FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

MICROBIOLOGIA

BIO-251

MEDICINA
 TRABAJO PRÁCTICO N°1

PROCEDIMIENTOS BÁSICOS

OBJETIVOS

1. Conocer los objetivos de un laboratorio de microbiología y la metodología usada

para el diagnóstico de agentes bacterianos.
2. Conocer la forma de trabajar en un laboratorio de microbiología, con énfasis en
bioseguridad y técnicas asépticas de trabajo.
3. Conocer los medios de cultivo y sus utilidades.
4. Conocer y practicar las técnicas de siembra microbiológica.
5. Conocer el material usado en un laboratorio de microbiología y adquirir destreza en
su uso correcto.
6. Observar y describir las características macroscópicas de las colonias desarrolladas
en los distintos medios de cultivo.
7. Conocer las tinciones más frecuentemente utilizadas en microbiología (Gram y
Ziehl Neelsen), sus fundamentos y su utilidad.
8. Realizar la observación microscópica de los frotis teñidos. Distinguir morfología
(cocáceas y bacilos, Gram positivos y negativos) y agrupación (cadenas, racimos,
diplococos).

MARCO TEÓRICO

El objetivo del laboratorio de microbiología es la identificación del agente causal de la

infección a partir de una muestra clínica.

Para lograr este objetivo se debe realizar:

a)Examen microscópico de la muestra (tinción de Gram) que otorga una orientación
rápida al clínico.
b)Siembra de la muestra en medios de cultivos, seleccionando los medios de cultivo
adecuados según el microorganismo que se sospeche y el origen de la muestra.
c) Incubación de los medios de cultivos sembrados a 37°C por 16 a 24 horas, para
obtener desarrollo de colonias bacterianas.
d) Diagnóstico microscópico de las colonias con tinciones y diagnóstico
macroscópico de las colonias que permite una orientación para la identificación
bacteriana.
f) Pruebas bioquímicas y estudio de sensibilidad (antibiograma) a partir de las
colonias desarrolladas en el cultivo. En otras 16-24 horas se leen los resultados de estas
pruebas llegándose a la identificación del microorganismo.

Para trabajar correctamente en el laboratorio de microbiología es necesario conocer los

riesgos a los que se está expuesto. Para minimizar y controlar estos riesgos deben
observarse estrictas medidas de seguridad, tanto para proteger al operador como para
evitar la contaminación de las muestras clínicas y cultivos.
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

A. Bioseguridad:

Se define bioseguridad como un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger

la salud de las personas que trabajan en el laboratorio frente a riesgos por agentes
biológicos, físicos o químicos, así como también la protección indirecta del ambiente.

Situaciones de Riesgo:
• Riesgo por agentes biológicos:
El riesgo de infección por microorganismos se produce por inhalación, ingestión o
contacto directo a través de la piel, mucosas erosionadas y/o sanas y a través de la
conjuntiva.

• Riesgo por agentes químicos:

Se produce por ingestión, inhalación y/o contacto con la piel, tejidos, mucosas o
conjuntiva, de sustancias tóxicas, irritantes, corrosivas y/o nocivas.

• Riesgo por agentes físicos:

Se está expuesto cuando se manipulan gases o sustancias radioactivas, radiaciones
ionizantes y no ionizantes, exposición a ruidos, vibraciones, fuego y electricidad.

Medidas mínimas de bioseguridad en el laboratorio:

1.- Uso obligatorio del delantal abotonado. No se puede ingresar al área del laboratorio
sin
delantal
2.- Pelo largo tomado.
3.- No colocar bolsos y ropa en el área de trabajo.
4.- No comer, fumar ni beber en el laboratorio.
5.- En caso de derrame de material contaminado en las superficies de trabajo, avisar al
ayudante.
6.- No pipetear con la boca.
7.- En caso que la piel o mucosas tomen contacto con material contaminado, se debe
lavar profusamente con agua y jabón en el caso de la piel y sólo con agua enl el caso de
mucosas.
8.- Desechar el material contaminado en recipientes adecuados.
9.- Uso cuidadoso de los mecheros.
10.- Lavar las manos con agua y jabón al finalizar el paso práctico.

B. Control de la contaminación en el laboratorio:

Dada la relevancia del diagnóstico etiológico que otorga el laboratorio, es de la mayor

importancia evitar la contaminación de las muestras, ya sea desde el operador como
desde otras muestras procesadas sucesivamente (contaminación cruzada). Para ello, es
necesario que el operador trabaje con técnica aséptica y que el material utilizado sea
estéril.
1. Esterilización:

Proceso que lleva a la eliminación absoluta de microorganismos: bacterias (formas

vegetativas y esporuladas), virus y hongos en las superficies inanimadas.

Métodos de esterilización:

a) Físicos:
• Calor seco: - Incineración ( mechero)
- Horno Pasteur
• Calor húmedo: - Ebullición
- Autoclave
- Pasteurización
• Luz ultravioleta
• Radiaciones ionizantes
• Ondas sónicas y ultrasónicas
• Filtración

b) Químicos:
• Oxido de etileno

2. Técnica aséptica:

En el laboratorio de microbiología es esencial trabajar con técnicas estériles que eviten

la contaminación de las muestras clínicas.
Dado que los medios de cultivo están diseñados para favorecer el crecimiento
microbiano, las bacterias y los hongos del ambiente (provenientes de los materiales,
manos y faringe del operador, etc.) depositados sobre el medio crecerán y contaminarán
los cultivos. Esto debe ser evitado para tener la certeza que los microorganismos
desarrollados correspondan a los de la muestra.
Por lo tanto los medios de cultivo se esterilizan antes de su uso y se manipulan con
técnica aséptica

3. Técnicas de siembra microbiológica:

El objetivo de la siembra microbiológica es obtener desarrollo de colonias aisladas para

poder lograr la identificación de las bacterias.
Existen distintos tipos de siembras, las más usadas son la siembra en cuadrantes y la
siembra cuantitativa.

a) Siembra en cuadrantes:

Pretende obtener colonias aisladas, para lo cual en la primera parte del cuadrante (1), se
siembra la muestra directamente (tórula con la que se obtiene la muestra). Para
diseminar en la segunda zona (2), se esteriliza por incineración (mechero) una pipeta
Pasteur o asa de siembra, que se enfría y se arrastra muestra desde la zona 1 a la 2. Se
esteriliza nuevamente el asa, se enfría y se disemina en la zona 3 de igual forma. Por
último en la zona 4 se realiza una diseminación en estría.

b) Siembra cuantitativa:

El objetivo de este tipo de siembra es cuantificar el número de bacterias presentes en la

muestra, para lo cual se debe sembrar una cantidad conocida y exacta de muestra. En el
caso de una muestra de orina, se siembra con un asa calibrada de 1 microlitro (0.001
ml) en la zona 1 de inoculación primaria. Posteriormente se disemina con estrías
perpendiculares a la inoculación primaria (2). Se incuba, se realiza el recuento de
colonias, se multiplica por 1000 y se informa en Unidades Formadoras de Colonias
(ufc) por ml. de muestra.

MORFOLOGIA MACROSCOPICA DE LAS COLONIAS (Diagnóstico

macroscópico)

Permite un acercamiento en la identificación de los géneros bacterianos, que poseen

características propias de desarrollo de sus colonias, según su forma, elevación, margen
y color de la colonia.
La orientación sobre las pruebas bioquímicas para la identificación definitiva depende
en gran parte del aspecto macroscópico de las colonias.

Figura Nº 1: Criterios macroscópicos para la descripción de una colonia

MICROSCOPIA Y TINCIONES:
La observación microscópica de una colonia extendida sobre un portaobjetos permite
distinguir la forma microscópica de las bacterias.
 a. Microscopía directa al fresco:
Esta técnica no utiliza tinciones sino que consiste en observar entre lámina y laminilla
una gota de muestra clínica o una gota de cultivo líquido. Su principal utilidad es la
observación de la motilidad bacteriana.

b. Microscopía con tinciones:

La observación microscópica de bacterias utiliza variadas técnicas tintoriales que se
basan en ciertas características estructurales de los agentes, de las cuales la más
importante es la tinción de Gram. La siguiente tabla menciona algunas tinciones
utilizadas en el laboratorio para el diagnóstico de infecciones bacterianas.

Tabla Nº1. Tinciones de uso en el diagnóstico de agentes bacterianos:

TINCION REACTIVOS PRINCIPIO UTILIDAD

Gram Cristal violeta, lugol, Gram positivos Clasificación
acetona, safranina retienen cristal violeta bacteriana clásica:
(azul), Gram Gram (+) y (-)
negativos se tiñen con
contraste (rojo)
Tinción de Verde de malaquita, Tiñe la espora (verde) Esporas de bacilos
esporas safranina Gram (+)
Kinyoun Fucsina, ácido Unión ácido resistente Nocardia (BAA
sulfúrico, azul de de fucsina a escasos lábiles)
metileno ácidos micólicos de
pared (fucsia)
Naranja de Naranja de acridina Tiñe DNA bacteriano Bacterias Gram
acridina (fluorescencia) (fluorescencia lábiles
naranja)
Giménez Fucsina, verde de Tiñe la pared de Bartonella spp,
malaquita Bartonella (fucsia) corpúsculo
elemental de
Chlamydia
Ziehl Neelsen Fucsina, alcohol-ácido, Unión ácido-alcohol Micobacterias
azul de metileno resistente de fucsina a (BAAR*)
ácidos micólicos de
pared (fucsia)
Auramina- Auramina-rodamina, Unión de auramina- Micobacterias
rodamina permanganato de rodamina al ácido (mayor sensibilidad
potasio micólico de pared que Ziehl Neelsen)
(fluorescencia
amarilla)
BAAR* bacilos ácido-alcohol resistentes

1. Tinción de Gram:

La técnica de mayor importancia en el área de la microbiología, es la tinción de

Gram, pues divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivo y Gram
negativo. Además permite diferenciar forma (cocos, bacilos) y la disposición bacteriana
(diplos, cadenas, racimos).
 La tinción Gram consiste en teñir un frotis de bacterias con cristal violeta, y
luego tratarlas con una solución mordiente (fijadora) de Iodo y Ioduro. Todas las
bacterias se tiñen en estas condiciones. Sin embargo, sólo algunas son capaces de
retener el colorante al tratarlas con un agente decolorante como etanol o una solución
decolorante de etanol-acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram
positivo; las que se decoloran son las Gram negativo y para observarlas deberán
teñirse con un colorante de contraste (safranina). Por lo tanto, las Gram positivo se
verán de color azul y las Gram negativo de color rojo o rosado.
La diferencia en la reacción frente a la tinción de Gram se debe a la diferencia en
la composición química de las estructuras externas de las bacterias. Las bacterias Gram
positivo tienen una capa gruesa de peptidoglicán o mureína, mientras que las Gram
negativo tienen menor cantidad de peptidoglicán y tienen una membrana externa
(además de la membrana citoplasmática). La explicación más aceptada es que, luego de
la acción de la solución decolorante, las bacterias Gram positivo son capaces de
retener el colorante gracias al peptidoglicán. En cambio, las Gram negativo,
pierden parte de los lípidos de su membrana externa por acción del decolorante
(un solvente orgánico como por ejemplo alcohol), lo que sumado a la menor cantidad
de peptidoglicán, hace que se decoloren. Es importante destacar que la etapa crítica en
la tinción es la de decoloración, por lo que se debe tener especial cuidado en realizarla
en forma adecuadaEsta tinción es la más importante en microbiología pues permite
diferenciar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram (+) y Gram (-).

La tinción de Gram:

1.- Revela la afinidad tintorial de las bacterias:

- Gram positivo - Gram negativo
2.- Permite conocer la forma bacteriana:
- Cocáceas - Bacilos
- Cocobacilos - Vibrios
- Espirilos - Espiroquetas
TECNICA

Gram (-

Gram

3.- Permite conocer la disposición bacteriana:

Cocáceas en diplo: diplococos
Cocáceas en cadena: Streptococcus
Cocáceas en tétrada: Micrococcus
Cocáceas en octógena: Sarcina
Cocáceas en racimo: Staphylococcus
Utilidad clínica de la tinción de Gram:

Este examen permite al clínico sospechar el agente causal de la infección, que muchas
veces sirve de base para el inicio de terapia antibiótica.
La sensibilidad analítica (número mínimo de bacterias que la técnica puede detectar) es
de 100.000 bacterias /ml de muestra.
La sensibilidad clínica (probabilidad que un paciente que tenga una infección tenga un
test positivo) varía según tipo de muestra:
Líquido cefalorraquídeo (meningitis) : 75 %
Líquido pleural (empiema pleural) : 50-80%
Líquido peritoneal (peritonitis) : 25-50%
Líquido articular (artritis séptica) : 50%

Se debe solicitar en toda muestra clínica

De gran importancia en infecciones mixtas por bacterias aeróbicas y anaeróbicas, pues
si bien los anaerobios no crecen en los medios habituales, sí se observan en la tinción de
Gram.

2. Tinción de Cápsula:
Utiliza tinta china para evidenciar la presencia de la cápsula microbiana, pues tiñe de
color negro todo el frotis, salvo la cápsula (queda un espacio blanco, sin teñir). El resto
del microorganismo se tiñe de color rojo con el colorante de contraste (safranina). Se
observa con objetivo de inmersión (100x).
Ej. Tinción de cápsula (Enterobacter sp. y Streptococcus pneumoniae).
3. Tinción de esporas:
Utiliza el colorante verde de malaquita que tiñe esta forma de resistencia de algunas
bacterias. El resto de la bacteria se tiñe de color rojo con el colorante de contraste
(safranina). Se observa con objetivo de inmersión (100x).
Las esporas pueden ser terminales o subterminales o pueden encontrarse libres de la
célula bacteriana. Ej.Clostridium, Bacillus.

Espora terminal

Espora subterminal

4. Tinción de Ziehl Neelsen:

Es de gran importancia en microbiología ya que permite evidenciar la presencia de
bacilos ácido-alcohol resistentes como el Mycobacterium tuberculosis, agente causal de
la tuberculosis, enfermedad infecciosa muy importante en nuestro país.
También se utiliza para el estudio de Cryptosporidium en muestras de deposiciones.

Fundamento:
La fucsina que es un colorante básico forma un complejo con los ácidos micólicos de la
pared de las micobacterias. Este complejo es resistente a la decoloración con alcohol-
ácido (alcohol clorhídrico) permaneciendo de color fucsia a diferencia de las otras
bacterias que se decoloran. El azul de metileno se usa como tinción de contraste.

Técnica:
1.- Se cubre el frotis con fucsina concentrada de Ziehl Neelsen.
2.- Se calienta el frotis hasta que emita vapores (2 a 3 minutos).
3.- Se decolora escurriendo alcohol-ácido.
4.- Se tiñe de contraste con azul de metileno por 30 segundos.
5.- Dejar secar y leer con objetivo de inmersión (100x)
Utilidad clínica:
Permite identificar micobacterias presentes en una muestra.
En Chile, la presencia de bacilos ácido-alcohol resistente en muestras diferentes de
orina es altamente sugerente de tuberculosis.
La cantidad mínima de bacilos que es capaz de detectar (sensibilidad analítica) varía
entre 5.000 a 10.000 bacilos / ml de muestra.
La sensibilidad cínica varía según tipo de muestra:
Líquido cefalorraquídeo : 20-40%
Líquido pleural : 50-%
Líquido peritoneal : 25-%
Líquido articular : 20%
Orina : No es diagnóstica de tuberculosis por la alta incidencia
de micobacterias no tuberculosas en esta muestra.
 Se debe solicitar en toda muestra clínica cuando se sospecha tuberculosis ya que es un
examen rápido, sencillo y de bajo costo que además de confirmar un diagnóstico
permite conocer los casos infecciosos.

USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO DE LUZ (ACEITE DE INMERSIÓN):

Para observar las bacterias con tinción de Gram, Tinción de Ziehl Neelsen, tinción de
cápsula y tinción de esporas es necesario utilizar el objetivo de inmersión (100x). Para
ello una vez realizado el extendido y la tinción se debe:

1. Colocar la preparación sobre la platina del microscopio

2. Verificar que el condensador esté arriba y el diafragma abierto, ya que el objetivo de
inmersión requiere mucha más luz que los objetivos secos.
3. Enfocar primero con el objetivo 40x (seco), eligiendo la zona de interés.
4. Colocar el revólver a mitad de camino, entre el objetivo 40x y el de inmersión
(100x, línea negra) (figura A) EVITANDO CUALQUIER CONTACTO DE LOS
OBJETIVOS SECOS CON EL ACEITE DE INMERSIÓN.
5. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación
6. Cuidadosamente colocar el objetivo 100x en contacto con el aceite (figura B), el
objetivo deberá estar prácticamente tocando el portaobjetos, y el aceite deberá
ocupar este pequeño espacio (figura C)
7. Observe con los oculares, y ajuste el foco utilizando sólo el micrométrico
8. Una vez terminada la observación microscópica, LIMPIAR CUIDADOSAMENTE
EL OBJETIVO, RETIRANDO EL ACEITE CON UN PAPEL TISSUE.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS

1. Observe e identifique el material usado en el laboratorio de microbiología:

• asas de platino
• asas calibradas
• pipetas Pasteur
• placas de Petri
• tubos de cultivo

2. Observe y reconozca los medios más frecuentemente usados:

• agar corriente
• agar sangre
• agar McConkey
• agar chocolate

3. Comente con su profesor cómo se preparan los medios de cultivo: placa de agar
sangre, tubo de agar semi-tendido.
4. Técnicas de Esterilización

4.1 Flameado
a. Dividir una placa por la mitad.
b. Tomar un asa y abrir una placa de agar nutritivo y deslizarla suavemente por
una mitad del agar. Cerrar la placa.
c. Flamear el asa para su esterilización, enfríela en la tapa y deslícela
suavemente por la otra mitad del agar.
d. Cerrar la placa.
e. Incubar la placa a 37ºC.

4.2 Desinfección y Asepsia

-Yodo
a. Dividir una placa en dos, por una mitad deslizar suavemente uno de sus
dedos por el agar.
b. Tome un trozo de algodón con yodo y aplíquelo en el dedo que utilizó, espere
unos segundos.
c. Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa.
d. Incubar la placa a 37ºC.

-Alcohol
a. Repita los pasos realizados para la actividad del cloro.
b. Escoja otro lugar del laboratorio de amplia exposición.
c. Incubar la placa a 37ºC.

5. Observe cómo su profesor realiza los tipos de siembra más frecuentemente usados, y
luego practique diferentes siembras a partir de muestras en medios sólidos y líquidos:
a) en placa de Petri:
De sólido a sólido con siembra en cuadrantes (asa de siembra)
De líquido a sólido con técnica semicuantitativa (asa calibrada)
b) en tubo:
De líquido a líquido (con asa de siembra o pipeta Pasteur)
De sólido a líquido (con asas de platino)

6. Recuerde que siempre debe rotular adecuadamente placas y tubos. Las placas se
rotulan en la base donde está el medio de cultivo (nunca en la tapa) y se dejan con la
tapa hacia abajo y el agar hacia arriba.

7. Observe y describa las características macroscópicas de las distintas colonias que se

le entregarán.

8. Realice tinción de Gram de sus muestras e identifique la forma, agrupación y

afinidad tintorial al microscopio.
 TRABAJO PRÁCTICO N°2

FLORA NORMAL Y MUESTRAS CLINICAS DE

BACTERIAS GRAM POSITIVO

OBJETIVOS

1. Conocer la importancia de una buena muestra.

2. Conocer la metodología de la recolección de las muestras clínicas más relevantes.
3. Conocer y practicar el procesamiento microbiológico de cocáceas Gram positivo
aisladas a partir de muestras clínicas
• identificación bioquímica de las especies bacterianas
• estudio de sensibilidad a los agentes antimicrobianos.
4. Conocer algunos cuadros clínicos relevantes causados por microorganismos Gram
positivo, y correlacionarlos con conocimientos adquiridos en clases teóricas.

MARCO TEÓRICO

Flora Normal.

Los microorganismos no sólo están presentes en el ambiente inmediato que

rodea al hombre, sino que además se encuentran en gran número en la biósfera
compuesta por los más variados organismos, la que está sufriendo constantemente
cambios cualitativos y cuantitativos en su población.
La colonización microbiana del individuo, comienza con el nacimiento. Los
primeros microorganismos en establecerse son aquellos transferidos desde la vagina
materna y del área perineal, hacia la piel, la boca, la nariz y región faríngea del niño.
Las biotas características de éstas y otras áreas, se desarrollan posteriormente y
probablemente se derivan y seleccionan de diversas fuentes ambientales.
Ha sido útil dividir los ambientes biológicos del hombre en grupos:

La del intestino inferior: Rico en gran cantidad de substancias alimenticias, que

favorecen el crecimiento de saprófitos.

La boca, región orofaríngea y vulva: Con substancias provenientes del exterior,

o acumulación de restos celulares, o bien ambos con gran cantidad de repliegues, que
favorecen la existencia de anaerobios.

La piel: Que difiere de los otros ambientes por su menor humedad y alto
contenido lipídico, que tiende a seleccionar una biota algo diferente.

Es válido enfatizar que, en general, los anaerobios estrictos tienden a exceder en

número a las formas facultativas y aerobias por un factor de 10 a 100 o más. Existe una
permanente interacción tanto entre los compuestos de la flora, como entre ellos y el
huésped, que conduce a fluctuaciones en la biota, tanto cualitativamente como
cuantitativamente, así como efectos más o menos pronunciados en el huésped. Estos
efectos pueden ir desde los beneficios, los inaparentes, hasta los perjudiciales.
 MICROORGANISMOS QUE FORMAN PARTE DE LA FLORA NORMAL

1.- Piel
Levaduras
Staphylococcus epidermidis
Difteroides
Propionibacterium acnes
Staphylococcus aureus
Streptococcus (incluye grupo A)
Peptococcus (micrococos anaeróbicos)
Bacilos Gram negativos

2.- Boca y faringe

Streptococcus (no grupo A)

Lactobacilos
Moraxella catarrhalis
Staphylococcus epidermidis
Haemophilus influenzae (40-80%)
Espiroquetas
Difteroides
Streptococcus pneumoniae (neumococos) (20-40%)
Candida albicans
Klebsiella sp.
E.coli
Enterococcus
Micrococcus sp.
Staphylococcus aureus
Actinomycetes

3.- Fosas nasales

Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus aureus (20-50%)
Moraxella catarrhalis
Streptococcus pneumoniae (neumococos)
Flora de la piel

4.- Senos nasales, laringe, tráquea, bronquios y pulmones:

Generalmente estériles

5.- Intestino delgado:

Lactobacilos
Enterococcus
Bacteroides
6.- Intestino grueso (90-95% son anaerobios obligados):

Bacteroides
E. coli
Enterococcus
Lactobacilos
Klebsiella sp.
Actinomycetes
Difteroides
Clostridium perfringens
Candida albicans
Pseudomonas aeruginosa
Proteus mirabilis
Alcaligenes faecalis
Staphylococcus epidermidis y aureus

7.- Hígado, vesícula y peritoneo:

No hay microorganismos

En otras zonas del cuerpo existen cantidades menores de microorganismos, a

menudo en tránsito (resto del aparato digestivo y respiratorio, la vejiga y el útero). El
hallazgo de microorganismos patógenos en estos sitios es altamente sugerente de
enfermedad, pero no constituye una prueba.

En el otro extremo se encuentran ciertos tejidos y órganos que son normalmente

estériles, en donde la presencia de microorganismos se considera de importancia
diagnóstica, por ejemplo: sangre, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido de cavidades
estériles (sinovial, pleural, etc.) y los tejidos profundos en general.

Normalmente existe un equilibrio entre los microorganismos de la flora y el

hospedero; sin embargo este equilibrio puede romperse por:

- Aumento de la masa crítica

- Traslado desde el sitio original
- Ruptura de barreras mecánicas por traumatismos.

Esto produce una proliferación e invasión de los microorganismos, dando origen

a una infección endógena. Por lo general, se requieren algunos determinantes para que
se produzcan estas enfermedades, como son:

- Deficiencia en el estado inmunitario del huésped.

- Tratamiento inmunosupresor o con corticoides.
- Cirugías.
- Uso de antibióticos.

Como ejemplos de infección endógena se pueden mencionar:

- Infección urinaria por Enterobacterias.

 - Endocarditis bacteriana por microorganismos de la boca (Streptococcus grupo
viridans)
- Diarrea por sobreinfección de Clostridium difficile, debido al uso prolongado
de antibióticios.

Muestras clínicas

En la recuperación del o los microorganismos causantes de la infección, lo más

importante es la correcta recolección de una muestra para su estudio microbiológico.
Esta recolección comprende cuatros pasos importantes:
1. Seleccionar el sitio anatómico más adecuado para tomar la muestra.
2. Usar la técnica más apropiada.
3. Poner la muestra recolectada en un envase que favorezca la viabilidad de los
microorganismos causantes del proceso infeccioso, y que además impida la
filtración o derrame de la muestra, como medida de protección para el
personal que posteriormente la manipula.
4. Enviar la muestra en forma rápida y expedita al laboratorio, y en el caso de
que esto no sea posible, asegurarse que sea almacenada a la temperatura y en
los medios de transporte adecuados.
Una muestra mal recolectada puede inducir a error en el aislamiento del
microorganismo etiológico real, y la recuperación de contaminantes puede llevar a
indicar una antibioticoterapia incorrecta y a veces incluso perjudicial. Debe recordarse
entonces, que “la calidad del trabajo realizado en el laboratorio no puede ser superior
a la calidad de la muestra recibida”.
Ya que el proceso de toma de muestra se inicia al lado del paciente siendo éste parte
activa, es necesario explicarle el porqué del procedimiento y el tipo de técnica a realizar,
para lograr así su colaboración y participación, lo que lleva a la obtención de la muestra
en óptimas condiciones.

Recolección y transporte de la muestras:

Preparación del sitio. En todos aquellos casos en que la muestra se obtenga con aguja
o por aspiración, se debe desinfectar la piel. Esto se logra limpiando la piel con alcohol
al 70%, seguido por povidona yodada, la que se deja actuar un minuto (esperando que
se seque). Si el paciente presenta hipersensibilidad al yodo, se debe usar solo alcohol.
Volumen. Si es posible obtener muestras líquidas (mediante aguja o aspiración) no
debieran usarse tórulas. El volumen de muestra que se envía al laboratorio es
generalmente menor de lo requerido. No existe consenso sobre los volúmenes mínimos
para cada tipo de muestra.
Envase y aparatos recolectores. Existen diferentes métodos de recolección, desde la
tórula hasta aparatos recolectores de muestra.
Las tórulas deben ser de un material que no inhiba el crecimiento bacteriano (alginato
de calcio o polyster). Éstas, luego de tomada la muestra, se introduce en un envase
estéril con un medio de transporte. Para muestras líquidas, lo más adecuado es usar
envases plásticos estériles, o tubos con tapa rosca.
Técnicas de recolección. Con el fin de obtener una muestra óptima para la recuperación
del agente etiológico es necesario seguir las instrucciones dadas más adelante.
Medio de transporte. No deben usarse tórulas sin medio de transporte (excepto para
ciertas técnicas específicas) porque esto lleva a la desecación de la muestra y a la
pérdida de la viabilidad bacteriana. Los medios de transportes recomendados cuando se
usan tórulas, en el caso de las secreciones, son del tipo tampón (Stuart, Amies).
Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido y es útil para
suprimir cambios oxidativos en el medio de transporte,. De esta manera se favorece la
viabilidad de los microorganismos durante su envío al laboratorio.

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE UNA MUESTRA CLINICA. SECUENCIA:

a. Observación microscópica.
b. Cultivo
c. Observación macroscópica de las colonias
d. Identificación fisiotaxonómica (batería bioquímica)
e. Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos
La observación directa de la muestra teñida con el método de Gram, entrega
información sobre el contenido bacteriano en la muestra. Otras estructuras bacterianas
que también pueden ser diferenciadas son las esporas, por medio de una tinción
especial. Algunos géneros bacterianos como Bacillus y Clostridium, producen
endosporas como una forma de resistencia a condiciones ambientales adversas, por
ejemplo sequedad o falta de nutrientes. Las endosporas o esporas se caracterizan por ser
altamente resistentes al calor, a las radiaciones y a la desecación. La resistencia de la
espora se debe a la estructura proteica (rica en aminoácidos azufrados) de sus capas
externas, lo que también las hace resistentes a tinción. Por este motivo las esporas se
tiñen en caliente.
Tanto las tinciones como la observación de la morfología de colonias bacterianas, en
un medio determinado, son estudios orientativos los que deben ser complementados con
análisis de identificación como baterías bioquímicas y de sensibilidad a agentes
antimicrobianos.
La fisiología bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a través de
las alteraciones que se producen en el medio de cultivo. Estas manifestaciones han
permitido establecer diferencias entre ellas, las que han sido utilizadas en su
clasificación en diferentes géneros y especies.
Las técnicas de identificación bioquímica de las bacterias diferencian géneros y
especies bacterianos en base a la detección de :
a. Utilización de fuentes de carbono: Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Manitol,
Sorbitol, Citrato.
b. Formación de productos finales o intermediarios del metabolismo microbiano:
Indol, CO2 Acido sulfhídrico (H2S), Acetilmetilcarbinol, etc.
c. Presencia de enzimas: Catalasa, Ureasa, Oxidasa, Coagulasa, etc.
d. Sensibilidad a algunos compuestos químicos o antibióticos: Bacitracina,
Optoquína, Novobiocina, etc.
En general, para cocáceas Gram positivo se utilizan fundamentalmente los dos
últimos métodos, en cambio para bacilos Gram negativo se emplean los tres primeros.
En este trabajo se analizaran dos de las Familias de Bacterias Gram positivo más
importantes, como son las Micrococcaceae y Streptococcaceae.

La Familia Micrococcaceae comprende los géneros Micrococcus, Staphylococcus y

Planococcus. Son bacterias Gram positivo, esféricas (cocos) agrupadas en racimo. Son
catalasa positivo, reacción característica de la Familia Micrococcaceae y que permite
diferenciarala de otros cocos Gram positivos como por ejemplo Streptococcus.
Las especies del género Micrococcus son saprófitas, se encuentran habitualmente en
la piel de mamíferos, en el suelo y el agua. Tienen metabolismo estrictamente aerobio, a
diferencia de las especies del género Staphylococcus que son aerobios anaerobios
facultativos.Otra característica que diferencia ambos géneros, es la propiedad de
Staphylococcus de fermentar glucosa en anaerobiosis, no así los Micrococcus.
 Las principales especies del género Staphylococcus son:
¾ Staphylococcus aureus.
¾ Staphylococcus epidermidis.
Staphylococcus aureus es patógeno para el hombre. Produce una variedad de
factores responsables de su patogenicidad, algunos de estos se describen en las Tablas
Nº 1 y 2.
 TABLA DE IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS GRAM POSITIVO

Cocaceas Bacilos

Catalasa Catalasa positivo

Positivo Negativo Aspecto Tinción Gram

Test de Bacitracina Streptococcus

R S
Observar Hemólisis
Test de Coagulasa Micrococcus Bacilos Grandes
(+) (-) Esporulados
Hemólisis Hemólisis Hemólisis Bordes netos
Alfa Beta Gamma
Staphylococcus aureus Staphylococcus
Coagulasa negativo Bacillus sp
Test de Latex Bilis Esculina
Optoquina Optoquina NaCl 6,5 %
Test de Novobiocina Bacilos finos
resistente sensible
S R Streptococcus Enterococcus
Grupo A, B, C, Listeria
S. Coagulasa negativo Staphylococcus D, F, G
No saprophyticus saprophyticus
Streptococcus Streptococcus Bacilo en empalizada
grupo viridans pneumoniae

Corynebacterium sp
Bilis positivo
NaCl positivo

Enterococcus
 Tabla Nº 1: Algunas enzimas producidos por Staphylococcus aureus.
Enzimas Acción en la célula blanco
Rompe el cemento celular facilitando la invasión de los
Hialuronidasa
tejidos por las bacterias.
Fibrinolisina Disgrega coágulos de fibrina.
Coagulan el plasma y, se pueden encontrar secretadas al
Coagulasa
medio extracelular y otras que están unidas a membranas.
Nucleasas Hidrolizan DNA.

Tabla Nº 2: Algunas toxinas producidos por Staphylococcus aureus.

Toxinas Acción en la célula blanco

Alfa toxina Es una hemolisina que produce lisis total de los glóbulos rojos. Es una
proteína antigénica de peso molecular 30.000 D.
Leucocidina* Causa degranulación de los leucocitos y macrófagos.

Exfoliatina Algunas cepas producen esta toxina, la que causa el síndrome de piel
quemada.
Enterotoxinas Algunas cepas producen estas toxinas que causan intoxicaciones
alimentarías.
* También es conocida como toxina de Panton - Valentine.
Las toxinas producidas por Staphylococcus aureus son causantes de los síntomas de las
enfermedades estafilocócicas.

Aislamiento y Caracterización:
El medio de cultivo utilizado para el aislamiento de S. aureus dependerá del origen de la
muestra. Para el aislamiento de S. aureus de muestras clínicas como pus, heridas, secreciones, etc.
se utilizan:
a. AGAR SANGRE. Éste es un medio enriquecido que contiene sangre defibrinada de cordero o
de conejo. Permite el desarrollo abundante de las especies de Staphylococcus y además permite
visualizar la producción de hemolisinas por lisis de los glóbulos rojos alrededor de las colonias.
S. aureus : produce halos de hemólisis completa alrededor de las colonias, producida por
la alfa toxina.
S. epidermidis : no produce hemólisis o lo hace débilmente.
Micrococcus : no produce hemólisis.
 Figura Nº 2: Tipos de hemolisis

b) AGAR MANITOL SALADO O MEDIO DE CHAPMAN. Es un medio selectivo que

contiene Manitol, NaCl al 7,5% y el indicador de pH Rojo de Fenol. Micrococcus y
Staphylococcus son halotolerantes, es decir, son capaces de crecer en esta concentración de
NaCl al 7.5%. En este medio además se evidencia la fermentación de Manitol, la que se
observa por el viraje del indicador a amarillo.
S. aureus : Da colonias amarillas cremosas rodeadas de una zona amarilla (producto de la
fermentación)
S. epidermidis : Generalmente no fermenta el manitol
Micrococcus : No fermenta el manitol.

En los dos medios (Agar Sangre y Agar Manitol Salado) se debe confirmar mediante tinción de
Gram la presencia de cocos Gram positivo en racimo, ya que otras especies pueden dar colonias
semejantes. Una vez confirmada la presencia de cocos Gram positivo en racimo se realizan pruebas
bioquímicas para confirmar el diagnóstico.
Una vez aisladas las colonias y habiendo observado su aspecto y características en medios
selectivos se realizan las pruebas bioquímicas.

Prueba de la Catalasa: Busca la presencia de la enzima catalasa, que descompone el H2O2.

H2O2 Enzima Catalasa H2O + O2

 La enzima se encuentra en la mayoría de las bacterias que contienen citocromo. La excepción
es Streptococcus que no puede descomponer el H2O2. El test permite diferenciar Staphylococcus,
Micrococcus y Listeria (catalasa +) de Streptococcus (catalasa -).
Se debe colocar una gota de peróxido de hidrógeno en un portaobjetos, sobre la cual se agrega
la colonia en estudio. La aparición rápida y sostenida de burbujas (antes de 20 segundos) indica
test (+).
Precauciones: no tocar el agar sangre al tomar la colonia ni usar asas de platino ya que
estas sustancias dan falsos positivos.

Si se sospecha que la colonia corresponde a Staphylococcus aureus, se realiza la prueba de la

COAGULASA.
Coagulasa: Es una prueba de PATOGENICIDAD que busca la presencia de la enzima
coagulasa producida por Staphylococcus aureus. La enzima es un activador del fibrinógeno a
fibrina, además, la pared de Staphylococcus aureus posee receptor de fibrinógeno lo que
permite la formación de puentes entre bacteria y bacteria, formándose un coágulo.
Diferencia Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus coagulasa negativo.
Esta prueba se puede realizar de dos formas:
a) Técnica en tubo: consiste en incubar plasma de conejo con gotas de cultivo líquido de
Staphylococcus. La reacción positiva se observa como la aparición de un coágulo a las 4
horas. Esta técnica detecta la coagulasa libre.
b) Técnica en portaobjeto: a partir de un cultivo de Staphylococcus en medio sólido, se hace
una suspensión abundante sobre una gota de agua. Esta suspensión debe ser lo más
 homogénea posible. Sobre ésta se coloca una o dos gotas de plasma de conejo y se
homogeniza. La reacción positiva se observa como aglutinación de las bacterias a los 20
segundos. Esta técnica detecta la coagulasa unida a membrana.
Otra prueba que sirve para diferenciar Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus es
un test comercial de aglutinación a través de particular de latex. La metodología consiste en
poner una gota del reactivo latex sobre un círculo de la tarjeta, a continuación se emulsiona
sobre la gota, la colonia sospechosa, se agita durante unos segundos y si hay formación de
grumos visibles se considera positiva. Siempre se debe realizar un control negativo que está
incluído en el kit. El fundamento de la técnica de aglutinación con partículas de latex se
muestra en la siguiente figura.

Partículas de latex con

Bacterias Aglutinación de las partículas
anticuerpo
Anticuerpo (Antígeno específico) = reconocen el antígeno bacteriano (proteína A)

Bacitracina:

Detecta si el desarrollo bacteriano es inhibido por este antibiótico. Se debe diseminar en una placa
de agar sangre una colonia con la precaución de una siembra homogénea y total de la placa. Luego
se coloca un disco de bacitracina, se incuba 16-24 horas y después se mide el tamaño del halo.
Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición > o = a 10 mm de diámetro.
Se considera resistente cuando el halo de resistencia es de < 10 mm de diámetro.
Micrococcus son sensibles a bacitracina.
Staphylococcus, son resistentes a bacitracina

Por otra parte, el género Streptococcus corresponde a cocos Gram positivos, anaerobios
facultativos que se disponen en pares o en cadenas y son catalasa negativo. Bajo ciertas
condiciones de cultivo las células son ovoides o alargadas. Se encuentran en diferentes superficies
y mucosas del hombre y de algunos animales como cavidad oral, faringe, piel, tracto intestinal.
Algunas especies son utilizadas en la industria lechera para la elaboración de quesos, leches
fermentadas y yoghurt (Streptococcus lactis).
Los miembros del género Streptococcus se clasifican de acuerdo a:
1.- ACTIVIDAD HEMOLÍTICA: según el tipo de hemólisis que presenten al ser cultivadas
en placas de agar sangre de conejo o de cordero.
a) Beta hemolíticos: producen halos limpios de hemólisis alrededor de las colonias.
(hemolisis completa de los glóbulos rojos).
b) Alfa hemolíticos: producen halos de hemólisis incompleta de color verdoso
(viridans) alrededor de las colonias.
c) Gama hemolíticos: no producen hemólisis
2.- SEGÚN CONSTITUCIÓN ANTIGÉNICA DE LA PARED CELULAR: es la
clasificación de Lancefield. Se basa en la composición química y antigénica de un hidrato de
carbono presente en la pared celular y permite clasificar a los estreptococos en grupos serológicos
que van desde la A hasta la U.
Ambas clasificaciones se asocian entre sí, así tenemos por ejemplo estreptococos beta hemolíticos
del grupo A como Streptococcus pyogenes, que es el más patógeno del género.
Streptococcus pyogenes produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder patógeno. Es
el agente causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis, faringitis, otitis, etc. Además
provoca enfermedades sistémicas como fiebre puerperal y escarlatina.

Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este género, agente

causante de neumonia lobar en el hombre. Es un diplococo no perfectamente esférico, tiene forma
de cabeza de lanza (lanceolado). Su forma virulenta se encuentra rodeada por una cápsula. Es
habitante normal de la faringe del hombre. Para su aislamiento las placas deben incubarse en un
ambiente con 10% de CO2. En agar sangre S. pneumoniae presenta alfa hemólisis y las colonias
son planas con formas de fichas de damas.

Streptococcus fecales o enterococos (por ejemplo Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium).

Existen otras especies de Streptococcus que habitan el intestino del hombre y animales y se les
conoce con el nombre de estreptococos fecales o enterococos. Se caracterizan porque generalmente
 son no hemolíticos y pueden crecer en condiciones de alta salinidad (NaCl 6,5%), pH básico (pH
9,6) y presencia sales biliares en que otros estreptococos no pueden hacerlo. Su presencia en
alimentos o agua indica contaminación fecal.

Aislamiento y Caracterización:
El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efectúa sembrando la muestra sobre una placa de
agar sangre. Los Streptococcus pyogenes presentan las siguientes características:
1. Hemólisis en placa de agar sangre. Se observa hemólisis limpia alrededor de las colonias, las
cuales son muy pequeñas.
Se debe confirmar mediante tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo en cadena ya
que otras especies pueden dar colonias semejantes, por ejemplo Staphylococcus. Una vez
confirmada su presencia se realizan pruebas adicionales para confirmar el diagnóstico.
a) Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los estreptococos beta hemolíticos del grupo A
(Streptococcus pyogenes) son sensibles a Bacitracina (se realiza en forma similar a un
antibiograma). Otros estreptococos también son sensibles, sin embargo no son beta hemolítico.
b) Pruebas serológicas. El diagnóstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar mediante
reacciones serológicas con antisueros específicos para el antígeno superficial.
c) Bilis/Esculina, NaCl 6,5%. Los Enterococos
crecen en presencia de NaCl 6,5%, toleran las sales
biliares y pueden hidrolizar la esculina. Estas
propiedades se pueden usar para distinguir los
Enterococos de otros cocos Gram Positivo
catalasa-negativos. En la prueba positiva, el tubo
donde está el medio se torna de color negro,
característico al desdoblar la bilis esculina.

d) Test de Camp

La mayoría de los Streptococcus grupo B producen una proteína extracelular difusible

(factor CAMP), la que actúa sinérgicamente con la beta-hemolisina producidas por algunas cepas
de Staphylococcus aureus causando la hemolisis de los eritrocitos.
 Sobre una placa de agar sangre de cordero, se siembra una cepa de Staphylococcus aureus
productora de beta-hemolisina, haciendo una estría en el centro de la placa. Se inoculan los
Streptococcus en estudio trazando estrías perpendiculares a la estría del Staphylococcus,
deteniéndose justo antes de alcanzarlas. Se incuban las placas a 37º durante 18 a 24 hrs.
Después de esta incubación, se observa la presencia de una zona hemolítica en forma de
punta de flecha en el área de intersección donde el factor CAMP y la beta-hemolisina han
difundido (prueba de CAMP positiva). Aproximadamente el 95% de los Streptococcus del grupo B
y de forma ocasional unas cepas de otros grupos son CAMP-positivos.

TEST DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS

MÉTODO DE DIFUSIÓN EN AGAR O KIRBY-BAUER

Se utilizan para determinar la sensibilidad in vitro de las bacterias a los distintos antimicrobianos.
Para que los resultados sean confiables y reproducibles es necesario estandarizar algunas
condiciones de laboratorio:
a) Concentración de las bacterias que se siembran: Requiere uso de estándares de turbidez: Mac
Farland 0.5
b) Medio de cultivo utilizado: Agar Mueller-Hinton o agar Mueller-Hinton con sangre para
Streptococcus
c) Concentración del antimicrobiano en el disco: varía para cada antimicrobiano.
d) Temperatura (37°C), tiempo de incubación (16-24 horas) y atmósfera de incubación (en O2)
e) Utilizar siempre cepas de Control de Calidad (ATCC) que tienen patrones de resistencia
conocidos y no modificables en el tiempo.

Una vez que se obtiene una colonia aislada (es absolutamente necesario que no exista mezcla de
bacterias), se prepara una suspensión bacteriana a una concentración conocida (1 a 2 x 108
UFC/mL) llevando a una turbidez equivalente a un Mac Farland 0.5.
La siembra de la suspensión debe ser homogénea sobre el agar. Una vez que la placa está seca, se
colocan cuidadosamente los sensidiscos con los antimicrobianos que interesa evaluar, dispuestos
equidistantes unos de otros.
Se incuban generalmente 16 a 18 horas para la mayoría de los antibióticos (excepto la oxacilina
que requiere 24 horas de incubación). En este tiempo se produce la difusión del antimicrobiano en
el agar y si la bacteria es sensible, se produce la inhibición del desarrollo en forma de halo. Si la
bacteria es resistente habrá desarrollo hasta el disco mismo (6mm) o con halos de inhibición
disminuidos.
Están definidos para cada grupo de bacterias los halos de inhibición que permitirán clasificar a las
bacterias en Sensibles, Intermedias o Resistentes.
 Antibiograma mediante
la técnica de difusión con
discos

Interpretación de los halos de Inhibición para Staphylococcus spp (Agar Mueller –Hinton)
DROGA CONTENIDO SENSIBLE INTERMEDIA RESISTENTE Observaciones
DEL DISCO (Halo en mm) (Halo en mm) (Halo en mm)
Oxacilina 1 μg ≥13 11-12 ≤10 Para S. aureus
Eritromicina 15 μg ≥23 14-22 ≤13
Clindamicina 2 μg ≥ 21 15-20 ≤14
Vancomicina 30μg ≥15 - -

Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus β-hemolíticos (Mueller-Hinton

con sangre de cordero)
DROGA CONTENIDO SENSIBLE INTERMEDIA RESISTENTE
DEL DISCO (Halo en mm) (Halo en mm) (Halo en mm)
Penicilina 10 unidades ≥ 28 20-27 ≤19
Eritromicina 15 μg ≥21 16-20 ≤15
Clindamicina 2μg ≥19 16-18 ≤15
Vancomicina 30μg ≥17 - -

Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus pneumoniae (Mueller-Hinton

con sangre de cordero)
DROGA CONTENIDO SENSIBLE INTERMEDIA RESISTENTE
DEL DISCO (Halo en mm) (Halo en mm) (Halo en mm)
Penicilina 1 μg de oxacilina ≥20
Eritromicina 15 μg ≥21 16-20 ≤15
Trimet/sulfame 1.25/25.75μg ≥19 16-18 ≤15
Vancomicina 30μg ≥17 - -
ACTIVIDADES PRÁCTICAS

I.- En el caso de la flora normal Ud. deberá:

- Tomarse una muestra con tórula humedecida con suero fisiológico, con la que frotará la
zona anatómica de interés.

- Sembrar en placa de agar sangre. Incubar a 37ºC por 24 horas.

- Hacer análisis macro y microscópico de la colonia más representativa.

II.- En el caso de su muestra clínica el grupo dispondrá de:

A. HISTORIA CLÍNICA: Lea y comente brevemente la historia clínica asociada a la muestra

clínica que se le ha entregado. Con los resultados del análisis microbiológico, vale decir, análisis
macroscópico, microscópico, pruebas bioquímicas y patrón de sensibilidad a los agentes
antimicrobianos de su muestra Ud. deberá hacer una correlación con los signos y síntomas del
paciente para definir los posibles agentes patógenos involucrados y su tratamiento más apropiado.
LA DISCUSIÓN DE ESTE PUNTO ES LA PARTE MÁS IMPORTANTE EN LA
EVALUACION DE SU INFORME DE LABORATORIO.

B. GRAM Y CULTIVO
1. Observe sus placas con detención y realice la descripción macroscópica de las colonias.
Observe si se trata o no de cultivos puros.
2. Realice un frotis de las colonias, tíñalas con tinción de Gram y describa lo observado.

C. IDENTIFICACIÓN BACTERIANA:
Utilice los esquemas de identificación entregados en el marco teórico y siguiendo las
instrucciones que se detallan para cada técnica, interprete las pruebas bioquímicas.

D. ESTUDIO DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS:

Utilizando el método de difusión en agar, realice estudio de sensibilidad a diversos agentes

antimicrobianos de su muestra clínica.
Realice la lectura del halo de inhibición con una regla en mm. e interprete los diámetros de los
halos para definir según la tabla adjunta si se trata de un organismo Sensible, Intermedio o
Resistente.
 TRABAJO PRÁCTICO N°3

MUESTRAS CLINICAS DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO

OBJETIVOS

1.- Realizar pruebas bioquímicas convencionales para la identificación de bacterias Gram

negativo.
1. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de productos
intermediarios, debido a la acción bacteriana.
3.- Realizar y leer un antibiograma
4.- Conocer algunos cuadros clínicos relevantes causados por microorganismos Gram negativo,
y correlacionarlos con conocimientos adquiridos en clases teóricas.

MARCO TEÓRICO

El grupo de las Enterobacterias, nombre común utilizado para referirse a la Familia

Enterobacteriaceae, incluye a bacilos Gram (-), aerobios y anaerobios facultativos, la mayoría de
ellos móviles mediante flagelos perítricos, que como característica microbiológica fenotípica
común tienen la capacidad de fermentar la glucosa y reducir los nitratos a nitritos. Tienen como
habitat el intestino de animales inferiores y del hombre.

Entre las numerosas especies que constituyen esta familia, encontramos algunos grupos que
en su relación con el hospedero humano son comensales, ya que constituyen como es el caso de
Escherichia coli un constituyente importante de la microbiota intestinal normal aerobia,
especialmente a nivel de la porción distal del intestino delgado y fundamentalmente a nivel del
intestino grueso. En esta localización la presencia de E. coli resulta en un beneficio para el
hospedero, pues como parte de su metabolismo se sintetizan vitaminas y esta microbiota participa
en la degradación de ácidos y sales biliares.

Otros integrantes de este grupo en cambio son patógenos intestinales como el género
Salmonella, Shigella, Yersinia y un subgrupo de E. coli con factores de virulencia específicos que
afectan el intestino y por ello se denominan E. coli diarreogénicos. Estos grupos o géneros
bacterianos causan infecciones gastrointestinales que pueden expresarse clínicamente como diarrea
acuosa, diarrea con sangre (también denominada diarrea enterocólica o síndrome disentérico) y en
algunos casos a partir de la infección intestinal estas bacterias pasan al torrente sanguíneo y se
puede producir una infección sistémica o bacteremia, como por ejemplo la fiebre tifoidea.
Análisis de una muestra clínica
En el laboratorio de Microbiología el análisis de una muestra clínica o ambiental sigue, por lo
general, la siguiente secuencia:
a) Toma de muestra
b) Siembra y obtención del microorganismo aislado (cultivo puro)
c) Observación de morfología macroscópica
d) Tinciones y observación de morfología y agrupación microscópica.
e) Identificación fisiotaxonómica (reacciones metabólicas específicas) con batería
convencional y Sistema estandarizado API 10S
f) Estudios de sensibilidad a agentes microbianos.

La fisiotaxonomía bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas frente a distintos

medios de cultivo a través de las alteraciones que producen en estos medios. Estas alteraciones, son
producidas por enzimas específicas de las diferentes bacterias, ya que no todos los
microorganismos poseen los mismos requerimientos nutricionales y las mismas rutas metabólicas.
De este modo esta técnica taxonómica se basa principalmente en la detección de:
a) Utilización de distintas fuentes de carbono.
b) Formación de productos finales.
c) Presencia de enzimas.
d) Sensibilidad a productos químicos o antibióticos.
La identificación de una cepa bacteriana aislada puede realizarse utilizando diferentes ensayos
bioquímicos que generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de
reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la
bacteria al crecer transforma o no.
Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para
demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como la presencia o ausencia
de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica,
crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No
significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano.
Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diversos sistemas de trabajo (medio de cultivo,
indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de distintos
microorganismos. Por ejemplo, se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para
estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es
exigente.
A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de
identificación, comerciales, etc.). Los sistemas comerciales utilizan modificaciones de las
pruebas bioquímicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro
impregnadas en reactivos o pequeños compartimentos con medios listos para sembrar. En
todos los casos se emplean códigos numéricos para la interpretación de resultados.

Batería bioquímica convencional para diagnóstico microbiológico

1. Agar tendido corriente: Es un medio sólido nutritivo, que permite observar posible
pigmentación en las colonias.

2. Agar Urea de Christensen: Es un medio sólido. En él se puede observar la presencia de la

enzima Ureasa, ya que contiene además de nutrientes básicos:
¾ Triptona.
¾ Urea.
¾ Indicador de pH fenolftaleina.
Esta prueba se basa en la capacidad de algunas bacterias, que poseen la enzima ureasa, de
degradar urea a amoníaco y CO2. Esta reacción es fácilmente evidenciable porque el pH varía hacia
alcalino debido al efecto del amoníaco. Este cambio se observa por viraje de un indicador de pH
como la fenolftaleína.

3. Agar Citrato: Este medio de cultivo contiene además de sales minerales:

¾ Fosfato de amonio.
¾ Citrato de sodio, como única fuente de carbono.
¾ Indicador de pH azul de bromo timol (verde a pH neutro, azul a pH alcalino).
En este medio sólo pueden desarrollarse aquellas bacterias que poseen la enzima Citrato
Permeasa, la que les permite transportar el citrato a través de la membrana citoplasmática.
 Una vez en el interior de la célula, el ión citrato es metabolizado a través del ciclo de los ácidos
tricarboxílicos.

4. Agar TSI: Las bacterias pueden utilizar azúcares (hidratos de carbono) a través de varias
rutas metabólicas. Los productos finales de estas reacciones dependerán de cada bacteria, del
azúcar utilizado y de la ruta metabólica. En general estos productos serán ácidos (fórmico,
pirúvico, láctico, etc.) y gases (CO2, H2). Existen muchos medios de cultivo que se han diseñado
con el objeto de detectar la producción de ácidos y de gas a partir de distintos azúcares.
El Agar TSI (Triple Sugar Iron) es un medio rico que contiene los nutrientes necesarios
para el crecimiento de las bacterias y que permite visualizar la utilización de azúcares. Contiene
además de nutrientes como extracto de carne, extracto de levadura, peptona, etc:
¾ Glucosa al 0,1%
¾ Lactosa al 1,0%
¾ Sacarosa al 1,0%
¾ Citrato de amonio.
¾ Hierro.
¾ Indicador de pH rojo de fenol (Amarillo pH ácido; Rojo pH alcalino).
Si la bacteria inoculada es fermentadora solo de glucosa usará esta y se obtiene solo una
pequeña cantidad de ácido, la que en las primeras 8 horas a 12 horas de incubación es suficiente
para conventir ambas porciones (tendido y profundo) a un color amarillo. Dentro de las próximas
horas, sin embargo, la glucosa sobrante es completamente agotada y la bacteria comienza la
degradación oxidativa de los aminoácidos en el tendido del tubo, donde hay oxígeno, lo que lleva
a la liberación de aminas que neutralizan las pequeñas cantidades de ácido presente en el tendido, y
en 18 a 24 horas este tendido cambia a pH alcalino y vuelve a color rojo. En la porción profunda
(anaeróbica) del tubo, la degradación de aminoácidos es insuficiente para neutralizar el ácido
formado, y el medio permanece amarillo. Si el TSI es inoculado con un organismo fermentador de
glucosa y lactosa o sacarosa, aún cuando la glucosa se agota en las primeras 8 a 12 horas, la
fermentación continúa ya que el organismo es capaz de usar la lactosa o sacarosa. Así, a las 18 a 24
horas, ambas porciones están amarillas.
Si se produce gas se observará como quiebres en el agar o separación de la columna de agar
del fondo del tubo.
 Para la detección de H2S, el cual es incoloro, el medio incluye un indicador. El tiosulfato de
sodio es la fuente de átomos azufre en la mayoría de los medios usados para la producción de H2S.
Sales de fierro (Sulfato ferroso y citrato férrico amoniacal) incorporadas en el medio de cultivo
reaccionan con sulfuro de hidrógeno para producir un precipitado negro insoluble (sulfuro ferroso)
este reacciona con la sal de hierro dando sulfato ferroso, un compuesto insoluble de color negro.

5. Agar LIA: Las distintas bacterias poseen enzimas inducibles que pueden actuar sobre
algunos aminoácidos, desaminándolos o decarboxilándolos. Ejemplo de estas reacciones
enzimáticas son: decarboxilación de la lisina y la desaminación de la lisina.

Figura Nº 1:
Esquema de descarboxilación
de la Lisina

Otro efecto de las bacterias sobre aminoácidos azufrados es la remoción del grupo -hSH2,
produciendo H2S (reacción que se observa también en el medio TSI).
Este medio contiene además de nutrientes como peptona y extracto de levadura:
¾ Aminoácido lisina
¾ Aminoácidos azufrados
¾ Glucosa
¾ Citrato de hierro y amonio
¾ Indicador de pH púrpura de bromocresol (Amarillo a pH ácido, morado a pH alcalino).
La bacteria primero utiliza la glucosa produciendo ácido por lo que el pH baja y el
indicador vira a amarillo. Si la bacteria NO PRODUCE lisina decarboxilasa se mantendrá esta
coloración amarilla. Si la bacteria PRODUCE la enzima lisina decarboxilasa, la cual remueve el
grupo COOH de la lisina (Figura Nº 1) dando como producto CO2 y una diamina (alcalina),
entonces el indicador vira nuevamente hacia el lado alcalino y se revierte el viraje de amarillo a
morado.
Si la bacteria produce H2S éste reacciona con la sal de hierro formando sulfuro ferroso
(negro). Si la bacteria es capaz de desaminar a la lisina, la superficie se verá roja y el fondo
amarillo.
6. Medio MIO: Permite observar motilidad. Si el crecimiento bacteriano se observa como el
enturbamiento completo del medio, la reacción es positiva. Si sólo se limita al pinchazo, es
negativa. También es posible observar la presencia de la enzima ornitina descarboxilasa, que
participa en el metabolismo de varios aminoácidos en algunas bacterias. La reacción positiva se
observa por el color morado del tubo; en cambio, si la reacción es negativa el medio se torna
amarillo (puede ponerse morado el fondo). Además, se puede observar la presencia de indol, para
lo cual hay que agregar una gota de reactivo de Kovacs. En este caso, la reacción positiva será la
aparición de un aro rojo sobre la superficie del medio.
Otra prueba que complementa la determinación de una especie bacteriana desconocida es la
susceptibilidad a antibióticos. Los antibióticos son agentes terapéuticos producidos por organismos
vivos, que inhiben o destruyen a los agentes infecciosos. Los ensayos de susceptibilidad están
indicados para apoyar la terapia antimicrobiana de tratamiento en procesos infecciosos por
bacterias en las que la identidad del microorganismo no es suficiente para predecir en forma
confiable su susceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa que el
organismo causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes
antimicrobianos más comúnmente usados.
Los métodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas son métodos que
determinan in vitro la sensibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes
antimicrobianos bajo condiciones específicas y estandarizadas.

Sistemas comerciales usados en la identificación de enterobacterias

2.1- API 10S:

Sistema de identificación estandarizado para Enterobacterias y otros bacilos Gram negativos, como
algunos no fermentadores (Pseudomonas, Acinetobacter) que utiliza 11 pruebas bioquímicas que
usan sustratos deshidratados. (Es el que ocupamos en este práctico).
2.2- SensIdent
Es un sistema semiautomatizados que permite identificar bacilos gram negativos fermentadores y
no fermentadores de glucosa. La identificación se hace mediante pruebas bioquímicas las que
vienen liofilizadas en placas de microtitulación y se rehidratan con la suspensión bacteriana.
2.3 VITEK
Es un sistema automatizado (Bio-Merieux). La identificación de los bacilos gram negativos
fermentadores y no fermentadores de glucosa se hace a través de pruebas bioquímicas que vienen
incluidas en tarjetas de identificación. Los tiempos de incubación varían entre 2 y 15 horas. El
sistema vitek determina si cada pocillo es positivo o negativo midiendo la turbidez mediante un
lector óptico. Cuando finaliza el periodo de incubación, las reacciones son analizadas
automáticamente y la identificación es impresa.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS

A. HISTORIA CLÍNICA

Lea y comente brevemente la historia clínica asociada a la muestra clínica que se le ha entregado.
Con los resultados del análisis microbiológico, vale decir, análisis macroscópico, microscópico,
pruebas bioquímicas y patrón de sensibilidad a los agentes antimicrobianos de su muestra Ud.
deberá hacer una correlación con los signos y síntomas del paciente para definir los posibles
agentes patógenos involucrados y su tratamiento más apropiado. LA DISCUSIÓN DE ESTE
PUNTO ES LA PARTE MÁS IMPORTANTE EN LA EVALUACION DE SU INFORME
DE LABORATORIO.

B. GRAM Y CULTIVO

1. Observe sus placas con detención y realice la descripción macroscópica de las

colonias. Observe si se trata o no de cultivos puros.
2. Realice un frotis de las colonias, tíñalas con tinción de Gram y describa lo observado.

C. IDENTIFICACIÓN BACTERIANA:

Utilice los esquemas de identificación entregados en el marco teórico y siguiendo las

instrucciones que se detallan para cada técnica, realice una batería bioquímica clásica y un
API 10S a su muestra clínica. Interprete las pruebas bioquímicas.

1. Pruebas bioquímicas convencionales

Cada grupo contara con una batería convencional compuesta por 6 pruebas bioquímicas
dispuestas en 6 tubos. Para sembrar la batería se deben seguir las siguientes indicaciones:
a. Flamear el asa para su esterilización.
b. Tomar una colonia aislada de la placa de agar MacConkey con la muestra a estudiar.
c. Flamear la boca del tubo con caldo estéril o suero fisiológico, sumergir el asa con cuidado y
agitar.
d. Flamear el asa para su esterilización. El caldo recién sembrado será utilizado como inóculo
para sembrar toda la batería.
e. Esterilizar el asa, enfriar en las paredes internas del tubo recién sembrado y sumérjala en el
caldo.
f. Usar este inóculo para sembrar todos los tubos de la batería.
g. Antes de empezar, anotar los colores de los distintos medios. Esto le servirá para hacer
una comparación con el resultado final.
h. Para cada tubo de la batería el asa debe ser esterilizada previamente y enfriada en las
paredes del tubo antes de sumergirla en el caldo inoculado.

Posteriormente siembre en los medio teniendo en cuenta que:

1. Los medios semitendidos (Agar TSI y LIA) se deben sembrar en profundidad y en
superficie, es decir, atravesándolos hasta el fondo con el asa en punta, y luego en zig-zag
por la superficie.
2. Los medios tendidos (Agar Citrato, Agar Urea y Corriente) se siembran sólo en la
superficie, es decir, se realiza un zig-zag con un asa convencional (en argolla).
3. Los caldos se siembran agitando el asa con el inóculo dentro del tubo con el medio.
4. Los medios semisólidos (agar MIO) se siembran sólo en profundidad con un asa en punta,
pinchando el agar hasta la mitad del tubo aproximadamente.

LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LA BATERÍA.

Una vez que la batería es sembrada, se incuba a 37ºC para que los microorganismos crezcan y
produzcan los cambios en los distintos medios. Posteriormente los resultados se “leen” y se
comparan con la Tabla de Resultados adjunta.

Lectura Batería Bioquímica

Agar Urea
Reacción positiva : El agar se torna fucsia.
Reacción negativa : El agar no cambia de color.

Agar Citrato
Reacción positiva : Viraje del indicador de pH a color azul (alcalino).
Reacción negativa : El agar permanece de color verde (neutro).

Agar TSI
Utilización de glucosa : Superficie roja (pH alcalino). Se anota K
Fondo amarillo (pH ácido). Se anota A
Utilización de lactosa : Fondo y superficie amarilla (pH ácido). Se anota A/A
Producción de gas : Ruptura de la columna de agar
Producción de H2S : Ennegrecimiento del agar.
Reacción negativa : El tubo no varía de color. Se anota K/K.

Agar LIA
Decarboxilación de lisina positivo
Decarboxilación de lisina negativo
Desaminación de lisina positivo
Desaminación de lisina negativo
Producción de H2S
: todo el tubo morado (alcalino). Se anota K/K
: superficie morada (alcalina). Se anota como K
fondo amarillo (ácido). Se anota como A
: superficie roja. Se anota R
fondo amarillo. Se anota A
: no hay cambio. Se anota A/A
: ennegrecimiento del agar

Medio MIO
Reacción positiva para ornitina descarboxilasa : El medio se observa de color morado.
Reacción negativa para ornitina descarboxilasa : El medio se torna amarillo (puede ponerse
morado el fondo).

Producción de indol : Reacción positiva será la aparición de un anillo rojo sobre

la superficie del medio al agregar una gota de reactivo de
Kovacs.

Movilidad positiva : Enturbiamiento del agar (Crecimiento en todo el volumen de

medio)

Movilidad negativa : Agar transparente (Crecimiento solo en la picadura)

 Resultados mas frecuentes de algunas pruebas bioquimicas para la familia ENTEROBACTERIACEAE

Glucosa Lactosa Sacarosa Manitol Sorbitol Gelatina Citrato H2S Motilidad Indol V-P R-M Pigmento Urea
Escherichia coli AG + V + + - - - +/- + - + - -
Shigella flexneri A - V V - - - - - - - + - -
Shigella dispar - V - - - - - - - + - + - -
Salmonella typhi A - - + + - V + + - - + - -
Salmonella paratyphi A AG - - + + - - - + - - + - -
Salmonella paratyphi B AG - - + + - + + + - - + - -
Salmonella gallinarum A - - + + - + +/- - - - + - -
Citrobacter freundii AG + +/- + + - + +/- + - - + - -
Klebsiella pneumoniae AG + + + + - + - - - + - - +
Enterobacter aerogenes AG + + + + -/+ + - + - + - - -
Enterobacter hafniae AG V V + - - V - + - +/- -/+ - -
Serratia marcescens V - + + + + + - + - + -/+ + V
Serratia rubidae AV + + + - + + - +/- - + -/+ + V
Proteus vulgaris AV - + - - + V + + + - + - +
Proteus mirabilis AG - V - - + (+) + + - -/+ + - +
Pseudomonas
aeruginosa* - - - - - + + - + - - - + -

Alcaligenes faecalis* - - - - - - V - + - - - - -
* No pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

AG = Acido-Gas (utilización del substrato y producción de gas)

V = Variable
(+) = Positivo después de 3 ó 4 días
+/- = Generalmente positivo
-/+ = Generalmente negativo
 TABLA I

Fermentación de Glucosa Positivo

Fermentación de Lactosa Positivo
Lisina Desaminasa Negativo

Producción de H2S

Positivo Negativo

Indol Negativo Lisina Descarboxilasa Positivob

Lisina Descarboxilasa Indol

Positivo Negativo Positivo Negativo

Salmonella Arizonaa Citrobacter freundii Escherichia coli Enterobacter spp.

Klebsiella spp.

Nota : Todos producen gas de glucosa.

Todos son Citrato positivo. Excepto E. coli
Todos son Ureasa negativo. Excepto Klebsiella, que puede dar positivo al 2do o 3er día

a : ciertas especies de S. Arizona Fermentan la Lactosa lentamente

b : ciertas especies de E. coli son Lisina Descarboxilasa negativo.
 TABLA II

Fermentación de Glucosa Positivo

Fermentación de Lactosa Negativo
Lisina Desaminasa Positivo

Producción de H2S

Positiva Negativo

Lisina Descarboxilasa Negativo Lisina Descarboxilasa Negativo

Indol Indol Positivo

Citrato
Positivo Negativo
Negativo Positivo
Proteus vulgaris Proteus mirabilis
Proteus morganii Proteus rettgeri
Providencia spp.

Nota : P. vulgaris y P. mirabilis pueden o no utilizar Citrato

Todos producen un poco de gas de Glucosa
Todos son Ureasa positivo. Excepto Providencia
 TABLA III
Fermentación de Glucosa Positivo
Fermentación de Lactosa Negativo
Lisina Desaminasa Negativo

Producción de H2S

Positiva Negativa

Lisina Descarboxilasa Lisina Descarboxilasa

Positivo Negativo
Positivo Negativo

Indol Citrato Positivo Indol Negativo Citrato Negativo

Citrato Positivo
Positivo Negativo Citrobactera Indol
Serratia
Citrato Citrato Negativo Positivo
Negativo
Negativo Positivo Salmonella Paratyphi A Shigella spp.
Edwarsiella Shigella spp. Yersinia enterocolitica
Salmonella Typhi Salmonella Paratyphi B
Salmonella Arizona

Nota : Todos son Ureasa Negativo. Excepto algunas cepas de Yersinia enterocolitica.
No producen gas de Glucosa Shigella, Serratia, Salmonella Typhi y Yersinia enterocolitica. El resto produce gas de

a: Ciertas especies de Citrobacter son Lactosa Negativo y pueden ser Indol Positivo o Negativo
4. Siembra y Lectura de API 10 S
TECNICA:
1. Prepare una suspensión bacteriana en 5 ml de suero fisiológico.
2. Llene los microtubos con la suspensión bacteriana y además la cúpula del test CIT.
3. Llene las cúpulas de los test LDC, ODC, H S y URE con aceite de parafina, para crear
2

una atmósfera de anaerobiosis.

4. Coloque la galería en la cámara de incubación, a la que debe colocarle previamente 3 ml
de agua destilada para crear un ambiente húmedo.
5. Cierre la cámara e incube 18 a 28 horas a 37°C.
6. Después de la incubación, lea aquellos test de reacciones espontáneas:

7. Lea aquellos test que requieren agregar reactivos

TDA (Triptofano-deaminasa): agregue una gota del reactivo TDA. Coloración marrón
oscura indica positivo.
IND (Producción de indol): Agregue una gota del reactivo de James. Coloración rosa indica
positivo.
NO (Producción de nitritos): Agregue una gota del reactivo NIT1 y NIT 2 en el tubo GLU.
2

Espere 2 a 3 minutos. Una coloración roja indica positivo.

8. Realice aparte el test de oxidasa.
9. Registre todas las reacciones en la hoja de resultados que le entregará su ayudante.
10. Codifique el conjunto de reacciones obtenidas en un perfil numérico. Sume los números
de cada grupo si las reacciones son positivas Se obtienen 4 dígitos que corresponden al
perfil numérico. Busque el perfil numérico en el catálogo que tendrá su ayudante o en un
software.
11. Registre sus resultados

5. Test de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos método de difusión en agar o

Kirby-Bauer

Se utilizan para determinar la sensibilidad in vitro de las bacterias a los distintos

antimicrobianos. Para que los resultados sean confiables y reproducibles es necesario
estandarizar algunas condiciones de laboratorio:
a) Concentración de las bacterias que se siembran: Requiere uso de estándares de
turbidez: Mac Farland 0.5
b) Medio de cultivo utilizado: Agar Mueller-Hinton
c) Concentración del antimicrobiano en el disco: varía para cada antimicrobiano.
d) Temperatura 37°C, tiempo de incubación 16-24 horas y atmósfera de incubación
en O2
e) Utilizar siempre cepas de Control de Calidad (ATCC) que tienen patrones de
resistencia conocidos y no modificables en el tiempo.

Una vez que se obtiene una colonia aislada (es absolutamente necesario que no exista
mezcla de bacterias), se prepara una suspensión bacteriana a una concentración conocida (1-
8
2 x 10 UFC/mL) llevando a una turbidez equivalente a un Mac Farland 0.5. La siembra de
la suspensión debe ser homogénea sobre el agar. Una vez que la placa está seca, se colocan
cuidadosamente los sensidiscos con los antimicrobianos que interesa evaluar, dispuestos
equidistantes unos de otros. Se incuban generalmente 16 a 18 horas para la mayoría de los
antibióticos. En este tiempo se produce la difusión del antimicrobiano en el agar y si la
bacteria es sensible, se produce la inhibición del desarrollo en forma de halo. Si la bacteria
es resistente habrá desarrollo hasta el disco mismo (6mm) o con halos de inhibición
disminuidos.
Están definidos para cada grupo de bacterias los halos de inhibición que permitirán
clasificar a las bacterias en Sensibles, Intermedias o Resistentes.
 TRABAJO PRACTICO Nº4

BACTERIAS ANAEROBIAS Y FASTIDIOSAS

OBJETIVOS

1. Conocer la importancia de una buena muestra para un cultivo anaerobio

2. Conocer y practicar el procesamiento microbiológico de bacterias anaerobias y con
requerimientos especiales de cultivo aisladas a partir de muestras de flora normal de la
boca.
3. Conocer algunos cuadros clínicos relevantes causados por microorganismos de este tipo.

MARCO TEÓRICO

Las bacterias anaerobias estrictas son microorganismos incapaces de crecer en

presencia de oxígeno y mueren en su presencia (por los radicales tóxicos) ya que no tienen
los sistemas de citocromos para el metabolismo del oxígeno, ni las enzimas superoxido
dismutasa (SOD) y catalasa para eliminar estos radicales. Para su desarrollo in vitro éstas
requieren medios de cultivo enriquecidos y un ambiente anaeróbico.

En el hombre las bacterias anaeróbicas predominan normalmente en la cavidad oral

alrededor de los dientes y en el tracto gastrointestinal, en los orificios del tracto
genitourinario y en la piel. La mayoría de estos hábitats tienen una baja tensión de oxígeno
y bajo potencial de oxidorreducción.

Las infecciones de importancia médica por bacterias anaerobias son comunes. Estas
son frecuentemente polimicrobianas, o sea, las bacterias anaerobias en general producen
infecciones mezcladas con otros anaerobios, con anaerobios facultativos y con aerobios, las
infecciones se producen cuando los anaerobios y otras bacterias de la flora normal
contaminan sitios del cuerpo normalmente estériles. Por ejemplo abscesos cerebrales
(contaminación por bacterias de la boca), abscesos abdominales, supuraciones, como
peritonitis por contaminación del contenido del colon, después de algún daño en el intestino
(principalmente Bacteroides grupo fragilis).

Las infecciones producidas por anaerobios pueden dividirse según su origen en:

a) Endógenas: abcesos, endocarditis, infecciones pleurales y pulmonares,

bacteremia, infecciones peridontales, peritonitis, sinusitis crónica, gingivitis necrotizante,
colitis pseudomembranosa.

b) Exógenos: intoxicaciones alimentarias, botulismo, tétano, colitis

pseudomembranosa.
Aislamiento de bacterias anaeróbicas

A fin de obtener resultados óptimos se debe actuar según los siguientes principios
generales:

- Correcta recolección y transporte de la muestra clínica

- Procesamiento de muestras con mínima exposición al oxígeno atmosférico
- Uso de medios frescos y prerreducidos
- Empleo correcto del sistema anaeróbico, con inclusión de un catalizador activo para
permitir la eliminación del oxígeno de éste

Existen diferentes sistemas que son satisfactorios para el cultivo de bacterias

anaeróbicas,
Uno de los más utilizados es el “Sistema GASPAK”, este consta de un soporte para placas
incluido en una cubeta transparente con tapa hermética (figura 1). Para crear la atmósfera
anaeróbica se utiliza un sobre comercial con catalizador que contiene una tableta de
borohidrato sódico y otra de bicarbonato sódico y ácido cítrico.
Las placas y los tubos sembrados en el interior de la jarra, obtendrán un ambiente de
anaerobiosis, al reaccionar el catalizador con 10 ml de agua destilada estéril que se
adiciona al sistema, de esta manera se produce la reducción del oxígeno según la siguiente
reacción.

2H2+ O2 2H2O

Además en otras reacciones se forma H2 y CO2. Para confirmar el ambiente anaerobio, se

coloca dentro de la jarra un papel indicador (azul de metileno) que vira de color (de azul a
blanco) en presencia de CO2.

Figura 1: Sistema GASPAK para crecimiento de bacterias anaeróbicas

 Por su parte, las bacterias fastidiosas, corresponden a aquellas que no crecen en
medios de cultivo convencionales (agar nutriente, agar sangre) y requieren medios
suplementados con vitaminas, aminoácidos, factores de crecimiento, etc. Además pueden
requerir condiciones especiales de cultivo como por ejemplo mayor tiempo de incubación,
condiciones anaeróbicas o de CO2 (bacterias capnofílicas).

Un medio utilizado para el crecimiento de bacterias anaeróbicas fastidiosas es el

agar sangre suplementado con hemina-menadiona, la menadiona es una tipo de vitamina K
y la hemina es un producto de la descomposición de la hemoglobina, la gran cantidad de
nutrientes de este medio permite el crecimiento de bacterias exigentes metabolicamente.

En este práctico, utilizaremos el agar “Mitis salivarius”, este es un medio selectivo

para el aislamiento de Streptococcus oralis, Streptococcus salivarius y Enterococcus. Se
utiliza para estudios microbiológicos de la placa dental y caries producidas por bacterias
presentes en la saliva. Este medio esta compuesto por cristal violeta, telurito de potasio y
azul de tripan, que son agentes que inhiben la mayoría de los bacilos Gram Negativo y
bacterias Gram positivo a excepción de Streptococcus.

Streptococcus salivarius en agar Mitis-salivarius

Streptococcus oralis en agar Mitis salivarus

Enterococcus en agar Mitis-salivarius

ACTIVIDADES PRÁCTICAS

I.- Flora anaerobia facultativa Gram +

1.- Tinción directa de muestras del diente

Para esto el alumno con un mondadientes estéril tomará muestras de al menos una
superficie dental que le parezca más interesante. Las muestras tomadas se fijarán y teñirán
con tinción de Gram para observar los microorganismos adheridos a la superficie celular.

Tinción Gram:

1) Preparar un frotis con la bacteria de la siguiente manera:

a.- Colocar una gota de agua en el centro de la lámina (Aprox, 0,5 cm de
diámetro).
b.- Obtener una pequeña muestra desde la mucosa oral a estudiar.
c.- Mezclar la muestra con la gota de agua.
d.- Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.

2) Teñir el frotis de manera habitual, observar al microscopio, anotar y dibujar lo que

observe

2.- Siembra de saliva en agar sangre y en agar Mitis-Salivarius (Streptococcus mutans)

1) El alumno deberá obtener una muestra de saliva en un tubo de ensayo estéril (aprox.
3 ml)
2) Se realizarán dos diluciones seriadas 1/10 de la muestra de saliva obtenida en el
punto anterior y se sembrará 0,1 mL en cada placa (con técnica de aislamiento).
3) Incubar las placas en un ambiente con 5% de CO2, que se logra en un tarro con una
vela
4) Realizar análisis macroscópico de colonias en agar sangre y contar colonias azules y
negras en agar Mitis-Salivarius. Las colonias azules corresponden a Streptococcus
mutans que juegan un rol en cariogénesis y son uno de los principales agentes
causales de bacteremias continuas y endocarditis. Las colonias negras corresponden
a Enterococcus, que pueden ser causantes de infecciones urinarias, bacteremias,
abscesos y endocarditis.
5) Realizar análisis microscópico mediante tinción de Gram.
II.- Análisis de la microflora anaerobia de la lengua. Siembra en placa de muestras
tomadas de la lengua e incubadas en ausencia de oxígeno.

1) Con un limpiador lingual (asa de plástico) el alumno tomará muestras del dorso de
la lengua. Desde la secreción remanente en el limpiador realizará un aislamiento en placa
de agar sangre suplementado con hemina y menadiona con asa en loop y la incubará en
anaerobiosis. Además, observará directamente las bacterias, para lo cual se fijarán y
teñirán con tinción de Gram para analizar la microflora adherida a la superficie de la
lengua.
Para el cultivo en anaerobiosis la placa debe ser debidamente rotulada e incubada en
una jarra de anaerobiosis.

2) Realizar análisis macroscópico de colonias observando principalmente la variedad de

colonias distintas. Aquellas colonias pigmentadas de negro en la placa de agar sangre
H-M se relacionan con el nivel de halitosis. Algunas de estos géneros bacterianos
también son causantes de endocarditis.

3) Realizar análisis microscópico mediante tinción de Gram.

 TRABAJO PRÁCTICO N°5

LEVADURAS Y HONGOS FILAMENTOSOS

OBJETIVOS
1.- Conocer y caracterizar la morfología macroscópica de las colonias de hongos
unicelulares (levaduras) y pluricelulares (filamentosos).
2.- Conocer la morfología microscópica de hongos unicelulares (levaduras) y pluricelulares
(filamentosos).

MARCO TEÓRICO
El ser humano está constantemente expuesto a la propagación de organismos
eucariontes como son los hongos. La mayoría tolera esta exposición sin secuelas, pero
algunos desarrollan una hipersensibilidad alérgica. Esto porque un individuo sano tiene una
resistencia innata a la colonización de hongos y porque la virulencia inherente en estos
microorganismo es muy baja.
Sin embargo, en individuos inmunosuprimidos, la infección puede desencadenar
enfermedades que, si no son debidamente controladas, pueden llevar a un resultado fatal
para el hospedero. A los hongos que se aprovechan de la debilidad del hospedero se les
denomina hongos oportunistas. Hongos como Candida (Candida albicans), Aspergillus
(Aspergillus fumigatus) y varios Zigomicetos (Rhizopus arrhizus) son ejemplos de ellos.

TALO (cuerpo macroscópico)

Unicelular Pluricelular

Levaduras Micelio

Colonias semejantes a las Sifonado Septado

bacterianas

Colonias algodonosas,
lanosas, aterciopeladas
 Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se siembran en agar Sabouraud,
cuyo contenido en glucosa es mayor que el de otros medios de cultivo y el pH es ácido (pH
5,6) para impedir la contaminación bacteriana. Generalmente se incuban a 25-30°C por un
tiempo que depende de la especie fúngica (levaduras y hongos ambientales, 48 horas
aproximadamente, hongos dermatofitos, 15-30 días).

Hongos Unicelulares (Levaduras)

Las levaduras son organismos fúngicos unicelulares que generalmente se

reproducen asexualmente por yemación. Los criterios usados para el diagnóstico son
fundamentalmente morfológicos (macroscópicos y microscópicos).

Las levaduras normalmente prosperan en hábitat con abundante azúcar, tales como
frutas, flores e incluso la corteza de los árboles. Algunas de ellas viven en simbiosis con
animales, especialmente insectos. Las levaduras más importantes desde el punto de vista
comercial son las cepas cerveceras y panaderas de la especie Saccharomyces cerevisiae.

Candida spp.: En ciertas condiciones C. albicans, C. tropicalis, C. kefyr, y otras, son

parte de la flora normal de los humanos. Pueden aislarse de las superficies mucosas sanas
de la cavidad oral, vagina, tracto gastrointestinal y área rectal. Sin embargo, cuando se
rompe la barrera mucosa, los microorganismos pueden llegar a la sangre e invadir pulmones,
bazo, riñones, hígado, corazón y cerebro. Este género se caracteriza por un aspecto
macroscópico de su colonia opaco, de color cremoso y consistencia pastosa (Figura 1)

Figura 1: Observación microscópica de una muestra de esputo en que se ponen de

manifiesto las levaduras en yemación y las pseudohifas de las especies de Candida.
 Hongos Filamentosos:

Estos pueden ser sifonados (aseptados) o septados. Los hongos sifonados son
generalmente multinucleares (ej. Mucoral) y los hongos septados presentan hifas con
tabiques que son prolongaciones de la membrana citoplasmática (ej. Aspergillus,
Dermatophytos).
1) Hongos septados
Estos hongos pueden presentarse como contaminantes ambientales (ej. Penicillium),
como patógenos oportunistas (ej. Aspergillus) y como patógenos (ej. Dermatophytos).
Aspergillus spp.: Los microorganismos que pertenecen a éste género son
extremedamente frecuentes en el medio ambiente y de crecimiento rápido (48 hr). En
contraste con la mayoría de las infecciones producidas por Candida, la aspergilosis se
adquiere de fuentes exógenas. Estos microorganismos se identifican por sus características
morfológicas presentando colonias aterciopeladas, algodonosas o pulverulentas,
coloreadas (crema, verde, café y negras). Microscópicamente presentan hifas septadas
de las que nace una prolongación no septada (conidóforo), el cual se dilata en su
extremo distal (vesículas) rodeándose allí de células conidiogénicas (fiálides). Las
fiálides producen conidios los que se disponen en forma de cadenas. El conjunto
vesícula, fiálide y conidios se conoce como “cabeza aspergilar” (Ver Figura 2).
De las aproximadamente 900 especies de
Aspergillus descritas, A. fumigatus y A. flavus son
las que con mayor frecuencia se asocian a
enfermedad invasiva. Son ubicuitarios en el
ambiente y no forman parte de la flora normal del
ser humano, aunque pueden producirse
colonizaciones transitorias. La aspergilosis está
asociada con problemas respiratorios como la
dilatación crónica de la vía aérea hasta un colapso
de un segmento pulmonar.

Figura 2: Estructura microscópica de

especies de Aspergillus
 Penicillium: Estos microorganismos son ubicuitarios en el medio ambiente y
suelen aislarse en muestras de aire y como contaminantes en los cultivos de laboratorio,
desarrollándose en 3-4 días. En 1929, Sir Alexander Fleming observó que una especie de
Penicillium había contaminado su cultivo de Staphylococcus aureus, destruyendo las
bacterias que se encontraban inmediatamente en contacto con el hongo. Esta observación
casual llevó al descubrimiento de la penicilina.
Los hongos que petenecen a este género se caracterizan por la producción de
conodióforos en el extremo de hifas septadas ramificantes. Cuando se alojan en
superficies, como una placa de agar, germinan y crecen rápidamente produciendo
colonias con aspecto polvoriento, de color verde azulado.
P. marnefeii es la única especie patógena de Penicillium y es causa de infecciones
espontáneas del sistema retículoendotelial, afectando vasos linfáticos, pulmón, hígado, bazo
y hueso. Ver figura 3.

Figura 3:
Aspecto microscópico de Penicillium.
 2) Hongos sifonados.

Zigomicetos: Especies de Rhyzopus, Mucor y Absidia han sido implicados en

cuadros de zigomicosis. Macroscópicamente presentan un micelio algodonoso.
Microscópicamente, forman hifas aseptadas y se reproducen asexualmente
produciendo esporangios en los que se desarrollan esporas (Ver figura 4). Las
enfermedades asociadas a estos microorganismos son usualmente la mucormicosis
rinocerebral. Esta infección se origina en los senos paranasales y puede afectar órbita y el
paladar, extendiéndose hacia el cerebro. En pacientes inmunodeprimidos puede afectar el
pulmón, el tracto gastrointestinal y los tejidos subcutáneos.

Figura 4:
Aspecto microscópico de hongos sifonados.
I.- Estudio Clínico
El reconocimiento del hongo como agente de infección se inicia por la sospecha clínica del
Médico al orientar su diagnóstico hacia una micosis. Este se sustenta gracias al examen
físico, la historia clínica y en infecciones profundas, se agrega el apoyo de imágenes,
fundamentalmente el Scanner. Frecuentemente, en micosis oportunistas los signos y
síntomas clínicos no son específicos, siendo indistinguibles de una infección bacteriana.
Muchas veces, la presencia de factores predisponentes o de riego y la pobre respuesta al
tratamiento antibacteriano, es señal que índica la posible presencia causal de agentes
fúngicos, sospecha que debe ser indicada en la solicitud de examen para que el profesional
de laboratorio oriente la búsqueda y aislamiento del hongo siguiendo la metodología
apropiada.
II.- Toma y Transporte de Muestras
La recolección y transporte del material clínico depende en gran parte de la sospecha clínica,
tejido afectado, tipo de lesión y estado general del paciente. Esta etapa es fundamental para
el éxito del diagnóstico. Debe asegurarse una cantidad suficiente de muestra que permita
realizar todos los exámenes de laboratorio. La calidad de la muestra está directamente
relacionada con la sensibilidad y rendimiento del examen en el laboratorio.

Si el paciente se encuentra bajo tratamiento antifúngico, se recomienda suspender el

tratamiento, por lo menos 2 semanas antes de la toma de muestra. Esto se orienta
principalmente a pacientes portadores de micosis superficiales o cutáneas y las consideradas
no graves.
III.- Procedimiento General del Diagnóstico de Laboratorio
En general, el examen microscópico directo (EMD) y el cultivo pueden ser realizados para
todas las muestras clínicas que se reciben. Estos exámenes forman parte del método directo
de identificación de hongos y se recomienda en todas las micosis. La microscopía
proporciona información vital y frecuentemente una inmediata corroboración del
diagnóstico presuntivo al observar el agente fúngico en el material clínico. Los hongos
filamentosos se presentan en parasitismo como hifas que pueden ser cenociticas (poco
septadas) o septadas, hialinas o dematiancias (oscuras) según el tipo de hongo. Algunas
levaduras presentan características microscópicas particulares en parasitismo, lo cual orienta
su identificación.

a) El EMD puede ser realizado en frotis, fijándose la muestra al portaobjetos y usando

la tinción de Gram o Giemsa, para poder observar con la objetiva de inmersión
(100X). Lo más frecuente, es la preparación al fresco con soluciones clarificadoras
con o sin colorantes como KOH 10 o 20%. Además, se emplea la tinta de China
para observar la presencia de cápsula en levaduras del género Cryptococcus,
observándose con objetivos de 10X y 40X de aumento. En muestras de tejido,
además puede solicitarse examen histopatológico donde se verá además la reacción
tisular.
b) El cultivo primario del hongo es realizado en varios tubos o placas de Petri conteniendo
los medios de cultivo según la sospecha clínica. Las micosis causadas por hongos
filamentosos se incuban generalmente a 25ºC y el tiempo de incubación dependerá de la
sospecha clínica. Así, en las dermatofitosis o tiñas los medios se incuban hasta por 30
días, debido a que estos hongos demoran aproximadamente 20 días en crecer y presentar
sus estructuras micromorfológicas características que permitirán su diagnóstico a nivel
de especie. Sin embargo, los hongos filamentosos oportunistas como Aspergillus spp.,
Penicillium spp., Fusarium spp., mucorales y dematiaceos, entre otros, crecen más
rápido, obteniéndose colonias entre los 5 a 10 días de incubación. Las levaduras crecen
mejor a 37ºC y sus colonias se obtienen entre las 24 y 72hrs dependiendo de la especie.
1.- HONGOS FILAMENTOSOS
Examen Microscópico de la Colonia
A partir del hongo filamentoso aislado in vitro, se realiza una preparación microscópica para
observar las características morfológicas del organismo, buscando principalmente las
estructuras reproductivas, ya que son éstas las que permitirán identificar el agente. Muchas
veces, como consecuencia de la fragilidad de estas estructuras, se logra aproximar el
diagnóstico a nivel de género o grupo de hongos, por tal motivo se requiere de un cultivo
especial cuyo propósito es estimular la producción de células reproductivas en medios
pobres y conservar su agrupación con respecto a las hifas a partir de un microcultivo. (no se
realizará)

2.- IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS

a.- Prueba Fisiológica de Producción del Tubo Germinativo
Este examen es realizado para identificar la presencia de C. albicans. En condiciones
determinadas de cultivo “in vitro”, esta levadura desarrolla un tubo fino que no se libera ni
presenta punto de constricción en el punto de unión con la célula madre. Se inocula la
levadura en un tubo conteniendo plasma o suero humano y se incuba a 37ºC por 2 a 3 hrs.
Debido a lo rápida, fácil y barata, esta técnica se encuentra implementada en la gran mayoría
de los laboratorios. Sin embargo, es recomendable acompañarla siempre con estudios en
microcultivo, para comprobar la identificación de C. albicans, ya que se han descrito casos
de falsos positivos y negativos.

c) Pruebas Bioquímicas
El estudio bioquímico de levaduras comprende principalmente el análisis de asimilación de
hidratos de carbono conocido como Auxanograma, sometiéndose a la cepa en estudio a
diferentes azúcares dependiendo del género de levadura que se sospeche. Este examen se
complementa con asimilación de fuentes de nitrógeno, fermentación de azúcares
denominado Zimograma e hidrólisis de urea. El auxanograma y la asimilación de nitratos
son incubados a 25ºC hasta por 3 días. Entretanto, el zimograma e hidrólisis de urea se
incuba a 37ºC.
El perfil bioquímico obtenido será comparado con los datos en las tablas de identificación
respectivas, según el género de levadura sospechado, permitiendo reconocer la o las especies
que presentan el patrón bioquímico determinado.
Sistemas Comerciales de Identificación de Levaduras
En virtud de trabajo y experiencia que se requiere para leer e interpretar los resultados
bioquímicos realizados por el método estándar, la industria ha desarrollado progresivamente
nuevos sistemas para facilitar y disminuir el tiempo de identificación de las especies de
levaduras de interés clínico. La mayoría de los sistemas disponibles en el mercado son
galerías que contienen distintos nutrientes y reactivos deshidratados en los pocillos que, al
ser inoculados e incubados correctamente proporcionan lectura de fácil interpretación, las
cuales, en su mayoría generan un código numérico de varios dígitos que son interpretados
por registros propios de cada empresa. El primer inconveniente observado por los
laboratorios es la necesidad de contar con disponibilidad de otra estufa de cultivo, ya que
algunos de estos sistemas se incuban a 30ºC por 24 y 48hr.
Sistema comercial Productor
- Api Candida BioMérieux
- ID 20C e ID 32C BioMérieux
- Fungichrom I International Microbio

En resumen, a partir del diagnóstico clínico los pasos importantes que favorecen el
aislamiento e identificación del hongo son:
- Apropiada recolección del material clínico y rápido transporte al laboratorio
- Inmediato y oportuno procesamiento de la muestra
- Adecuada elección de la o las soluciones en el examen microscópico directo
- Correcta selección del o los medios de cultivos
- Óptimo procedimiento de inoculación e incubación
- Adecuada realización, lectura, análisis e interpretación de las técnicas de
identificación
ACTIVIDADES PRÁCTICAS

1.- Observación y descripción de cultivos de levadura.

1.1.- Procedimientos.
a) Examen macroscópico: Describa, tal como lo hacía para colonias bacterianas,
forma, color, aspecto de la superficie, borde, elevación y brillo de las colonias. Anote
lo que observe.
b) Examen microscópico: Realice una tinción Gram tradicional. Es decir, realice un
frotis con la colonia de levaduras en una gota de agua y continúe con el protocolo
por usted. conocido. Observe con inmersión y dibuje lo que observa.

Nota: La tinción Gram es sólo una técnica de tinción. Las levaduras no son Gram + ni
Gram -. Recuerde que la característica de ser Gram+ o Gram- está relacionada con
propiedades que pertenecen a las membranas bacterianas.

c) Observación de tubo germinativo y filamentación en Candidas:

1. Coloque en un portaobjeto limpio una gota del cultivo de Candida que se le
entragará(*)
2. Cubra con un cubreojeto.
3. Observe al fresco en aumento de 40X y dibuje lo observado

(*) Para esta prueba la levadura a estudiar se siembra en un tubo con plasma humano
y se cultiva a 37°C por 4 horas para observar tubo germinativo y por 24 horas para
observar filamentación.

Recuerde que sólo C. albicans presenta tubo germinativo a las 4 horas, mientras que
varias especies de Candida presentan filamentación a las 24 horas.

2.- Observación, y descripción de hongos filamentosos.

2.1.- Procedimientos.
a) Examen macroscópico: Color y aspecto (aterciopelada, algodonosa, polvorienta,
lanosa) en anverso y reverso. Anote lo que observe.
b) Examen microscópico: Para esto se realizará un examen al fresco.

Examen al Fresco:

1.- Coloque una gota de azul de lactofenol sobre un portaobjeto.

2.- Flamee un asa en punta, enfríe cerca del mechero y obtenga un pequeño trozo del
hongo (sin sacar agar). DEBE USAR MASCARILLA.
3.- Mezcle el fragmento del hongo con el azul de lactofenol y cubra con un cubreobjeto.
4.- Observe con aumento de 40X (sin inmersión, ni aplastando la muestra).
5.- Reconozca las estructuras microscópicas reproductivas de cada especie y dibuje.

• Recuerde: el principal criterio para la identificación de estos microorganismos es el

morfológico, por lo tanto, es importante que trabaje con cuidado.

CULTIVO
POSITIVO

LEVADURAS

TUBO GERMINATIVO

TUBO GERMINATIVO (+) TUBO GERMINATIVO (-)

Candida albicans FILAMENTACIÓN (+) FILAMENTACIÓN (-)

PSEUDOHIFAS O HIFAS PSEUDOHIFAS O HIFAS HIFAS CON ARTROCONIDIAS CÁPSULA (-) CÁPSULA (+)
BLASTOCONIDIAS Y CON BLASTOCONIDIAS
CLAMIDOCONIDIAS

Candida albicans Candida sp. API 32, PROBABLE API32, probable Cryptococcus sp.
Trichosporon o Rhodotorula o
Geotrichum Torulopsis

ASIMILACIÓN/ FERMETACIÓN
DE AZÚCARES
(API 32 U OTRO))
 TRABAJO PRÁCTICO N°6

PARÁSITOS

OBJETIVOS

1.- Reconocer elementos parasitarios frecuentes en muestras clínicas.

2.- Observar las características más importantes de estos parásitos.

MARCO TEÓRICO

Se define como parásito a todo ser vivo, vegetal o animal, que pasa toda, o parte de
su existencia, a expensas de otro ser vivo, generalmente más potente que él (huésped), del
cual vive causándole o no daño, que puede ser aparente o inaparente, y con quien tiene una
dependencia obligada y unilateral. Existen diversos tipos de parasitismo:
1. Parasitismo obligatorio: los parásitos necesitan para vivir hacer vida parasitaria. Este
estado puede ser permanente, permanente estacionario, periódico o temporario.
2. Parasitismo facultativo: son seres de vida libre que en circunstancias favorables hacen
vida parasitaria.
3. Parasitismo accidental: no son parásitos verdaderos, pero ocasionalmente pueden serlo.
4. Parasitismo extraviado: parásitos de los animales que anormalmente pueden encontrarse
en el hombre.
5. Parasitismo errático: cuando la localización del parásito, en el huésped, no es en el órgano
o tejido habituales.
Ciclos de vida del parásito:
1. Ciclos directos (monoxenicos): son aquellos en los que no es necesaria la presencia de un
huésped intermediario. Pueden ser cortos -donde la forma emitida es la infectante- o largos,
donde la forma emitida necesita un determinado tiempo en el medio (generalmente el suelo)
para transformarse en infectante. En general, los parásitos con ciclos directos cortos son
cosmopolitas y los directos largos están condicionados por las situaciones climáticas.
2. Ciclos indirectos (heteroxenicos): son los que necesitan un huésped intermediario para
completar su ciclo. La presencia de estas parasitosis en un área determinada depende de la
existencia de ese huésped intermediario.

Características más importantes de los parásitos:

Resistencia al medio exterior: para enfrentar los factores climáticos y algunos agentes
químicos, los huevos, quistes o larvas se protegen con cubiertas proteicas que los hacen
resistentes.
Patogenicidad: está relacionada con la morbilidad y la mortalidad. Algunos parásitos son
patógenos por sí mismos, y otros lo son, dependiendo de las características del huésped; ésto
hace que un mismo parásito pueda o no producir enfermedad. Por esta razón existen el
portador sano y los parásitos oportunistas, que se manifiestan en pacientes
inmunocomprometidos.
Autoinfección: es la forma para que el parásito permanezca por más tiempo en el huésped.
Puede ser autoexoinfección, en la que está en el exterior un tiempo muy corto; o
autoendoinfección, en la que se multiplica dentro del huésped, y la recontaminación se hace
en el interior del mismo.
Prepatencia: es el tiempo que transcurre entre la entrada del parásito al huésped y la
demostración de éste, o sus formas de desarrollo, ya sea por la observación directa, estudios
bioquímicos, cultivos, etc.
Viabilidad: es importante que las formas emitidas al exterior por el parásito sean viables a
través de estructuras resistentes, tanto al medio como a los huéspedes intermediarios. Se
asegura de esta forma la continuidad del ciclo y su permanencia.
Diapausa: es el estado en que muchas veces las larvas de los parásitos permanecen en el
organismo del huésped en forma latente -encapsuladas o formando quistes- para evadir la
respuesta inmunológica.
Longevidad: la longevidad de un parásito admite dos formas: longevidad verdadera, cuando
permanecen muchos años en un organismo; o perpetuándose -por medio de la autoinfección-
aunque el parásito tenga vida muy corta.
Fecundidad: la capacidad para emitir determinada cantidad de formas parasitarias le sirve
al parásito para perpetuarse. Es útil conocerla, ya que a través de ello (por ejemplo, en los
helmintos, postura diaria de huevos), es posible hacer el cálculo aproximado del número de
parásitos que infectan al huésped.
Prevención de las parasitosis

La Organización Mundial de la Salud estableció que, dado que las parasitosis son
patologías con alto componente social, podrían ser controladas, pero difícilmente
eliminadas. Las medidas de prevención están vinculadas a la modificación de los hábitos, la
educación y el bienestar de la población. Incluyen:
1. Disminuir el “fecalismo” ambiental a través de medidas de saneamiento básico,
como facilitar el acceso al agua potable, la correcta eliminación de excretas, etc.
2. No utilizar excrementos como abono para el cultivo de hortalizas, ni aguas servidas
para riego.
3. No consumir carnes o verduras crudas.
4. Controlar los vectores mecánicos (moscas, cucarachas) y los vectores biológicos
(vinchuca, mosquitos etc.).
5. Desparasitar periódicamente a los animales domésticos, sobre todo perros y gatos.
6. Prevenir las parasitosis congénitas a través del control de la mujer embarazada.
7. Evaluar parasitosis en dadores de sangre y donantes de órganos.
8. Modificar hábitos de convivencia del hombre con los animales, para evitar el
contacto con las heces de los mismos.
9. Promocionar la lactancia materna, ya que se ha comprobado que ésta protege contra
determinadas parasitosis, principalmente las que originan diarreas.
10. Evitar el hacinamiento, que facilita el contagio persona a persona.
11. Hervir el agua de consumo por un minuto, utilizando esta modalidad como norma,
especialmente cuando la ingieran lactantes y niños.
12. No caminar descalzo o con calzado abierto en suelos de tierra o arena, sobre todo
húmedos.
 13. Utilización de guantes y calzado cerrado siempre que se trabaje con la tierra.
14. Antes de utilizar abono o turba de río comercial rociar el material con agua recién
hervida.
15. Tratar de evitar que los niños jueguen en areneros o patios de tierra. Si ello no fuera
factible, establecer un lugar delimitado para ellos, al que se rociará periódicamente,
si es posible en forma diaria, o en los períodos de clima cálido y después de las
lluvias, con agua recién hervida.
16. Colocar los juguetes de los niños al sol las veces que se pueda, ya que la mayoría de
las formas parasitarias no resisten a la desecación y temperaturas superiores a 50ºC.

LABORATORIO DE PARASITOLOGIA

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

CONDICIONES GENERALES
• Los parásitos intestinales del hombre son protozoarios y/o helmintos, llamados
comúnmente gusanos intestinales (Anexo A). Estos helmintos o gusanos pueden ser
cilíndricos (nemátodes), anillados o segmentados (céstodes).
• Para observar los trofozoítos, quistes u ooquistes de los protozoarios, así como las
larvas y huevos de helmintos, se debe usar un microscopio; en cambio, la mayor
parte de los gusanos o helmintos adultos son macroscópicos y su morfología puede
estudiarse directamente, con ayuda de un estereoscopio o una lupa.
• Los protozoarios intestinales eliminan con las heces sus formas evolutivas
(trofozoíto, quiste, ooquiste y espora), según la especie involucrada.
• Los helmintos intestinales adultos (proglótidos de Taenia sp., Enterobius
vermicularis y Ascaris lumbricoides) pueden salir al exterior espontáneamente o
después del tratamiento.
• Los gusanos intestinales se eliminan con las heces.
• Los métodos de diagnóstico de los parásitos intestinales pueden ser: directo o por
concentración de los elementos parasitarios que se eliminan en las heces.
• En las heces podemos encontrar formas adultas y microscópicas (huevos, larvas,
trofozoitos, quistes, ooquistes y esporas) de los parásitos intestinales; por ello, es
importante obtener una buena muestra fecal, así como la conservación óptima del
espécimen.
• La muestra debe ser obtenida (entre 3 y 6 gramos) lo más fresca posible (máximo 90
minutos, si se busca Entamoeba histolytica), y depositada en un frasco de boca ancha
con tapa rosca y rotulada correctamente con los datos de identificación.
• La muestra debe obtenerse antes del uso de medicamentos antiparasitarios, o hasta 2
a 5 días después de su administración.
• Las heces depositadas en el suelo no son las recomendadas para el diagnóstico,
debido a que pueden contaminarse con formas biológicas, como por ejemplo: larvas
similares a los enteroparásitos del hombre, larvas de nemátodes, huevos de ácaros o
insectos, etc.
• Si el paciente no es regular en la evacuación de sus deposiciones y ha evacuado en la
noche anterior al examen, se recomienda guardar la muestra en una refrigeradora o
 en un lugar fresco no expuesto a la luz solar, para que no se alteren las formas
parasitarias. Cuando la muestra va a demorar en llegar al laboratorio varias horas o
días, se recomienda adicionarle líquido fijador y/o conservador (PAF, PVA,
formalina 10%, SAF, acetato de sodio, etc.).

MUESTRA PARA EXAMEN PARASITOLÓGICO

Comprende las siguientes muestras: heces, bilis o jugo duodenal, esputo, secreción, biopsia
o preparaciones histológicas, siendo heces, la más frecuente.

EXAMEN DIRECTO MACROSCÓPICO

Fundamento.
Permite observar directamente las características morfológicas de los parásitos adultos,
enteros o fraccionados, así como los cambios en las características organolépticas de las
heces eliminadas, (color, presencia de sangre y/o moco, consistencia, etc.).

Figura Nº 1. Ascaris lumbricoides macho adulto (der.) y proglótido grávido de Taenia

solium (4X) (izq.), coloración: Tionina

EXAMEN DIRECTO MICROSCÓPICO

Fundamento.
Buscar, principalmente en muestras frescas, la presencia de formas evolutivas móviles de
parásitos de tamaño microscópico (trofozoítos, quistes de protozoos: Entamoeba histolytica,
Giardia lamblia, Balantidium coli, etc.; así como larvas o huevos de helmintos:
Strongyloides stercoralis, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Trichostrongylus
sp., Paragonimus, Fasciola, etc.).

Ejemplos
Trofozoito de Giardia lamblia con solución lugol. Huevos operculados de
Paragonimus peruvianus (izq.) y Fasciola hepatica (der.) en muestra fresca

DIAGNOSTICO EN EL LABORATORIO PARASITOLOGÍA

La recolección correcta de las muestras es esencial para un examen de heces

confiable. Se recomienda realizar un seriado coproparasitológico, una muestra fresca en
solución formolsal. Debe entregarse a cada paciente tres frascos o recipientes plásticos de
boca ancha con cierre adecuado, Se puede solicitar al paciente que tres días antes de iniciar
la recolección no ingiera manteca, frutas de hollejo, verduras de hoja y legumbres.Puede
ingerir carnes magras, pastas, dulces, papa. Esta dieta previa no es un requisito estricto. Se
debe suspender la ingesta de purgantes oleosos y sustancias radio opacas.

Recolección de materia fecal en conservantes:

• Seriada coproparasitológica:
Se indica la recolección de un mínimo de una muestra (tamaño de una cucharada de postre)
de cada deposición en tres días alternos. Se le indica al paciente que defeque en una
bacinica, o en un recipiente de boca ancha, limpio y seco, o sobre superficie plástica o papel
no absorbente de donde tomará la porción para colocarla en un frasco grande con formolsal
al 5%.

Examen macroscópico de las heces remitidas:

Cuando las heces frescas son recibidas en el laboratorio deben ser examinadas bajo luz lo
que permite observar directamente las características morfológicas de los parásitos adultos,
enteros o fraccionados, así como los cambios en las características organolépticas de las
heces eliminadas, (color, presencia de sangre y/o moco, consistencia, etc.).

Examen microscópico de heces:

La aplicación de los métodos de concentración permite detectar elementos parasitarios que
estén presentes y se examina una cantidad mayor de heces en menor volumen.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS

Las actividades del laboratorio de parasitología consistirán en la observación de

elementos parasitarios conservados en soluciones fijadoras y disecados y/o observación
de diapotecas según disponibilidad de cada laboratorio.
EJEMPLOS DE ELEMENTOS PARASITARIOS QUE PUEDEN ENCONTRARSE
EN UN SERIADO DE DEPOSICIONES