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Análisis Instrumental

TEMA 10 Y 11

Maracaibo, febrero 2018 Profa. Cristina Uzcátegui Arrieta


¿QUÉ ES LA CROMATOGRAFÍA?

Agrupa un conjunto importante y diverso de


métodos, que permite a los científicos separar
componentes estrechamente relacionados en
mezclas complejas
CROMATOGRAFÍA
IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)
Método utilizado inicialmente para la separación de los
componentes de una muestra, en la cual los componentes se
distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria,
mientras que la otra se mueve. La fase estacionaria puede ser
un sólido, un líquido sobre un soporte sólido o un gel. La fase
estacionaria puede estar contenida en una columna,
extendida en forma de capa o dispuesta en forma de película.
La fase móvil puede ser gaseosa o líquida.
CROMATOGRAFÍA
Chroma = Color
Graphein = escribir

Mikhail Tswett, 1906

Separación de los
pigmentos vegetales
coloreados
CROMATOGRAFÍA
Martin y Synge (1941)
Aplicaron técnicas cromatográficas para estudiar la composición de aminoácidos en
lana. Idearon la cromatografía de reparto.

En 1952 recibieron el permio Nóbel en Química.


iniciaron los estudios de cromatografía de reparto
líquido-gas.

En 1954, Giddings planteó la hipótesis que sería posible aplicar a la


cromatografía de líquidos los mismo factores que hacían a la cromatografía de
gases una poderosa técnica de separación. Fue el inicio de la cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC)
EVOLUCIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA

Desde la columna sencilla de Tswett, se ha


evolucionado hasta los modernos equipos
que hoy se conocen

Cromatografo de gases con


Equipos para HPLC
espectrofotómetro de masas
En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se
desplaza con una fase móvil que se hace pasar a través de una
fase estacionaria

Eluyente COLUMNA Eluato

Fase móvil Fase estacionaria


Líquido o gas que transporta Sólido o líquido inmovilizado
los analitos a través de una sobre el cual se reparte la
fase estacionaria. especie de analito durante el
paso de una fase móvil.
Las interacciones química cruciales
tienen lugar en la superficie de la fase
estacionaria.
TÉRMINOS BÁSICOS EN CROMATOGRAFÍA

Cromatografo Instrumento empleado para realizar una


separación cromatográfica.

Cromatograma Representación gráfica de la composición


de los solutos que salen de una columna
cromatográfica en función del tiempo.

Eluir Proceso en el que la fase móvil se desplaza


a lo largo de la fase estacionaria
transportando los componentes a separar.

Eluyente Disolvente aplicado al principio de una


columna cromatográfica.

Detector Aparato que registra una propiedad físico-


química del material eluido.
MÉTODOS INSTRUMENTALES

Entrada de la
fase móvil

DETECTOR

Cromatograma
REPRESENTACIÓN DE UN CROMATOGRAMA

Respuesta del detector

Tiempo de retención (tR): Representa el tiempo transcurrido entre el instante de


inyección y el determinado cuando el pico correspondiente en el cromatograma
alcanza su máximo.
La separación de los componentes de la muestra
problema se debe a la acción de dos efectos
contrapuestos

Efecto de
retención Efecto de
arrastre
Ejercido sobre los
componentes de la mezcla
por la fase estacionaria que Ejercido por la fase móvil que
está situada en el soporte. los empuja a través del
camino recorrido.
Según el dispositivo utilizado
para poner en contacto la fase
estacionaria y la fase móvil

TIPOS DE
CROMATOGRAFÍA

Según los estados de Según el mecanismo de


las fases implicadas interacción del soluto
con la fase estacionaria
CLASIFICACIÓN DE LOS SISTEMAS CROMATOGRÁFICOS

CROMATOGRAFÍA

FASE MÓVIL GAS LÍQUIDO

Líquido Sólido Líquido Sólido


FASE
ESTACIONARIA
Adsorbente Adsorbente Resina Gel

SOPORTE Columna
Columna Plano
Columna Columna

Reparto Reparto Adsorción Intercambio Tamaño


Reparto Adsorción molecular
iónico

C.G.L C.G.S C.L.L C.P C.C. F. C.L.S C.C.I C.E.M


NOMBRE c.gas-líq c.gas-sól c.líq-líq c. papel c. capa c. liq-sól
c. cambio c. exclusión
fina
iónico molecular

Figura tomada de Hernández, L.


Introducción al análisis instrumental. 2002
Tipos de cromatografía
Según el dispositivo utilizado para conseguir poner en
contacto la fase estacionaria y fase móvil:

Cromatografía en
columna

Cromatografía Plana
Tipos de cromatografía
Según el dispositivo utilizado para conseguir poner en
contacto la fase estacionaria y fase móvil:

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Consiste en columnas huecas de longitud y diámetro variable en


cuyo interior encontramos la fase estacionaria. La fase móvil se
hace pasar por ellas ya sea por gravedad o por aplicación de
presión.
Representación esquemática de una separación
cromatográfica
Diluyente puro

Banda inicial
con los solutos
A
AyB

Empaquetado de la columna B
(fase estacionaria) suspendida
en el disolvente
(fase móvil)

Disco poroso
Emerge B Emerge A

Figura tomada de Harris, D.


Análisis químico cuantitativo. 2007
Tipos de cromatografía
Según el dispositivo utilizado para conseguir poner en
contacto la fase estacionaria y fase móvil:

CROMATOGRAFÍA PLANA

La fase estacionaria se encuentra sujeta por una placa plana o en


papel (cromatografía en capa fina y en papel, respectivamente) y la
fase móvil se desplaza por ella mediante capilaridad o influenciada
por la gravedad.
Tipos de cromatografía
CROMATOGRAFÍA PLANA

Cromatografía en Capa Fina (TLC)

Fase estacionaria Fase móvil


Gel de sílice, celulosa, Ácido acético, agua,
alúmina depositado éter dietílico,
sobre un soporte metanol, benceno
plano (lámina de
aluminio o plástico)

Cromatografía en Papel
Fase estacionaria Fase móvil
Hoja de papel de Agua, etanol.
celulosa de elevada
pureza recubierta de
una capa de agua
Tipos de cromatografía
Según los estados de las fases implicadas, en especial de la
fase móvil

CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA DE
CROMATOGRAFÍA FLUIDOS
DE GASES DE LÍQUIDOS SUPERCRÍTICOS

Líquido-sólido, Cualquier sustancia


Gas-líquido Líquido-líquido, que se encuentre en
Gas-sólido Intercambio iónico, condiciones de
Exclusión molecular. presión y temperatura
superiores a su punto
crítico.
Tipos de cromatografía
MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA
SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA

Adsorción

Afinidad Reparto

Exclusión Intercambio
molecular iónico
MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA
SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA

Cromatografía de adsorción
El soluto presente en una fase móvil líquida o
gaseosa se adsorbe a las partículas sólidas de
la fase estacionaria. La separación de los
diferentes solutos se debe al equilibrio entre
las fases estacionaria y móvil.

Cromatografía de reparto
Los componentes de la fase móvil son
LO SIMILAR ES SOLUBLE retenidos por la fase estacionaria liquida en
EN LO SIMILAR función de su solubilidad en ella. Si las dos
son liquidas se tiene un proceso de
extracción en continuo.
MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA
SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA

Cromatografía de intercambio iónico


consiste en hacer pasar una fase móvil
líquida sobre una fase estacionaria que
presenta grupos iónicos en su superficie de
modo que los iones de signo opuesto
quedarán retenidos por fuerzas
electrostáticas.
MECANISMOS QUE INTERVIENEN EN LA
SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA

Cromatografía de exclusión molecular

Las moléculas de cierto tamaño presente en la


fase móvil líquida o gaseosa son excluidas por la
matriz que presenta poros de un determinado
tamaño, impidiendo así su paso por el gel y, por
tanto, acortando su tiempo de retención.

Cromatografía de afinidad
Se basa en la unión reversible entre el
analito de interés y un ligando específico,
inmovilizado en un soporte sólido inerte.

Ejemplo: Anticuerpo-proteína.
Instrumentación Cromatográfica
CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC)
La cromatografía de gases incluye todos los sistemas cromatográficos
en los que la fase móvil es un gas.

La muestra se volatiliza y se
inyecta en la cabeza de una
columna cromatográfica. La
elución se produce por el
flujo de una fase móvil de un
gas inerte.

La fase móvil no interacciona con las


moléculas del analito; su única función es la
de transportarlo a través de la columna.
Instrumentación Cromatográfica
CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC)

HORNO
Instrumentación Cromatográfica

Cromatografo de Gases
Instrumentación Cromatográfica

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

Dentro de las cromatografías cuya fase móvil está constituida por un


líquido, destaca la Cromatografía Líquida de Alta Resolución
(HPLC, High Performance Liquid Chromatography)

Esta técnica de separación y análisis consiste en hacer pasar


una muestra líquida, o sólida disuelta, en un disolvente
adecuado junto con una fase líquida móvil por una columna
cromatográfica.
Instrumentación Cromatográfica
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
High Performance Liquid Chromatography
Bomba
inyector
Inyección

Columna

Desgasificador
Horno para
la columna
Eluente

Reservorio del
Desechos Detector
solvente
Instrumentación Cromatográfica

Cromatografo HPLC
APLICACIONES

Control
Química de
calidad
Bioquímica

Investigación
APLICACIONES

Farmacia: antibiótico, sedantes, esteroides y analgésicos.

Bioquímica: aminoácidos, proteínas, carbohidratos y lípidos.

Alimentos: edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas y aditivos.

Compuestos industriales: aromáticos condensados, agentes tensoactivos,


agentes propulsores, y colorantes.

Contaminantes: plaguicidas, herbicidas, fenoles, bifenilos policlorados.

Química forense: drogas, venenos, alcohol en la sangre y narcóticos.

Medicina Clínica:. Sales biliares, metabolitos de medicamentos, extractos


de orina y estrógenos.
APLICACIONES

Cromatografía Gas Líquido: análisis cualitativo y cuantitativo de mezclas


complejas de compuestos orgánicos

Alimentos: para determinar especies volátiles, que en muchas ocasiones


son responsables de olores y sabores característicos, para determinación
de lípidos y ácidos grasos mediante procesos de derivatización.

Análisis de drogas junto con HPLC

Para la determinación de alquitranes, pinturas, películas fibras sintéticas


mediante pirolisis.

Para el seguimiento y el control de contaminantes en el medio ambiente


(polutantes del agua, contaminación atmosférica)
La electroforesis se basa en la migración
de iones presentes en una disolución por
la acción de un campo eléctrico.

Modificando convenientemente las


condiciones de una electroforesis se
pueden separar moléculas neutras e
iones, así como isómeros ópticos, y
disminuir los límites de detección.
Electroforesis
Elektro: Electricidad
Phoros: Movimiento

Esta técnica fue introducida por el


bioquímico sueco Arne Tiselius. Su
interés principal fue la química de las
proteínas séricas.

Recibió el premio Nobel en el año 1948


por su gran contribución en el desarrollo
de la técnica de electroforesis y por la
importancia de su hallazgo sobre la
naturaleza compleja de las proteínas del
suero.
Método de separación de:

Proteínas

Ácidos nucleicos

Otras biomoléculas

Permite determinar:

• Peso molecular de una proteína


• Punto isoeléctrico
• Distinguir moléculas por su carga neta o su forma
Electroforesis Separación de especies
cargadas, anión (-) y catión (+)

Influencia de campo
cargado eléctricamente

Movimiento al cátodo (-) o al


ánodo (+)

- +
Ánodo Cátodo

+ - + -

Técnica de separación que consiste en el transporte de iones


a través de una disolución por acción de un campo eléctrico.
FUNDAMENTO
La electroforesis separa moléculas según su
relación carga:masa

Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un


campo eléctrico a una velocidad determinada por su
relación carga:masa.

Por ejemplo: si dos moléculas tienen masa y formas iguales, la de


mayor carga neta se desplazará más rápido hacia un electrodo

La movilidad electroforética (μe) depende de:

• La carga de la molécula, su tamaño y su forma.


* la carga, a su vez, depende del pH de la disolución.
FUNDAMENTO

LA VELOCIDAD DE MIGRACIÓN (V) DE LA PARTÍCULA es


directamente proporcional al producto de su carga efectiva
(q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente
proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la
forma de la molécula, o sea, a la resistencia que le ofrece
el medio.

V=qE/f
FUNDAMENTO

El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas


adicionales: inicialmente la fricción con el solvente dificultará este
movimiento originando una fuerza que se opone, por otro lado las moléculas
poseen energía cinética propia por lo que tienden a moverse en forma
aleatoria o movimiento browniano
PARÁMETROS QUE INFLUYEN EN LA MOVILIDAD
ELECTROFORÉTICA
Parámetros externos
- Campo eléctrico
- Temperatura

Parámetros relacionados con el solvente y con el sistema


electroforético
- Viscosidad
-Fuerza iónica
-La naturaleza de los iones componentes
-El pH
Parámetros relacionados con el
soluto
- La carga
- La forma y el tamaño de los iones
La velocidad de migración electroforética depende de
los siguientes FACTORES:
 Carga: cuanto mayor sea la carga, mayor será la movilidad,
además su carácter catiónicos o aniónicos determinará la
dirección del desplazamiento.

 Tamaño y forma de las partículas: el tamaño del ión es un


factor decisivo; cuanto menor sea un ión mayor será su
movilidad.

 Fuerza iónica y pH del solvente: la mayoría de las


biomacromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y
polisacáridos) poseen determinada carga eléctrica con grupos
aniónicos y catiónicos capaces de disociarse.
FACTORES:

 Temperatura: el aumento de la temperatura puede traducirse en


destrucción, o en la alteración de sus características (estructura,
función, entre otros) de las que depende la movilidad
electroforética.

 Viscosidad del medio: al disminuir la viscosidad aumenta la


movilidad.

 Voltaje: no se puede incrementar indiscriminadamente porque se


genera un excesivo calor.
Fenómenos que pueden originarse en el sistema
electroforético

DIFUSIÓN

 Esta provocado por la existencia de gradientes de concentración


que favorecen el transporte hacia las zonas de menor
concentración de cada especie.

 Afecta tanto a partículas cargadas como no cargadas.

 Las moléculas tienen a moverse en forma aleatoria (movimiento


browniano) debido a que poseen energía cinética propia
Fenómenos que pueden originarse en el sistema
electroforético

MIGRACIÓN:
Es el movimiento de las especies producido por una fuerza externa
que es impuesta al medio, en este caso, el campo eléctrico y su
intensidad.

CONVENCIÓN:
Se trata de un fenómeno no deseable en electroforesis. Consiste en el
transporte de todo tipo de especies, cargadas y no cargadas.
Fenómenos que pueden originarse en el sistema
electroforético

FLUJO TÉRMICO
Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que origina
una resistencia dada, se produce calor. Por tanto, el sistema
electroforético no es isotérmico.

FRICCIÓN
La fricción con el solvente dificultará el movimiento (es decir, al
moverse los solutos chocarán con las moléculas de solvente que
están en su camino), lo que genera una fuerza que se opone al
movimiento.
Métodos
Electroforesis libre (en disolución)

Electroforesis Zonal (sobre un medio soporte)

Geles
En Papel Sílice
(a través de una matriz porosa)

Agarosa Policramida
Electroforesis libre: sin la presencia de soporte

Las moléculas cargadas migran hacia los electrodos, aunque no


bien separadas por tratarse de una disolución. Actualmente está
en desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se
desarrolla, tiene poco poder de resolución.

Tiselius
Electroforesis zonal: presencia de soporte

Es una de las técnicas más utilizadas en bioquímica y biología


molecular por su elevada resolución. El campo eléctrico se
aplica a un medio o soporte estabilizante (en vez de a un
fluido) y la muestra se deposita en una reducida zona del
mismo.
Medios de Soporte
Soportes no
Soportes restrictivos
restrictivos
• Porosidad del • Poros de tamaño
soporte mucho similar al de las
mayor que el tamaño moléculas.
de las moléculas. • Efecto de tamizado
• No ofrece restricción durante el avance.
al avance de las • Se separan
moléculas. dependiendo de su
• Se separan tamaño.
dependiendo de su
densidad de carga.

Ejemplo: acetato de celulosa (para Ejemplo: Agarosa (para ácidos nucleicos),


proteínas), agarosa (para proteínas) poliacrilamida (para proteínas)
Medios de Soporte

 Método sencillo y
rápido
• Proteínas
 Separación de: • Oligonucleótidos
• Carbohidratos
Papel • Lípidos

• Se desgarra fácilmente
• Distorsiona las bandas
 Desventajas • Se produce interacción entre
las proteínas y los grupos
hidroxilo de la celulosa
Electroforesis en Papel
Medios de Soporte

 Se usa en el análisis de fluidos biológicos


(proteínas séricas, proteínas urinarias,
hemoglobinas).
Acetato de
Celulosa  Tiempo de análisis corto.
 Sencillez en la técnica.
 Desventaja: débil resolución

Gran parte de los grupos hidroxilo de la celulosa se


han esterificado por acetilación, por lo que no hay
interacción con las proteínas
Medios de Soporte

• Técnica económica,
 Almidón fácil y rápida.

• Soporte más usado en


 Poliacrilamida electroforesis.
• Alta resolución.
Gel • Componentes tóxicos

• Buena resolución
• Separación de moléculas
 Agarosa grandes (virus, ácidos
nucleicos).
Electroforesis en Geles de Poliacrilamida
(PAGE)
Polimerización de
acrilamida

Químicamente inertes

Geles de porosidad controlable

Forma geles transparentes


Permiten buena visualización
Electroforesis en Gel de Agarosa

Polisacárido obtenido de
algas

Separa moléculas grandes


(20 000 nucleótidos)

Actúa en forma restrictiva


frente a las fibras de ADN
Presentan mucha carga negativa
(migran hacia el ánodo)
Electroforesis en gel

Isoelectroenfoque

TIPOS DE
ELECTROFORESIS
Electroforesis capilar

Electroforesis
bidimensional
Cubeta vertical u
horizontal donde se
coloca el soporte

Sistema de
revelado y lectura Buffer
(Detector)

COMPONENTES DE UN SISTEMA
ELECTROFORÉTICO

Estándares y
2 electrodos
muestra

Fuente de poder
COMPONENTES DE UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO

 Cubeta vertical u horizontal


donde se coloca el soporte
 Buffer
 Estándares y muestra
 Fuente de poder
 2 electrodos
 Sistema de revelado y lectura
(Detector)
COMPONENTES DE UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO
ESQUEMA DE EQUIPO DE ELECTROFORESIS CAPILAR

Capilares de sílica
(75 μm x 60 cm) Temperatura constante
(20 – 30º C)

Detección UV

Electrolitos Muestras y
Estándares
Electroforesis capilar
VENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR

 Alta resolución.

 Requiere pequeño volumen de muestra.

 Rápida separación.

 Automatización.

 Reproducibilidad.

 Puede acoplarse a otros equipos, como espectrometría de masa


MOLÉCULAS QUE PUEDEN SER SEPARADAS POR
ELECTROFORESIS CAPILAR

 Proteínas.
 Péptidos.
 Amino ácidos.
 Ácidos nucleicos.
 Iones inorgánicos.
 Bases orgánicas.
 Ácidos orgánicos.
APLICACIONES DE LA
ELECTROFORESIS

 Es posible separar moléculas biológicas en dependencia


fundamentalmente de su carga bajo la influencia de un campo
eléctrico.

 Método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos,


proteínas y otras biomoléculas, donde aportan un potente criterio de
pureza.

 Es útil además para determinar otros parámetros como peso


molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de
las proteínas.