpios y de preferencia
proporcionados por el laboratorio.
2) Enjuagar el frasco por lo menos tres veces con la muestra.
3) Tomar porciones individuales del cuerpo de agua en estudio en frascos de
boca ancha, y tapar inmediatamente. En todos los casos la muestra de agua
no deberá llenar totalmente el frasco, siendo necesario dejar un espacio
interior a fin de facilitar su homogenización en el momento de iniciar los
análisis.
4) Colocar la muestra en contenedores (hieleras) a menos de 10°C, no requiere
de preservantes.
5) El tiempo de recolección de la muestra hasta el inicio del análisis no debe
exceder de 48 horas, por lo que se recomienda enviar las muestras de
inmediato al laboratorio.
6) Identificar el lugar, fecha y hora de muestreo, tipo de muestra, persona
encargada de tomar la muestra y otras observaciones adicionales.
Procedimiento para la toma de muestras de agua de grifos:

1) Lavarse manos y antebrazos con agua y jabón, colocarse guantes, cubreboca,
bata y cofia.
2) El muestreo debe realizarse cuidadosamente, evitando que se contaminen el
tapón, boca e interior del envase
3) Tomar un poco del agua que se va a analizar, cerrar el envase y agitar
fuertemente para enjuagar, desechando esa agua, efectuar esta operación dos
o tres veces procediendo enseguida a la toma de muestra.
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R001
4) Dejar correr el agua aproximadamente por 3 min. o hasta que la temperatura

de la muestra sea estable antes de la toma o hasta asegurarse que el agua
contenida en la línea ha sido renovada.
Procedimiento para la toma de muestras de aire:

1) Dejar un número de cajas con medio de cultivo (agar nutritivo) abiertas, de
acuerdo con el tamaño del espacio a estudiar (1 caja por cada 10 m2) por un
período entre 15 a 30 minutos.
2) Cerrar las cajas y enviarlas a incubar.
Procedimiento para la toma de muestras de superficies con hisopos:

1) Colocarse cubre-bocas y guantes estériles.
2) Seleccionar la superficie a muestrear.
3) Humedecer el hisopo en la solución diluyente esterilizada (agua peptonada
al 0,1%, pH 7) y presionar ligeramente en la pared del tubo con un
movimiento de rotación para quitar el exceso de solución.
4) Con el hisopo inclinado en un ángulo de 30º, frotar 4 veces la superficie a
muestrear, cada una en dirección opuesta a la anterior. Asegurar el
hisopado en toda la superficie. Se debe frotar con el hisopo una superficie
de aproximadamente 100 cm2, para lo cual se puede emplear una plantilla
de 10 cm x 10 cm.
5) Colocar el hisopo en el tubo con la solución diluyente, quebrando la parte
del hisopo que estuvo en contacto con los dedos de la persona que
muestreó, la cual debe ser eliminada.
47. Cuestionarios y problemas:

a) ¿Por qué es importante utilizar un neutralizante en la toma de muestras de
agua en microbiología?
b) ¿Qué análisis microbiológicos se hacen frecuentemente en agua?
c) ¿Por qué es necesario dejar correr el agua del grifo antes de tomar la muestra?
48. Bibliografía:
 Ambiente, M. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS ANALITICOS PARA
AGUAS Y EFLUENTES.
http://imasd.fcien.edu.uy/difusion/educamb/docs/pdfs/manual_dinama.pdf
 Bolívar, C. 2011. Manual de procedimientos de toma de muestras de aguas
para análisis físico-químicos y microbiológicos.
http://tecnologosencontrolambientalsenacicuc.blogspot.com/p/manual-de-
procedimiento-de-toma-de.html
 Secretaría Distrital de Salud de Bogotá, D. C. 2008. Manual para la toma de
muestras para análisis microbiológico.
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
http://www.saludcapital.gov.co/sitios/VigilanciaSaludPublica/Todo%20IIH/
Manual%20Toma%20Muestras.pdf
Ministerio de Salud. 2007. Guía técnica para el análisis microbiológico de superficies
en contacto con alimentos y bebidas.
http://www.sanipes.gob.pe/normativas/8_RM_461_2007_SUPERFICIES.pdf
_____________________________________________________________________________
#8
1. TEMA: Microbiología de Aguas I
2. Objetivo general: Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos

mediante el recuento de mesófilos aerobios y la búsqueda de microorganismos
coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.
* Explicar el concepto microbiológico de indicador de contaminación.
* Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos
coliformes fecales.
* Aplicar las técnicas de cuantificación de microorganismos totales y comparar
con las técnicas de determinación de viables.
4. Introducción: La determinación de la calidad bacteriológica reviste gran

importancia en el ámbito de la salud pública ya que permite garantizar la
inocuidad del agua destinada al consumo evitando así epidemias
gastrointestinales.
El agua destinada al consumo humano puede ser contaminada por las agua
residuales o por desechos humanos y animales que pueden contener
microorganismos patógenos (principalmente intestinales) como son los causantes
de la tifoidea (Salmonella typhi), la disentería (Shigella dysenterieae) o el cólera
(Vibrio cholerae) entre otros.
5. Fundamento:
La detección de microorganismos patógenos es poco práctica por las siguientes
razones:
a) No siempre están presentes en la fuente de contaminación (material fecal), pero
pueden aparecer repentinamente.
b) Al diluirse en el agua, pueden quedar en concentraciones no detectables por los
métodos de laboratorio.
c) Sobreviven relativamente poco tiempo en el agua, por lo que pueden
desaparecer antes de ser detectados.
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d) Los resultados del análisis bacteriológico del agua se obtienen después que ésta
ha sido consumida por lo cual si hay patógenos, la población habrá estado
expuesta a la infección.
Todo esto hace indispensable una medida de control más efectiva como es la
detección del peligro potencial; es decir, la advertencia del riesgo de
contaminación con microorganismos patógenos antes de que aparezcan.
Para detectar ese peligro potencial, se utilizan indicadores de contaminación que
reúnen las siguientes características:
a) Se encuentran como flora normal en la fuente de contaminación, es decir, en la
materia fecal, independientemente de que haya o no microorganismos patógenos.
b) Son más resistentes y sobreviven en el agua más tiempo que los patógenos.
c) Su detección en el laboratorio es relativamente rápida, fácil y confiable.
Las bacterias coliformes reúnen las características anteriores, ya que se
encuentran en grandes cantidades en el tracto intestinal del hombre y de los
mamíferos y por lo tanto en sus heces y es fácil diferenciar las especies coliformes
de origen fecal de las que no lo son.
La sobrevivencia de los coliformes en el agua es mayor que la de cualquier
bacteria es enteropatógena y su identificación es fácil y confiable.
Por todo ello, el aspecto más importante del análisis bacteriológico del agua es la
determinación de coliformes que puede hacerse por el método del número más
probable (NMP) o por el método de filtración de membrana (FM), el primero es
el método oficial en nuestro país.
Existen otros métodos microbianos que son indicadores de otros tipos de
contaminación:
Bacterias mesófilas aerobias que reflejan la exposición de la muestra a la
contaminación en general, la existencia de condiciones favorables para la
multiplicación de microorganismos y la presencia de materia orgánica. La
determinación de bacterias mesófilas aerobias también es rutinaria en el análisis
bacteriológico del agua.
Streptococcus de origen fecal, que son más abundantes que los coliformes en el
tracto intestinal y heces de los animales, pero sobreviven menos que los
coliformes porque prácticamente no se multiplican en el agua, por ello su
predominio en el agua indica contaminación fecal proveniente de animales o
contaminación relativamente reciente.
La relación entre el número de coliformes y el número de Streptococcus de origen
fecal son: S. faecalis, S. faccium, S. durans, S. equinus y S. bovis.
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Clostridium perfringens que también se encuentra en la flora normal intestinal y,

por ser esporulado, resiste la presencia de sustancias tóxicas que se encuentran en
aguas residuales de industrias; por eso es indicador de contaminación fecal en este
tipo de aguas, en las que otros microorganismos no sobreviven.
El Código Sanitario Mexicano establece que el agua potable debe contener menos
de 20 coliformes por litro (es decir menos de 2/100mL) determinados por el
método del NMP, y que la cuenta de mesófilos aerobios no debe exceder de 200
colonias/mL de agua determinadas en agar triptona glucosa extracto de levadura
a 35ºC durante 24 horas.
Desde el punto de la salud Pública, los resultados individuales de muestras

tomadas de la red de distribución tienen solo un valor relativo; el control de la
calidad bacteriológico del agua debe ser sistemático.
Los programas de control se establecen tomando en cuenta la calidad
bacteriológica de la fuente de abastecimiento, los riesgos de contaminación, la
longitud de la red de distribución, los cambios estacionales y eventualidades tales
como brotes epidémicos, reparaciones, interrupciones y operación anormal, entre
otras.
6. Materiales:
Material (Muestreo 1) Cantidad

Frasco de boca ancha con tapón 1
esmerilado
Papel Kraft 1
Pipeta de 1mL 1
Algodon 1
Material (muestreo 2) Cantidad

Bolsa de plástico con cierre (ziploc) 1
Pipeta de 1mL 1
Material (Técnicas de Dilución y vaciado Cantidad

en placa, NMP, y Filtración)
Tripié y tela de asbesto 1
Accesorios de equipo millipore 1
33
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LABORATORIO
Versión: 00
ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
Matraz Erlenmeyer 250ml 1

Tubos de ensayo 10ml 5
Caja petri 1
7. Reactivos:
Reactivo (Muestreo 1) Cantidad

Solución de tiosulfato de sodio 10% 1L
Etanol 1L
Reactivo (Muestreo 2) Cantidad

Solución de tiosulfato de sodio 10% 1L
Reactivo (Técnicas de Dilución y vaciado Cantidad

en placa, NMP, y Filtración)
Agar cuenta estándar 150ml
Caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) 50ml
triple concentración (3X)
Agar bilis rojo violeta 25ml
8. Equipos:
Equipo Cantidad
Equipo Millipore esteril 1
Balanza analitica 1
Plancha agitadora 1
Microscopio 1
Camara de flujo laminar 1
Mechero 2
Autoclave 1
9. Notas: Se necesita muestra de: 10 ml agua almacenada, 600ml de hielo raspado

(sin sabor) y los alumnos deberán tener: 3 tubos con 9mL de solución salina
estéril, pipetas serológicas de 10, 5 y 1mL estériles y 10 cajas petri estériles de
vidrio o plástico estériles
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LABORATORIO
Versión: 00
ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
MUESTREO 1
a) Preparación de los frascos:
1. Lavar perfectamente el frasco, eliminando todo resto de jabón o detergente
2. Agregar 0.1mL de tiosulfato de sodio al 10% (0.5mL para frascos de 500mL)
3. Colocar una tira de papel kraft de 1 x 5cm entre tapón y cuello (frascos
refractarios con tapón esmerilado)
4. Cubrir el tapón y el cuello del frasco con papel kraft
5. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
b) Toma de la muestra:
1. Lavarse las manos y desinfectarlas con etanol al 70%
2. Para grifos lo primero es desinfectar el grifo con algodón y etanol y dejar correr
el agua por 3 minutos.
3. Generar zona aséptica cuando sea posible hacerlo.
4. Destapar el frasco, llenar hasta 2/3 del recipiente y tapar inmediatamente.
5. Para la recolección de agua a partir de depósitos naturales y cuerpos receptores,
retirar la cubierta de papel y sostener el frasco por la base e introducirlo en el agua
30cm.
6. Destapar y llenar contra corriente o moviéndolo al frente, llenar hasta 2/3 del
recipiente y tapar inmediatamente.
7. En cada caso etiquetar el frasco y elaborar una hoja de registro de datos.
8. Llevar las muestras al laboratorio lo más pronto posible, para analizarlas antes
de que transcurran 2 horas, o 5 horas si se transportan en hielo.
MUESTREO 2
a) Toma de la muestra
1. Comprar con un día de anterioridad 3 vasos de hielo raspado (1.5L) o granizado
de los carritos y colocarlo en la bolsa plástica.
2. Cerrar inmediatamente y refrigerar (no congelar).
3. Llevar las muestras al laboratorio lo más pronto posible, para analizarlas antes
de que transcurran 2 horas, o 5 horas si se transportan en hielo.
DILUCIÓN Y VACIADO EN PLACA, NMP, Y FILTRACIÓN

a) Determinación de mesófilos aeróbios
1. Homogenizar la muestra de agua de sabor.
2. Realizar 2 diluciones decimales en SSI.
3. Depositar con pipeta 1mL de muestra o dilución en cada caja de Petri estéril
(esquema 1). Realizar cada dilución por duplicado.
4. Verter en cada caja aproximadamente 20mL del medio agar cuenta estándar,
fundido y enfriado a 45°C, homogenizar y dejar solidificar.
5. Etiquetar cada una de las cajas.
6. Verter una en una caja medio de cultivo sin muestra como control.
7. Una vez solidificadas, incubar las placas a 35°C durante 24 horas.
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
8. Contar todas las colonias presentes, en las cajas que contengan de 25 a 250.
b) Determinación del NMP de coliformes en agua o hielo potables (esquema

general)
b.1.)Prueba presuntiva. Determinación del NMP de coliformes en agua y hielo

potables:
1. A partir de la muestra de agua inocular 20mL en cada uno de 5 tubos con
caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) triple concentración. Rotular.
2. Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si hay
formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no
se observa producción de gas, incubar 24 h. más.
c) Técnica de filtración:
1. Etiquetar la caja con Agar Bilis Rojo Violeta con los siguientes datos: # de
equipo - Filtración (muestra) - dd/mm/aa
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
2. Colocar dos mecheros encendidos y crear entre ellos un área estéril. En

condiciones de asepsia instalar el equipo Millipore estéril. Antes de instalar el
del filtro conector. Las pinzas de punta roma se esterilizan con alcohol y a la
flama antes de tomar la membrana.
3. Retirar la tapa de aluminio del vaso y transferir el contenido de la muestra
líquida solicitada, si presenta partículas en suspensión filtrar previamente con
algodón y gasa.
4. Abrir la llave de vacío y filtrar el medio a través de la membrana. Una vez que
hubo pasado todo el medio cerrar el vacío.
5. Retirar las pinzas de pato y el vaso.
6. Con ayuda de las pinzas de punta roma, retirar la membrana y colocarla en la
caja de Petri con Agar Bilis Rojo Violeta. Presionar ligeramente la superficie
para favorecer la adherencia de la membrana.
7. Sellar con dos tiras de masking tape la caja de Petri recién inoculada e incubar
a 37ªC durante 24 horas.
8. Transcurrido el tiempo de incubación revisar los resultados y guardar en
refrigeración.
12. Bibliografía:
* Standard Methods for the examination of water and wastewater. 1998. American Public
Health Association. 20th edition. Washington.
* Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la
cuenta de bacterias aerobias en placa.
* Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinación de
bacterias coliformes. Técnica del número más probable.
* Norma Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2002, Productos y servicios. Agua y hielo
para consumo humano, envasado y a granel. Especificaciones sanitarias.
* Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. 8ª Edición.
* Cappuccino, James G. and Sherman Natalie. 2005. Microbiology: a laboratory manual.
7th edition. Pearson/Benjamin Cummings. USA. QR63 C36 2005
* Leboffe Michael J. and Burton E. Pierce. 2006. Microbiology laboratory theory and
application. 2nd edition, Morton Publishing Co. USA. QR63 L43 2006.
* Madigan, M. T. and J. M. Martinko. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th
edition. Pearson Prentice Hall. USA. QR41.2 B753 2006
37
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LABORATORIO
Versión: 00
ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
* Mac Faddin, Jean F. 2003. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de

importancia clínica. 3ª edición. Médica Panamericana, Argentina. QR67 M3318 2003
* Prescott Lansing M., Harley John P. and Klein Donald A. 2005. Microbiology. 6th
edition. McGraw-Hill. USA. QR41.2 P74 2005
* Tortora Gerard J., Funke Berdell R. and Case Christine L. 2007. Microbiology: an
introduction. 9th edition. Benjamin Cummings. USA. QR41.2 T67 2007
_____________________________________________________________________________
#9
1. TEMA: Recuento de coliformes totales por el método de filtración a través de

membrana.
2. Objetivo general:
Determinar el número de Unidades Formadoras de Colonia en una muestra de agua,
por medio de la filtración a través de membrana.
 Desarrollar destrezas en el manejo de un sistema de filtrado utilizando una bomba
de vacío.
 Entender la utilidad del medio de cultivo Caldo – m- Endo.
 Determinar las diferencias entre coliformes totales y coliformes fecales.
4. Introducción:
Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un
grupo de bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que
por criterios taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se
caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas,
más o menos rápidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de
incubación comprendida entre 30-37ºC.
Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del
grupo <<coliforme>> forman parte varios géneros: Escherichia, Enterobacter,
Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
animales, pero también en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cáscara de huevo,
etc.
5. Fundamento:
El número de coliformes totales presentes en el agua se determina mediante la
filtración de volúmenes específicos de la muestra a través de filtros de membrana. Por
lo general, están compuestos de ésteres de celulosa, típicamente con poros de 0,45
mm de diámetro que retienen los coliformes totales y otras clases de bacterias
presentes en la muestra. Después se incuban las membranas vueltas hacia arriba en
un medio selectivo. En la práctica, la técnica de filtración de membrana ofrece
resultados comparables a los que se obtienen con el método de tubos múltiples.
Una de las ventajas del método de filtración a través de membrana es la prontitud con
que pueden obtenerse los resultados y, en consecuencia, se pueden llevar a cabo
rápidamente acciones correctivas y operar en la planta de agua de nuevo en forma
normal. Esta técnica puede aplicarse en el análisis de casi todos los tipos de agua,
también se utiliza en el análisis de leche y otros alimentos líquidos.
Cuando se obtienen recuentos de más de 200 colonias sobre una misma membrana
pueden dar resultados erróneos debido a la superpoblación, ya que lo que aparece
como una colonia puede ser originado por varias bacterias bajo condiciones de
hacinamiento. En estos casos debemos volver a muestrear el agua y analizar muestras
más diluidas.
Por otra parte, un número de colonias inferior a 10 ó 20 por membrana es poco fiable
como base para establecer cuantitativamente la concentración bacteriana de la
muestra. Por ejemplo, la obtención de 2 colonias a partir del análisis de 1 ml de un
agua, no nos permite afirmar que esa agua contenía 200 colonias en 100 ml. En estos
casos conviene repetir el análisis filtrando un volumen de muestra mayor.
Cuando el recuento de colonias está entre 20-200, los resultados se expresan:

Recuento de colonias = UFC / volumen de muestra filtrada.
6. Materiales:
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
Material Cantidad
Filtros de membrana 0,45 um 1
Matraz kitasato 500 ml 4
Marcador 5
Pipetas estériles 1 ml 1
Pinzas estériles 1
Parafilm 1
Asa bacteriológica 1
7. Reactivos:
Reactivos Cantidad
Muestras de agua 100 ml
Cajas pertri Caldo m - Endo 1
Equipos Cantidad
Mechero Bunsen 1
Incubadora 1
Soporte del filtro con 1
embudo estéril
Sistema de vacío 1
1. Colocar la membrana filtrante de 0,45 µm de tamaño de poro sobre el portafiltros

de la base del mismo. El manejo de las membranas se debe realizar con pinzas de
punta plana o guantes de goma para no lesionarlas.
2. Colocar el embudo sobre la base, teniendo cuidado de no lesionar la membrana y
que esta quede bien centrada. La membrana filtrante queda ahora situada entre el
embudo y la base-soporte del filtro.
3. Filtrar 100 mL de la muestra de agua a través del filtro. Poner en marcha el sistema
de vacío.
40
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
4. Una vez filtrada toda la muestra, parar el sistema de vacío y separar el embudo de
la base del filtro.
5. Retirar con pinzas estériles o flameadas la membrana filtrante.
6. Colocar la membrana sobre la placa con la almohadilla absorbente y el caldo
Endo, de forma progresiva para evitar que queden burbujas entre la membrana y
el medio y que quede asegurado el contacto entre la membrana y el medio.
7. Colocar la tapa de la placa de Petri, invertir la placa e incubar en estufa a 37ºC
durante 24 horas

a) Exprese los resultados en UFC/ml. Adjunte una fotografía de la placa Petri.
b) ¿Qué compuesto del Caldo – m- Endo permite el crecimiento de coliformes
totales, pero inhibe el crecimiento de otro tipo de bacterias?
c) Exprese la diferencia entre coliformes totales y coliformes fecales
d) ¿Cómo se debe proceder en el caso de que el conteo sea superior a las 200
UFC?
11. Bibliografía:
Departamento de Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca. (s.f.). Recuento de

Coliformes Totales. Filtración a través de membrana. Salamanca, España. Obtenido de
http://virus.usal.es/Web/demo_fundacua/demo2/FiltraMembColiT_auto.html
_____________________________________________________________________________
#10
1. TEMA: Microorganismos del medioambiente y cuerpo humano.
2. Objetivo general: Cultivar microorganismos que puedan estar presentes en

diferentes áreas y superficies, así como también aquellos presentes en el cuerpo
humano.
a. Diferenciar la morfología macroscópica de cada colonia formada.
b. Distinguir la estructura microscópica de las células bacterianas presentes.
c. Relacionar la práctica de Microorganismos del medioambiente y cuerpo
humano, con temas tratado en clase como Influencia de factores ambientales en
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
el crecimiento, ecología de la diversidad microbiana y el crecimiento microbiano

en los ambientes naturales, de forma que se refuerce el conocimiento adquirido.
4. Introducción: La diversidad microbiana es bastante amplia, los microorganismos

funciona como poblaciones o agrupaciones de organismos similares, y
comunidades, o mezclas de poblaciones microbianas distintas. Son capaces de
convivir en determinados ambientes, que pueden ser naturales o controlados en
laboratorio. Con técnicas adecuadas es posible trasladar los microorganismos de
sus ambientes naturales hacia laboratorios de microbiología (Prescott, Harley, y
Klein, 2009). Se puede proporcionar un medio de cultivo que mantenga los
nutrientes necesarios para la reproducción de las células microbianas muestreadas
en diferentes ambientes.
5. Fundamento:
El agar nutritivo es un caldo nutritivo al que se le ha incorporado agar, es un medio de
cultivo ampliamente usado en microbiología para el crecimiento de bacterias
nutricionalmente poco exigentes. Pueden existir variaciones en las que se enriquece el
medio con sangre, carbohidratos u otras sustancias, con fines específicos (Rodríguez
Cavallini, 2005).
El agar nutritivo se empleará como medio de crecimiento de microorganismos presenten

en diferentes sectores del Campus universitario. Al finalizar su incubación se registrará
un heterogéneo grupo de colonias, producto de la diversidad microbiológica encontrada.
Parte de la identificación microbiana es la descripción macroscópica, para esto se
puntualizan las características de las colonias presentes. El desarrollo de las colonias
microbianas en la superficie de los medios sólidos ayuda a los microbiólogos a identificar
a los microorganismos, puesto que cada especie suele formar colonias de tamaño y
aspectos característicos. Al sembrar una población heterogénea en una caja Petri, es
posible a veces identificar la colonia deseada según su aspecto general, y usarla para
obtener un cultivo puro (Prescott, Harley, y Klein, 2009).
42
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
A pesar de la amplia diversidad microbiana, se registra que únicamente el 1% de los

microorganismos se han podido cultivar en el laboratorio. En la naturaleza, los
microorganismos suelen crecer sobre superficies formando biofilms, es decir,
agregaciones de microbios recubiertas de secreciones mucosas. Sin embargo, en
ocasiones pueden formar colonias aisladas (Prescott, Harley, y Klein, 2009).
6. Materiales:
Material Cantidad
Hisopos estériles 1
Tapones de algodon 1
Papel parafilm 1
Tijeras 1
Tubos de ensayo 10
7. Reactivos:
Reactivo Cantidad
Agar nutritivo 1L
TSA 1L
Saboraud + Cloranfenicol 1L
Agua destilada estéril 1L
TSB 1L
8. Equipos:
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
Equipo Cantidad
Incubadora 1
Autoclave 1
9. Notas:

1. Tome las cajas Petri con los medios de cultivo (nutritivo,
sabaurad+cloranfenicol y TSA) y diríjase a diferentes ambientes con
probabilidad alta de estar contaminados.
2. Abra la caja Petri y coloque tanto la base como la tapa en una superficie plana
3. Espere 60 minutos, cierra la caja y retorne al laboratorio donde debe sellar la
caja con el papel parafilm.
4. Utilice el tubo de ensayo con medio TSB y con su hisopo tome una muestra
de una superficie que usted considere altamente contaminada (celulares, tablets,
pasamanos, hornillas, teclados, etc). Procure tomar la muestra con todos los
lados de la punta del hisopo volteando y retorciendo el hisopo a medida que se
lo mueve por la superficie del objeto.
5. Siembre la muestra en el caldo TSB utilizando la técnica de agitación o
picadura.
6. Utilice el tubo de ensayo con agua destilada estéril y con su hisopo toma una
muestra de las uñas, cabello y cuero cabelludo y mucosas de la cavidad bucal.
Procure tomar la muestra con todos los lados de la punta del hisopo volteando y
retorciendo el hisopo a medida que se lo mueve por la superficie del objeto.
7. Con el mismo hisopo siembre en las cajas Petri utilizando la técnica por
estriamento simple.
8. Incubar todas las muestras en medios Nutritivo, TSA y TSB a 37°C por 24 o
48 horas.
9. Incubar las muestra en medio Sabouraud+Cloranfenicol a 27°C por 24 o 48
horas.
10. Observar las muestras al esteroscopio.
11. Determine las formas de los microorganismos y realice un conteo de los
mismos en UFCs

* Anote las observaciones y tome fotografías en cada uno de los procedimientos,
así como también de los resultados finales
* Anote sus conclusiones
12. Bibliografía:
44
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Versión: 00
ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke y Christine L. Case Introducción a la Microbiología,

9ª edición, Editorial Panamericana, Buenos Aires-Bogotá-Caracas-Madrid-Mèxico-Porto
Alegre. 2007
M. Alvarez, E. Boquet, I. de Fez y otros. Manual de Técnicas en Microbiología Clínica,
1a edición,Graficart Cia. Ltda. Quito-Ecuador. 1995
Prescott, L.M., Harley, J.P. y Klein, D.A. Microbiología, Ed. McGraw-Hill
Interamericana. Madrid. 2004.
Curtis H y Barnes NS Biología 6ª. Ed; México, Medica Panamericana, 2000
Maldigan, M.T., Martinko, J.M. y Parker, J. Brock. Biología de los Microorganismos. Ed.
Pearson Prentice-Hall, Madrid 2003.
Austin- Priest Taxonomía bacteriana moderna. Grupo Noriega. Editores. México. 1992.
Granados Pérez, Raquel. Microbiología : Bacteriología Medios de Cultivo y Pruebas
Bioquímicas, Parnaninfa, Madrid 2002
Coyne Marck. Microbiología del Suelo: Un enfoque exploratorio, Paraninfa, Madrid,
2002
Corrie Allaert Vandevenne y Marta Escolá Ribes. Métodos de análisis Microbiológicos
de los alimentos. Ediciones Díaz de Santos 2002
http://www.diversidadmicrobiana.com/index.php?option=com_content&view=article&i
d=9&Itemid=12
http://docencia.udea.edu.co/bacteriologia/MicrobiologiaAmbiental/introduccion.html
books.google.com.ec/books?isbn=8429118683
_____________________________________________________________________________
#11
1. TEMA: Inhibición de crecimiento bacteriano
2. Objetivo general: Describir el efecto de los factores ambientales, su concentración,

así como de agentes químicos en el crecimiento de los microorganismos.
 Establecer la capacidad inhibitoria del cristal violeta en el crecimiento de
bacterias.
45
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Versión: 00
ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
 Determinar el efecto etanol en el crecimiento de las bacterias.

 Establecer la eficacia de un antibiótico de amplio espectro sobre un cultivo
bacteriano.
4. Introducción:
Cada grupo microbiano tiene características metabólicas y de crecimiento específicas
y en consecuencia la alteración de las condiciones ambientales como el pH, la
temperatura y la concentración de nutrientes pueden modificar la velocidad de
reproducción. De la misma manera existen compuesto que son capaces de interferir
con el crecimiento bacteriano.
Los diferentes tipos de microorganismos o de sus formas de desarrollo (esporas,

células vegetativas) tienen diferentes grados de sensibilidad a los tratamientos físicos
o químicos. Además, el uso de antibióticos supone una presión selectiva sobre las
poblaciones bacterianas que puede llevar a la substitución de las poblaciones del
microorganismo sensibles al antibiótico por otras que han desarrollado mecanismos
de resistencia frente al mismo.
5. Fundamento:
Se denomina antibiótica a aquella substancia que interfiere el crecimiento y la
supervivencia de los microorganismos mediante una interacción específica (toxicidad
selectiva) con alguno de sus componentes celulares. Debido a esta especificidad, los
antibióticos tienen un espectro de acción limitado; esto es, en general son activos
frente a ciertos microorganismos e inactivos frente a otros, lo que permite usarlos
como agentes selectivos.
Se denomina antiséptico aquel compuesto químico que desarrolla su acción letal

interaccionando de forma inespecífica con los componentes celulares de forma que
no existe una acción selectiva frente a grupos de microorganismos, sino que su acción
es más general. Los antisépticos no suelen ser demasiado tóxicos y pueden aplicarse
sobre tejidos vivos.
6. Materiales:
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ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
Material Cantidad
Mechero
Gradilla
Tubos de ensayo 5
Pipetas Pasteur estériles
Discos de papel filtro de 7mm 30
Pinzas de punta roma
Marcador
Parafilm
7. Reactivos:
Reactivos Cantidad
Solución de Cristal Violeta 1% en 5 ml
solución acuosa.
Solución de antibiótico. 5 ml
Etanol 96%. 5 ml
Solución de hipoclorito de sodio5%. 5 ml
Cajas Petri de 24 horas cultivo 20 unidades
Equipos Cantidad
Mechero Bunsen 1
Incubadora 1
1. Utilizando un marcador para vidrio, identifique todas las cajas Petri con la siguiente
información:
a. Nombre del medio
b. Nombre del grupo
c. Fecha
d. Enumere del 1 al cuatro
2. Colocar unas gotas de los agentes químicos en los tubos de ensayo.
47
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Versión: 00
ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
3. Impregnar los discos de papel en las soluciones y dejar escurrir junto al mechero.
Tener cuidado con las soluciones alcohólicas.
4. Depositar 5 discos de papel previamente impregnados con diferentes soluciones

sobre la superficie del agar de cada una de las cajas de inoculadas como lo indica la
siguiente tabla
Agente inhibidor Número de caja

Solución de Cristal Violeta 1% en 1
solución acuosa.
Solución de antibiótico* 2
Etanol 96%. 3
Solución de hipoclorito de sodio 5%. 4
* Se prepararán soluciones de antibióticos a diferentes concentraciones para cada uno de los grupos.
5. Incubar las cajas de bacterias durante 72 horas a 37ºC

6. Medir los halos, en mm, de inhibición a las 24 y a las 72 horas.

Agente Mecanismo de Resultados a las Resultados a las
inhibitorio acción 24 horas 72 horas
 Indique la definición de los siguientes términos:

a) Antibiograma
b) Bactericida
c) Bacteriostático
11. Bibliografía:
48
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Versión: 00
ÁREA:
MICROBIOLOGÍA
R001
Universidad de Navarra. (2003). Microbiología Clínica. Navarra, España. Obtenido de

http://www.unavarra.es/genmic/microclinica/tema08.pdf
Universidad Nacional Autónoma de México. (2012). Crecimiento microbiano. Efecto de los

factores ambientales y químicos. México DF, México. Obtenido de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/P8_FactoresFisicosQuimicos_19678.pdf
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1. TEMA: NORMAS DE BIOSEGURIDAD

2. Objetivo general: Concientizar al alumno sobre la importancia de la

4. Introducción: El estudio de las bacterias, virus, parásitos, hongos y otros agentes

5. Fundamento: “La bioseguridad es la aplicación de conocimientos, técnicas y

10. Procedimiento experimental:

2. MANEJO DE ELEMENTOS DE PROTECCION:

- Descartar ese papel en la caneca.

4. USO Y CUIDADO DEL MECHERO DE ALCOHOL

11. Cuestionarios y problemas :

14. Objetivo general: Concientizar al alumno sobre la importancia de la

15. Objetivos específicos:

16. Introducción: Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar

Clasificación de los medios de cultivo

a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen

d) DIFERENCIALES: son medios de cultivos que nos permiten distinguir entre

B) CALOR SECO.- En este tipo de esterilización existe una destrucción de los

22. Procedimiento experimental:

ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

23. Cuestionarios y problemas :

3. ¿En qué momento se esteriliza un medio de cultivo y por qué?

1. Llevar a cabo la técnica de transferencia aséptica de microorganismos para un

3. Realizar los procedimientos de rayado de placas (siembra por estrías)

Existen diferentes técnicas de siembra que se pueden aplicar dependiendo de las

Siembra en cajas Petri por la técnica de agotamiento, aislamiento o de estría

Figura 1. Pasos para la siembra de bacterias por la técnica de agotamiento

Figura 2. Técnica de siembra en cuadrantes

Figura 3. Siembra con asa bacteriológica en medio líquido.

7. Equipos: En la tabla se detallan los materiales para un grupo de 5 estudiantes

Aquiahuatl Ramos, M. d., & Pérez Chabela, M. d. (2004). Manual de prácticas de

25. TEMA: Cuantificación de bacterias por el método de dilución

26. Objetivo general: Cuantificar las bacterias utilizando el método de diluciones

27. Objetivos específicos:

 Entender el concepto de Unidad Formadora de Colonia (UFC)

Métodos indirectos: Buscan realizar una estimación de la población bacteriana en

32. Equipos: En la tabla se detallan los materiales para un grupo de 5 estudiantes

33. Procedimiento experimental:

Fig. 1. Esquema de la preparación de las diluciones y la siembra en las Cajas Petri.

34. Cuestionarios y problemas

Aquiahuatl Ramos, M. d., & Pérez Chabela, M. d. (2004). Manual de prácticas de

Rojas-Triviño, A. (2011). Conceptos y práctica de microbiología general. Palmira,

2. Objetivo general: Determinar el crecimiento microbiano mediante conteo de

3. Introducción: Los métodos directos de cuantificación de microorganismos

población que se duplica a intervalos regulares de tiempo (td). Fase estacionaria:

Material (por grupo) Cantidad

8. Notas: Se necesita la cepa de Escherichia coli

Tabla 1. Horario de inoculación de E. coli a tubos con medio de cultivo y muestreo

5. Contar cuando menos 10 campos

10. Cuestionarios y problemas :

 Ramírez-Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García,

1. TEMA: Metabolismo bacteriano

Demostrar la diversidad de reacciones metabólicas que pueden utilizar las bacterias.

complejo que supone la replicación de todas las estructuras y componentes celulares

El término metabolismo se refiere al conjunto de reacciones químicas que se producen

A continuación, se describe brevemente el fundamento de las pruebas que se

Prueba de la catalasa: la catalasa en una enzima que descompone el peróxido de

Fermentación de glucosa: La determinación de la capacidad de fermentación de la

adicionalmente puede observarse la presencia de burbujas de H2 en la campana, el

Producción de indol: el indol es uno de los productos de la degradación metabólica

Prueba de Citrato de Simmons: La utilización de citrato como única fuente de carbono

7. Equipos: En la tabla se detallan los materiales para un grupo de 5 estudiantes